Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Boris Kuzman Povezanost funkcionalnog polimorfizma gena za GluR7 podjedinicu ionotropnog glutamatnog receptora (GRIK3) i razvoja ovisnosti o alkoholu Diplomski rad Zagreb, 2013. godina
65
Embed
Sveučilište u Zagrebu · PŽS – periferni živčani sustav RCLB – pufer za lizu eritrocita (red cell lysis buffer) RPM – okretaj u minuti (rotation per minute) RT-PCR –
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Sveučilište u Zagrebu
Prirodoslovno-matematički fakultet
Biološki odsjek
Boris Kuzman
Povezanost funkcionalnog polimorfizma gena za GluR7 podjedinicu ionotropnog glutamatnog
receptora (GRIK3) i razvoja ovisnosti o alkoholu
Diplomski rad
Zagreb, 2013. godina
Ovaj rad, izrađen na Institutu Ruđer Bošković, Zagreb, u Laboratoriju za
molekularnu neurofarmakologiju pod vodstvom dr. sc. Dubravke Švob Štrac,
znanstvene suradnice IRB, predan je na ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-
matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja zvanja magistra
eksperimentalne biologije.
Zahvaljujem svojoj mentorici, dr.sc. Dubravki Švob Štrac, koja me primila na
institut i usmjerila me k ovom projektu te je svojim znanstvenim i stručnim savjetima
oblikovala ideju i pomogla mi u izradi ovog diplomskog rada. Želim zahvaliti i svim
ostalim djelatnicima Insitituta Ruđer Bošković na razumijevanju, susretljivosti i vrlo
ugodnoj radnoj atmosferi.
Posebno se želim zahvaliti svojim roditeljima i sestri koji su me tokom čitavog
mog školovanja podupirali i poticali moju težnju k ostvarivanju sve viših i viših ciljeva.
Veliko hvala obitelji Fabijanić na bezuvjetnoj podršci i svemu što su učinili za
mene.
Hvala Andrei.
Zahvaljujem svim prijateljima i kolegama na nesebičnom razumijevanju, te što
su mi vrijeme provedeno na fakultetu uljepšali svojim prisustvom.
Hvala Maji jer zbog nje posljednje dvije godine smatram najljepšim dijelom
svoga života.
TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA
Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Diplomski rad
POVEZANOST FUNKCIONALNOG POLIMORFIZMA GENA ZA GLUR7 PODJEDINICU IONOTROPNOG GLUTAMATNOG RECEPTORA (GRIK3) I
RAZVOJA OVISNOSTI O ALKOHOLU
Boris Kuzman Rooseveltov trg 6, 10 000 Zagreb
Postoje brojni dokazi o uključenosti glutamata u akutne i kronične učinke alkohola, te pojavu ovisnosti i sindroma ustezanja, a glutamatni sustav predstavlja potencijalni cilj u liječenju alkoholizma. Nedavna istraživanja uputila su na povezanost alkoholizma i gena koji kodiraju podjedinice ionotropnih glutamatnih receptora. Cilj istraživanja bio je utvrditi postoji li u ispitanika hrvatskog podrijetla povezanost funkcionalnog polimorfizma Ser310Ala (rs6691840) smještenog u genu GRIK3, koji kodira za GluR7 podjedinicu glutamatnih kainatnih receptora, s rizikom razvoja ovisnosti o alkoholu. U tu svrhu u istraživanje je uključeno 275 ispitanika ovisnih o alkoholu, te 208 zdravih dobrovoljaca. U sklopu istraživanja željeli smo istražiti i moguće razlike u raspodjeli GRIK3 genotipova i alela između skupina ispitanika različitog spola i pušačkog statusa, te u ispitanika ovisnih o alkoholu podijeljenih s obzirom na suicidalno i agresivno ponašanje, početak zlouporabe alkohola, kao i na tip alkoholizma prema Cloningerovoj klasifikaciji. Rezultati pokazuju manju učestalost homozigotnog CC genotipa u ispitanika koji su počeli zloupotrebljavati alkohol prije 25. godine života, u odnosu na alkoholičare s kasnijim početkom zlouporabe alkohola. Daljnja istraživanja potrebna su daljnja istraživanja kako bi se razjasnila uloga gena GRIK3 u alkoholizmu. (58 stranica, 20 slika, 15 tablica, 131 literaturnih navoda, jezik izvornika: hrvatski) Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjižnici Ključne riječi: alkoholizam; glutamatni kainatni receptor; gen GRIK3, polimorfizam; rs6691840 Voditelj: Dr. sc. Dubravka Švob Štrac, znanstvena suradnica IRB Suvoditelj: Doc. dr. sc. Domagoj Đikić, PMF Ocjenitelj: Doc. dr. sc. Domagoj Đikić, PMF Dr. sc. Dubravka Švob Štrac, znanstvena suradnica IRB Doc. dr.sc. Inga Marijanović, PMF Rad prihvaćen: 28.11.2013.
BASIC DOCUMENTATION CARD
University of Zagreb Faculty of Science Division of Biology Graduation thesis
SER310ALA FUNCTIONAL POLYMORPHISM IN THE GLUR7 IONOTROPIC GLUTAMATE RECEPTOR SUBUNIT GENE (GRIK3) AND DEVELOPMENT OF
ALCOHOL DEPENDENCE
Boris Kuzman Rooseveltov trg 6, 10 000 Zagreb
There is accumulating data suggesting an involvement of glutamate in the acute and chronic effects of alcohol, including dependence and withdrawal, and glutamatergic system is emerging as potential target for alcoholism treatment. Recent studies have suggested an association of ionotropic glutamate receptor genes with alcohol dependence. The aim of this study was to examine the association of Ser310Ala functional polymorphism (rs6691840) in the GluR7 glutamate kainate receptor subunit gene (GRIK3) with the development of alcoholism. The study included 275 alcohol-dependent patients and 208 healthy subjects. Possible differences in the frequency of GRIK3 genotypes and alleles between subjects of different gender and smoking status, as well as between alcohol-dependent patients stratified according to aggressive and suicidal behavior, age of drinking onset, and type of alcoholism according to Cloninger’s classification were also studied. The results demonstrated lower frequency of homozygous CC genotype in patients who started abusing alcohol before 25. years of age in relation to alcohol-dependent subjects with the late onset of alcohol abuse. Further studies are needed to elucidate the role of GRIK3 gene in the development of alcohol dependence.
(58 pages, 20 figures, 15 tables, 131 references, original in Croatian) Thesis deposited in Central biological library Keywords: alcoholism; glutamate kainate receptor; GRIK3 gene, polymorphism, rs6691840 Supervisor: Dubravka Švob Štrac, PhD, Research Associate, IRB Co-supervisor: Dr. Domagoj Đikić, Asst. Prof., Faculty of Science, University of Zagreb Reviewers: Dr. Domagoj Đikić, Asst. Prof., Faculty of Science, University of Zagreb Dubravka Švob Štrac, PhD, Research Associate, IRB Dr. Inga Marijanović, Asst. Prof., Faculty of Science, University of Zagreb Thesis accepted: 28.11.2013
Literatura ..............................................................................................................................46
1. Uvod
1.1. Alkoholizam
Alkoholizam predstavlja naviku ili ovisnost o unošenju prekomjernih količina
alkoholnih pića. Karakterizira ga prinudna i nekontrolirana primjena alkohola koja
dovodi do štetnih utjecaja na zdravlje pojedinca. Iz tog razloga, Svjetska zdravstvena
organizacija (eng. World Health Organisation, WHO) 1952. godine definirala je
alkoholizam kao bolest, a ovisnika o alkoholu kao bolesnika kod kojeg se zbog
prekomjerne i dugotrajne primjene alkoholnih pića pojavljuje psihička i fizička
ovisnost, zdravstveni problemi i narušava se socijalni i ekonomski status. Magnus
Huss je 1849. godine skovao termin alkoholizam, a kasnije je zamijenjen u medicini
80-ih godina prošlog stoljeća, prema tadašnjim DSM III (eng. Diagnostic and Statistic
Manual of Mental Disorders) kriterijima, izrazima „ovisnost o alkoholu“ i „zloupotreba
alkohola“ (American Psychiatric Association, 1987). WHO procjenjuje da na svijetu
trenutno postoji oko 140 milijuna alkoholičara (Gro Harlem Brundtland, 2001), dok se
u europskoj populaciji alkoholizam javlja s učestalošću između 2% i 12% (WHO
global status report on alcohol, 2011).
Alkoholizam se prije svega očituje kroz snažnu želju za pićem i gubitak
kontrole nad konzumacijom alkohola, rezultirajući povećanom tolerancijom na
alkohol, simptomima ustezanja, te nemogućnošću osobe da kontrolira kompulzivno
opijanje usprkos svijesti o štetnosti po njegovo zdravlje (American Psychiatric
Association, 1994). Posljedice alkoholizma (Slika 1.) su brojni medicinski i
psihijatrijski poremećaji (Caan and Belleroche, 2002). Ciroza jetre, pankreatitis,
epilepsija, alkoholna demencija, povećan rizik od nastanka kardiovaskularnih bolesti,
poremećaji u prehrani, seksualna disfunkcija, rak, brojna oštećenja središnjeg
živčanog sustava (SŽS) i perifernog živčanog sustava (PŽS), neki su od potencijalnih
medicinskih problema, a u konačnici alkoholizam može dovesti i do smrti (Testino,
2008).
1
Slika 1. Dugoročni utjecaj alkohola na pojedinca (preuzeto i prilagođeno prema web stranici: http://www.ias.org.uk/Alcohol-knowledge-centre/Health-impacts/Factsheets/Alcohols-impact-on-the-
body.aspx)
Među psihijatrijskim poremećajima najčešće se pojavljuju anksioznost i
depresija (Wetterling and Junghanns, 2000). Žene ovisne o alkoholu, osim
anksioznosti i depresije, najčešće podliježu dodatnim psihijatrijskim dijagnozama kao
što su napadi panike, bulimija, posttraumatski stresni poremećaj (PTSP) ili granični
poremećaj ličnosti, dok muškarci ovisni o alkoholu često pokazuju simptome
narcisoidnog ili antisocijalnog poremećaja ličnosti, bipolarnog poremećaja,
shizofrenije, impulzivnog ponašanja, manjka koncentracije, te hiperaktivnosti (Karoll,
2002). Pokazano je da su žene osjetljivije na fizičke i mentalne učinke alkohola u
usporedbi s muškarcima, ponajviše zbog metaboličkih i hormonalnih čimbenika
*ukoliko je p<0,05 rezultat nije u skladu sa HW ravnotežom
4.2.1. Rezultati raspodjele ispitanika prema spolu
Tablica 10. prikazuje učestalost uočenih genotipova i alela za polimorfizam
rs6691840 u kontrolnoj skupini i skupini ispitanika ovisnih o alkoholu koji su
prethodno grupirani po spolu.
Tablica 10. Brojnost i frekvencije genotipova i alela za SNP rs6691840 po spolu u skupini kontrolnih ispitanika i ispitanika ovisnih o alkoholu
Kontrola
AA AC CC A C
Muškarci 91 (50,28%)
71 (39,23%)
19 (10,50%)
253 (69,89%)
109 (30,11%)
Žene 14 (41,85%)
9 (33,33%)
4 (14,81%)
37 (68,52%)
17 (31,48%)
Ukupno 105 (50,48%)
80 (58,46%)
23 (11,06%)
290 (69,71%)
126 (30,29%)
Alkoholičari AA AC CC A C
Muškarci 99 (44,80%)
105 (47,51%)
17 (7,69%)
303 (68,55%)
139 (31,45%)
Žene 24 (44,44%)
22 (40,74%)
8 (14,81%)
70 (64,81%)
38 (35,19%)
Ukupno 123 (44,73%)
127 (46,18%)
25 (9,09%)
373 (67,81%)
177 (32,18%)
Za polimorfizam rs6691840 učestalost nosioca genotipa AA naspram nosioca
alela C, te nosioca genotipa CC u odnosu na nosioce alela A, unutar kontrolne grupe
i grupe alkoholičara, također prethodno podijeljenih prema spolu, prikazuje tablica
11.
29
Tablica 11. Brojnost i frekvencije nosioca genotipa AA u odnosu na nosioce alela C i nosioca
genotipa CC u odnosu na nosioce alela A po spolu u skupini kontrolnih ispitanika i ispitanika ovisnika
o alkoholu
Kontrola AA C CC A
Muškarci 91 (50.28%)
90 (49.72%)
19 (10.50%)
162 (89.50%)
Žene 14 (51.85%)
13 (48.15%)
4 (14.81%)
23 (85.19%)
Ukupno 105 (50.48%)
103 (49.52%)
23 (11.06%)
185 (88.94%)
Alkoholičari AA C CC A
Muškarci 99 (44.80%)
122 (55.20%)
17 (7.69%)
204 (92.31%)
Žene 24 (44.44%)
30 (55.56%)
8 (14.81%)
46 (85.19%)
Ukupno 123 (44.37%)
152 (55.27%)
25 (9.09%)
250 (90.91%)
Razlike u raspodjeli genotipova i alela s obzirom na spol nisu pronađene (Slika
12.), ni unutar kontrolne skupine (pgenotipovi=0,7335; paleli=0,9629, χ2-test), ni u skupini
ovisnika o alkoholu (pgenotipovi=0,2401; paleli=0,4561,χ2-test ).
Slika 12. Raspodjela genotipova (gore) i alela (dolje) po spolu u skupini kontrolnih ispitanika i
ispitanika ovisnih o alkoholu
muški ženski0
25
50
75
100
125
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
u s
poj
edin
im g
enot
ipom
AAACCC
muški ženski0
25
50
75
100
125
broj
kon
trol
nih
osob
as
poje
dini
m g
enot
ipom
AA
ACCC
muški ženski0
50
100
150
200
broj
kon
trol
nih
osob
as
poje
dini
m a
lelo
m
AC
muški ženski0
50
100
150
200
250
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
us
poje
dini
m a
lelim
a
AC
30
muški ženski0
25
50
75
100br
oj k
ontr
olni
h no
sioc
age
notip
a A
A n
aspr
am C
AAC
muški ženski0
50
100
150
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
u n
osio
ca g
enot
ipa
AA
nas
pram
C AAC
muški ženski0
50
100
150
200
broj
kon
trol
nih
nosi
oca
geno
tipa
CC
nas
pram
A
CCA
muški ženski0
50
100
150
200
250
broj
oso
ba o
v isn
i h o
al k
oho l
u n
osio
ca g
enot
i pa
CC
nas
p ram
A CCA
Slika 13. Raspodjela nosioca genotipa AA u odnosu na nosioce alela C, odnosno nosioca genotipa
CC u odnosu na nosioce alela A po spolu u skupini kontrolnih ispitanika i ispitanika ovisnih o alkoholu
Razlike u raspodjeli nosioca alela AA, odnosno CC ni u grupi ovisnika o
alkoholu (pAA=0,9628; pCC=0,1027, χ2-test), ni u kontrolnoj skupini (pAA=0,8786;
pCC=0,5046, χ2-test, nisu pronađene (Slika 13.). Iz tog razloga u daljnjim analizama
ispitanici nisu bili dijeljeni u odnosu na spol. Obrađeni podaci genotipizacije nisu
ukazali na postojanje statistički značajne razlike u raspodjeli pojedinih genotipova,
alela i nosioca alela CC odnosno AA polimorfizma rs6691840 između ispitanika
ovisnih o alkoholu i zdravih osoba (pgenotipovi=0,2301; paleli=0,4821; pAA=0,2098;
pCC=0,4743, χ2-test).
4.2.2. Rezultati raspodjele ispitanika prema pušačkom statusu
Brojnost i frekvencije genotipova i alela za polimorfizam rs6691840 kod
zdravih ispitanika i ispitanika ovisnih o alkoholu, podijeljenih prema pušačkom
statusu, navedeni su u tablicama 12.
31
Tablica 12. Brojnost i frekvencije genotipova i alela za SNP rs6691840 kod pušača i nepušača unutar skupina alkoholičara i kontrolnih ispitanika
Kontrola
AA AC CC A C
pušači 39 (56,52%)
24 (34,78%)
6 (8,69%)
102 (73,91%)
36 (26,09%)
nepušači 66 (47,48%)
56 (40,29%)
17 (12,23%)
188 (67,63%)
90 (32,37%)
Alkoholičari AA AC CC A C
pušači 78 (48,75%)
70 (43,75%)
12 (7,50%)
226 (70,63%)
94 (29,38%)
nepušači 44 (40,74%)
52 (48,15%)
12 (11,11%)
140 (64,81%)
76 (35,19%)
Tablica 13. prikazuje podatke o učestalosti nosioca genotipa AA naspram
nosioca alela C, te nosioca genotipa CC u odnosu na nosioce alela A, unutar
kontrolne grupe i grupe alkoholičara podijeljenih prema pušačkom statusu.
Tablica 13. Brojnost i frekvencije nosioca genotipa AA u odnosu na nosioce alela C i nosioca genotipa
CC u odnosu na nosioce alela A kod pušača i nepušača u kontrolnoj grupi i grupi alkoholičara
Kontrola AA C CC A
pušači 39 (56,52%)
30 (43,48%)
6 (8,70%)
63 (91,30%)
nepušači 66 (47,48%)
73 (52,52%)
17 (12,23%)
122 (87,77%)
Alkoholičari AA C CC A
pušači 78 (48,75%)
82 (51,25%)
12 (7,50%)
148 (92,50%)
nepušači 44 (40,74%)
64 (59,26%)
12 (11,11%)
96 (88,89%)
Među podacima nije nađena statistički značajna razlika u raspodjeli određenih
genotipova i alela između kontrolne skupine ispitanika (pgenotipovi=0,4425;
paleli=0,1889, χ2-test) i ispitanika ovisnih o alkoholu (pgenotipovi=0,3462; paleli=0,1563,
χ2-test) kada ih usporedimo kao pušače i nepušače (Slika 14.)
32
pušači nepušači0
25
50
75
100br
oj k
ontr
olni
h os
oba
s po
jedi
nim
gen
otip
om
AA
ACCC
pušači nepušači0
25
50
75
100
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
u s
poj
edin
im g
enot
ipom
AAACCC
pušači nepušači0
50
100
150
broj
kon
trol
nih
osob
as
poje
dini
m a
lelo
m
AC
pušači nepušači0
50
100
150
200
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
us
poje
dini
m a
lelim
a
AC
Slika 14. Raspodjela genotipova (gore) i alela (dolje) između pušača i nepušača u skupini kontrolnih
ispitanika i ispitanika ovisnih o alkoholu
pušači nepušači0
25
50
75
100
broj
kon
trol
nih
nosi
oca
gen
otip
a A
A n
aspr
am C
AAC
pušači nepušači0
25
50
75
100
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
u n
osio
ca g
enot
ipa
AA
nas
pram
C AAC
pušači nepušači0
50
100
150
broj
kon
trol
nih
nosi
oca
geno
tipa
CC
nas
pram
A
CCA
pušači nepušači0
50
100
150
200
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
u n
osio
ca g
enot
ipa
CC
nas
pram
A CCA
Slika 15. Raspodjela nosioca genotipa AA u odnosu na nosioce alela C, odnosno nosioca genotipa CC u odnosu na nosioce alela A između pušača i nepušača u skupini kontrolnih ispitanika i ispitanika
ovisnih o alkoholu
33
S obzirom na pušački status, između kontrolne skupine (pAA=0,2195;
pCC=0,4441, χ2-test) i skupine alkoholičara (pAA=0,1966; pCC=0,3099, χ2-test),
statistički značajna razlika nije pronađena ni kod raspodjele nosioca alela AA
odnosno CC (Slika 15.).
4.2.3. Rezultati raspodjele ispitanika ovisnih o alkoholu
Ovisnici o alkoholu nadalje su razvrstani u podskupine s obzirom na rani,
odnosno kasni početak zlouporabe alkohola (prije ili nakon 25. godine), prema
prisutnosti agresivnog i suicidalnog ponašanja, te s obzirom na tip alkoholizma prema
Cloningerovoj klasifikaciji. Brojnost i frekvencije genotipova i alela svake od pojedinih
podskupina ispitanika ovisnih o alkoholu navedene su u tablici 14.
Tablica 14. Brojnost i frekvencije genotipova i alela za SNP rs6691840 u različitim podskupinama
ispitanika ovisnih o alkoholu
Alkoholičari
AA AC CC A C
Rani početak zlouporabe alkohola 42 (42,86%)
52 (53,06%)
4 (4,08%)
136 (69,39%)
60 (30,61%)
Kasni početak zlouporabe alkohola 81 (45,76%)
75 (42,37%)
21 (11,87%)
237 (66,95%)
117 (33,05%)
Prisutnost agresivnog ponašanja 35 (47,30%)
31 (41,89%)
8 (10,81%)
101 (68,24%)
47 (31,76%)
Odsutnosti agresivnog ponašanja 87 (43,50%)
96 (48,00%)
17 (8,50%)
270 (67,50%)
130 (32,50%)
Pokušaj suicida tijekom života 21 (42,96%)
22 (44,90%)
6 (12,24%)
64 (65,31%)
34 (34,69%)
Bez pokušaja samoubojstva tijekom života
101 (44,89%)
105 (46,67%)
19 (8,44%)
307 (68,22%)
143 (31,78%)
Alkoholizam tip I 107 (44,77%)
108 (45,19%)
24 (10,04%)
322 (67,36%)
156 (32,54%)
Alkoholizam tip II 16 (45,71%)
18 (51,43%)
1 (2,86%)
50 (71,43%)
20 (28,57%)
U tablici 15. prikazana je učestalost nosioca genotipova AA u odnosu na
nosioce alela C, te nosioce genotipa CC u odnosu na nosioce alela A, za svaku
podskupinu alkoholičara.
34
Tablica 15. Brojnost i frekvencije nosioca genotipa AA u odnosu na nosioce alela C i nosioca genotipa CC u odnosu na nosioce alela A u različitim podskupinama ispitanika ovisnih o alkoholu
Alkoholičari AA C CC A
Rani početak zlouporabe alkohola 42 (42,86%)
56 (57,14%)
4 (4,08%)*
94 (95,92%)
Kasni početak zlouporabe alkohola 81 (45,76%)
96 (54,24%)
21 (11,86%)
156 (88,14%)
Prisutnost agresivnog ponašanja 35 (47,30%)
39 (52,70%)
8 (10,81%)
66 (89,19%)
Odsutnosti agresivnog ponašanja 87 (43,50%)
113 (56,50%)
17 (8,50%)
183 (91,50%)
Pokušaj suicida tijekom života 21 (42,86%)
28 (57,14%)
6 (12,24%)
43 (87,76%)
Bez pokušaja samoubojstva tijekom života 101 (44,89%)
124 (55,11%)
19 (8,44%)
206 (91,56%)
Alkoholizam tip I 107 (44,74%)
132 (55,23%)
24 (10,04%)
215 (89,96%)
Alkoholizam tipa II 16 (45,71%)
19 (54,29%)
1 (2,86%)
34 (97,14%)
* frekvencija nosioca genotipa CC je značajno različita (p=0,0344, χ2-test ) između skupine alkoholičara s ranim početkom zlouporabe alkohola i alkoholičara s kasnim početkom zlouporabe alkohola
35
Raspodjela genotipova, alela i nosioca homozigotnih genotipova AA, tj. CC s
obzirom na prisutnost agresije u ispitanika ovisnih o alkoholu prikazana je na slici 16.,
a obrada podataka nije pokazala nikakvu statistički značajnu razliku
Slika 17. Raspodjela genotipova (lijevo gore), alela (desno gore) i nosioca genotipa AA u odnosu na
nosioce alela C, odnosno nosioca genotipa CC u odnosu na nosioce alela A (dolje) s obzirom na pokušaj suicida u skupini ispitanika ovisnih o alkoholu
37
S obzirom na Cloningerovu podjelu prema tipu alkoholizma, kod ispitanika
ovisnih o alkoholu također nije pronađena statistički značajna razlika u raspodjeli
genotipova, alela i nosioca genotipa AA i CC (pgenotipovi=0,3694; paleli=0,4964;
pAA=0,9164; pCC=0,1680, χ2-test). To je grafički prikazano na slici 18.
tip 1 tip 20
25
50
75
100
125
150
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
u s
poj
edin
im g
enot
ipom
AAACCC
tip 1 tip 20
50
100
150
200
250
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
us
poje
dini
m a
lelim
a
AC
tip 1 tip 20
25
50
75
100
125
150
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
u n
osio
ca g
enot
ipa
AA
nas
pram
C AAC
tip 1 tip 20
50
100
150
200
250
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
u n
osio
ca C
C n
aspr
am A
CCA
Slika 18. Raspodjela genotipova (lijevo gore), alela (desno gore) i nosioca genotipa AA u odnosu na nosioce alela C, odnosno nosioca genotipa CC u odnosu na nosioce alela A (dolje) s obzirom na tip
alkoholizma prema Cloningeru u skupini ispitanika ovisnih o alkoholu
Između ispitanika ovisnih o alkoholu s ranim početkom zlouporabe alkohola i
alkoholičara s kasnim početkom zlouporabe alkohola, obrađeni podaci raspodjele
genotipova, alela i nosioca genotipa AA pokazali su da ne postoji statistički značajna
razlika (pgenotipovi=0,0651; paleli=0,5210; pAA=0,2164; χ2-test). Međutim, analiza
podataka kod nosioca genotipa CC otkrila je da postoji statistički značajna razlika u
frekvenciji homozigotnog CC genotipa (pCC=0,0344, χ2-test). Ispitanici ovisni o
alkoholu koji su počeli zlorabiti alkohol nakon 25. godine imaju značajno veću
frekvenciju CC genotipa, u odnosu na alkoholičare s ranim početkom zlouporabe
alkohola. Grafički je to prikazano na slici 19. i 20.
38
rani početak kasni početak0
25
50
75
100
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
o hol
u s
po j
edin
i m g
enot
ipom
AAACCC
rani početak kasni početak0
50
100
150
200
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
us
poje
dini
m a
lelim
a
AC
rani početak kasni početak0
102030405060708090
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
u n
osio
ca g
enot
ipa
AA
nas
pram
C AAC
rani početak kasni početak0
50
100
150
200
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
u n
osio
ca g
enot
ipa
CC
nas
pram
A CCA
* *
Slika 19. Raspodjela genotipova (lijevo gore), alela (desno gore) i nosioca genotipa AA u odnosu na
nosioce alela A, odnosno nosioca genotipa CC (p=0,0344; χ2-test) u odnosu na nosioce alela A (dolje) prema početku zlouporabe alkohola u skupini ispitanika ovisnih o alkoholu
Rani početak
CC 4,12%A 95,88%
Kasni početak
CC 11.80%A 88.20%
Slika 20. Prikaz nosioca genotipa CC i nosioca alela A kod alkoholičara koji su ranije počeli zlorabiti alkohol (<25 godine života) naspram nosioca genotipa CC i nosioca alela A koji su alkohol počeli zlorabiti kasnije (>25 godine života). Prikazana razlika statistički je značajna (p=0,0344, χ2-test).
39
5. Rasprava
Glutamatni NMDA receptori danas se smatraju jednim od glavnih molekularnih
ciljeva alkohola u mozgu (Gass and Olive, 2008), te se većina istraživanja fokusirala
na ulogu glutamatnih NMDA receptora u djelovanju alkohola, za koji je pokazano da
djeluje inhibicijski na funkciju NMDA receptora u mozgu. Međutim iako se do sada
malo znalo o prilagodbama kainatnih receptora nakon kronične primjene alkohola,
posljednih godina kainatni receptori također su se pokazali kao značajni ciljevi
djelovanja alkohola u SŽS (Carta et al., 2003). Izloženost etanolu od 1-5 dana
selektivno je smanjila osjetljivost kainatnih receptora na male koncentracije kainata
(Dildy-Mayfield i Harris, 1992). Nadalje, uočen je povišeni broj ovih receptora u
hipokampalnoj regiji kod kronične primjene alkohola. Moguće je da povećanje broja
receptora kasnije uzrokuje inhibiciju GABAergičnih interneurona u hipokampusu
tijekom sindroma ustezanja (Carta i sur., 2002). To čini kainatne receptore glavnim
čimbenikom u okidanju hipokampalnih neurona, koje se smatra važnim
patofiziološkim čimbenikom odgovornim za napade uzrokovane ustezanjem i delirium
tremens (Dietrich i sur., 1997).
Nedavna istraživanja uputila su na povezanost alkoholizma i gena za
glutamatne receptore (Gass i Olive, 2008). Ta povezanost podržana je studijom koja
je mapirala 1p regiju kromosoma 1 (Lappalainen i sur., 2004). Naime, nekoliko studija
utvrdilo je povezanost alkoholizma i polimorfizama u genima GRIK1 i GRIK3, koji
kodiraju GluR5 i GluR7 podjedinice glutamatnih kainatnih receptora (Preuss i sur.,
2006; Kranzler i sur., 2009), potrebnih za formiranje funkcionalnih kanalića kainatnih
receptora.
Prijašnja elektrofiziološka istraživanja oba alela funkcionalnog polimorfizma
Ser310Ala gena GRIK3 u HEK 293 stanicama nisu pokazala da zamjena serina 310
s alaninom utječe na odgovor receptora na glutamat (Schiffer i sur., 2000). Međutim,
daljnja istraživanja ekspresije i karakterizacije posljedica potvrdila su funkcionalnu
značajnost polimorfizma. Prvo, uočena je niža ekspresija kainatnih receptora kod
nosioca T-alela (Ser310), pri čemu je u sedam od devet uzoraka ljudskog moždanog
tkiva pronađena smanjena ekspresija alela za 1,4 - 4,7 puta. Drugo, dok je ekspresija
alela Ser310 u okcipitalnom režnju korteksa, mezencefalonu, bazalnim ganglijima 40
malog mozga i talamusu bila značajno niža, u prednjem mozgu ekspresija alela je
bila dva puta veća.
Pojedina istraživanja pokazala su povezanost alkoholizma, posebice delirium
tremens-a tijekom ustezanja i Ser310Ala funkcionalnog polimorfizma u genu GRIK3
(Preuss i sur., 2006). Stoga smo u našem istraživanju željeli istražiti moguću
povezanost ovog genetskog biljega s razvojem ovisnosti o alkoholu u ispitanika
hrvatskog porijekla. Naime, pojedine studije nisu potvrdile navedene rezultate
(Samochowiec i sur., 2006; Grzywacz i sur., 2013), što bi se između ostalog moglo
objasniti i različitim podrijetlom ispitanika, s obzirom da se utjecaj genetičkih i
okolišnih čimbenika rizika može razlikovati između pojedinih populacija. Tako na
primjer uobičajeni okolišni čimbenici rizika, poput razine izlaganja alkoholu i
prosječne konzumacije alkohola, koji variraju između različitih zemalja, potencijalno
odražavaju smanjeni, odnosno povećani značaj genetičkih čimbenika u razvoju
ovisnosti o alkoholu. Stoga, iako su dosadašnja istraživanja počela rasvjetljavati
ulogu gena glutamatnih kainatnih receptora u razvoju ovisnosti o alkoholu, potrebne
su daljnje studije koje bi uključile različite etničke skupine, podtipove alkoholizma,
kao i brojne druge čimbenike. Premda je naš uzorak ispitanika velikim dijelom
sadržavao alkoholičare primljene na liječenje upravo zbog posljedica ustezanja
alkohola, u našem istraživanju nismo utvrdili povezanost Ser310Ala funkcionalnog
polimorfizma u genu GRIK3 i alkoholizma. Uz etničke razlike, naši rezultati se mogu
objasniti veličinom uzorka, odabirom ispitanika, genetskom strukturom populacije, ali
ne i razlikama u spolu, jer nisu utvrđene razlike u raspodjeli genotipova i alela za
polimorfizam rs6691840 između muškaraca i žena.
U našem istraživanju također smo željeli utvditi postoje li razlike u
frekvencijama genotipova i alela za rs6691840 polimorfizam u GRIK3 genu u
skupinama zdravih ispitanika i osoba ovisnih o alkoholu podijeljenih s obzirom na
pušački status. Naime, utvrđeno je da se alkoholizam i pušenje vrlo često javljaju u
kombinaciji, te da ovisnost o alkoholu i nikotinu dijele zajedničke genetske čimbenike
rizika (Bierut et al., 2004). Veliki broj radova pokazao je da su alkoholičari češće i
pušači za razliku od kontrolnih ispitanika, čemu u prilog idu i rezultati našeg
istraživanja koji pokazuju značajno veći broj pušača u skupini ispitanika ovisnih o
alkoholu u odnosu na kontrolnu skupinu (p<0,0001; χ2-test). Naime, u skupini
41
ovisnika o alkoholu 150 od 275 ispitanika puši, dok je u kontrolnoj skupini od ukupno
208 ispitanika pušača samo njih 69. To je dosljedno radovima koji pokazuju da
ovisnici o alkoholu imaju viši rizik pušenja naspram zdravih ispitanika (Schlaepfer et
al., 2008). Rezulti našeg istraživanja nisu ukazali na razlike u raspodjeli genotipova i
alela za Ser310Ala funkcionalni polimorfizam između pušača i nepušača niti u
kontrolnoj skupini niti u skupini alkoholičara.
GRIK3 gen povezuje se s poremećajima raspoloženja i ponašanja, često
kormobidnih s razvojem alkoholizma, poput bipolarnog poremećaja (Cherlyn i sur.,
2010), depresije (Schiffer i Heinemann, 2007, Sequeira i sur., 2009), anksioznosti
(Luciano i sur., 2010), te opsesivno–kompulzivnog poremećaja (Millet i sur., 2003),
dok mu određene studije daju važnost pri procesu oblikovanja ličnosti (Minelli i sur.,
2009). alkoholizam učestalo se povezuju s povećanim rizikom suicidalnog ponašanja,
a visoke stope pokušaja samoubojstva utvrđene su u osoba ovisnih o alkoholu
(Modesto-Lowe i sur., 2006, Flensborg-Madsen i sur. 2009). Stoga smo u našem
istraživanju osobe ovisne o alkoholu podjelili s obzirom na pokušaj samoubojstva
tijekom života. Iako sve više dokaza povezuje glutamatni sustav sa samoubojstvom
(Bernstein i sur., 2013; Sequeira i sur., 2009; Freed i sur., 1993), te ukazuje da
genetički čimbenici doprinose riziku pokušaja suicida (Tsai i sur., 2011), u našem
istraživanju nismo utvrdili povezanost rs6691840 polimorfizma sa suicidalnim
pokušajem alkoholičara.
Agresivnost osoba ovisnih o alkoholu još je jedan čimbenika koji je proučavan
u novijim istraživanjima (Kachadourian i sur., 2012; Klostermann i sur., 2009;
Träskman-Bendz i Westling, 2005). Stoga smo i mi u našem istraživanju željeli
utvrditi postoji li povezanost Ser310Ala funkcionalnog polimorfizma i agresivnog
ponašanja. Naši rezultati su pokazali da ne postoje razlike u frekvencijama
genotipova i alela ovog polimorfizma GRIK3 gena između alkoholičara sa i bez
agresije.
Upravo zbog velike heterogenosti između osoba ovisnih o alkoholu, pojavile
su se brojne dodatne klasifikacije, koje pokušavaju preciznije definirati specifične
podtipove (endofenotipove) alkoholizma (Leggio i sur., 2008). Cloningerova
klasifikacija (Cloninger i sur., 1988) razlikuje tip I alkoholizma s relativno kasnim
početkom, neurotičnim simptomima i minimalnim kriminalitetom, od alkoholizma tipa 42
II s relativno ranim početkom zlouporabe alkohola (u ranim dvadesetim godinama),
povišenom razinom antisocijalnog ponašanja i delikvencije koja često počinje tijekom
adolescencije. Umjereno nasljedan tip I alkoholizma, značajno je utjecan okolišnim
čimbenicima za razliku od tipa II alkoholizma, koji se smatra snažno nasljednim i na
kojeg okolišni čimbenici imaju ograničen utjecaj (Cloninger i sur., 1988). U našem
istraživanju statistički značajna razlika pronađena je u frekvenciji homozigotnog CC
genotipa (p=0,0465, χ2-test) između ispitanika ovisnih o alkoholu s ranim početkom
zlouporabe alkohola i alkoholičara s kasnim početkom zlorabljanja alkohola. Pokazali
smo da ispitanici ovisni o alkoholu koji su počeli zlorabiti alkohol nakon 25. godine
života imaju značajno veću frekvenciju CC genotipa, u odnosu na alkoholičare s
ranim početkom zlouporabe alkohola. Rani početak zlouporabe alkohola često je
ozbiljniji, s povišenim rizikom vraćanja ovisnosti, kao i pojave komorbidnih
poremećaja poput antisocijalnog poremećaja ličnosti (eng. antisocial personality
disorder, ASPD) i poremećaja ponašanja (eng.conduct disorder) (Dick i sur., 2006;
McGue i sur., 2001), te je mnogo češći u osoba s alkoholizmom tipa II prema
Cloningerovoj klasifikaciji.
Bez obzira na relativno mali broj ispitanika, koji je nedostatak i ograničenje ovog
istraživanja, naši rezultati su ukazali na moguću povezanost GRIK3 gena s
alkoholizmom. Ovakva istraživanja koja uključuju različite etničke skupine mogla bi
biti korisna u utvrđivanju genetskih varijacija glutamatnih kainatnih receptora i
funkcionalnih promjena GRIK3 gena povezanih s alkoholizmom. Naime, genetski
polimorfizmi GRIK3 gena mogli bi objasniti individualne razlike u gustoći i afinitetu
kainatnih receptora s obzirom da je utvrđeno da nosioci Ser310 alela imaju smanjenu
ekspresiju ovog receptora u određenim moždanim regijama. Stoga, iako su
dosadašnja istraživanja počela rasvjetljavati ulogu gena GRIK3 u razvoju ovisnosti o
alkoholu, potrebna su dodatna istraživanja koja će uključiti različite populacije i
obuhvatiti još više ispitivanih parametara, i to na većem broju ispitanika.
43
6. Zaključak
• Iako smo u sklopu istraživanja povezanosti funkcionalnog polimorfizma
Ser310Ala, smještenog u genu GRIK3, s rizikom razvoja alkoholizma u
ispitanika hrvatskog podrijetla, težili da sve uključene skupine ispitanika budu
prilagođene po dobi i spolu, skupina ispitanika ovisnih o alkoholu bila je
značajno starija od kontrolne skupine, pri čemu su i muškarci i žene ovisni o
alkoholu bili značajno stariji od zdravih muškaraca i žena. Međutim, premda su
u obje skupine većinu ispitanika sačinjavali muškarci, raspodjela po spolu nije
se značajno razlikovala između kontrolne skupine i skupine osoba ovisnih o
alkoholu.
• U skladu s literaturnim podacima, značajna razlika u učestalosti pušača i
nepušača utvrđena je između alkoholičara i zdravih ispitanika, odnosno u
skupini zdravih ispitanika postojao je manji broj pušača nego u skupini
alkoholičara.
• Učestalost opaženih genotipova polimorfizma Ser310Ala i u skupini ovisnika o
alkoholu i u kontrolnoj skupini bila je u skladu s Hardy-Weinberg-ovom
ravnotežom.
• U istraživanju povezanosti polimorfizma rs6691840 gena GRIK3 s rizikom
razvoja ovisnosti o alkoholu, nisu utvrđene značajne razlike u raspodjeli
genotipova i alela između ispitanika ovisnih o alkoholu i zdravih kontrolnih
ispitanika.
• Također, nisu utvrđene značajne razlike u učestalosti genotipova i alela
polimorfizma rs6691840 u odnosu na spol, niti u skupini zdravih osoba, niti u
skupini ovisnika o alkoholu, te stoga u naknadnim usporedbama ispitanici nisu
razlikovani po spolu.
• Rezultati istraživanja nisu pokazali razlike u raspodjeli varijanti polimorfizma
Ser310Ala gena GRIK3 između pušača i nepušača, u skupini ispitanika
ovisnih o alkoholu, kao ni u kontrolnoj skupini.
44
• Analiza genotipova i alela polimorfizma rs6691840 u skupini ovisnika o
alkoholu podijeljenih prema prisustvu agresivnog, kao i suicidalnog ponašanja,
nije utvrdila značajne razlike između ispitivanih skupina.
• Značajne razlike u raspodjeli genotipova i alela biljega rs6691840 nisu
utvrđene unutar skupine alkoholičara s kombinacijom ranog početka
zlouporabe alkohola i agresivnog ponašanja, što odgovara alkoholizmu tipa II
prema Cloningerovoj klasifikaciji, u odnosu na ovisnike o alkoholu s
kombinacijom kasnog početka zlorabljenja alkohola i bez agresije (alkoholizam
tipa I prema Cloningeru).
• Međutim, usporedbom osoba ovisnih o alkoholu samo prema početku
zlouporabe alkohola utvrđeno je da postoji statistički značajna razlika u
frekvenciji homozigotnog CC genotipa između alkoholičara s ranim i kasnim
početkom zlouporabe alkohola. Naime, rezultati su pokazali da ispitanici ovisni
o alkoholu koji su počeli zlorabiti alkohol nakon 25. godine života imaju
značajno veću frekvenciju CC genotipa, u odnosu na alkoholičare s ranim
početkom konzumacije alkohola (prije 25. godine života).
• S obzirom da rani početak alkoholizma često odražava veću težinu bolesti, viši
rizik ponovnog povratka ovisnosti, kao i pojave komorbidnih poremećaja poput
antisocijalnog poremećaja ličnosti i poremećaja ponašanja, a niža ekspresija
kainatnih receptora pronađena je u mnogim moždanim regijama nosioca T-
alela (Ser310), dobiveni rezultati mogli bi doprinijeti razjašnjavanju uloge gena
GRIK3 u ovisnosti o alkoholu. Naravno, u tu svrhu potrebna su daljnja i