SYNTHESE EN ENZYMATISCHE GLYCOSYLERING VAN MONO- EN BICYCLISCHE 3-HYDROXY-Β- LACTAMEN Maarten Debruyne Stamnummer: 01305991 Promotor: Prof. dr. ir. Matthias D’hooghe en Prof. Dr. Tom Desmet Tutor: ir. Lena Decuyper en ir. Jorick Franceus Masterproef voorgelegd voor het behalen van de graad Master of Science in de bio-ingenieurswetenschappen: chemie en bioprocestechnologie Academiejaar: 2017 - 2018
90
Embed
SYNTHESE EN ENZYMATISCHE GLYCOSYLERING VAN MONO- EN ...
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
SYNTHESE EN ENZYMATISCHE
GLYCOSYLERING VAN MONO- EN
BICYCLISCHE 3-HYDROXY-Β-
LACTAMEN
Maarten Debruyne Stamnummer: 01305991
Promotor: Prof. dr. ir. Matthias D’hooghe en Prof. Dr. Tom Desmet
Tutor: ir. Lena Decuyper en ir. Jorick Franceus
Masterproef voorgelegd voor het behalen van de graad Master of Science in de bio-ingenieurswetenschappen:
chemie en bioprocestechnologie
Academiejaar: 2017 - 2018
De auteur en de promotoren geven de toelating deze Masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en
delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik.
Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de
verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze Masterproef.
The author and the promoters give the permission to make this Master dissertation available for consultation
and to copy parts of it for personal use.
Every other use is subject to the copyright law, more specifically the source must be extensively specified when
using results from this Master dissertation.
Gent, juni 2018
De promotoren, De auteur,
Prof. dr. ir. M. D’hooghe Prof. dr. T. Desmet Maarten Debruyne
Voorwoord De vijf jaar bio-ingenieur zijn voorbijgevlogen en zitten er nu (bijna) op. Deze Masterproef vormt het
sluitstuk van mijn opleiding. Ik kan eerlijk zeggen dat ik erg tevreden ben met het eindresultaat,
alhoewel de weg ernaar toe niet altijd even makkelijk was. Zonder de bijdrage van enkele personen
was dit niet mogelijk geweest en deze zou ik nu graag bedanken.
Ten eerste zou ik mijn promotors Prof. dr. ir. Matthias D’hooghe en Prof. dr. Tom Desmet willen
bedanken voor de kans om aan dit interessante en multidisciplinaire onderzoek te werken. Prof. dr. ir.
Matthias D’hooghe, dank voor de uitstekende begeleiding, de bemoedigende maandelijkse meetings
en uw lessen in de tweede bachelor die bij mij de interesse voor de organische chemie hebben gewekt.
Mijn begeleiders, Lena en Jorick, enorm bedankt voor de ongelofelijk goede begeleiding. Lena, je stond
steeds klaar om alle vragen, hoe klein ook, te beantwoorden. Jouw werkersmentaliteit heeft mij zeker
ook aangespoord om er het meeste uit te halen. Hoewel ik je verbetergeduld af en toe wel op de proef
zal gesteld hebben, wil ik je zeker ook bedanken om zoveel na te lezen en alle fouten eruit te halen.
Naast organische chemie en biokatalyse werden ook de dt-regels opgefrist! Daarnaast ook bedankt
voor alle praktische tips en ideeën. Jorick, dank om mij met je aanstekelijke enthousiasme in te leiden
in de wereld van de biokatalyse. Je stond altijd klaar om nieuwe dingen met veel geduld aan mij uit te
leggen en dat heb ik zeer geapprecieerd.
Ook aan de andere doctoraatsstudenten een welgemeende dankjewel om vragen te beantwoorden,
te helpen met praktische moeilijkheden en ons gerust te stellen. Speciale dank aan Sari, om ons steeds
op te peppen en aan Tim, om een dosis (soms flauwe) humor met het labowerk te combineren.
Mijn medethesisstudenten, we hebben ongelofelijk veel tijd samen doorgebracht en ik denk dat we
allemaal er niet waren geraakt zonder elkaar. Ik ben blij dat ik jullie heb leren kennen en dat we samen
hebben kunnen lachen (en klagen). Marie en Daan, bedankt voor ons vele gelach en gebabbel, het
labowerk werd veel plezanter (soms te) als we samen waren.
Verder wil ik mijn vrienden (tsjoerels en tsjoerelina’s) bedanken om mijn studententijd zo leuk te
maken. Ook in dit laatste drukke jaar heb ik nog vele mooie momenten kunnen beleven met jullie,
waarvoor ik enorm dankbaar ben.
Mama en Anne, bedankt om er altijd voor mij te zijn en mij te steunen doorheen deze vijf jaar. Als
laatste: dank aan de katjes, omdat jullie zo ongelofelijk leuk zijn.
Maarten Debruyne, 6 juni 2018
Inhoudstabel 1 Situering en doel ............................................................................................................................... 1
massaspectrometrie (MS), antilichamen, capillaire elektroforese… maken geen deel uit van dit
overzicht, en hiervoor wordt dan ook verwezen naar de betreffende literatuur.50,53,54 De meest
conventionele methoden betreffen chromatografie, optische methoden en nucleaire magnetische
resonantie (NMR).55
Literatuurstudie
10
2.1.2.1 Chromatografie
Chromatografie wordt al tientallen jaren gebruikt om enantiomeren te scheiden en zo ook de ee te
bepalen. Er zijn twee verschillende manieren om enantiomeren te scheiden via chromatografie: direct
of indirect. Bij directe chirale scheiding wordt het analiet in een chirale omgeving geplaatst. Hiervoor
moet er dus een bepaalde chirale selector in de mobiele of stationaire fase aanwezig zijn. Dit is typisch
een chirale stationaire fase (CSP). Bij indirecte chirale scheiding wordt het analiet gederivatiseerd met
een chiraal reagens om diastereomeren te vormen.54 Chirale chromatografie kan uitgevoerd worden
met een vloeibare, superkritische of een gasvormige mobiele fase: vloeistofchromatografie (LC),
superkritische vloeistofchromatografie (SFC) of gaschromatografie (GC). Chirale high performance
liquid chromatography (HPLC) heeft als nadeel tijdrovend te zijn met een typische analysetijd van tien
minuten per staal. Bovendien zijn er dure kolommen nodig en verliezen de kolommen hun resolutie
met de tijd. Er zijn meerdere kolommen nodig om verschillende klassen verbindingen te analyseren,
en er is methodeontwikkeling of optimalisatie nodig voor elke klasse analiet.54 Chirale SFC is
vergelijkbaar met HPLC, maar gebruikt een superkritisch gas, typisch CO2, als mobiele fase, hetgeen
leidt tot snellere analysen.54 Chirale GC heeft in vergelijking met HPLC een hogere efficiëntie,
gevoeligheid, reproduceerbaarheid en leidt tot snellere analysen. GC is echter minder universeel
toepasbaar want de analieten moeten geëvaporeerd worden, hetgeen enkel mogelijk is voor volatiele
en thermisch stabiele producten. Daarenboven degraderen en racemiseren de chirale stationaire fasen
sneller bij de hogere werkingstemperaturen in GC.54 Ook chirale dunnelaagchromatografie (TLC)
bestaat, hetgeen gebruikt kan worden om snel en goedkoop de enantiomere zuiverheid van een
verbinding te analyseren, met als nadeel de lagere resolutie en hogere detectielimieten in vergelijking
met HPLC, SFC of GC.56
2.1.2.2 Optische methoden
Met bepaalde optische methoden kan onmiddellijk de ee van een mengsel enantiomeren gemeten
worden zonder de enantiomeren te scheiden. Hiervoor kunnen detectoren gebaseerd op optische
rotatie (OR) of circulair dichroïsme (CD) gebruikt worden. Deze kunnen ook als supplementaire
detectoren gebruikt worden in chirale chromatografie, naast de typisch voorkomende UV-detectoren.
CD- en OR-detectoren reageren wel selectief op chirale componenten, in tegenstelling tot UV-
detectoren.57 Detectoren gebaseerd op optische rotatie meten de rotatie van gepolariseerd licht
wanneer dat licht door een oplossing met de chirale verbinding gestuurd wordt. OR-detectoren zijn
universeel. Er is geen chromofoor voor nodig, maar ze zijn wel afhankelijk van
temperatuurschommelingen en solventveranderingen. Detectoren gebaseerd op circulair dichroïsme
meten de absorptieverschillen tussen rechts en links gepolariseerd licht, zijn onafhankelijk van
temperatuurs- of solventveranderingen en meten absorptie, waardoor er dus wel een chromofoor in
het analiet nodig is.57 Geïnduceerd circulair dichroïsme vormt een oplossing hiervoor. Analieten
worden hierbij gederivatiseerd om een sterker signaal te bekomen. Chromofore groepen worden op
Literatuurstudie
11
de chirale molecule geplaatst, hetgeen metingen op zeer kleine hoeveelheden materiaal toelaat. Dit
wordt het meest toegepast bij alcoholen en aminen die dan met sterk absorberende groepen worden
geacyleerd.50
2.1.2.3 NMR
Enantiomeren in een achirale omgeving vertonen dezelfde chemische shift. Daarom moeten ze in een
chirale omgeving worden geplaatst of gederivatiseerd worden opdat hun chirale overmaat via
integratie van de NMR-signalen kan worden bepaald. Dergelijke derivatisering kan door reactie met
optisch zuivere reagentia, waardoor diastereomeren gevormd worden die wel een verschillende
chemische shift hebben. Hierbij is het essentieel dat beide enantiomeren even goed reageren met het
chiraal reagens en er geen racemisatie tijdens de reactie optreedt. Er kunnen echter ook bepaalde
additieven worden toegevoegd die voor een chirale omgeving zorgen. Dit zijn optisch zuivere stoffen
die binden met het substraat door intermoleculaire niet-covalente interacties. De hierdoor gevormde
complexen zijn wederom diastereomeren en dus detecteerbaar via NMR.58
2.2 Chirale discriminatie door CAZymes
Er is nog niet veel onderzoek gevoerd naar de chirale voorkeur van CAZymes bij glycosyleringsreacties.
In dit literatuuroverzicht zal de huidig beschikbare kennis besproken worden. Eerst wordt een
overzicht gegeven van de verschillende CAZymes en dan zal hun enantioselectiviteit besproken
worden.
2.2.1 Glycosylering door CAZymes
Er zijn vier types koolhydraatactieve enzymen (CAZymes) bruikbaar voor glycosyleringsreacties:
glycosidehydrolasen (GH’s), transglycosidasen (TG’s), glycosidefosforylasen (GP’s) en de ‘Leloir’
glycosyltransferasen (GT’s). De GT’s katalyseren in vivo glycosyleringsreacties gebruik makend van
geactiveerde suikers als donor. De GH’s en GP’s hebben in vivo enkel een katabolische functie. In vivo
hydrolyseren GH’s glycosidische bindingen, hetgeen dus de transfer inhoudt van het afgesplitste
glycosyldeel naar water als acceptor. De GP’s doen hetzelfde maar dan met fosfaat als acceptor.
In vitro echter kunnen deze enzymen wel aangewend worden voor synthese, hetgeen verder in meer
detail besproken zal worden.37 TG’s transfereren een glycosylgroep van de ene koolhydraatketen naar
een andere. In vitro kunnen zij ook glycosylgroepen transfereren naar andere acceptoren. TG’s zijn
interessant vanwege hun goedkope donorsubstraten, maar ze hebben echter een kleine
substraatspecificiteit.37,59
Literatuurstudie
12
2.2.2 Enantioselectiviteit van glycosyltransferasen
Glycosyltransferasen zijn de enzymen die in de natuur aangewend worden om substraten te
glycosyleren. GT’s gebruiken geactiveerde glycosyldonors zoals nucleotide-geactiveerde suikers,
bijvoorbeeld UDP-glucose 47. Vaak zijn ze zeer gevoelig voor bepaalde omgevingsomstandigheden. Ze
zijn daarentegen zeer selectief, met hoge regio- en stereoselectiviteiten en geven vaak aanleiding tot
hoge rendementen.37,60 Ook zijn er reacties bekend waarbij GT’s discrimineren tussen enantiomeren
van racemische alcoholen met grote selectiviteit, zoals hieronder in meer detail wordt besproken. In
wat volgt zullen steeds algemene overzichtsschema’s worden gegeven; voor meer details wordt
verwezen naar tabel 2.
2.2.2.1 Glucosylering van secundaire alcoholen door GTF-I en GTF-II
In onderzoek van de groep van Shimoda et al. werden racemische secundaire alcoholen butaan-2-ol
48, octaan-2-ol 49, 1-fenylethanol 50, trans-1,2-cyclohexaandiol 51 en 1,2-trans-2-isopropyl-5-
methylcyclohexanol 52 door twee verschillende glucosyltransferasen geglucosyleerd tot hun (R)- en
(S)-glucosiden (R)-(48-52)βG en (S)-(48-52)βG. De gebruikte GT’s betroffen GTF-I uit Catharanthus
roseus en GTF-II uit Nicotiana tabacum. De diastereomere overmaat en absolute configuratie van het
aglycon werden bepaald door vergelijking van de NMR-integraties van het enzymatisch product met
die van de diastereomeer zuivere producten bekomen door chemische synthese uit optisch zuivere
alcoholen. Voor beide enzymen werden hoge de’s bekomen: 78-99% voor GTF-I en 90-100% voor GTF-
II. Beide enzymen kunnen dus gebruikt worden om de glycosiden van het (R)- (GTF-I) en het (S)- (GTF-
II) alcohol selectief te bekomen.
De enantioselectiviteit wordt zowel door het enzym als het substraat beïnvloed. Substraten met
grotere R-groepen geven aanleiding tot hogere de’s. Bij gebruik van ruwe enzympreparaten daalde de
enantioselectiviteit. Voor GTF-I bijvoorbeeld werden er dan de’s van 57-65% bekomen. De
aanwezigheid van onzuiverheden zoals glucosidasen of andere glucosyltransferasen in het ruwe
enzympreparaat zouden hiervoor verantwoordelijk zijn. Met dit onderzoek werd aangetoond dat GT’s
gebruikt kunnen worden om diastereomeer zuivere glucosiden en enantiomeer aangerijkte secundaire
Literatuurstudie
13
alcoholen aan te maken.61 Optisch zuiver fenylethanol 50 en derivaten hiervan zijn belangrijke chirale
synthons voor de synthese van farmaceutica, agrochemicaliën en natuurproducten.62,63
2.2.2.2 Resolutie van abscisinezuur gebruik makend van een Arabidopsis glycosyltransferase
Abscisinezuur (ABA) 53 is een plantenhormoon dat fysiologische processen, gerelateerd met
ontwikkeling en stress in planten, regelt.64 Via conventionele chemische synthese wordt een racemisch
mengsel bekomen.65–67 Een enantioselectieve synthese via de resolutie van diastereomere kristallen is
echter ook bekend.68 De vorm die van nature in de plant voorkomt, is het (+)-enantiomeer.69 ABA-
glycosylering is in planta een manier om de hormonale homeostase te controleren, en glycosylering
zou een manier zijn om ABA doorheen de plant te transporteren.70 Lim et al. ontdekten acht enzymen
in Arabidopsis thaliana die in staat waren om in vitro ABA te glucosyleren. Voor alle acht enzymen
werd na enzymatische glucosylering het glucose-ester 54 afgezonderd en terug gehydrolyseerd. Het
aldus bekomen product werd geanalyseerd via chirale HPLC. Zo werd het enzym UGT71B6 ontdekt,
hetgeen in staat was selectief (+)-ABA te glucosyleren. Dit enzym werd dan gebruikt in een whole cell
biokatalysesysteem om (+)-ABA te bekomen met een ee van 84%. Glucosylering met het zuivere enzym
(dus niet in een levende cel) leverde een nog iets hogere ee van op: 92%. Deze synthese vormt met
andere woorden een aantrekkelijk alternatief voor de conventionele resolutie om enantiomeer zuiver
ABA te bekomen.71,72
Literatuurstudie
14
2.2.2.3 Resolutie van tetrahydroprotoberberinen
Tetrahydroprotoberberinen (THPB’s) zijn alkaloïden geïsoleerd uit bepaalde Chinese kruiden. THPB’s
vertonen een unieke activiteit ten opzichte van dopaminereceptoren in het centraal zenuwstelsel en
hebben daarom een groot potentieel naar pijnbestrijding toe.34 Racemisch 55, een THPB, werd door
middel van een whole cell biotransformatie door Gliocladium deliquescens NRRL1086 selectief
geglycosyleerd. Het glycoside van het (S)-enantiomeer, (S)-55βG, werd bekomen met hoge
selectiviteit. Deze glycosylering vormt een nieuwe route naar optisch zuivere THPB’s en hun
glycosiden. De gevormde diastereomeren werden gescheiden via kolomchromatografie en zo werd
een de van 81% bekomen. Opmerkelijk is de invloed van de glucoseconcentratie van het medium op
deze omzetting. Bij hogere concentraties werd meer van het (R)-55βG gevormd en daalde de de. Bij
het gebruik van een 1-2% glucosemedium werd een de van 81% bekomen, bij 2,5-3% daalde deze tot
25%. Dit is de eerste keer dat er werd waargenomen dat de enantioselectiviteit van een glycosylering
afhangt van de suikerconcentratie in het medium. Om na te gaan welk soort enzym verantwoordelijk
is voor deze glycosylering, werden glycosyltransferasen en glycosidasen selectief geïnhibeerd door
respectievelijk natriumdodecylsulfaat (SDS) en imidazool. SDS inhibeerde de glycosylering en
imidazool had geen invloed. Ook werd er bij endogeen toevoegen van de glycosiden (S)-55βG en (R)-
55βG aan het medium geen hydrolyse gedetecteerd. Een GT zou dus verantwoordelijk zijn voor deze
glycosylering, maar het specifieke enzym is nog niet gekarakteriseerd.73
2.2.2.4 Enantioselectieve galactosylering door het β-1,4-galactosyltransferase
Er is al veel onderzoek verricht naar synthetische routes om enantiomeer zuivere conduritolen 56
(5-cycohexeen-1,2,3,4-tetraolen) te bekomen. Deze verbindingen zijn nuttige precursoren voor de
synthese van cyclische polyolen en hun biologisch actieve derivaten.74 Conduritol B epoxide 57,
bijvoorbeeld, is een belangrijke inhibitor van glycosidasen.75 Racemisch conduritol B 59 is eenvoudig
te synthetiseren vanuit myo-inositol 58. De chemische synthese van optisch zuiver conduritol B 59 is
echter minder eenvoudig, vandaar de aanzienlijke interesse om deze verbinding op biokatalytische
wijze enantiomeer zuiver aan te maken.76–78
Literatuurstudie
15
De groep van Yu et al. rapporteerde een enzymatische galactosylering van conduritol B 59 waarbij
enkel de (-)-vorm (-)-59 reageerde. Deze reactie werd gekatalyseerd door het β-1,4-
galactosyltransferase (GalT)/α-lactalbumine complex. De absolute configuratie van het product werd
bepaald door analyse van de optische rotatie na hydrolyse van het glycoside. Deze enzymatische
glycosylering vormt aldus een route naar optisch zuivere glycosidase-inhibitoren en geglycosylereerde
inositolen.79
Met hetzelfde enzymsysteem kon ook N-(2,3-dihydroxypropyl)aceetamide 60 volledig regio- en
stereoselectief gegalactosyleerd worden.80,81
Literatuurstudie
16
2.2.3 Enantioselectiviteit van glycosidehydrolasen
In de natuur katalyseren GH’s enkel katabolische reacties, in vitro daarentegen kunnen GH’s
synthetisch worden gebruikt. In plaats van water wordt dan een andere molecule met een
hydroxylfunctie als acceptor voor de glycosylgroep gebruikt. Deze reactie kan verlopen onder
thermodynamische of kinetische controle.37 Onder thermodynamische controle wordt een suiker,
zoals glucose 61, gecondenseerd met een alcohol 62 met afsplitsing van water 64. Het evenwicht van
deze reactie ligt in fysiologische omstandigheden aan de hydrolysezijde. Dit evenwicht kan echter
verlegd worden naar de synthesezijde door het verwijderen van product, het vermijden van water of
het gebruik van een grote overmaat reagentia (principe van Le Châtelier). Deze reactie wordt een
omgekeerde hydrolyse genoemd.59
Onder kinetische controle worden geactiveerde donorsubstraten gebruikt, deze reacties worden
transglycosyleringen genoemd. De donors zijn dan glycosiden met een goede leaving group 65,
bijvoorbeeld 4-nitrofenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) 75. Dit laat snelle accumulatie van product
toe hoger dan de evenwichtsconcentratie.82 Over het algemeen leidt kinetische controle tot hogere
rendementen dan omgekeerde hydrolyse. Transglycosylering is enkel mogelijk met de retaining GH’s
aangezien deze een covalent enzym-substraatintermediair 66 vormen, hetgeen transglycosylering
toelaat. Nevenreacties zijn primaire hydrolyse, waarbij het intermediair 66 met water reageert, en
secundaire hydrolyse, waarbij het gewenste product 67 terug gehydrolyseerd wordt. Beiden houden
netto een hydrolyse van de donor 65 in.
GH’s zijn robuust, stabiel, hebben een absolute selectiviteit voor het α- of β-anomeer en een brede
substraatspecificiteit. De rendementen van de transglycosyleringsreacties zijn echter laag en de GH’s
zijn vaak niet regioselectief, hetgeen leidt tot mengsels van producten.37,51,59,83
Literatuurstudie
17
Aangezien glycosidehydrolasen zowel een synthetische reactie als een hydrolyse kunnen katalyseren,
kan de discriminatie tussen enantiomeren zowel in de synthetische als lytische richting plaatsvinden.
Ook voor enzymen als lipasen, esterasen, oxidoreductasen, nitrilasen… is dit het geval.84
In dit hoofdstuk zal de enantioselectiviteit bij glycosylering van chirale primaire alcoholen besproken
worden, gevolgd door de selectiviteit bij galactosylering van secundaire alcoholen, diolen en meso-
diolen. Ook de enantioselectiviteit van glucosidasen en de enantioselectiviteit bij de hydrolysereactie
worden nader bekeken.
2.2.3.1 Enantioselectiviteit bij glycosylering van primaire alcoholen
Algemeen geldt dat voor kinetische resolutie van chirale alcoholen glycosidasen typisch veel slechter
presteren dan bijvoorbeeld lipasen.83,85 Eén van de eerste voorbeelden van resolutie door een
glycosidase was dat van racemisch isopropylideenglycerol 69 door het E. coli β-galactosidase. Hierbij
werd enkel het (R)-glucoside bekomen.86 Dit bleek echter het geval door het selectief uitkristalliseren
van dit diastereomeer, en niet door de selectiviteit van het enzym zelf.87,88 Daarom moet ook aandacht
besteed worden aan de wijze van zuivering, aangezien dit de verhouding tussen diastereomeren kan
wijzigen.
Doorheen de loop van de reactie wordt er vaak een afname van de de waargenomen, hetgeen wordt
toegeschreven aan de snellere hydrolyse van het preferentieel gevormde diastereomeer.83,89
Daarentegen zou een geactiveerde donor zoals ONPG secundaire hydrolyse moeten verhinderen en
dus de enantioselectiviteit moeten verhogen. Bij galactosylering van de primaire alcoholen 69 en 70
werd dit fenomeen ook waargenomen. Glycosyleringen onder thermodynamische controle gaan door
tot een thermodynamisch evenwicht wordt bereikt, en dus wordt er hierbij minder enantioselectiviteit
verwacht.83
De enantioselectiviteit van glycosidasen bij glycosylering van primaire hydroxylgroepen is over het
algemeen zeer klein. In de literatuur zijn glycosyleringsreacties van isopropylideenglycerol 69,
1,2-propaandiol 72, glycerol 94 en 2,3-epoxypropanol 70 bekend, elk met verwaarloosbare
enantioselectiviteit.83 Björcklink en Godtfredsen namen bij de galactosylering van
isopropylideenglycerol 69 en 2,3-epoxypropanol 70 verschillende enantioselectiviteiten waar
naargelang de donor. Voor ONPG werd wel een zekere selectiviteit waargenomen (de = 50%), lactose
echter gaf aanleiding tot een 1/1-diastereomeer mengsel.87 Dit wijst erop dat de stereochemische
uitkomst van de reactie kinetisch gecontroleerd is, aangezien beide β-galactosyldonoren verschillende
kinetische eigenschappen (Km, Vmax) vertonen.60
Literatuurstudie
18
2.2.3.2 Enantioselectiviteit bij glycosylering van secundaire alcoholen
In onderzoek van Matsumura et al. werden verschillende secundaire alcoholen 48-50 en 71-74c
geglycosyleerd onder kinetische controle met ONPG 75 als geactiveerde donor. Vergelijking van de
chemische shift met deze van de zuivere (R)- of (S)-glycosiden en integraties van de NMR-signalen liet
toe de de’s te bepalen. De selectiviteit voor het (R)-enantiomeer steeg en het rendement daalde
wanneer de substituent op het secundaire alcohol groter werd. Bij hydroxybutanoaten echter, daalden
zowel de rendementen als de de’s wanneer de zijketens sterisch meer gehinderd waren. Deze waarden
waren maximaal na één uur en daalden daarna terug. De secundaire hydrolyse is namelijk ook
enantioselectief: het (R)-enantiomeer wordt sneller gehydrolyseerd. Ook de oorsprong van het enzym
blijkt een invloed te hebben op de enantioselectiviteit: het Aspergillus oryzae galactosidase vertoont
een vergelijkbare, maar minder uitgesproken enantioselectiviteit. Zo werd bijvoorbeeld voor
galactosylering van butaan-2-ol 48 een de van 21% bekomen, terwijl deze voor het E. coli
β-galactosidase 64% bedroeg.90
Literatuurstudie
19
2.2.3.3 Enantioselectiviteit bij galactosylering van diolen
De stereochemie van de transgalactosylering werd bestudeerd door Trincone et al. met propaan-1,2-
diol 72 als modelverbinding. Aangezien diolen twee reactieve hydroxylgroepen hebben, werden er
steeds mengsels bekomen. Voor galactosylering van de primaire hydroxylgroep werd er geen
enantioselectiviteit waargenomen. De secundaire hydroxylgroep daarentegen werd selectief
gegalactosyleerd met hoge selectiviteit voor het (S)-enantiomeer met het β-galactosidase van
Sulfolobus solfataricus (de = 90%).91 In analoog onderzoek door Crout et al. werd een lage selectiviteit
voor het (R)-enantiomeer waargenomen met het E. coli β-galactosidase en lactose als donor, zowel
voor het primaire als secundaire alcohol.88 Verder werd in het reeds aangehaalde onderzoek door
Matsumura et al., waarbij ook het β-galactosidase van E. coli werd gebruikt maar ONPG 75 als donor
voor het secundaire alcohol, een selectiviteit voor het (R)-enantiomeer waargenomen (de = 49%).90
Zoals eerder bevonden, is de enantioselectiviteit bij glycosylering van primaire alcoholen laag tot
onbestaande.
Trincone et al. galactosyleerden ook andere diolen 51, 72, 77-82 in dezelfde reactieomstandigheden.
Bij 1,2-diolen werden beide hydroxylgroepen steeds gegalactosyleerd en was er nooit
enantioselectiviteit voor galactosylering van het primaire alcohol.92
Literatuurstudie
20
Tot slot onderzochten Crout et al. de stereoselectiviteit van het E. coli β-galactosidase. Preferentie
voor galactosyltransfer naar de (R)-enantiomeren van chirale alcoholen werd geobserveerd, maar de
selectiviteit was niet erg uitgesproken. Er werd hier wel enige enantioselectiviteit bij galactosyltransfer
naar het primaire alcohol bekomen, maar deze was zeer klein (de = <1-8%). Butaan-1,3-diol 79 werd in
deze omstandigheden wel met enige selectiviteit gegalactosyleerd (de = 33%), terwijl de selectiviteit
voor propaan-1,2-diol 72 zeer laag was (de = 13%).88
2.2.3.4 Stereoselectiviteit bij de galactosylering van mesodiolen
Mesovormen of meso-isomeren zijn moleculen die niet chiraal zijn, hoewel ze wel over chirale centra
beschikken. Mesovormen zijn enantiotoop: bij reactie ervan ontstaan enantiomeren of
diastereomeren. Gais et al. galactosyleerden mesodiolen 83-87 tot hun overeenkomstige galactosiden,
hetgeen aanleiding gaf tot diastereomeren met een vrij grote diastereomere overmaat (50-90%).
Verschillende enzymen (het β-galactosidase van Aspergillus oryzae (AOβG) en E. coli (ECβG)), donoren
(lactose of fenyl-β-D-galactopyranoside (PhGal)) en solventsystemen (water of water/aceton (1/1))
werden gebruikt. De diastereomere overmaat werd bepaald door integratie van de NMR-signalen van
de anomere protonen of koolstofatomen.
Glycosylering van 83-85 met het AOβG in water gaf geen aanleiding tot enige stereoselectiviteit. Diol
85 bijvoorbeeld werd geglycosyleerd met een rendement van 45% en een de van 0%. Bij gebruik van
een water/acetonmengsel (1/1) werd er echter wel selectiviteit waargenomen.
Reactieomstandigheden zoals het solvent kunnen dus een grote invloed uitoefenen op de
enantioselectiviteit. Voor het ECβG werd er wel selectiviteit waargenomen bij gebruik van water als
solvent. De selectiviteit was echter voor het andere diastereomeer in vergelijking met het AOβG.
Verder werd er geen verschil waargenomen tussen geïmmobiliseerd of niet-geïmmobiliseerd ECβG.93
Literatuurstudie
21
2.2.3.5 Enantioselectiviteit van glucosidasen
Vic et al. onderzochten de enantioselectiviteit van het amandel-β-glucosidase onder
thermodynamische controle. Een racemisch mengsel van 1-fenylethanol 50 werd geglycosyleerd in
een rendement van 5% en een de van 43%. Glycosylering van racemisch trans-1,2-cyclohexaandiol 51
in dezelfde omstandigheden gaf echter geen aanleiding tot enige selectiviteit. De waargenomen
selectiviteit zou afkomstig zijn van hydrofobe interacties tussen de fenylgroep in 1-fenylethanol en een
aromatische bindingsplaats in het katalytisch centrum. Er werd echter ook selectiviteit voor één van
de diol-enantiomeren 51 verwacht aangezien het (1R,2R)-diolsysteem overeenkomt met de 3,4-
diolgroep van glucose. Dit werd hier echter niet waargenomen, terwijl bij andere enzymen wel
selectiviteit geïnduceerd wordt door de configuratie van de diolgroep, zoals verder wordt besproken.82
Itano et al. glucosyleerden racemisch trans-cyclohexaan-1,2-diol 51 met verschillende ruwe
enzympreparaten die commercieel beschikbaar zijn of gebruikt worden in de voedingsindustrie.
Voorbeelden zijn takadiastase, een ruw enzymmengsel geproduceerd door A. oryzae dat zijn
toepassing vindt als geneesmiddel om de koolhydraatvertering te bevorderen en hesperidinase en
naringinase, enzymmengsels geproduceerd door A. niger. Glycosylering van trans-cyclohexaan-1,2-diol
51 met takadiastase en maltose als donor gaf exclusief aanleiding tot één glucoside. Zuivering en
hydrolyse van dit glycoside gaf het (R,R)-51 in 21% rendement. Glycosylering met naringinase leverde
hetzelfde resultaat op. Met hesperidinase werden er echter twee glycosiden gevormd, dewelke niet
volledig gescheiden werden, en waarvan de de dus niet bepaald kon worden. Met cellobiose als donor
werden β-glycosiden 51βG gevormd, en werd er ook voor takadiastase en naringinase een selectiviteit
voor het (R)-enantiomeer waargenomen. Bij deze reacties werd er dus wel selectiviteit geïnduceerd
door de configuratie van de diolgroep. De configuratie van het glycolsysteem in het (R)-glucoside komt
overeen met het 3,4-glycol van het reducerend D-glucosedeel van de donor (cellobiose of maltose).94
Literatuurstudie
22
2.2.3.6 Enantioselectiviteit bij de hydrolyse van glycosiden
De voorbeelden hierboven tonen aan dat glycosidasen discrimineren tussen de verschillende stereo-
omgevingen van de te glycosyleren hydroxylgroep. Analoog betekent dit dat stereodiscriminatie ook
kan optreden tijdens de hydrolysereactie.60 In een studie door Werschkun et al. werden chemisch
gesynthetiseerde β-galactosiden (48, 69, 79, 88-90)βGal van verschillende racemische alcoholen 48,
69, 79, 88-90 onderworpen aan een enzymatische hydrolyse door β-galactosidasen van meerdere
bronnen, namelijk E. coli, Aspergillus oryzae, Kluyveromyces lactis en Bacillus circulans. Het
hydrolyseproduct was steeds enantiomeer aangerijkt en het β-galactosidase van E. coli vertoonde de
hoogste stereoselectiviteit. De selectiviteit steeg met hogere temperaturen en kortere reactietijden.
De galactosiden werden bereid via een Koenigs-Knorrglycosylering, hetgeen aanleiding geeft tot
diastereomeren in verschillende verhoudingen, waarmee dan ook moet rekening gehouden worden
om de enantioselectiviteit van de enzymen te bepalen.95
Tabel 1: Enantioselectiviteit bij de hydrolyse van galactosiden.
Aglycon dec (%) Geprefereerde
enantiomeer ee (%)
Gecorrigeerde
selectiviteit (Ecorr) Omzetting (%)
Isopropylideenglycerol 69 22 (S) R 46 7 40
Butaan-2-ol 48 20 (S) R 51 4,8 14
Pentaan-2-ol 88 11 (R) R 22 1,3 8
Propaan-2-ol 89 23 (R) R 5 0,5 63
Butaan-1,3-diola 79 9 (R) S 56 5,0 22
Butaan-1,3-diolb 79 23 (R) R 76 5,5 23
Pentaan-1,3-diola 90 0 R 24 1,9 41
Pentaan-1,3-diolb 90 8 (S) R 16 1,7 16 a en b Galactoside van respectievelijk het primaire en secundaire alcohol. c Van het chemisch gesynthetiseerde galactoside.
Een veelgebruikte strategie om optisch zuivere alcoholen of esters te bekomen is de kinetische
resolutie van alcoholen door lipasen. Analoog kan ook de resolutie van glycosiden door glycosidasen
toegepast worden.96 Een algemene strategie hiervoor zou zijn om een racemisch alcohol 91 chemisch
of enzymatisch te glycosyleren. De aldus bekomen glycosiden 92 kunnen dan met behulp van
glycosidasen gehydrolyseerd worden. In het ideale geval, met een volledig selectief enzym, wordt dan
het alcohol 91 en het glycoside 92 in respectievelijk optisch en diastereomeer zuivere vorm bekomen.
Literatuurstudie
23
Deze strategie werd uitgetest door Zarevúcka et al. om te trachten diastereomeer zuivere glycosidische
juvenogens te bekomen. Juvenogens zijn een klasse verbindingen die na activatie door in vivo
biochemische routes of omgevingsomstandigheden (vochtigheid, zuur, UV…) juveniel
hormoonactiviteit vertonen.97,98 Hiertoe werd het racemisch cis-alcohol 93 chemisch geglycosyleerd
via de Koenigs-Knorrsynthese, hetgeen na alkalische ontscherming van de acylgroepen glycosiden
93βGal en 93βG gaf. Deze werden dan gehydrolyseerd met een glycosidase, hetgeen resulteerde in
glycosiden (S,S)-93βGal, (R,R)-93βGal en (S,S)-93βG en alcoholen (R,R)-93 en (S,S)-93. De ee’s en de’s
werden bepaald door scheiding van de enantiomeren op een chirale kolom na hydrolyse van de
glycosiden. De bekomen de’s en ee’s waren te laag om optisch zuivere juvenogens 93βGal en 93βG te
synthetiseren.96
Literatuurstudie
24
2.2.4 Enantioselectiviteit van glycosidefosforylasen
Glycosidefosforylasen zijn vergelijkbaar met GH’s, maar ze gebruiken fosfaat in plaats van water als
acceptor. In vivo heeft dit als voordeel dat de energie van de glycosidische binding geconserveerd
wordt en zo één ATP molecule extra oplevert. In vitro is dit ook voordelig aangezien de hogere energie-
inhoud van de fosfaatbinding toelaat de reactie om te keren en te gebruiken voor synthese.59 Binnen
deze enzymklasse is enkel onderzoek gevoerd naar de enantioselectiviteit van sucrosefosforylase.
Nidetzky et al. toonden aan dat glycerol 94 regioselectief en met hoge rendementen met
sucrosefosforylase uit Leuconostoc mesenteroides omgezet kan worden tot 2-(α-glucosyl)glycerol
94αG. Dit natuurlijk voorkomend osmoliet wordt verkocht onder de handelsnaam Glycoin® en vindt
toepassing in cosmetische crèmes.99
Om de scope en selectiviteit van sucrosefosforylase te bepalen, glucosyleerden Renirie et al. een reeks
verbindingen gerelateerd aan glycerol. De glucosylering van propaan-1,2-diol 72, butaan-1,2-diol 77
en 3-methoxypropaan-1,2-diol 95 vertoonde interessante regio- en stereoselectiviteiten. De diolen
werden preferentieel op de 2-plaats geglucosyleerd. Een opmerkelijke vaststelling was echter dat deze
regioselectiviteit ook afhangt van de configuratie van het alcohol. Racemisch propaan-1,2-diol 72 werd
voornamelijk geglucosyleerd op de 2-plaats, net zoals het zuiver (S)-enantiomeer. Het zuivere (R)-
enantiomeer daarentegen werd preferentieel op de 1-plaats geglucosyleerd. Voor racemisch propaan-
1,2-diol 72 en butaan-1,2-diol 77 werd het (S)-enantiomeer preferentieel geglucosyleerd, voor 3-
methoxypropaan-1,2-diol 95 werd het (R)-enantiomeer verkozen. Er werden redelijk hoge de’s (71-
83%) bekomen. Sucrosefosforylase uit Leuconostoc mesenteroides en Bifidobacterium adolescentis
leidden tot dezelfde resultaten.100
Literatuurstudie
25
2.3 Beïnvloeden van de enantioselectiviteit
De enantioselectiviteit van enzymen hangt af van een aantal factoren: het substraat, het enzym, het
(co)solvent, de temperatuur…101,102 De factoren die de enantioselectiviteit van enzymen beïnvloeden
werden bijna uitsluitend bij lipasen, de meest gebruikte enzymen in de organische synthese,85,103
onderzocht. Daarom zullen zij hier ook besproken worden, hoewel ze geen glycosyleringsreacties
katalyseren.
2.3.1 Invloed van de temperatuur
Bij het bestuderen van de invloed van de temperatuur op de enantioselectiviteit zijn er niet alleen
omgekeerd evenredig en evenredige relaties, maar ook combinaties van de twee waargenomen. De
enantioselectiviteit bij de kinetische resolutie van methyl-2-amino-4-fenylbutyraat 100 gekatalyseerd
door het Thermomyces lanuginosus lipase, hing bijvoorbeeld af van de temperatuur. Hierbij steeg de
enantioselectiviteit drastisch bij het verlagen van de temperatuur. De selectiviteitsfactor bedroeg 13
bij 40 °C, bij -20 ˚C was deze tot 84 gestegen.104
Voor de lipasegekatalyseerde verestering van 2-(4-methoxyfenoxy)propaanzuur 102 met n-butanol
namen Wattanabe et al. een andere relatie waar. De selectiviteitsfactor steeg van 13 naar 120 bij het
verhogen van de temperatuur van 37 °C naar 57 °C. Dit werd gerationaliseerd doordat bij hogere
temperatuur het lipase flexibeler is, hetgeen de oriëntatie van de zijketens van de aminozuren van het
lipase nog voordeliger maakt voor het geprefereerde enantiomeer. Deze hypothese werd nog gesterkt
doordat de enantioselectiviteit voor verbinding 102 groter is dan voor 2-aryloxypropionzuren met
minder elektronengevende substituenten. Dit effect wijst erop dat de elektronendichtheid van de
aromatische ring, en dus π-π stacking met aromatische residuen van het enzym, een rol speelt voor de
enantioselectiviteit.105
Een kleine hoeveelheid water werd toegevoegd aan het organisch solvent, aangezien dit de
enantioselectiviteit van lipasen kan verbeteren vanwege het stijgen van de conformationele flexibiliteit
geïnduceerd door de waterstofbrugvorming met het toegevoegde water.106,107
Literatuurstudie
26
Ook complexere relaties tussen de selectiviteit en de temperatuur zijn mogelijk. De enantioselectiviteit
kan bijvoorbeeld eerst stijgen en dan dalen in functie van de temperatuur. Dit werd waargenomen bij
een penicilline G-amidasegekatalyseerde hydrolyse van 3-amido-β-lactam 104. De enantioselectiviteit
daalde in functie van de temperatuur, tot er een minimum bereikt werd bij de inversietemperatuur
(Tinv). Hier was Emin = 24 bij 28 ˚C, om dan terug te stijgen tot 130 bij 55 ˚C. Een selectiviteitsfactor van
100 wordt vaak als de minimale waarde genomen voor de industriële toepassing van een enzymatisch
proces, dus hierbij maakte de kleine temperatuurswijziging het verschil tussen een inefficiënte en een
efficiënte methode. De 13C-NMR-chemische shift van de fenylacetoxy-carbonylgroep van verbinding
104 vertoonde een analoog gedrag in functie van de temperatuur. De auteurs stellen dat beide relaties
verklaard kunnen worden door de reorganisatie van solventclusters rond de opgeloste stof bij
verandering van de temperatuur. Deze clusters beïnvloeden de chemische omgeving en dus ook de
chemische shift. Ook beïnvloeden ze de energie van de transitietoestanden van het substraat-
enzymcomplex en dus de enantioselectiviteit.108
2.3.2 Invloed van solvent en enzymbereiding
Zoals reeds in een voorgaande paragraaf besproken, werd 1-fenylethanol 50 door ECβG geglycosyleerd
in een rendement van 39% en een ee van 89% voor het (R)-enantiomeer. Majumder et al.
onderzochten hoe de enantioselectiviteit van deze reactie verder verbeterd kon worden.109
Eerst werd het effect van de enzymbereiding nagegaan. Drie mogelijkheden werden getest. Ten eerste
werd pH tuning toegepast. Hierbij wordt het enzym opgelost in een buffer bij optimale pH en dan
gevriesdroogd. Een tweede enzympreparaat werd gelyofiliseerd in aanwezigheid van lyoprotectants
(colyofilisatie), hetgeen structurele veranderingen van eiwitten tijdens het vriesdrogen vermijdt.110
Ook de aanwezigheid van substraten minimaliseert structurele schade tijdens het vriesdrogen.111 Voor
het vriesdrogen van het ECβG werd er galactose gebruikt, aangezien dit zowel een lyoprotectant als
een substraat is. Voor gebruik van enzymen in low water media kan het aanwezige water verwijderd
worden door de enzymen te spoelen of neer te slaan in solvent, hetgeen actievere enzympreparaten
oplevert.112 Een voorbeeld van dergelijke formulering is enzyme precipitated and rinsed with propanol
(EPRP), dit was het derde geteste enzympreparaat.
Literatuurstudie
27
Vergeleken met de niet-geoptimaliseerde reactie werd er voor pH tuning reeds een hogere de behaald,
en colyofilisatie gaf een hogere conversie, de en ee. EPRP leidde tot nog betere resultaten. Deze
reacties vonden plaats in een mengsel van acetonitril (ACN), dimethylformamide (DMF) en water
(ACN/DMF/H2O (9/0,5/0,5)). De optimale enzymbereiding (EPRP) werd dan geselecteerd voor verdere
optimalisatie door het testen van enkele andere solventsystemen. De enantioselectiviteit kon nog
verder verbeterd worden door optimalisatie van het solvent.
Als laatste werd de reactie in DMSO nog verder geoptimaliseerd door toevoeging van moleculaire
zeven. Het verminderen van de waterhoeveelheid in organische solventen kan de enantioselectiviteit
verbeteren.52 Er wordt aangenomen dat dit veroorzaakt wordt door het afnemen van de
conformationele flexibiliteit, waardoor de enantioselectiviteit van het enzym toeneemt.113 Hoewel ook
een omgekeerde relatie mogelijk is, zoals reeds gezien bij de verestering van 2-aryloxypropionzuur 102
door het Candida rugosa lipase. Onder optimale omstandigheden werd er zo 45% omzetting met een
de van >99% bekomen. Zowel het solvent, de enzymbereiding als de hoeveelheid water beïnvloedt dus
de enantioselectiviteit van het β-galactosidase.
2.4 Conclusie
Enzymatische glycosylering heeft veel potentieel in vergelijking met de gangbare chemische
methoden. Enzymen zijn niet alleen in staat om de regioselectiviteit en de configuratie aan het
anomere koolstofatoom te controleren, maar ook om tussen twee enantiomeren van een chiraal
alcohol te discrimineren.
Bij het bestuderen van de literatuur in verband met de enantioselectiviteit van deze enzymen werd al
snel duidelijk dat dit complexe materie is die van vele factoren afhangt. Zowel de structuur van de
acceptor en donor als het gebruikte enzym, de temperatuur, reactietijd en solvent beïnvloeden de
bekomen selectiviteit. Het potentieel van deze enzymen om enantiomeer zuivere glycosiden en
alcoholen te bekomen is zeer groot, hetgeen het onderzoeken van de enantioselectiviteit zeer
interessant maakt. In deze Masterproef zal er dan ook gepoogd worden de enantioselectiviteit van het
aangewende glycosyltransferase en sucrosefosforylase te bestuderen.
Literatuurstudie
28
Tabel 2: De enantioselectiviteit van CAZymes.
Acceptor Omstandigheden Geprefereerd enantiomeer,
regioselectiviteitb, anomere configuratieb
de
(%)
Rendement
(%)
Ref.
Enantioselectiviteit van glycosyltransferasen
Butaan-2-ol 48 GTF-I of GTF-II (5 µg/mL),
UDP-glucose (4 mg/mL),
50 mM HEPES buffer, pH 7,0,
35 °C, 24 of 36 h
GTF-I, 24 h R 78 25c 61
GTF-II, 24 h S 90 24c
Octaan-2-ol 49 GTF-I, 24 h R 84 22c
GTF-II, 24 h S 93 20c
1-Fenylethanol 50 GTF-I, 36 h R 87 28c
GTF-II, 36 h S >99 26c
trans-Cyclohexaan-1,2-diol 51 GTF-I, 36 h R >99 39c
GTF-II, 36 h S >99 33c
1,2-trans-2-Isopropyl-5-
methylcyclohexanol 52
GTF-I, 24 h R 98 17c
GTF-II, 24 h S 100 21c
Abscisinezuur 53 Recombinant UGT71B6 (E. coli), 0,1 mM (+/-)-ABA, pH 7,4, 28 °C, 24 h S 84 20c 71
THPB 55 Gliocladium deliquescens, 1-2% glucose, PD medium, 28 °C, 120 h S 81 >48c 73
Conduritol B 59 GalT (2,5 u/mL)/α-Lactalbumine (1 mg/mL), 50 mM 59, 10 mM UDP-galactose,
100 mM Tris buffer, pH 7,5, 5 mM MnCl2, 0,2% NaN3, kt, 2 dagen
25c Ph Bn 1,5 eq. 109, THF 40 100/0 a Bepaald via 1H-NMR van het ruwe reactiemengsel. b Rendement voor het cis- en trans-isomeer samen. c Ruw rendement.
Zoals reeds eerder waargenomen werd er enkel voor verbinding 25a ook het trans-isomeer
bekomen.38,39 De cis- en trans-isomeren van dit β-lactam werden samen geïsoleerd en zij werden na
de volgende stap gescheiden via omkristallisatie. De diastereomere ratio’s (dr) werden bepaald na
integratie van de 1H-NMR-signalen na analyse van de vicinale koppelingsconstanten tussen de C3- en
C4-protonen. Voor de cis-β-lactamen bedroegen deze J = 4,6-5,0 Hz (1H-NMR, CDCl3) en voor het trans-
isomeer van β-lactam 25a bedroeg de koppelingsconstante 1,5 Hz, hetgeen overeenkomt met
waarden gerapporteerd in de literatuur voor cis- en trans-β-lactamen.119
3.1.3 Synthese van monocyclische β-lactamalcoholen
De laatste stap in deze syntheseroute bestond uit een ontscherming van de gevormde cis-3-acetoxy-
β-lactamen 25 via hydrolyse van de acetylgroep. Deze reactie vindt plaats in basisch midden, met als
solvent een mengsel van water en methanol. Het aflopen van deze reactie werd nagegaan via LC-MS-
analyse. Zuivere cis-3-hydroxy-β-lactamen 26 werden bekomen na omkristallisatie in
ethylacetaat/hexaan (1/4), waarbij ook trans-β-lactam 26a van zijn cis-diastereomeer gescheiden
werd. De gebruikte solventmengsels en rendementen van deze reactie worden weergeven in tabel 5.
Tabel 5: Synthese van 3-hydroxyazetidin-2-onen 26.
Verbinding R1 R2 Solvent Rendement (%)a
26a iPr Bn H2O/ MeOH (2/1) 47
26b Pr iPr H2O/ MeOH (1/1) 9b
26c Ph Bn H2O/ MeOH (1/1) 20
a Na omkristallisatie.
b Globaal rendement vanaf imine 24b.
Bespreking van de resultaten
35
3.2 Synthese van bicyclische β-lactamalcoholen
Nieuwe bicyclische β-lactamalcoholen 20 en 21 werden gesynthetiseerd om hun mogelijke reactiviteit
in de enzymatische glycosyleringsreacties te bestuderen. De chemische synthese van deze moleculen
bouwde verder op eerder onderzoek aan de vakgroep Groene Chemie en Technologie (Faculteit Bio-
ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent).40 De synthese startte vanuit optisch zuiver 1,2:5,6-di-O-
isopropylideen-D-mannitol 27, waaruit in vijf stappen (3R,4R)-3-benzyloxy-1-(2-chloorethyl)-4-formyl-
β-lactam 34 gevormd wordt. Deze veelzijdige chemische bouwsteen werd hierna omgezet tot
benzylbeschermde bicyclische β-lactamen 36 en 38. Vervolgens werd een methode uitgewerkt om
deze te ontschermen met vorming van de nieuwe bicyclische β-lactamalcoholen 21 en 20.
3.2.1 Synthese van (3R,4R)-3-benzyloxy-1-(2-chloorethyl)-4-formyl-β-lactam
De syntheseroute tot de bicyclische β-lactamalcoholen 20 en 21 start met de vorming van
(R)-glyceraldehydeacetonide 28 door oxidatieve splitsing van 1,2:5,6-di-O-isopropylideen-D-mannitol
27 met behulp van natriumperjodaat in aanwezigheid van natriumbicarbonaat. Na twee uur roeren bij
kamertemperatuur werd (R)-glyceraldehydeacetonide 28 zuiver en in een hoog rendement (83%)
bekomen. Aangezien 1,2:5,6-di-O-isopropylideen-D-mannitol 27 in optisch zuivere vorm aangewend
werd en bij deze reactie de absolute stereochemie van de chirale centra op C2 en C5 niet verloren
gaat, werd zo selectief het (R)-enantiomeer bekomen. Deze syntheseroute vormt een voorbeeld van
een synthese vanuit de chiral pool; zoals vermeld in het deel ‘literatuurstudie’ vormt dit één van de
drie manieren om optisch zuivere verbindingen te bekomen. Het startproduct beschikt hier reeds over
de gewenste stereochemie en indien er in volgende synthetische stappen geen racemisatie van de
chirale centra optreedt, blijft deze stereochemie ook behouden in het eindproduct.121
(R)-Glyceraldehydeacetonide 28 werd vervolgens geïmineerd met het hydrochloridezout van
2-chloorethylamine 29. Toevoegen van drie equivalenten triëthylamine was noodzakelijk om het
amine te activeren. Anderhalf equivalent magnesiumsulfaat werd aangewend om het gevormde water
te onttrekken. Na een uur was het karakteristieke aldehydesignaal (δ = 9,71 ppm, 1H-NMR, CDCl3)
verdwenen en de reactie afgelopen. Het reactiemengsel werd ingedampt en opgelost in droge ether
waarna de aldus gevormde kristallen, het hydrochloridezout van triëthylamine, werden verwijderd
door filtratie. Door de beperkte stabiliteit van dit imine 30 moest er voldoende zorg worden besteed
Bespreking van de resultaten
36
aan de temperatuur bij indampen en werd de Staudingersynthese direct uitgevoerd. Als bij de
oxidatieve splitsing van 1,2:5,6-di-O-isopropylideen-D-mannitol 27 en de imineringsreactie die hierop
volgde geen racemisatie van de chirale centra is opgetreden, kan imine 30 optreden als een chirale
inductor in de Staudingersynthese waarbij het de stereochemie controleert van de nieuw gevormde
chirale centra.
Daartoe werd imine 30 opgelost in droge dichloormethaan in aanwezigheid van drie equivalenten
triëthylamine als base. Hieraan werden 1,3 equivalenten benzyloxyacetylchloride 31, opgelost in droge
dichloormethaan, voorzichtig toegedruppeld bij 0 °C. Na 16 uur roeren bij kamertemperatuur werd
waargenomen dat imine 30 volledig omgezet was door het verdwijnen van het karakteristieke
iminesignaal (δ = 7,70 ppm, 1H-NMR, CDCl3). Zoals reeds waargenomen is de chirale inductie van imine
30 niet volledig en worden daardoor twee cis-diastereomeren 32a (major) en 32b (minor) gevormd in
een verhouding van 94/6 (dr werd bepaald via 1H-NMR (CDCl3) van het ruwe reactiemengsel).40
Diastereomeren 32a en 32b konden niet gescheiden worden door chromatografische zuivering. Het
vermelde rendement van 60% was dan ook voor beide diastereomeren samen. In een latere stap gaat
de stereochemie van het derde stereocenter verloren waarbij uit 32a en 32b twee cis-enantiomeren
gevormd worden.40 Deze synthese werd in eerder onderzoek reeds uitgewerkt met methoxy-, fenoxy-
en benzyloxyacetylchloride.40,122,123 In deze Masterproef werd geopteerd voor benzyloxyacetylchloride
31 omdat de hydroxylgroep zo met behulp van een eenvoudig te verwijderen benzylgroep beschermd
werd.
De volgende stap bestond uit een zure hydrolyse van de acetaalfunctie. Hiertoe werd het acetaal 32
opgelost in een mengsel van THF en water (1/1) in aanwezigheid van 1,2 equivalenten para-
tolueensulfonzuur. Deze reactie werd opgevolgd via LC-MS en de omzetting bleek volledig te zijn na
drie uur. Het reactiemengsel werd vervolgens geneutraliseerd met vast natriumbicarbonaat. Extractie
verwijderde het gedeprotoneerde, wateroplosbare para-tolueensulfonzuur en hierdoor werd
Bespreking van de resultaten
37
(1’S,3R,4S)-3-benzyloxy-1-(2-chloorethyl)-4-(1,2-dihydroxyethyl)azetidin-2-on 33 zuiver bekomen in
een hoog rendement (93%).
De finale stap ter vorming van het aldehyde 34 bestond opnieuw uit oxidatieve splitsing van een diol.
Hiertoe werd diol 33 opgelost in een mengsel van dichloormethaan en verzadigd natriumbicarbonaat
(25/1) en gekoeld met behulp van een ijsbad. Vervolgens werden 2,4 equivalenten natriumperjodaat
portiegewijs over een periode van tien minuten toegevoegd. De reactie werd opgevolgd via LC-MS en
vereiste 36 uur voor een volledige omzetting, in tegenstelling tot de gerapporteerde twee uur.122
Eenvoudig affiltreren en wassen van het reactiemengsel echter leidde tot zuiver (3R,4R)-3-benzyloxy-
1-(2-chloorethyl)-4-formyl-β-lactam 34 in een hoog rendement (94%).
3.2.2 Synthese van (6S,7R)-7-benzyloxy-1,4-diazabicyclo[4.2.0]octaan-8-onen
Voor de synthese van (6S,7R)-7-benzyloxy-1,4-diazabicyclo[4.2.0]octaan-8-onen 36a-b werd aldehyde
34 eerst geïmineerd met isopropylamine of benzylamine en vervolgens ringgesloten. Het nog niet
eerder beschreven benzylaminederivaat 36b werd gesynthetiseerd omdat dit bij een
hydrogenolysereactie simultane O- en N-debenzylering zou kunnen ondergaan.124 Daardoor zou dit
derivaat een minder sterisch gehinderde verbinding vormen, hetgeen belangrijk kan zijn voor de
reactiviteit in de enzymatische glycosylering.
De iminering vond plaats in droge dichloormethaan met 1,5 equivalenten magnesiumsulfaat als
droogmiddel. Het aflopen van deze reacties werd opnieuw via 1H-NMR-analyse bevestigd. Deze iminen
35a-b werden bekomen in hoge rendementen en zuiverheden, waardoor meteen de volgende reacties
opgestart konden worden.
In de volgende stap ondergingen iminen 35a-b reductie gevolgd door ringsluiting. Hiertoe werden de
iminen 35a-b opgelost in methanol of ethanol en met behulp van een ijsbad gekoeld.
Natriumboorhydride werd portiegewijs gedurende vijf minuten aan het reactiemengsel toegevoegd
gevolgd door verhitting tot refluxtemperatuur voor twee of 16 uur. Zuivering gebeurde door middel
van filtratie over silicagel, hetgeen resulteerde in de benzylbeschermde bicyclische β-lactamen 36a-b
in middelmatig tot hoog rendement (55-84%).
Bespreking van de resultaten
38
3.2.3 Synthese van (6S,7R)-7-benzyloxy-4-oxa-1-azabicyclo[4.2.0]octaan-8-on
Voor de synthese van (6S,7R)-7-benzyloxy-4-oxa-1-azabicyclo[4.2.0]octaan-8-on 38 werd aldehyde 34
opgelost in methanol en gekoeld door middel van een ijsbad. Hieraan werden portiegewijs twee
equivalenten natriumboorhydride toegevoegd. Na één uur roeren onder refluxomstandigheden was
deze reactie afgelopen, hetgeen werd nagegaan door het verdwijnen van het karakteristieke
aldehydesignaal (δ = 9,58 ppm, 1H-NMR, CDCl3). Het zo gevormde alcohol 37 werd vervolgens
gedeprotoneerd met natriumhydride, een sterke base. Ringsluiting vond overnacht plaats in DMSO bij
hoge temperatuur.
3.2.4 Debenzylering ter vorming van bicyclische β-lactamalcoholen
De laatste stap bestond uit de ontscherming van de benzylgroep op zuurstof in verbindingen 36a-b en
38 hetgeen leidde tot de vorming van de gewenste bicyclische β-lactamalcoholen 20-21b.
De (6S,7R)-7-hydroxy-1,4-diazabicyclo[4.2.0]octaan-8-onen 21a-b vormen nieuwe bicyclische
piperazineafgeleiden. Piperazinen vertonen vele interessante biologische activiteiten zoals antifungale
en antibacteriële activiteit of treden op als serotinereceptorantagonisten of -agonisten.26–30
(6S,7R)-7-Hydroxy-4-oxa-1-azabicyclo[4.2.0]octaan-8-on 20 kan beschouwd worden als een
interessant intermediair in de synthese van nieuwe gesubstitueerde morfolinederivaten met
toepassingen als hongeronderdrukkers, antidepressiva, antikankerverbindingen, antioxidantia en
antibiotica.25
De af te splitsen benzylgroep is afkomstig van benzyloxyacetylchloride 31 dat aangewend werd in de
Staudingersynthese. Deze beschermgroep werd gekozen omdat deze eenvoudig en onder milde
omstandigheden kan worden verwijderd via een hydrogenolysereactie.124 In de literatuur zijn er enkele
voorbeelden van hydrogenolysereacties van 3-benzyloxy-β-lactamen bekend.125–127 Deze voorbeelden
vormden de leidraad voor de uiteindelijk gekozen reactieomstandigheden. De hieronder afgebeelde
3-benzyloxy-β-lactamen 117 konden bijvoorbeeld in zeer hoge rendementen (85-97%) omgezet
worden tot hun overeenkomstige alcoholen 118 door middel van een hydrogenolysereactie in
methanol met 5 bar waterstofgas en 10% (m/m) palladium op koolstof (Pd/C) als katalysator.
Bespreking van de resultaten
39
Een testreactie in deze omstandigheden met β-lactam 36a leidde tot een extreem trage reactie. Er
werd dan ook gekozen voor hogere katalysatorhoeveelheden (40-80%, m/m). Er werd ook gepoogd
verbinding 38 te ontschermen onder atmosferische druk met behulp van een ballon met waterstofgas,
hetgeen echter niet mogelijk bleek. Hydrogenolyse met 40% Pd/C voor verbindingen 36a-b gaf
aanleiding tot volledige ontscherming na één week, waarbij voor 36b, zoals geanticipeerd, zowel de O-
als N-benzylgroep afgesplitst werd. Voor verbinding 38 werd 80% katalysator gebruikt en was een erg
lange reactietijd nodig om een volledige omzetting te bekomen. Ondanks het nadeel van de lange
reactietijden, konden de producten echter zeer eenvoudig in zuivere vorm bekomen worden. Daartoe
werden de ruwe reactiemengsels gefiltreerd over celiet, het solvent ingedampt en de residu’s opgelost
in water. Aangezien de producten 20-21b zeer wateroplosbaar waren, konden zij eenvoudig en
efficiënt gezuiverd worden via een extractie van de apolairdere onzuiverheden met ethylacetaat.
(6S,7R)-7-Hydroxy-1,4-diazabicyclo[4.2.0]octaan-8-onen 21a-b werden zo bekomen in een hoog
rendement (64-91%). Voor verbinding 20 werd een opbrengst van 98% bekomen maar was er nog een
onzuiverheid (~25%) aanwezig. Een analytisch zuiver staal kon via preparatieve TLC bekomen worden
in een rendement van 21%.
3.3 β-glucosylering van monocyclische β-lactamalcoholen
Glycosylering heeft een enorme invloed op de fysicochemische eigenschappen van een verbinding. In
de natuur is glycosylering één van de meest voorkomende en belangrijkste modificatie van
biomoleculen. Het speelt een centrale rol in cellulaire communicatie en de organisatie van het leven
in het algemeen.128 Er bestaan dan ook veel ziektes, zeker aangeboren of erfelijke ziektes zoals het
syndroom van Wiskott-Aldrich, die geassocieerd zijn met de foute glycosylering van bepaalde
eiwitten.129,130,131 De herkenning van specifieke glucanen op het oppervlak van een cel vormt vaak de
basis van virale en bacteriële infecties132 en de metastase van kanker.133 Een breed bereik aan
verbindingen kan geglycosyleerd worden, gaande van macromoleculen zoals proteïnen, vetten en
glycanen op de celwand tot kleine moleculen zoals secundaire metabolieten en oligosachariden.134
De wateroplosbaarheid, stabiliteit en biologische activiteit van kleine moleculen kan drastisch
beïnvloed worden door glycosylering. Glycosylering verhoogt bijvoorbeeld de stabiliteit van vitamine
C en anthocyanidinen.32,135 Daarnaast verlaagt het de biologische- en antikankeractiviteit van deze
anthocyanidinen, de antioxidantactiviteit kan zowel stijgen, gelijk blijven als dalen.136 De glycosylering
van steviol resulteert in zoetsmakende steviolglycosiden.137 Glycosylering speelt ook een rol bij de
Bespreking van de resultaten
40
detoxificatie van xenobiotica door hun glucuronylering. Lipofiele endo- en exobiotica worden zo
omgezet tot wateroplosbaardere glucuroniden en geëxcreteerd.138,139
Ook de configuratie van het anomere centrum (α of β) kan de biologische activiteit beïnvloeden.
Methyl-β-galactofuranoside en n-octyl-β-galactofuranoside bezitten bijvoorbeeld een
immuunstimulerend effect. De overeenkomstige α-galactofuranosiden beschikken echter niet over
deze eigenschap.140 Vandaar het belang om zowel de α- als β-glucosiden van de 3-hydroxy-β-lactamen
selectief te kunnen synthetiseren.
In de organische chemie werd reeds veel onderzoek gevoerd naar manieren om glycosyleringsreacties
uit te voeren. Deze chemie is echter zeer complex. Glucose heeft bijvoorbeeld één hemiacetale
hydroxylgroep, drie secundaire hydroxylgroepen en één primaire hydroxylgroep. Selectief één van
deze hydroxylgroepen koppelen met een acceptor houdt dus een enorme uitdaging in. Deze
uitdagende regioselectiviteit leidt tot het noodzakelijk zijn van vele beschermings- en
ontschermingsstappen en activeringen van de glycosyldonor. De daarmee gepaard gaande complexe
synthetische manipulaties leiden tot lage rendementen, het gebruik van grote hoeveelheden
organische solventen en vaak ook de vorming van toxische gehalogeneerde (bij)producten. Productie
van glycosiden via chemische methoden in een economisch en ecologisch haalbare manier blijft dus
nog steeds een grote uitdaging.128
Door gebruik te maken van biokatalyse kunnen vele van de nadelen van chemische glycosyleringen
vermeden worden. Biokatalyse wordt steeds meer een bruikbaar alternatief voor sommige chemische
reacties, ook op industriële schaal.141 Enzymen zijn in staat regio-, stereo- en enantioselectief
glycosyleringen uit te voeren zonder andere functionele groepen te moeten beschermen, hetgeen
chemisch vaak zeer moeilijk of zelfs onmogelijk is. Het vermijden van beschermings- en
ontschermingsstappen zorgt ervoor dat er minder synthetische stappen vereist zijn. Enzymatische
glycosyleringen behoren ook tot de groene chemie aangezien het gebruik van toxische chemicaliën
vermeden wordt en er veiligere solventen (water) en reactieomstandigheden worden toegepast. Als
glycosyldonor kunnen ook hernieuwbare grondstoffen zoals sucrose aangewend worden.142
Om de problemen geassocieerd met de chemische glycosylering te vermijden en gebruik te maken van
de voordelen die biokatalyse biedt, werd er in deze Masterproef en in voorgaand onderzoek gezocht
naar enzymatische methodes om deze uitdagende substraten te glucosyleren.38,39 Er zijn verschillende
types CAZymes die deze reactie zouden kunnen uitvoeren. Om de α- en β-glycosiden 26αG en 26βG te
synthetiseren werden twee enzymen geselecteerd die gekend staan om hun brede
acceptorsubstraatspecificiteit. Voor het maken van α-glycosiden 26αG werd gebruik gemaakt van
mutant R134A van het sucrose 6'-fosfaat fosforylase van Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum
(TtSPP_R134A), terwijl voor de β-glycosiden 26βG werd gekozen voor het UDP-glucosyltransferase van
Stevia rebaudiana (UGT-76G1Sr).
Bespreking van de resultaten
41
Voor de α-glycosiden 26αG kon reeds in voorgaand onderzoek voldoende product gesynthetiseerd
worden voor een volledige karakterisatie.38,39 Voor de β-glycosiden 26βG was dit echter nog niet het
geval. Voornamelijk het moeilijk te verwijderen co-solvent DMSO, andere residuele onzuiverheden en
de lage hoeveelheid product die geen verdere zuivering toelieten, vormden hier een probleem. Ook
de enzymfermentatie van UGT-76G1Sr vormde een knelpunt. Het hoofddoel van deze Masterproef zal
dan ook bestaan uit de synthese en karakterisatie van de β-geglucosyleerde monocyclische β-lactamen
26βG. Hiertoe zullen er, na expressie van de nodige enzymen, reacties op kleine schaal (100-150 µL)
uitgevoerd worden om de reactieomstandigheden te optimaliseren. Na optimalisatie worden er op
grotere schaal (~100 mL) preparatieve reacties opgestart om uiteindelijk voldoende product te
bekomen voor een volledige karakterisatie (1H-NMR, 13C-NMR, MS, IR).
3.3.1 Screening en productie enzym
UGT-761Sr gebruikt UDP-glucose als geactiveerde donor en behoort tot de grootste groep Leloir GT’s:
de plant UDP-dependent glycosyltransferases (UGT’s). Dit enzym is afkomstig van honingkruid of de
steviaplant (Stevia rebaudiana); in planta katalyseert het de β-glycosylering van stevioside 119 of
steviolbioside 120 tot respectievelijk rebaudioside A 121 of rebaudioside B 122, die allebei toepassing
vinden als natuurlijke zoetstoffen.143
Er bestaat aanzienlijke interesse in dit enzym vanwege zijn opmerkelijk grote substraatspecificteit. In
tegenstelling tot microbiële GT’s, zoals het oleandomycine glycosyltransferase (OleD) uit
Streptomyces,144,145 hebben GT’s uit planten vaak een zeer grote substraatspecificiteit in vivo.134 Voor
in vitro glycosyleringen echter werden er tegenstellende waarnemingen gerapporteerd. Sommige
Bespreking van de resultaten
42
plant GT’s zijn promiscue en worden voornamelijk gelimiteerd door hun regioselectiviteit, waarbij het
substraat enkel over een sterisch ongehinderde hydroxylgroep dient te beschikken.146 Daarentegen
zijn er ook zeer specifieke GT’s bekend. Anthocyanine 3’-O-glucosyltransferase (3’GT) uit Gentiana
triflora bijvoorbeeld, katalyseert zeer specifiek de glucosylering van de 3’-hydroxylgroep van
delfinidine-type anthocyaninen met glucose op de 3- en 5-plaatsen.147 Het UGT-76G1Sr van Stevia
rebaudiana vertoonde in vitro echter een opmerkelijk brede substraatspecificiteit, gaande van
alifatische alcoholen tot fenolen, flavonoïden en glucosiden. In tabel 6 zijn de acceptoren die tot nu
toe succesvol werden geglucosyleerd met dit enzym weergegeven.148 Curcumine 125 kon bijvoorbeeld
bijna volledig (96% omzetting) worden omgezet tot de mono- en diglucosiden 126 en 127 wanneer
trehalose als eiwitstabilisator gebruikt werd.148
Tabel 6: Acceptoren die reeds succesvol geglucosyleerd werden met UGT-76G1Sr.
Figuur 1: Karakteristieke 1H-NMR-signalen (D2O) van 26cβG, signalen afkomstig van het glucosedeel zijn aangeduid in het
rood.
3.3.5 Enantioselectiviteit van de enzymatische glycosylering
Zoals reeds aangehaald in het deel ‘Literatuurstudie’, worden bij koppeling van racemische cis-3-
hydroxy-β-lactamen (R,R)-26 en (S,S)-26 met optisch zuiver glucose diastereomeren (R,R)-26G en (S,S)-
26G gevormd. Enzymen zijn chirale katalysatoren en het is dus mogelijk dat zij kunnen discrimineren
tussen één van de twee enantiomeren van de cis-3-hydroxy-β-lactamen 26. Reactieomstandigheden
zoals temperatuur, (co-)solvent, enzymformulering, additieven… kunnen deze selectiviteit bovendien
beïnvloeden.
Voor de α-glycosylering werd er in voorgaand onderzoek steeds maar één product waargenomen,38,39
hetgeen duidt op volledige selectiviteit van het enzym voor één van de twee enantiomeren van de
cis-3-hydroxy-β-lactamen 26. Bij synthese van de β-glycosiden 26a-cβG werd echter steeds de vorming
van twee isomere producten waargenomen. Analyse van de NMR-spectra van synthesen van de β-
glucosiden, die in voorgaand onderzoek bij andere omstandigheden hadden plaatsgevonden, leerde
Bespreking van de resultaten
48
dat de verhoudingen van de diastereomeren kon variëren. Zo werd er voor 26aβG bij 32 °C met als co-
solvent aceton een dr van 44/56 bekomen. Bij 40°C met als co-solvent DMSO werd een dr van 71/29
bekomen, wat wijst op een andere selectiviteit. Om de invloed van de reactieomstandigheden op de
enantioselectiviteit van de β-glucosylering na te gaan, werd er gepoogd de enantiomere overmaat van
het niet-gereageerde substraat (ees) na reactie in verschillende omstandigheden te bepalen. Vóór
reactie komen de cis-3-hydroxy-β-lactamen 26 namelijk voor als racemisch mengsel. Wanneer het
enzym een selectiviteit heeft voor een bepaald enantiomeer zal er meer van dit enantiomeer omgezet
worden. Na reactie is de acceptor dan aangerijkt aan één van de twee enantiomeren. Kwantificatie
van deze aanrijking verschaft aldus informatie over de enantioselectiviteit van het enzym.
Om de ees te kunnen bepalen werd er gebruik gemaakt van HPLC met een chirale kolom. Na
methodeontwikkeling voor deze scheiding werden β-glycosyleringsreacties op kleine schaal
(150-500 µL) uitgevoerd, met als variabelen het gebruikte co-solvent en de temperatuur. Na reactie
werd het ruwe reactiemengsel geëxtraheerd met ethylacetaat, de organische fase behouden en
ingedampt. Het residu werd vervolgens opgelost in n-hexaan/EtOH en geanalyseerd met chirale HPLC.
De omzetting werd steeds bepaald via LC-MS of LC-UV, aangezien dit ook de ee en de beïnvloedt.154
De resultaten van dit onderzoek zijn weergegeven in tabel 10.
Tabel 10: Enantioselectiviteit van de β-glycosylering.
Verbinding R1 R2 Omstandigheden ees (%) (omzetting (%))a,b dep (%) (omzetting (%))a,c
26a iPr Bn blanco
Aceton, 32 °C
-2,7
-2,8 (6)
-11 (9)
Aceton, 40 °C -3,8 (1)
DMSO, 32 °C 0,6 (6)
DMSO, 40 °C -6,8 (40) 44 (9)
26b Pr iPr blanco
Aceton, 32 °C
-7,11
-d(10)
-30 (14)
Aceton, 40 °C - d(/)
DMSO, 32 °C - d(15)
DMSO, 40 °C - d(9) -26 (5)
26c Ph Bn blanco
Aceton, 32 °C
-4,0
2,5 (10)
18 (4)
Aceton, 40 °C -6,1 (12)
DMSO, 32 °C -4,1 (12)
DMSO, 40 °C 6,1 (22) -47 (4,5) a Negatieve waarde betekent een selectiviteit voor het andere enantiomeer. b Bepaald via chirale HPLC met een ChiralPak® IA kolom, n-hexaan/isopropanol (96/4), 1 mL/min, 35 °C, 220 nm. c Bepaald via 1H-NMR (D2O).
d Accurate bepaling ees was niet mogelijk door co-elutie van een onzuiverheid uit het reactiemengsel.
Deze methode om de enantioselectiviteit te bestuderen werd gehinderd door enkele grote obstakels
waardoor de resultaten niet eenduidig zijn. Ten eerste vertoonden de ee’s van de blanco stalen reeds
vrij grote afwijkingen (verwachte ee’s = 0). Ten tweede waren de bekomen omzettingen laag, hetgeen
een grote invloed heeft op de ees. Een reactie met volledige enantioselectiviteit en een omzetting van
5% geeft bijvoorbeeld nog steeds maar aanleiding tot een ees van 5,3%. Deze verschillen zijn, mede
door de hoge ruis bij de metingen, niet betrouwbaar te detecteren. Ten derde vonden de reacties
Bespreking van de resultaten
49
steeds plaats op kleine schaal, waarbij er snel afwijkingen kunnen optreden. Om de betrouwbaarheid
te verhogen zou een triplicaat uitgevoerd kunnen worden. Bijvoorbeeld kan elke reactie driemaal
worden uitgevoerd, van elke reactie driemaal een staal worden genomen en elk van deze stalen
driemaal geanalyseerd worden via HPLC. Binnen het tijdsbestek van deze Masterproef was dit echter
niet meer mogelijk. Een laatste probleem stelde zich specifiek bij het bepalen van de ees van verbinding
26b. Hierbij elueerde er steeds ook een onzuiverheid uit het reactiemengsel samen met de
enantiomeren, hetgeen nauwkeurige bepaling van de ees onmogelijk maakte.
De diastereomere overmaten van het product (dep) vormen een andere manier om informatie te
verkrijgen over de enantioselectiviteit van het enzym. De dep’s konden via 1H-NMR (D2O) bepaald
worden door de integratie van de anomere of β-lactamprotonen en zijn weergegeven in tabel 10. Bij
het bepalen van de dep moet uiteraard wel de kanttekening worden geplaatst dat deze waarden na
zuivering werden bekomen. Aangezien diastereomeren verschillende fysicochemische eigenschappen
hebben, is het mogelijk dat bij de zuivering de recovery van één van de twee diastereomeren groter is,
hetgeen de dep zou doen afwijken van de werkelijke selectiviteit van het enzym. Dit wordt ook duidelijk
weerspiegeld in de minder samenhangende resultaten, dewelke bovendien sterk verschillend zijn van
de ees resultaten. Betrouwbaardere resultaten zouden behaald kunnen worden indien de dep bepaald
zou worden op basis van NMR-spectra van de ruwe reactiemengsels. Dit is echter praktisch niet
haalbaar door de vrij lage concentratie product in vergelijking met de concentratie aan acceptor,
sucrose, fructose, UDP en UDP-glucose.
Ook de enantioselectiviteit van de α-glycosylering werd bestudeerd (tabel 11). Hiertoe werden NMR-
spectra van de eerder gesynthetiseerde glucosiden geanalyseerd op de aanwezigheid van een mogelijk
tweede product. Ook werden reacties op kleine schaal uitgevoerd om de ees na reactie te bepalen.
Enkel voor 26aαG bleek er een klein aandeel van een ander glucoside aanwezig. Hieruit blijkt dat de
enantioselectiviteit hoog tot volledig is (de = 91-100%).
Tabel 11: Enantioselectiviteit van de α-glycosylering.
Verbinding R1 R2 ees (%) (omzetting (%))a,b dep (%) (omzetting (%))c
26a iPr Bn 0,9 (11) 91 (23)
26b Pr iPr -d (17) 100 (50)
26c Ph Bn 11,6 (10) 100 (10) a Negatieve waarde betekent een selectiviteit voor het andere enantiomeer. b Bepaald via chirale HPLC met een ChiralPak® IA kolom, n-hexaan/isopropanol (96/4), 1 mL/min, 35 °C, 220 nm. c Bepaald via 1H-NMR (D2O).
d Accurate bepaling ees was niet mogelijk door co-elutie van een onzuiverheid uit het reactiemengsel.
Vanwege de vermelde obstakels kon er moeilijk een duidelijke conclusie met betrekking tot de
enantioselectiviteit van UGT-76G1Sr getrokken worden. In de literatuur zijn er enkele gevallen bekend
van GT’s die met hoge enantioselectiviteit glycosyleringen katalyseren.61,71,79,80,155 De invloed van
reactieomstandigheden op de enantioselectiviteit van GT’s werd echter nog niet in detail bestudeerd.
In verder onderzoek zou deze selectiviteit grondiger bestudeerd kunnen worden, om zo eventueel
Bespreking van de resultaten
50
omstandigheden te vinden waarbij een hogere enantioselectiviteit wordt bekomen. Voor de α-
glucosylering met TtSPP_R134A kan echter wel geconcludeerd worden dat deze met een erg hoge
enantioselectiviteit plaatsvindt en aldus een route vormt naar optisch zuivere α-glucosiden en
alcoholen.
3.4 Enzymatische glycosylering van bicyclische β-lactamalcoholen
Bicyclische β-lactamen 107 werden in dit volgende luik getest als nieuwe substraten in enzymatische
glycosyleringsreacties. Voor deze bicyclische substraten 107 werden reacties gestart onder dezelfde
omstandigheden als voor de monocyclische β-lactamen 26. De bicyclische acceptoren 107 zijn echter
starre en meer gehinderde substraten dan de monocyclische β-lactamalcoholen 26, hetgeen tot uiting
komt in hun reactiviteit. Er werd ook gepoogd een ander enzym dat gekend staat om zijn erg brede
substraatspecificiteit, OleD, tot expressie te brengen en zijn activiteit voor deze bicyclische structuren
te evalueren.
3.4.1 α-Glycosylering van bicyclische β-lactamalcoholen
In voorgaand onderzoek bleek dat het sucrose 6'-fosfaat fosforylase, TtSPP_R134A, in staat was
3-hydroxy-β-lactamen 26 te glycosyleren. De reactieomstandigheden werden reeds geoptimaliseerd
en reacties op preparatieve schaal met sucrose als glucosyldonor en aceton als co-solvent gaven
aanleiding tot de gewenste α-glucosiden 26αG in een rendement van 2-17%.38,39 Er werd getest of dit
enzymsysteem ook de bicyclische β-lactamalcoholen 107 zou kunnen glucosyleren.
Het enzym aangewend voor de α-glycosylering, TtSPP_R134A, is een mutant van een thermostabiel
sucrose 6’-fosfaat fosforylase (SPP) afkomstig uit Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum
(Tt). Het geprefereerde substraat is sucrose 6’-fosfaat (Km = 13 mM). Sucrose, een veel goedkopere
donor, kan echter ook als glycosyldonor aangewend worden (Km = 77 mM).156 GP’s katalyseren drie
Bespreking van de resultaten
51
types reacties: glycosyltransfer van en naar fosfaat (respectievelijk synthese en fosforolyse), hydrolyse
en transglycosylering.157
De transglycosylering met SPP maakt gebruik van een double displacement (‘ping-pong’) mechanisme.
Zure katalyse protoneert de leaving group, fructose, en een nucleofiel carboxylaatresidu valt aan op
het anomere koolstofatoom van sucrose 128 met vorming van een covalent enzym-
substraatintermediair 129. Vervolgens wordt de hydroxylgroep van een acceptor 123 gedeprotoneerd,
welke dan aanvalt op het anomere koolstofatoom met verbreking van de covalente enzym-
glucosebinding. Deze twee nucleofiele substituties, elk gepaard met inversie van de stereochemie,
zorgen ervoor dat de α-configuratie van de donor 128 in het product 123αG behouden blijft.157–159
Na enzymexpressie werden celpellets gezuiverd door middel van cellyse met lysozym en sonicatie
gevolgd door een hittezuivering. Vervolgens werden reacties op kleine schaal opgestart met de
bicyclische β-lactamen 20-21b. Aangezien deze verbindingen wateroplosbaar zijn, werd er geen co-
solvent meer toegevoegd, hetgeen de enzymstabiliteit positief kan beïnvloeden. Het eerst
gesynthetiseerde isopropylderivaat 21a werd getest en mogelijke vorming van geglycosylereerde
producten werd nagegaan via LC-MS en TLC. Er werd geen product waargenomen, ook niet na lange
reactietijden (drie weken). Aangezien deze teleurstellende resultaten mogelijks veroorzaakt werden
door sterische hinder van de isopropylgroep, werd er besloten kleinere bicyclische derivaten 21b en
20 te synthetiseren en te testen. In eerder onderzoek bleek al dat TtSPP_R134A kleinere acceptoren
prefereert.39 Ook met deze minder gehinderde verbindingen 21b en 20 werd er echter geen
productvorming waargenomen.
Bespreking van de resultaten
52
3.4.2 β-glycosylering van bicyclische β-lactamalcoholen
3.4.2.1 β-glycosylering met UGT-76G1Sr
Voor de β-glycosylering met UGT-76G1Sr werden de reactieomstandigheden die effectief bleken voor
de glycosylering van de monocyclische β-lactamalcoholen 26 toegepast op de bicyclische acceptoren
20-21b. Er werd echter geen productvorming waargenomen via TLC en LC-MS, ook niet na opdrijven
van de acceptorconcentratie 21a.
3.4.2.2 β glucosylering met OleD
Aangezien de eerder aangewende enzymatische methoden voor glycosylering van monocyclische β-
lactamalcoholen 26 niet succesvol bleken voor de bicyclische derivaten 20-21b, werd er gezocht naar
een ander enzym om deze transformatie uit te voeren. Recente studies op OleD, het oleandomycine
glucosyltransferase uit Streptomyces antibioticus, gaven aan dat dit enzym over een zeer brede
substraatspecificiteit beschikt.145,160 OleD katalyseert in vivo de β-glucosylering van oleandomycine 130
gebruik makend van UDP-glucose als donor om glucoside 131 te produceren.161 Oleandomycine 130 is
een macrolide antibioticum met bacteriostatische activiteit. Het bindt op de 50S subeenheid van de
ribosomen waar het de translatie en de vorming van de 50S subeenheid inhibeert.162 In vivo inactiveert
de oleandomycineproducerende bacterie intracellulaire oleandomycine 130 door glycosylering.163 De
producent excreteert daarnaast ook een enzym dat het inactieve geglucosyleerde oleandomycine 131
terug omzet tot het actieve antibioticum.164 De reeds brede substraatspecificiteit van OleD werd
verder uitgebreid door middel van enzyme engineering, waarbij een drievoudige mutant
(A242V/S132F/P67T, afkorting: ASP) gegenereerd werd met een sterk vergrote substraatspecificteit.144
Bespreking van de resultaten
53
De substraatspecificiteit van deze mutant bleek enorm breed te zijn en omvatte antrachinonen,