プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 [email protected]1 www.promega.co.jp SV Total RNA Isolation System 日本語プロトコール No. TM048J 2001年 6月作成 カタログ番号 Z3100 および Z3101 I. I. I. I. I. はじめに はじめに はじめに はじめに はじめに ................................................................................ ................................................................................ ................................................................................ ................................................................................ ................................................................................ 2 II. II. II. II. II. キットの構成品 キットの構成品 キットの構成品 キットの構成品 キットの構成品 ....................................................................... ....................................................................... ....................................................................... ....................................................................... ....................................................................... 2 III. III. III. III. III. 考慮が必要な事項 考慮が必要な事項 考慮が必要な事項 考慮が必要な事項 考慮が必要な事項 .................................................................... .................................................................... .................................................................... .................................................................... .................................................................... 3 A. RNA の直接精製 ......................................................................................... 3 B. 精製した RNA のアプリケーション ............................................................ 5 C. RNase のない環境作り ............................................................................... 5 IV. IV. IV. IV. IV. RNA RNA RNA RNA RNA の単離と精製方法 の単離と精製方法 の単離と精製方法 の単離と精製方法 の単離と精製方法 ............................................................. ............................................................. ............................................................. ............................................................. ............................................................. 6 A. 溶液の調製 .................................................................................................. 6 B. 30mg 以下の組織からの細胞溶解液の調製方法 ......................................... 7 C. 30mg を越える組織からの細胞溶解液の調製方法 ...................................... 9 D. 培養細胞の溶解方法 .................................................................................... 9 E. 遠心法による RNA 精製 ............................................................................ 10 F. 吸引法による RNA 精製 ............................................................................. 11 V. V. V. V. V. RNA RNA RNA RNA RNA の収量と精製度の決定 の収量と精製度の決定 の収量と精製度の決定 の収量と精製度の決定 の収量と精製度の決定 ...................................................... ...................................................... ...................................................... ...................................................... ...................................................... 12 VI. VI. VI. VI. VI. 困った時には 困った時には 困った時には 困った時には 困った時には・・・ ................................................................. ................................................................. ................................................................. ................................................................. ................................................................. 14 VII. VII. VII. VII. VII. 参考文献 参考文献 参考文献 参考文献 参考文献 ............................................................................... ............................................................................... ............................................................................... ............................................................................... ............................................................................... 18 VIII. VIII. VIII. VIII. VIII.付録 付録 付録 付録 付録 ..................................................................................... ..................................................................................... ..................................................................................... ..................................................................................... ..................................................................................... 19 A. 白血球からの Total RNA の精製 ............................................................... 19 B. 植物組織からの Total RNA の精製 ............................................................ 20 C. グラム陽性 (B. subtilis) および陰性 (E.coli ) 菌からの RNA の精製 ......... 20 D. 酵母からの RNA 精製 ............................................................................... 21 E. 溶解液調整のためのヒント ....................................................................... 21 F. 接着培養細胞の回収方法 ........................................................................... 22 G. バッファーと溶液の組成 .......................................................................... 23 H. 関連製品の紹介 ......................................................................................... 24 簡易プロトコール 簡易プロトコール 簡易プロトコール 簡易プロトコール 簡易プロトコール ......................................................................... ......................................................................... ......................................................................... ......................................................................... ......................................................................... 27 目次 目次 目次 目次 目次 I. I. I. I. I. はじめに はじめに はじめに はじめに はじめに 組織や培養細胞から精製した RNA の精製度や完全性は、RT-PCR (a) や RNase protection asssy、プライマー伸長、ノーザンブロット解析、Poly(A) + RNA のオリ ゴ (dT) セレクション、in vitro 翻訳、cDNA ライブラリーの構築などのアプリケー ションが効率的に行われるために重要です。近年、RT-PCR が、少量の Total RNA や mRNA から特異的な mRNA を同定および定量するための強力な方法として登場 しました。RT-PCR を用いれば、cDNA ライブラリーの構築やスクリーニングの必 要なく、cDNA のクローニングも可能です。研究手段としての増幅技術の使用が拡 大するにつれ、高品質な RNA をゲノム DNA の混入なく少量の開始サンプル(組 織や培養細胞)から迅速に単離できる方法が必要とされてきています。SV Total RNA Isolation System は、これらの需要を満たすように作製されています。
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SV Total RNA Isolation System · SV Total RNA Isolation System ... ・ 1 Protocol 製品名製品名製品名 サイズサイズサイズ ...
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I I . I I . I I . I I . I I . キットの構成品キットの構成品キットの構成品キットの構成品キットの構成品製品名製品名製品名製品名製品名 サイズサイズサイズサイズサイズ カタログ番号カタログ番号カタログ番号カタログ番号カタログ番号SV Total RNA Isolation System 50 回分 Z3100
各システムには、組織や細胞または血液からの 50 回の Total RNA 精製に十分な試薬が含まれます。
II I . I I I . I I I . I I I . I I I . 考慮が必要な事項考慮が必要な事項考慮が必要な事項考慮が必要な事項考慮が必要な事項A. RNA の直接精製
インタクトなRNAを精製するには4つのステップが重要です。:効率的な細胞・組織の破砕、核タンパク質複合体の変性、内在性のリボヌクレアーゼ(RNase)の不活化および混入した DNA やタンパク質の除去です。最も重要なステップは、細胞破砕に伴い膜結合型オルガネラから放出される内在性 RNase を迅速に不活化する操作です。
SV Total RNA Isolation System では、細胞抽出液中に存在するリボヌクレアーゼを不活化するため、グアニジンチオシアネート (GTC) と ßメルカプトエタノール(BME)の変性特性および保護特性を組み合わせています(2)。GTC は SDS と結合すると核タンパク質複合体を変性する方向に働き、RNAが溶液中に放出されタンパク質の混入なく単離されるようにします。高濃度の GTC の存在下で細胞抽出液を希釈すると、細胞タンパク質が選択的に沈殿し、RNA は溶液中に残ります。細胞溶解液中の沈殿したタンパク質や細胞残さをを遠心によって除去した後、エタノールによって RNA を選択的に沈殿させ、Spin Basket 中のガラス繊維のシリカ表面に結合させることによって溶液中から回収します。各 Spin Column Assembly は、Spin Basket と 2ml の Collection Tube から構成されます。細胞溶解液から沈殿したタンパク質や細胞残さを効率良く除けば、これらの細胞溶解液の上清は遠心法または吸引法によって Spin Basket に結合させることができます。この結合はカオトロピック塩によって水分子の構造が壊されることによって急激に起こり、これにより核酸のシリカへの吸着が促進されます。混入したゲノム DNA を消化するため、RNaseFree DNase I を直接シリカメンブレンに添加します。結合した Total RNA は、簡単な洗浄ステップにより混入した塩やタンパク質、細胞中の不純物などからさらに精製されます。最後に、NucleaseFree Water を添加して Total RNA をメンブレンから溶出します。この手法を用いれば、有機溶媒による抽出や沈殿操作なしに、わずか一度の精製手順で高純度の Total RNA 画分を回収することができます。また、この手法は少量の組織や血液、あるいは培養細胞で容易に実施でき、複数のサンプルを処理するためにもご使用いただけます。
SV Total RNA IsolationSystem の構成品は、Wizard® Plus またはWizard® Plus SV DNAPurification System の構成品と組み合わせたり、代替品として使用しないで下さい。
50回分(カタログ番号Z3100): 0.5mLの ßMercaptoethanol (BME) を50ml の SV RNA Lysis Buffer に加える。または10 回分 (カタログ番号 Z3101):1 0 0 u L の ßMercaptoethanol
(BME) を 10ml の SV RNA LysisBuffer に加える。50 回分(カタログ番号 Z3100):NucleaseFree Water (添付) を凍結乾燥した DNase I の入ったDNase バイアルに記載されている量だけ添加する。または10 回分(カタログ番号 Z3101): NucleaseFree Water (添付) を凍結乾燥した DNase I の入ったDNase バイアルに記載されている量だけ添加する。
B M E B M E B M E B M E を添加した後、を添加した後、を添加した後、を添加した後、を添加した後、こ の スこ の スこ の スこ の スこ の ス テップを行ったボトルに印をテップを行ったボトルに印を つける。つける。SV RNA Lysis Buffer を 4℃ に保存する。
セクション IV. B、C、D には、様々なサイズの組織や細胞サンプルから溶解液を調製するための手順を記載しています。セクション IV. B には 30mg 以下の組織サンプルからの、セクション IV.C には 30mg 以上の組織サンプルからの溶解とホモジナイゼーションのプロトコールを記載しています。組織溶解液の調製方法に関する詳細はセクションVIII. E に示します。接着または浮遊培養細胞の溶解については、セクション IV. D にプロトコールを示します。セクション IV. E および IV. F ではそれぞれ、スピン法または吸引法を用いた溶解液からの RNA 精製プロトコールを示します。白血球細胞、植物組織、酵母やバクテリアなどの細胞から Total RNA を単離する場合は、セクション VIII.A ~ D をご覧ください。
B. 30mg B. 30mg B. 30mg B. 30mg B. 30mg 以下の少量の組織からの細胞溶解液の調製方法以下の少量の組織からの細胞溶解液の調製方法以下の少量の組織からの細胞溶解液の調製方法以下の少量の組織からの細胞溶解液の調製方法以下の少量の組織からの細胞溶解液の調製方法このプロトコールは、少量の組織サンプル処理のためのものです。一般的に 175µl
C. 30mg C. 30mg C. 30mg C. 30mg C. 30mg を越える組織からの細胞溶解液の調製方法を越える組織からの細胞溶解液の調製方法を越える組織からの細胞溶解液の調製方法を越える組織からの細胞溶解液の調製方法を越える組織からの細胞溶解液の調製方法このプロトコールでは 1ml の SV RNA Lysis Buffer を使用した組織のホモジナイ
注 意注 意注 意注 意注 意::::: このプロトコールでは、M i n i p r e pVacuum Adapters (カタログ番号 A1331) が必要となります。MiniprepVacuum Adapter を再利用される場合は、使用前に 0.1N NaOH、1mMEDTA で十分リンスした後、NucleaseFreeWater でさらにリンスしてください。
表表表表表 2. 2 . 2 . 2 . 2 . 組織および細胞からの組織および細胞からの組織および細胞からの組織および細胞からの組織および細胞からの Total RNA Total RNA Total RNA Total RNA Total RNA 精製後の平均収量精製後の平均収量精製後の平均収量精製後の平均収量精製後の平均収量
VII. 参考文献参考文献参考文献参考文献参考文献1. Otto, P. et al. (1998) Separate isolation of genomic DNA and total RNA from
single samples using the SV Total RNA Isolation System. Promega Notes 69,19.
2. Chirgwin, J.M. et al. (1979) Isolation of biologically active ribonucleic acid fromsources enriched in ribonuclease. Biochemistry 18, 5294.
3. Protocols and Applications Guide, Third Edition (1996) Promega Corporation.4. RNA Applications Guide (1997) Promega Corporation.5. Lehrach, H. et al. (1977) RNA molecular weight determinations by gel elec-
trophoresis under denaturing conditions, a critical re-examination. Biochemis-try 16, 4743.
6. Ausubel, F.M. et al., eds., (1993) In: Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley and Sons, New York, NY.
7. McMaster, G.K. and Carmichael G.G. (1977) Analysis of single- and double-stranded nucleic acids on polyacrylamide and agarose gels by using glyoxaland acridine orange. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 4835.
VI. VI . VI . VI . VI . 困ったときには困ったときには困ったときには困ったときには困ったときには・・・・・・・・・・・・・・・(((((続続続続続ききききき)))))
3. 1ml の Red Blood Cell Lysis Solution を添加し、4 ~ 5 回ピペッティングしてペレットを再懸濁する。備 考備 考備 考備 考備 考::::: 赤血球を溶解するには、最初の血液の 3 倍量の R e d B l o o d C e l lLysis Solution で十分です。大きいチューブ (溶解液全量が入る) を使用される場合にも、1 回の懸濁に 3 倍量の Red Blood Cell Lysis Solution を添加すれば十分です。
S V R N A R e d B l o o d C e l l L y s i sS V R N A R e d B l o o d C e l l L y s i sS V R N A R e d B l o o d C e l l L y s i sS V R N A R e d B l o o d C e l l L y s i sS V R N A R e d B l o o d C e l l L y s i s
Solut ion (Solut ion (Solut ion (Solut ion (Solut ion (血液からの血液からの血液からの血液からの血液からの RNARNARNARNARNA 精製用精製用精製用精製用精製用)))))5mM MgCl2
Total RNA 精製システム製品名製品名製品名製品名製品名 カタログ番号カタログ番号カタログ番号カタログ番号カタログ番号RNAgents® Total RNA Isolation System Z5110このシステムには、6×1g の組織または 6×108 個の培養細胞から、Total RNA精製をおこなうために必要とされる試薬がすべて含まれます。
Total RNA Total RNA Total RNA Total RNA Total RNA からのからのからのからのからの mRNA mRNA mRNA mRNA mRNA 精 製精 製精 製精 製精 製製品名製品名製品名製品名製品名 カタログ番号カタログ番号カタログ番号カタログ番号カタログ番号PolyATtract® mRNA Isolation System II Z5200このシステムには、1 ~ 5mg の Total RNA から mRNA の精製をそれぞれ 3 回行うために必要とされるすべての試薬が含まれます。
製品名製品名製品名製品名製品名 カタログ番号カタログ番号カタログ番号カタログ番号カタログ番号PolyATtract® mRNA Isolation System I Z5210このシステムには、1 ~ 5mg の Total RNA から mRNA の精製をそれぞれ 3 回行うために必要とされるすべての試薬が含まれます。Magnetic Separation Stand付き。
製品名製品名製品名製品名製品名 カタログ番号カタログ番号カタログ番号カタログ番号カタログ番号PolyATtract® mRNA Isolation System III Z5300このシステムには、100 ~ 1,000µg Total RNA から mRNA の精製を 15 回行うために必要とされるすべての試薬が含まれます。Magnetic Separation Stand 付き。
製品名製品名製品名製品名製品名 カタログ番号カタログ番号カタログ番号カタログ番号カタログ番号PolyATtract® mRNA Isolation System IV Z5310このシステムには、100 ~ 1,000µg Total RNA から mRNA の精製を 15 回行うために十分なすべての試薬が含まれます。Magnetic Separation Stand は含まれません。
Magnetic Separation 製品製品名製品名製品名製品名製品名 サイズサイズサイズサイズサイズ カタログ番号カタログ番号カタログ番号カタログ番号カタログ番号MagneSphere® Technology Magnetic 0.5ml Z5331Separation Stand (twohole) 1.5ml Z5332
12 × 75mm Z5333MagneSphere® Technology Magnetic 0.5ml Z5341Separation Stand (twelvehole) 1.5ml Z5342
12 × 75mm Z5343PolyATtract® System 1000 Magnetic Z5410Separation Stand
(a) The PCR process is covered by patents issued and applicable in certain countries. Promega does not encourage or supportthe unauthorized or unlicensed use of the PCR process.
(b) Patent Pending.(c) U.S. Pat. No. 5,552,302, European Pat. No. 0 422 217 and Australian Pat. No. 646803 have been issued to Promega
Corporation for the methods and compositions for production of human recombinant placental ribonuclease inhibitor (PRI).Inhibitors of Angiogenin, which comprises a segment of human PRI, is the subject of U.S. Pat. Nos. 4,966,964, 5,019,556and 5,266,687 assigned to the President and Fellows of Harvard College and exclusively licensed to Promega Corporation.
(d) U.S. Pat. No. 5,646,263 has been issued to Promega Corporation for a high efficiency method for isolating target substances using a multisample separation device. U.S. Pat. No. 5,693,784 has been issued to Promega Corporation formethods for creating agglomerates from colloidal particles.
(e) U.S. Patent No. 5,567,326 has been issued to Promega Corporation for a multisample magnetic separation device.
All Rights Reserved. MagneSphere, PolyATtract, RNAgents, RNasin, VacMan and Wizard are trademarks of Promega Corporation and are registered with the U.S. Patent and Trademark Office.
Series 9600 is a trademark of Promega Corporation.
LuerLok is a registered trademark of Becton Dickinson. Omni is a trademark of Omni International.Tissuemizer is a trademark of Tekmar, Inc.
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この簡易プロトコールは、SV Total RNA Isolation System に習熟したユーザーが簡単に流れを追えるように意図して作製されました。初めて SV Total RNA Isolation System をお使いになるときには、詳細なプロトコールにしたがってください (セクション IV)。
SV Total RNA Isolation System: 簡易プロトコール
実験を始める前に実験を始める前に実験を始める前に実験を始める前に実験を始める前に ßMercaptoethanol(BME)が SV RNA Lysis Buffer に添加されているかどうか、また SV RNA Wash Solution および SV DNase Stop Solution にエタノールが添加されているかどうかを確認する(セクション I V . A を参照)。凍結乾燥した DNase I に、バイアルに指示された量の NucleaseFree Water を添加する。ボルテックスは行わないでください。Vacuum Adapte rs (カタログ番号 A1331) は吸引法で行う際に必要となります。