T T A G G C G A A T A T G T 19 - media.axon.esmedia.axon.es/pdf/79407.pdf · los alimentos obtenidos por modificación genética se consi-deran nuevos alimentos por pertenecer a una

Alimentos transgénicos

Ë Objetivos

19Capítulo

ÁNGEL GIL HERNÁNDEZ

DANIEL RAMÓN VIDAL

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DNArecombinante

n Entender el concepto de DNA recombinante y las principales técnicas moleculares utilizadas actualmente en la ingeniería genética.

n Adquirir los conceptos de organismos modificados genéticamente y de alimentos transgénicos.

n Describir las bases de la obtención de las plantas transgénicas y algunos ejemplos de apli-caciones de la ingeniería genética en agricultura.

n Conocer las bases de las modificaciones genéticas de las bacterias y otros microorganismosusados comúnmente en la industria alimentaria mediante tecnología de DNA recombinante.

n Entender los procesos y modalidades utilizados en la obtención de los animales transgé-nicos.

n Comprender los procedimientos utilizados para la clonación de animales.

n Conocer el protocolo que debe seguirse para solicitar la comercialización de los «nuevosalimentos».

n Conocer las aplicaciones de las normas vigentes sobre el etiquetado y la trazabilidad denuevos alimentos e ingredientes en la Unión Europea.

n Comparar la legislación vigente en Estados Unidos con la de la Unión Europea en cuanto a

n INTRODUCCIÓN

n CONCEPTO Y CLASIFICACIÓN

n DNA RECOMBINANTE E INGENIERÍAGENÉTICA

n Clonado molecular

n Enzimas de restricción

n Ligado de fragmentos de DNA

n Otras enzimas de interés en la tecnología del DNArecombinante

n Vectores de clonación

n Selección del DNA recombinante

n Librerías genómicas

n Técnicas de visualización y cuantificación de fragmentos de ácidos nucleicos

n APLICACIONES DE LA INGENIERÍAGENÉTICA EN LA PRODUCCIÓN DE ALIMENTOS

n Agricultura: plantas transgénicas• Obtención de plantas transgénicas• Aplicaciones de la ingeniería genética

en agricultura

n Industria alimentaria: microorganismosmodificados genéticamente• Obtención de bacterias lácticas modificadas

genéticamente• Aplicaciones en la industria alimentaria

de las bacterias lácticas modificadasgenéticamente

• Otras bacterias• Obtención y aplicaciones de levaduras y hongos

filamentosos modificados genéticamente

n Producción animal: animales transgénicos• Obtención de animales transgénicos• Aplicaciones de los animales transgénicos

n EVALUACIÓN DE ALIMENTOS Y CULTIVOSTRANSGÉNICOS

n COMERCIALIZACIÓN DE ORGANISMOSMODIFICADOS GENÉTICAMENTE O DE PRODUCTOS QUE LOS CONTENGAN

n Solicitud de autorización de comercialización de un alimento transgénico en el ámbito comunitario• Dictamen de la Autoridad• Autorización

n Normas legislativas en España • Informe de evaluación• Régimen de autorización

n Etiquetado y trazabilidad de nuevos alimentos y de nuevos ingredientes alimentarios: legislaciónen la Unión Europea• Etiquetado• Trazabilidad

n SITUACIÓN LEGISLATIVA DE LOS ALIMENTOS MODIFICADOSGENÉTICAMENTE EN ESTADOS UNIDOS Y ÚLTIMOS AVANCES EN LA UNIÓN EUROPEA

n LEGISLACIÓN RELEVANTE SOBRE ORGANISMOS MODIFICADOSGENÉTICAMENTE

n RESUMEN

n BIBLIOGRAFÍA

n SITIOS WEB DE INTERÉS

Contenido

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DNArecombinante

n INTRODUCCIÓN

Los organismos modificados genéticamente (OMG)pueden definirse como organismos en los cuales el materialgenético, formado por el ácido desoxirribonucleico (DNA),ha sido alterado de un modo artificial mediante el uso de ladenominada tecnología del DNA recombinante o ingenieríagenética. Esta técnica permite aislar genes de cualquier or-ganismo vivo donador, seleccionarlos y transferirlos a otroorganismo de una especie receptora que en la escala filoge-nética puede estar relacionada o distante de la donadora. Enlos países hispanoparlantes los OMG también se denominanorganismos transgénicos.

Desde hace más de tres décadas se han desarrolladonuevos microorganismos, plantas y animales medianteestas técnicas genéticas, las que han permitido crear nue -vos alimentos con distintas propiedades. Así, se han des-arrollado nuevas variedades de plantas con resistencia ainsectos, virus o herbicidas, leguminosas con contenidomejorado de algún aminoácido o cereales con un mayorvalor biológico de sus proteínas. También se han creadoplantas de cuyas semillas se obtienen aceites con compo-sición nutricional mejorada u otras cuyos frutos presentanun retraso en la maduración o tienen mejorada su texturao color. Por otra parte, se han generado nuevos microorga-nismos que pueden producir aditivos alimentarios, comocolorantes y edulcorantes más eficaces, y se han obtenidomicroorganismos modificados útiles en los procesos fer-mentativos destinados a la producción de alimentos. Estasnuevas cepas de bacterias lácticas, levaduras y hongos fi-lamentosos posibilitan el desarrollo de nuevos productoso la prevención de problemas industriales, al estar limitadasu infección por virus, especialmente en el caso de las bac-terias lácticas. Aunque el desarrollo de animales modi -ficados genéticamente es más difícil y plantea mayoresproblemas éticos, también se han desarrollado razas trans-génicas para producir peces de mayor tamaño, mejorar lacomposición de la carne y de la leche en los mamíferos oaumentar la calidad de la lana, así como para producir pro-teínas con fines terapéuticos. Por otra parte, la clonaciónde animales de granja es un hecho y, aunque es un pro-ceso aún muy complejo no exento de riesgos, en el futuropodrá permitir mayores producciones de alimentos conmejor calidad.

Todos estos alimentos transgénicos han de pasar un pro-ceso de evaluación complejo antes de llegar al consumidor.Dicho proceso incluye el estudio de la mejora genética intro-ducida (características del organismo donante y del re-ceptor, sitio de inserción, patrón de expresión del gen trans-génico y consecuencias potenciales de la modificación), laseguridad alimentaria del alimento (características nutricio-nales, composición e inocuidad, toxicidad y alergenicidadposibles, cambios potenciales en la ingesta e impacto nutri-cional a largo plazo) y el potencial impacto en el medio am-biente. Además, desde el 18 de abril de 2004 la nueva regu-lación sobre trazabilidad y etiquetado de los OMG es deobligado cumplimiento en todos los estados miembros de la

Unión Europea. La normativa establece que se indique lapresencia de un OMG en un producto cuando al menos el0,9 % de uno de sus ingredientes sea OMG o proceda de unOMG. Además, la normativa exige conocer con exactitud elorigen y los detalles del proceso de producción de losnuevos OMG o de los alimentos que los contienen.

En este capítulo se analiza el concepto de OMG y se des-criben brevemente las técnicas más utilizadas en la tecno-logía del DNA recombinante. Asimismo, se describen las téc-nicas más comunes para la producción de microorganismos,plantas y animales transgénicos de utilidad en alimentacióny se ofrecen varios ejemplos de interés. Se destina especialatención a la evaluación sanitaria y medioambiental de di-chos productos. Por otra parte, se abordan los aspectos le-gales relacionados con la producción, la comercialización, eletiquetado y la trazabilidad de los OMG, así como su protec-ción jurídica.

n CONCEPTO Y CLASIFICACIÓN

Los alimentos transgénicos, también llamados alimentosmodificados genéticamente, son los diseñados para cubrircualquier necesidad de mejora en los que se ha incorporadomaterial genético distinto del original mediante técnicas deingeniería genética. Según el derecho alimentario, se consi-dera que se ha creado un nuevo alimento cuando: a) se tratade una materia prima nueva, b) es el resultado del uso de unanueva tecnología de fabricación o de tratamiento, o c) se es-tablece un nuevo uso a un producto ya existente. Al respecto,los alimentos obtenidos por modificación genética se consi-deran nuevos alimentos por pertenecer a una nueva tecno-logía de fabricación. De hecho, el Reglamento (CE) n.º 258/97del Parlamento Europeo y del Consejo clasifica los nuevos ali-mentos en seis categorías, quedando los alimentos transgé-nicos incluidos en dos de ellas. Por un lado, la categoría queconsidera nuevo alimento o nuevo ingrediente alimentario alque contenga OMG o que consista en dichos organismos, porejemplo, un yogur producido con bacterias de ácido lácticomodificadas genéticamente o una lechuga transgénica. Porotro, la categoría que comprende a los alimentos que con-tengan ingredientes alimentarios producidos a partir de OMG,por ejemplo, una galleta que contenga harina de maíz prove-niente de una variedad de maíz transgénico.

Históricamente, en la normativa jurídica de la Unión Eu-ropea, la definición de OMG ha tenido un tratamiento espe-cial. Así, la Recomendación de la Comisión de 29 de julio de1997 realizaba una clasificación científica de los nuevos ali-mentos con miras a la evaluación de su salubridad, en lacual aparecían seis clases de nuevos alimentos, quedandolos alimentos modificados genéticamente encuadrados entres de ellas, denominadas clases 3, 4 y 5, correspondientesrespectivamente a vegetales, animales y microorganismosmodificados genéticamente y sus productos. En las tresclases se incluían dos subclases relativas a organismos re-ceptores con historial de uso como alimento en la Comu-nidad en condiciones de preparación e ingesta comparableso sin dicho historial de uso. 3

19CAPÍTULO


Posteriormente, la Directiva 2001/18/CE del ParlamentoEuropeo y del Consejo de 12 de marzo de 2001 sobre la li-beración intencional al medio ambiente de organismostransgénicos definía el término OMG como «el organismo,con excepción de los seres humanos, cuyo material gené-tico haya sido modificado de una manera que no se producenaturalmente en el apareamiento ni en la recombinaciónnatural». En la Posición Común (CE) n.º 22/2003, aprobadapor el Consejo el 17 de marzo de 2003, se definía al OMGdestinado a la alimentación humana como «aquel quepuede utilizarse como alimento o como material de partidapara la producción de alimentos». En la misma reglamenta-ción se consideraban alimentos modificados genéticamentea «aquellos que contienen o están compuestos por OMG, ohan sido producidos a partir de ellos». Conviene aclarar quela expresión «producido a partir de OMG» para los legisla-dores europeos hace referencia a un derivado total o parcialde OMG que no contenga OMG o esté compuesto por OMG.Además, en esta definición, las técnicas de modificación ge-nética incluyen: a) técnicas de recombinación del DNA queconsideren la formación de combinaciones nuevas de ma-terial genético mediante la inserción de moléculas de ácidonucleico, obtenidas por cualquier medio fuera de un orga-nismo, ya sea en un virus, plásmido bacteriano u otro vector,y su incorporación a un organismo hospedador en el que nose encuentren de forma natural pero puedan seguir repro-duciéndose; b) técnicas que supongan la incorporación di-recta en el genoma de un organismo de material hereditariopreparado fuera del organismo, incluidas la microinyección,la macroinyección y la microencapsulación, y c) técnicas defusión de células (incluida la fusión de protoplastos) o de hi-bridación, en las que se formen células vivas con combina-ciones nuevas de material genético hereditario mediante lafusión de dos o más células utilizando métodos que no seproducen naturalmente.

Por todo lo expuesto en los párrafos anteriores, resultaevidente que antes de entrar a tratar en profundidad los ali-mentos modificados genéticamente conviene plantear lastécnicas destinadas a su diseño.

n DNA RECOMBINANTE E INGENIERÍAGENÉTICA

La esencia de la tecnología del DNA recombinante es elaislamiento y la manipulación del DNA, incluyendo la uniónde secuencias de nucleótidos de orígenes diversos (virus,microorganismos, plantas y animales) para generar nuevasmoléculas quiméricas o nuevas secuencias independientes.Esta tecnología implica la utilización de muchas metodolo-gías distintas, que se tratarán en este apartado, cuya basees la existencia de varios métodos que implican cortar lascadenas de DNA por lugares específicos mediante el uso delas denominadas enzimas de restricción, para posterior-mente usar la enzima DNA ligasa para unir segmentos deDNA de orígenes diferentes, generando así nuevas molé-culas de DNA quiméricas. Por otra parte, existen técnicasde clonado que permiten amplificar el nuevo DNA heteró-

logo. Su cuantificación, tanto del DNA clonado como delRNA que transcriba, es abordable gracias, entre otras téc-nicas, al uso de sondas de DNA. Por otro lado, existen mé-todos químicos y enzimáticos automatizados que posibilitanla secuenciación de largos fragmentos de DNA. También esposible la síntesis química de oligonucleótidos con una se-cuencia precisa. Finalmente, la reacción en cadena de la po-limerasa (PCR) permite la amplificación de una secuenciadeterminada de DNA de forma muy sensible y selectiva.Toda esta batería de métodos es la base del trabajo en in-geniería genética y con ellos se consiguen generar e identi-ficar las moléculas quiméricas con las que generar los OMG.

Para conseguir introducir esas moléculas híbridas en unorganismo receptor, en otras palabras, para generar unOMG, existen varios métodos, entre los que se incluyen latransformación por plásmidos y la transfección por fagospara el caso de los microorganismos y la transformación,para animales y plantas. En todos ellos las células hospeda-doras deben prepararse para poder recibir el DNA foráneo.

En la transformación microbiana, al generar un DNA re-combinante se inserta en él un marcador seleccionable quepermite la identificación de las moléculas recombinantes, porejemplo, un gen de resistencia a un antibiótico o un gen quecodifica una enzima clave en la síntesis de un aminoácido(marcador auxotrófico). Cuando se utiliza un gen marcador deresistencia a un antibiótico, la célula portadora del DNA re-combinante crece en un medio de cultivo que contiene el an-tibiótico. Cuando se utiliza un marcador auxotrófico, porejemplo, un aminoácido, la célula hospedadora es capaz decrecer en un medio de cultivo pobre en nutrientes que no con-tiene dicho aminoácido. La transfección con fagos supone ge-nerar fagos recombinantes en los que parte de su material he-reditario se sustituye por el gen transgénico que se quiereexpresar o, simplemente, se suplementa con dicho gen. La in-troducción del gen transgénico se realiza siguiendo el procesonatural de infección vírica. En el caso de la transformación nobacteriana, se transforman células de origen vegetal o animalmediante diferentes procesos, como la microinyección delDNA directamente en el núcleo o el bombardeo de la célulacon microproyectiles en forma de partículas de oro o tungs-teno recubiertas con el DNA recombinante. En el caso de losvegetales, también se puede utilizar una estrategia natural detransformación basada en el empleo del plásmido Ti de la bac-teria Agrobacterium tumefaciens, que en la naturaleza trans-forma células vegetales generando tumores. Para ello, se eli-minan de dicho plásmido las secuencias que codifican lasproteínas implicadas en el desarrollo tumoral y se sustituyenpor un marcador de resistencia y por el gen transgénico quese quiere expresar. Como en el caso de la transfección, a con-tinuación se sigue el proceso de transformación que se da enla naturaleza.

El DNA recombinante funciona cuando la célula trans-formada expresa la proteína o las proteínas correspon-dientes a los genes presentes en él. Las proteínas recombi-nantes sólo se expresan en cantidades apreciables si,además de los genes, se incluye toda una serie de señalesadicionales que permiten la transcripción y la traducción dedicha información genética. Estas secuencias son los pro-4

C O M P O S I C I Ó N Y C A L I D A D N U T R I T I VA D E L O S A L I M E N T O SIITOMO

motores, las secuencias génicas que permiten la unión delos mRNA a los ribosomas y las señales de terminación (cap.5, Síntesis, degradación y recambio de las proteínas, tomoI, y cap. 6, Regulación de la expresión génica en organismoseucariotas, tomo I). A veces, se generan problemas si el genrecombinante contiene intrones o ciertas señales que ac-túan de terminadores en el hospedador bacteriano. De estaforma, la proteína recombinante puede ser procesada o ple-gada incorrectamente o incluso ser degradada.

Mención aparte merece la producción de proteínas re-combinantes de uso en agroalimentación en sistemas mi-crobianos eucarióticos, fundamentalmente levaduras yhongos filamentosos. El uso de células animales es difícil,debido al hecho de que muchas de ellas necesitan una su-perficie para crecer y tienen necesidades nutritivas com-plejas. Sin embargo, algunas proteínas son demasiado com-plejas para poderse producir en bacterias. Sufren procesosde modificación química (acetilaciones, glucosilaciones) yobligatoriamente tienen que utilizarse células eucarióticaspara producirlas correctamente.

n Clonado molecular

Un clon es una población de moléculas, bacterias, cé-lulas o individuos idénticos que derivan de un ancestrocomún. El clonado molecular permite la producción de grannúmero de moléculas idénticas de DNA. Esta técnica sebasa en la posibilidad de construir moléculas de DNA híbridoo moléculas quiméricas utilizando vectores de clonado,como plásmidos, fagos, cósmidos o cromosomas artificiales,que se pueden replicar de forma autónoma en una célulahospedadora utilizando sus propios sistemas de control. Deesta manera se puede amplificar el DNA quimérico.

Cualquier procedimiento de clonación tiene cuatro partesesenciales: a) un método de obtención de fragmentos deDNA; b) la unión del DNA a un vector, con la consiguiente ob-tención del DNA recombinante; c) la introducción del DNA re-combinante en un hospedador, y d) la disponibilidad de unmétodo de selección del clon que ha adquirido el DNA re-combinante. La figura 19-1 ilustra el procedimiento generalde obtención de DNA recombinante y la figura 19-2, el declonado de DNA.

Para la obtención de fragmentos de DNA se utiliza prefe-rentemente la digestión con enzimas de restricción (v. En-zimas de restricción, más adelante), pero también se puedenobtener por rotura mecánica, síntesis de cDNA y síntesis quí-mica directa de oligonucleótidos. La unión al vector (v. Vec-tores de clonación, más adelante) se lleva a cabo mediante laligación de extremos cohesivos, la ligación de extremosromos, el encolado mediante homopolímeros o el empleo demoléculas espaciadoras, utilizando varias enzimas (v. Ligadode fragmentos de DNA y Otras enzimas de interés en la tec-nología del DNA recombinante, más adelante).

La introducción del DNA recombinante se lleva cabo me-diante procedimientos de transformación bacteriana conDNA plasmídico, transducción con fagos o cósmidos y, enel caso de células eucariotas, mediante transformación o 5

19CAPÍTULO


transfección con vectores diversos (v. Vectores de clona-ción, más adelante). La selección de los clones se realizamediante métodos microbiológicos, inmunoquímicos y dehibridación con ácidos nucleicos

n Enzimas de restricción

Las endonucleasas son enzimas que cortan el DNA en se-cuencias específicas dentro de la molécula, en oposición alas exonucleasas, que digieren los extremos terminales delas moléculas de DNA. Un tipo de endonucleasas, denomi-nadas genéricamente enzimas de restricción porque su pre-sencia en una bacteria determinada restringe el crecimientode bacteriófagos, representa una herramienta clave en la tec-nología del DNA recombinante. Estas enzimas cortan el DNAde cualquier origen en secuencias muy específicas, al con-trario que otras enzimas o métodos químicos o físicos que lohacen al azar. En la naturaleza protegen a la bacteria hospe-dadora de la infección por fagos, impidiendo la replicación delDNA foráneo. Actualmente se conocen miles de estas en-zimas, así como la secuencia específica de corte. Las enzimasde restricción están acompañadas en las células de otras en-zimas que metilan el DNA del hospedador, lo que impide la di-gestión por la propia enzima de restricción. Así, las metilasasespecíficas de sitio y las enzimas de restricción siempre estánen las bacterias de forma apareada.

Las enzimas de restricción se denominan mediante va-rias letras que hacen mención a la bacteria de la que pro-ceden. Las tres primeras letras sirven para nombrar el género(primera letra) y la especie (segunda y tercera letras). Estaspueden ir seguidas de una letra que designa la cepa y de unnúmero romano que indica el orden del descubrimiento. Porejemplo, EcoRI se ha obtenido de la cepa R de la bacteria Es-cherichia coli, y BamHI, de la cepa H de Bacillus amylolique-faciens. La enzima EcoRII se obtuvo después de la EcoRI(tabla 19-1).

Cada enzima de restricción corta una secuencia especí-fica de DNA de doble cadena de 4 a 7 pares de bases (pb),dando lugar a la aparición de extremos romos, como es elcaso de EcoRII o HpaI o de extremos solapantes o cohesivos,por ejemplo BamHI. La figura 19-3 muestra el mecanismo deacción de la enzima de restricción EcoRI. Teniendo en cuentaque el DNA está constituido por cuatro bases diferentes (A, C,G y T), una enzima de restricción que reconoce una secuenciade 4 pb corta una media de cada 44 pb (256 pb) y una que re-conoce una secuencia de 6 pb corta cada 46 pb (4.096 pb). Porlo tanto, se puede elaborar en una determinada secuencia ofragmento de DNA un mapa de restricción utilizando variasenzimas. Los fragmentos producidos pueden separarse y, pos-teriormente, aislarse por electroforesis en gel de agarosa opoliacrilamida, siendo éste un paso esencial para la clonación.

n Ligado de fragmentos de DNA

El ligado de fragmentos con extremos cohesivos es teóri-camente muy sencillo, ya que después del apareamiento, la

enzima DNA ligasa une los fragmentos complementarios delos DNA heterólogos, dando lugar a la formación de una mo-lécula de DNA recombinante (fig. 19-4). Sin embargo, los ex-tremos de un vector pueden reconectarse por sí mismos des-

pués del tratamiento con una enzima de restricción. Asi-mismo, también pueden aparearse formando concatémerosheterogéneos. Para solventar estos problemas se usan dilu-ciones extremas de los fragmentos. En el caso de moléculas

6


Figura 19-1. Obtención de DNA recombinante. T4 DNA ligasa: DNA ligasa procedente del bacteriófago T4.

LigaciónProductos de la mezcla de ambos DNAcon T4 DNA ligasa

DNA complejo portadordel fragmento de interés

DNA vector

DNA enteros

DNA digeridos

Molécularecombinante

Figura 19-2. Procedimiento general de clonado de DNA.

Purificacióndel DNA

Digestión

Ligación

Transformación

Selección de clonestransformantes

Detección de clonesrecombinantes

Célula que contieneel DNA de interés

Escherichia coli K12portadora del vector

Escherichia coli K12para transformar

Célulascompetentes

rificaci

1

gestión2

igación

3

sformac

4

ción de

5

ón de cl

6

In vitro In vivo

con extremos romos se añaden nuevas colas de polinucleó-tidos a los extremos 3’. Esta enzima se denomina transferasaterminal. Por ejemplo, si se añade poli-dG al extremo 3’ de unvector y poli-dC al extremo 3’ del DNA, se aparearán entre sí.Este procedimiento se denomina encolado homopolimérico.

También se pueden unir segmentos sintéticos de DNA dedoble cadena con extremos romos, que contienen uno o mássitios específicos para enzimas de restricción, denominados

espaciadores o polilinkers, a los extremos del DNA de cualquierfragmento utilizando la DNA ligasa procedente del bacterió-fago T4. Esta técnica permite unir cualquier par de extremos,aunque no existe control de la orientación de la inserción o delnúmero de moléculas apareadas consigo mismas.

n Otras enzimas de interés en la tecnologíadel DNA recombinante

En la tecnología del DNA recombinante se utiliza otra seriede enzimas cuyas funciones se detallan a continuación.

La fosfatasa alcalina desfosforila los extremos 5’ delRNA y del DNA. Se utiliza para eliminar los grupos 5’-fos- 7

19CAPÍTULO


Figura 19-3. Mecanismo de acción de la enzima de res-tricción EcoRI y su aplicación en la generación de molé-culas de DNA recombinante.

Sitio de reconocimiento

Tratamiento con EcoRI

Colas complementariasA - A - T - T - C

G - A - A - T - T - C

C - T - T - A - A - G

C - T - T - A - A

3’

3’ 5’

3’

5’

5’

3’

5’ G

G

C

G

T

A

T

A C

G

T

A

T

A C

G

T

A

T

A C

G

T

A

T

A

C

G

T T A A

A A C

G

T T

C

G

T T A A

A A C

G

T T

EcoRI

Generación deextremos cohesivos

Extremo cohesivo

DNA recombinante

Tabla 19-1 Enzimas de restricción y secuencias de corte del DNA

Endonucleasa Secuenciade corte Fuente bacteriana

BamHI ↓

AGATCTTCTAGA

↑

Bacillusamyloliquefaciens H

BgIII ↓

AGATCTTCTAGA

↑

Bacillus globigii

EcoRI ↓

GAATTCCTTAAG

↑

Escherichia coli RY13

EcoRII ↓

CCTGGGGACC

↑

Escherichia coli R245

HindIII ↓

AAGCTTTTCGAA

↑

Haemophilus influenzae Rd

HhaI ↓

GCGCCGCG↑

Haemophilus haemoliticus

HpaI ↓

GTTAACCAATTG

↑

Haemophilusparainfluenzae

MstII ↓

CCTNAGGGGANTCC

↑

Microcoleus strain

PstI ↓

CTGCAGGACGTC↑

Providentia stuartii 164

TaqI ↓

TCGAAGTC

↑

Thermus aquaticus YTI

A: adenina; C: citosina; G: guanina; T: timina. Las flechas muestran elsitio de corte. Según el sitio de corte se forman extremos romos (p.ej., HpaI) o extremos cohesivos (p. ej., BamHI).

fato y prevenir así la autoligación de fragmentos de DNA.La nucleasa BAL-31 degrada tanto el extremo 5’ como el 3’de moléculas de DNA, provocando el acortamiento progre-sivo de los fragmentos. Se utiliza para generar subfrag-mentos de secuenciación y también para localizar genesconcretos. La DNA polimerasa I sintetiza la formación deDNA de doble cadena a partir de una hebra simple de DNAque sirve como modelo. Se utiliza para la síntesis de cDNA,la eliminación de mellas y la generación de extremosromos a partir de extremos cohesivos. La enzima DNasa Ibajo condiciones apropiadas produce mellas en el DNA yse utiliza en el mapeado de sitios hipersensibles del DNAy en el mapeado de lugares de interacción del DNA conproteínas. La exonucleasa l elimina nucleótidos del ex-tremo 5’ y la exonucleasa II elimina nucleótidos del ex-tremo 3’. Ambas se usan en la secuenciación del DNA. Lapolinucleótido quinasa transfiere fosfatos terminales enposición l desde el adenosintrifosfato (ATP) hasta losgrupos hidroxilo en 5’ del DNA o del RNA y se utiliza en elmarcado con el isótopo 32P del DNA o del RNA. La trans-criptasa inversa sintetiza DNA a partir de RNA y se usapara sintetizar cDNA a partir de RNA y para el mapeado deregiones 5’ del RNA. Finalmente, la nucleasa S1 degradael DNA de cadena simple y se utiliza en la eliminación debucles en la síntesis de cDNA y en el mapeado de las re-giones 5’ y 3’ del RNA.

n Vectores de clonación

Los vectores de clonación son plásmidos o fagos o varia-ciones de ellos. Los plásmidos son moléculas de DNA de

doble cadena circulares cuya función natural más impor-tante es conferir ventajas adaptativas a las células que loscontienen. Los plásmidos tienen varias propiedades quehacen que sean muy útiles como vectores de clonado. Porejemplo, están presentes en las bacterias como copias úni -cas o múltiples que se replican independientemente delDNA bacteriano. Actualmente se conoce la secuencia com-pleta de numerosos plásmidos, así como la localización pre-cisa de los sitios de corte para diferentes enzimas de restric-ción y, por lo tanto, los lugares en los que es posible insertarDNA de otros organismos. Además, los plásmidos, al tenerun tamaño muy distinto al del cromosoma bacteriano,pueden aislarse con facilidad. La figura 19-5 muestra elmapa de restricción del plásmido pBR322 de E. coli, y la fi-gura 19-6, la inserción de DNA extraño en un plásmido.

Los fagos son virus que atacan bacterias y están consti-tuidos usualmente por moléculas de DNA lineal, con variossitios de corte para enzimas de restricción específicas enlos cuales puede insertarse el DNA foráneo, de forma que elconjunto se empaqueta en la cabeza proteica del virus. ElDNA quimérico formado puede recogerse después de quese complete el ciclo de lisis celular, de modo que se pro-duzcan numerosas partículas infectivas. La ventaja de losfagos como vectores en el clonado molecular de DNA esque pueden aceptar fragmentos de DNA de 10-20 kpb,mientras que los plásmidos tan sólo pueden aceptar frag-mentos de 6-10 kpb.

Los cósmidos son plásmidos que contienen unas secuen-cias específicas, denominadas cos, necesarias para el empa-quetamiento del DNA del fago l dentro de su cabeza. Estosplásmidos combinan las ventajas de los propios plásmidos yde los fagos, ya que crecen dentro de la bacteria como plás-8


Figura 19-4. Ligado de DNA heterólogo y formación de DNA recombinante.

C - T - T - A - A

G

C - T - T - A - A

G

G - A - A - T - T - C

C - T - T - A - A - G

G - A - A - T - T - C

C - T - T - A - A - G

A - A - T - T - C

G

A - A - T - T - C

G

C - T - T - A - A

G A - A - T - T - C

G

-

-

Digestión con EcoRI Digestión con EcoRI

Hibridación de fragmentoscomplementarios

Hueco

Hueco

DNA ligasa

midos, pero pueden almacenar una cantidad mucho mayorde DNA dentro de la cabeza del fago, ya que la mayor partedel genoma del fago l ha sido eliminada. Usualmente los cós-midos pueden llevar insertos de hasta 50 kpb.

Otro tipo de vector de clonación son los cromosomasartificiales de levaduras (yeast artificial chromosome, YAC).Pueden llevar insertos mucho más grandes, ya que se tratade segmentos cromosómicos de levaduras, por lo tanto line-ales, que contienen la región centromérica, siendo segre-gados de manera muy estable de acuerdo con patronesmendelianos. Los YAC permiten clonar segmentos de DNAde más de 40 kpb, incluso hasta cientos de kpb y, por lotanto, la amplificación de grandes moléculas de DNA con unfondo genético simple. En las levaduras, además de losYAAC, se utiliza para la clonación toda una serie de plás-midos (episómicos, centroméricos, etc.).

Para la inserción y expresión del cDNA en células demamíferos se han desarrollado vectores específicos ba-sados en virus animales, por ejemplo adenovirus, que tie -nen genomas DNA, y retrovirus, que tienen genomas RNA.Aunque estos vectores tienen limitaciones en cuanto a lalongitud de los insertos, son capaces de infectar numerosostipos celulares y permiten la expresión eficiente de genescomplejos.

Un tipo especial de vector es el constituido por los de-nominados vectores de expresión. Permiten la expresión deuno o varios genes introducidos con el inserto de DNA.Estos vectores están construidos de manera que, por unlado, contienen promotores muy activos fácilmente induci-bles y, por otro, codones adecuados que permiten el iniciode la traducción en fase de los RNA correspondientes. Tam-bién contienen señales para la terminación de la transcrip-ción y de la traducción y para el procesamiento de las pro-teínas (cap. 5, Síntesis, degradación y recambio de las

proteínas, tomo I, y cap. 6, Regulación de la expresión génicaen organismos eucariotas, tomo I).

n Selección del DNA recombinante

Como anteriormente se indicó, todos los vectores llevanun marcador o propiedad genética seleccionable. Los plás-midos y los cósmidos llevan marcadores nutricionales o deresistencia a antibióticos u otros fármacos. En el caso de losfagos, la formación de placas de lisis representa en sí mismala propiedad seleccionada. En el caso de los DNA recombi-nantes que llevan un vector plasmídico con marcadores deresistencia a antibióticos, la selección de las células clonadasse realiza utilizando medios de cultivo que llevan añadidosdichos antibióticos, ya que en estos medios sólo crecen lasbacterias que llevan los plásmidos recombinantes.

La inactivación por inserción del DNA foráneo de unmarcador de resistencia a antibióticos o de un gen comola b-galactosidasa son ejemplos de cómo se puede selec-cionar una población de células recombinantes. Por ejem -plo, si en el conocido vector plasmídico pBR322, que tienecomo marcadores de resistencia los genes que codificanpara la resistencia a la tetraciclina (tet) y a la ampicilina(amp), se inserta un segmento de DNA foráneo en el sitioúnico de corte para la enzima de restricción PstI (ubicadoen el locus amp), las bacterias que incorporen este DNArecombinante serán resistentes a la tetraciclina pero sen-sibles a la ampicilina.

La detección por técnicas inmunoquímicas de clonesque sintetizan una nueva proteína es útil si el gen insertadose transcribe y traduce a proteína, especialmente cuandoel gen no confiere ninguna propiedad al hospedador fácil-mente seleccionable con otros métodos. Para utilizar esta

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19CAPÍTULO


Figura 19-5. Características de los vectores de clonación. Se representa el plásmido pBR322 de E. coli que contiene un origende replicación, varios sitios de restricción únicos (EcoRI, HindIII, SalI) y dos marcadores de resistencia a antibióticos (ampi-cilina y tetraciclina). Amp: ampicilina; Tet: tetraciclina.

EcoRI

Ampr Tetr

PstI SalI

ColE1ori

pBR3224,4 kb

Ampr

ColE1ori

Tetr

Sal

pBR3224,4 kb

• Con sitios únicosde restricción parapoder clonar en ellos

• Con un marcadordirectamenteseleccionable(selección)

• Con un marcadorque se inactivepor la introduccióndel inserto(detección)

• Pequeñas moléculas de DNA autorreplicativas(plásmidos o genomasfágicos)

HindIII

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técnica, es necesario disponer del anticuerpo específicopara la proteína codificada en el transgén.

Finalmente, es posible acudir a los métodos de hibrida-ción con ácidos nucleicos para la selección de recombi-nantes. El procedimiento consiste en detectar secuenciasdeterminadas de DNA en colonias transformadas por hibri-dación in situ con sondas radiactivas o marcadas con un fluo-róforo de fragmentos de DNA del gen que se quiere detectar.Este método es capaz de identificar una colonia positivaentre miles de negativas. Una gran ventaja de los métodos dehibridación es que no requieren la expresión de los genesinsertados y puede aplicarse a cualquier secuencia.

n Librerías genómicas

La combinación de enzimas de restricción y de variosvectores de clonado permite el empaquetado del genomacompleto de cualquier organismo. La colección de clones

recombinantes que constituyen el genoma global se deno-mina genoteca o librería genómica. De forma similar, una li-brería de cDNA comprende todos los cDNA complementa-rios de la población de mRNA presentes en un organismo otejido determinado.

Las librerías genómicas se preparan por digestión par-cial del DNA genómico utilizando una enzima de restricción,con objeto de generar fragmentos suficientemente largosde DNA de manera que contengan genes completos in-tactos. Estos fragmentos se reinsertan en vectores que per-miten la inserción de fragmentos largos de DNA como losYAC o los vectores basados en el bacteriófago P1 de E. coli.

Para detectar la función de genes presentes en el cDNAde las librerías genómicas se utilizan vectores de expresión,algunos de ellos con genes que codifican para inhibidoresde proteasas, con lo que la producción de la proteína finalaumenta.

Las sondas marcadas con 32P o con una molécula fluo-rescente se utilizan para reconocer secuencias complemen-

Figura 19-6. Inserción de DNA extraño en un plásmido.

GAAT

CT

GA A T

CT

G A A T T C G A A T T C

GAAT TCGAAT TC

AA

T T C

G

AA

TT

CG

G

AA

T

C

T

G A

A

T

C

T

Plásmido DNA para serinsertado

Extremoscohesivos

Recombinacióny ligación de DNA

EcoRIEcoRI EcoRI

EcoRI EcoRI

EcoRI

DNArecombinante

T T A G G C G A A T A T G T 19 - media.axon.esmedia.axon.es/pdf/79407.pdf · los alimentos obtenidos por modificación genética se consi-deran nuevos alimentos por pertenecer a una

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