Top Banner
Sustained Hydrogen Photoproduction by Chlamydomonas reinhardtii: Effects of Culture Parameters Sergey Kosourov, * Anatoly Tsygankov, * Michael Seibert, Maria L. Ghirardi Basic Sciences Center, National Renewable Energy Laboratory, Golden, Colorado 80401; telephone: 303-384-6312, fax: 303-384-6150; e-mail: [email protected] Received 10 August 2001; accepted 3 January 2002 DOI: 10.1002/bit.10254 Abstract: The green alga, Chlamydomonas reinhardtii, is capable of sustained H 2 photoproduction when grown under sulfur-deprived conditions. This phenomenon is a result of the partial deactivation of photosynthetic O 2 - evolution activity in response to sulfur deprivation. At these reduced rates of water-oxidation, oxidative respi- ration under continuous illumination can establish an anaerobic environment in the culture. After 10±15 hours of anaerobiosis, sulfur-deprived algal cells induce a re- versible hydrogenase and start to evolve H 2 gas in the light. Using a computer-monitored photobioreactor system, we investigated the behavior of sulfur-deprived algae and found that: (1) the cultures transition through ®ve consecutive phases: an aerobic phase, an O 2 -con- sumption phase, an anaerobic phase, a H 2 -production phase and a termination phase; (2) synchronization of cell division during pre-growth with 14:10 h light:dark cycles leads to earlier establishment of anaerobiosis in the cultures and to earlier onset of the H 2 -production phase; (3) re-addition of small quantities of sulfate (12.5±50 lM MgSO 4 , ®nal concentration) to either syn- chronized or unsynchronized cell suspensions results in an initial increase in culture density, a higher initial speci®c rate of H 2 production, an increase in the length of the H 2 -production phase, and an increase in the total amount of H 2 produced; and (4) increases in the culture optical density in the presence of 50 lM sulfate result in a decrease in the initial speci®c rates of H 2 production and in an earlier start of the H 2 -production phase with unsynchronized cells. We suggest that the effects of sulfur re-addition on H 2 production, up to an optimal concentration, are due to an increase in the residual water-oxidation activity of the algal cells. We also dem- onstrate that, in principle, cells synchronized by growth under light:dark cycles can be used in an outdoor H 2 - production system without loss of ef®ciency compared to cultures that up until now have been pre-grown under continuous light conditions. ã 2002 Wiley Periodicals, Inc. *Biotechnol Bioeng 78: 731±740, 2002. Keywords: algae; hydrogen production; photobioreac- tor; sulfur deprivation; hydrogenase; oxygen sensitivity INTRODUCTION Photosynthetic production of H 2 from water is a bio- logical process that can convert sunlight into useful, stored chemical energy. This basic phenomenon has been known for 60 years (Gaffron and Rubin, 1942), but little progress has been reported on the biotech- nology of the process. Hydrogen production is a prop- erty of many phototrophic organisms (Appel and Schulz, 1998; Asada and Miyake, 1999; Weaver et al., 1980), and the list of H 2 producers includes several hundred species from different genera of both prok- aryotes and eukaryotes (Boichenko and Hoffmann, 1994). Phototrophic H 2 producers include photosyn- thetic bacteria, cyanobacteria and green algae, but not plants. Hydrogen production in photosynthetic bacteria and cyanobacteria is mediated primarily by the nitro- genase enzyme system that requires high-energy input in the form of ATP (Gogotov, 1978; Rao and Hall, 1996; Tsygankov et al., 1999). The enzyme-mediating H 2 production in green algae is a reversible (or bidirec- tional) hydrogenase that catalyzes the following ferre- doxin (Fd)-linked reaction in the absence of ATP input (Boichenko and Hoffman, 1994): 2H 2e ! hydrogenase H 2 Hydrogenase activity appears after several hours of anaerobic induction in the dark (Garon and Rubin, 1942; Happe et al., 1994; Roessler and Lien, 1984), and H 2 -photoproduction depends on low potential electrons supplied to ferredoxin by the photosynthetic electron- transport chain (Appel and Schulz, 1998; WuÈnschiers et al., 2001). The reversible hydrogenase accepts elec- trons from ferredoxin and reduces protons to H 2 . Two mechanisms have been proposed in green algae to ac- count for the origin of reductants involved in the photoproduction of H 2 . The ®rst involves the photo- synthetic water-splitting process of Photosystem II (PSII) and subsequent transport of electrons from water to ferredoxin through Photosystem I (PSI). This process results in the simultaneous release of both O 2 and H 2 Correspondence to: Maria L. Ghirardi Contract grant sponsor: U.S. Department of Energy H 2 program Contract number: DE-AC36-99-GO10337 *On leave from the Laboratory of Biotechnology and Physiology of Phototrophic Organisms, Institute of Basic Biological Problems, Russian Academy of Sciences, Pushchino (Moscow Region), 142290, Russia. ã 2002 Wiley Periodicals, Inc. *This article is a US Government Work and, as such, is in the public domain in the United States of America.
10

Sustained hydrogen photoproduction byChlamydomonas reinhardtii: Effects of culture parameters

May 01, 2023

Download

Documents

Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Page 1: Sustained hydrogen photoproduction byChlamydomonas reinhardtii: Effects of culture parameters

�������� �� ��� �� � �� ���� � ������������� �� ����� � ������� �������� ����������

������ � � �� ��� ���� �� ������� ��� ������ �������� ���� !" #������

����� �������� ����� ������ ��������� ������ ���������� �������������� ������ �������� !�!"!��"#!�$� %�& !�!"!��"#�'�� �"(��� (����)��������*����+��,

�����,�� �� -.�.� $���� ������� ! /��.��� $��$

012 ��+���$3��+��$'�

��������� ��� ����� ��� ���(���(���� ���������� �� ����� �� ��������� �� ���������� ���� ���� ���������� �������������� ���������� ���� ���������� �� ������ �� ��� ������ ��� �������� �� ������������� ����������� � ������ �� �������� �� ����� ������������ ������� ���� �� ����� �� ��������������� ��������� ������������ ����� ��������� ���������� �� �������� ���������� ����������� �� ��� ������ ����� !" # ������� ������������ �������������� ��� �� ���� � � ���������� ����������� ��� ����� �� ����� �� ��� �� �������� $���� � ����������������� ����������� ��������� �� ������������ ��� �������� �� ������������������ ��� ����� ����� % & ��� ������ ���������� �������'�� ���� ����� ������� �� ������ ����� �� ��� ����������� ����� �� �������� ����� � �������� ��������� ��� � ����������� �����( %�& ��� �����)����� �� � �������� ������ ���������� ���� *� ! � ��������+ � �� ���� �� ������ ������������ �� ������������ ����� ������ ��� �� ������ ����� �� ��� �������� ���������( %,& ����������� �� ��� -��������� �� ������% ��#"#! �4 .�/�* '�� �� ���������& �� ������ ���� �����)�� �� ����� �����)�� � ����������� ������ ���� ������ �� ����� �� ����� ������� � ������ ��������� �' ���� �� �� ����� ���� �� �� ����� �� ��� ������� ��� �������� ���� ����� ��� �� �� ����� �� ��� ���������� �� �� ����� ��( ��� %*& �� ������ �� ��� ��������� � ������� �� ��� ������ � �� #! �4 ������ ����� ��� �� ����� �� ��� ������ ��� �' ����� �� �� ����� ������� �� �� ������ ����� �� ��� �������� ���� ����� ��������� �����)�� ��� 0� ������� ���� ��� ���� �� ������� ����������� �� �� ����� ���� �� �� �� ������ �� ��������� ��� ��� �� �� �� ����� �� ��� ���������������������� � ������ �� ��� ��� ��� 0� ��� ������������ ���� �� ���� ��� �� ��� �����)�� �� ����������� ��������+ � �� �� �� ���� �� �� ������� �������� ���� ������ ������� ��� �� ��' ��� � ��������� ������ ���� �� ���� ��� ���� ���� ��������� ����� ��������� ���� ���������� � �!!� 0��� 1������ �� 2� ����������� ������ $%& 3, "3*! �!!�����' ��& ����( �������� ����� ����( ����������� ����( ����� �����������( �����������( ������ �����������

()�*+,-��(+)

������������ � ������� �� �� � �� ��� � � ��������� � ���� ���� ��� ���� � ������� ��� ��������� � ������ � ��� ��� ���� �������� ����� ����� �� � �� � !"��� �� ��� #���� $%&�'���� ���� � �� �� ��� �� �� �� �� �� ������������ �� �� � ����� ��� ��� � ������� � � � ��� �� �� ���� ������ ���� � ������ !(��� ���)����*� $%%+, (���� ��� -���� $%%%, .�� � ���� $%+ '� ��� �� ��� �� �� � ���� � ������ �� ������ � ���� � �� ��� �� �� � �� ���� � ���� ���� ��� ��� ���� !/������ ��� ���������$%%&'� ������ ���� �� � ���� � ����� ������������� ���� �� ��������� � ��� � � ����� ��� ���������� ��� ��� � ������� � ������������ ���� ���� ��������� � � ����� � �� �� �� �� �� ������ �*�� ����� ���� 0� � ����� �� ���� ��� �� � �� (�� !"������� $%1+, #�� ��� ����� $%%�,��������� � ���� $%%%'� �� �*��������� ��

� ������� � � � ���� � � � ��� !� �� �������' ��� ����� ���� ������*� �� �������� � ���2� !3�'����� ����� � �� ����� �� (�� ����!/������ ��� �������� $%%&'4

��� � �� ���������� �������

��� ����� ������ ���� � ��� �� �� ��� � ����� ��� ������� � �� �� � !"�5 �� ��� #����$%&�, ���� � ���� $%%&, #���� ��� 6�� $%+&'� ������������ ������� ����� �� ��� ������� ��� ��������� �� � ��2� �� �� ������������ ��� ���� ����� � ���� !(��� ��� )����*� $%%+, .�7 ���� �� ���� � $'� �� � ��� ��� ����� ������ ���� ��� � �� � ��2� ��� ���� � ����� �� ��� ����������� ��� �� � ����� � � � ���� �� �������� �� �� � �� �� �������� ������ � �������� ������� �� ��� �� 8 �� ������ �� ������������� ��� �������� � ���� �� ���������� 99!�)99' ��� ����0��� � ����� � �� ��� ��� � �� ��� �� � ��2� �� ���� ���������� 9 !�)9'� ��� � ���� ����� � �� ���������� ��� �� ���� :� ��� ��

������������� �� -� � 6� "� � �

;��� ��� � ��� ������ 4 <�)� =�� ���� �� >� �� �� � �� ��

;��� ��� ���� 4 =>�(;?��%%�":$ ??1

�:� ��� � �� �� 6��� ��� � �� /���������� ��� ��������� ��

������ ���� : ������� 9������ �� /��� /������� � ������

#����� (����� �� )����� �������� !-����� #���'� $&��% �

#�����

� �!!� 0��� 1������ �� 2� � ����� ���� � �� � $/ 4��������� 0��+��� �� �� � �� �� ��� ���� ������ �� ��� $����� /����� �� ����� ��

Page 2: Sustained hydrogen photoproduction byChlamydomonas reinhardtii: Effects of culture parameters

��� � ��2��� ��� ���� �� �� :� ��� �� � �� $ �� �������� ���� !" ����� � ���� $%+?'� <��� ��������� �� � ��� ��� ����� � � � ���� ������ ����� �� :�� ���� � ���� �������� ���*��@� ������ ���� ����� !"� � � � ���� $%%1'��� ����� ������� ����� �� �� ������� �2������ �� ��� � � ���� ��������� ���� � ������ ���)9 �� ���� �� ������0���� ���� ��� ����� � ������ � ������� ��� ;:� ��� !"��� ��� "����$%+&, "��� � ���� $%+�'� /���� ��� ������� ���� 0� � ����� ������������ :� ������� � ����� ��� ���� ����� �� �� ����� ��� ���� ����� �� � �������� ����� � � 0����� ���� � :� ������� ������� (� � ����0���� ������ ������� �� �� ������ ����� � � ��8���� �� ������� �� ������� ����� ����� �� :� �� ��� �� �� ��� ��������������� ���� �� � ����� ����� ���� �� � � ���� �� ������ �� � ����� ���� ������ �������

/��� ������ ��� �������� ������ ��� �������� �� ��� :� � ����� �� �� ������������� ������ �� �� ����� ����� ��� ��� ������ �������� �� :� ������ � !����� $%1 , #���� ���)�� � $%+A'� �� �� �� ���� �������� !#���� ���)�� � $%+A'� ��� �� ��� �� ����� � ��� � � ����!"��� ��� "���� $%+&, " ������ $%+�'� ���� ���� ��� ������ � 2���� ���� ������� ���� ���������� ��� ��� � �������� � ����� ��������� �� �� ���� �� �� � ������� ���� ����� ��������� ��� �� �� �� ��� ����� ������ ��������!/� ��� � ���� � '� 9� �������� �� ���� ���������� �� � ������� � � � ���� ��� ������������ �� ���� ��� � ��� �� ��� ��� ���� ������ �� 8 �� ������ �� �� ���� ��� �������� �� ���� ������ �� ���������� ����������������� ��� �� ��� :����� ���� ��� ��� ������� ��� �� ����� ������ ������ �� ������ �������� ��� � ��� �������� !"� � � � ���� $%%1,)� � � ���� $%%+, � $'� �� ����� ��� ���� ����� �� �� ���� �� ��� ���� �� :� ������� ����� � �������� ��� ��� � ���������� �������������� �� ������ �� ����� � �� ����� � �� �� � �������� !-�� � ���� � '� 9� �� ����� �� ����� ���� �� � ��� �� ����� �� ���������� ���� ��� �)99������ � ����� (�� ����� � B�& ��� � �� ����� �� ������ :� ����� �� �)99 �� ��� �� �� ����� :� ����� �� �� ����� (�� ��� ����� �� ���� �� ��� ����� ������� :� ��� �� ���� �������� �� �� ����� ��� ���� <�� ��� ���������� �� ���� ���� � � ��� ��� ����� ���� ���� �� �� �� �� & ���� !"� � � � ���� � �,-�� � ���� � '� ;���0������ �� ����� �� ������� �� � �� �� ����������� �� :�� ��������� � ������� �� ���� �� � ������� ����� )����0������ � ������ � ����� �� �� ����� � �� ������� ���� �� ����� �A ��� �������� ����� ����� � ���� ��� �� � ������� ��� � ��� ��!"� � � � ���� � �'�

3������ �� ��� ����� � �� � ��� ���� �� ������������� ����� �� � �������� ���� � ��������� ���� ��� ������ ��� �� ����� 9� ��� ��� ������������ �������� � � ��� ��� ����� ���� ���������� � �� � ��� �� ��� :� !��� ��� ���� �������� � �������' � �� ����� ����� �� ����� ����� �� ������������ :� ������� ������ �� ���� �� �� ��� ����� �*�� � ����� ����� �� ������ �� � ������� � ��� ����� �� �� ����� :� ����

9� �� � ��� ������ � ��� �������� �� 5����� ����� ��*���� �� ��� ������ ������� �� ��� ����� ������ ����� �� ����� �� ����� ����������� ��� ��� ����� �� �� ������ ������� �� ������������ ���� �� ��� �� �� �� ����������� ����������� ����� �� �� ����� �� �� � �� � ��������� � ���� �� �������� ������� ���� ��������� ��� ������������ ����� �� � ������� ����� �� ��������� ��� ��� ������� �� ��� � ���� ����� ����� ������

���*(�!� �), ��+,�

���� #� '��

�� ���������� ����������� �� �� ��$�&� ��� � ���������� �� �������� �� � ����������������!�(�' ����� �� � 1��� � C�� ����� ������ ����� �� �� ����� �A�;� (���� ��� ���� � ����� ��� ���� ��������� �� :� ������� ������ � ����� ������ ����� ���� !��������� �����'� =� ��� ����� �� ����� � � ����������� �������� ����������� C�� ���� ���� !� � �> � ��� � ��$' ��������� ��� ?� ;:� � � � �� ��� �2�� ��� �� ��*� ���� ��� �� 8�� � ��� � �� �� �� �*!(� � ?1 �3� "���� )����� 9���� (�� ( �� � -9'�(���� ���� � � ��� �� �� ������� ���� ����!�BA � $ � ���� � �6�$'� �� ���� �� ��� ������� ��� � �� A ��� ����� A ��� � �(������������ ����� ��� ������� � �� ��� ���� �� � 8��������� ���� �� ����� %B$� �� ;�� � �6�$ !&BA � $ �

���� � �6�$'��� ����� ����� ����� �� �� ���������� ���� ���

����� �� ��� ����� ���� ��� �� � !$&�� ����4 $ �� �� �' � ��� ��� ������� �� ���� ������ ���� ����� � �� � ��� ��� ����� �� ����� �AB$ � $ �

���� � �6�$� 3�� $ ������ ��� ���� ����� �������� ����� ��� ����� � �� ����� �� ����������� ���� �� ��� �� ��� �� �� �� �� �4�������� ����� ���������� ��� �� �� ������������ ��� ����� )����� �� ���� $ � ��� �� �� ��� ���� � ������ !�$ � =D6' ������ �� �� ������ � ������ ���� ���� �� ��� ���� ������� ��� ����� ��� � �� ����� ������� �� �� ��$&�� ���� � �� !E& ��� E% � =D6'� 9� ��� �������� ����� ��*� ����� � � �� ���� & � ��� �������� �� ���� ����� ����� ��� �������

3,� 52��67�8�9�4: �8; 52�6842866<284 =�9� 3> 8�� 3 ?$86 ,! �!!�

Page 3: Sustained hydrogen photoproduction byChlamydomonas reinhardtii: Effects of culture parameters

� �(������������ ���� �� ��� �� ����� ����� ����� �� � �� ��� ���� ��� ����� ���� ��� ���� � 2� ���� ������� ��� ��� ���� ������� �������� ����� �� ����� �� ��������

.� ����� � ������

/��� ����� ��*� ��� ������� ��*� ����� ��� ����� ��������� � ����� � ��� �� ��� ���������� ����� ����� ������� ���� � !A��� ������ �����$���6 ����� �����, � ������ ��� � 3�� ��'� ������� ���� � ����� � ��� ��������� ������� ���������� �� �? �> � ��� � ��$ !���� & �. �������� C�� ���� �����' �� �+ F $�A�; �� �� �� $& ���� ����� ����� � ��� �� ������� ���� � � �2� ����������� ��� ������ �� � !�;�$?$�;� ��� 9���� ;� ���� GH' �� ����� & BA �� ���������� � ��A��� �� �� �� 3�� ��������� ������ ������� �� ��� � �� ��� �� �� ����� �� ���� ����� � ����� � ������������ ��� ���������� � ��� �� �� ��� ������� ���� �� ( ��������� �� ������ *� ����� �� ����� � ����� �3�� �� ��� ������� �� �2 �����4 � ������� ���� ��� ���� �� � ��������0�� ���� ��� ����� � �0�������������� ������ � ������� � ����� � ������

������ �� ������� �� ���� �� ����� ��*� �� ���������� ����� �

!��������� � � � A � A ��'� ;��� � � ��� ��������

�� �������� �� �(� ���� ��� � $&�� ����4$ �� �� � ���� ��

����� �A�; ��� �� ���� �� �� ������ ����� �� �� ��

�� �4���� ����� 3� 2����� �$ ��� ���� $ ��� ��� ��

� ������ � �� �� �� � �� �� ���� � �� !=D6'� ��� E& ���

E% ��� � ���� & � % ��� � ��� �� � ������ �� �� ����

� ���

������ � !�' ������ ��� �� �� �� �� ��� ������� ���� � ���

������� ��� ��� ��� � ��������0�� ���� ��� ���� ��� !�' ����

���� �� �� �������� ����� �� ����� �� ������� ���� � ����

� ���� �� ���� ����� ��� �� ����� ����� �� �� ������� �����

���� ���� �� � �� �� ����� ���� ���� ��� �� �� �� ��� ������� �

���� �� !$' �� ������� ���� � !�' �� �� ���� ����� �� �������

�0�� ���� ���� !?' �� �0�������������� ������ !&' �� �������

!A' �� �� �� ����� ������ ��� !�' �� ������ ������ � ) ��

-�� ��� ��� -����� �� �� ������

@�/�$<�= 6� �9�� 1�<�.6�6</ �AA67�284 �94�9 �:;<�468 1����1<�;$7�2�8 3,,

Page 4: Sustained hydrogen photoproduction byChlamydomonas reinhardtii: Effects of culture parameters

��� ���� �� �� ����� �� �� �� ����� ���� ���� � !�;(��$?AD6� (�������� )�������� ;('� ��� ������� ������ � >��� ������� ���� ��� �� �� ���� ������� :� !�:�'� ��2 !>�'� ��� �� !��� ��������� ��� ���� ' ��� ���, �� �� � �� ����� ������� � ������ �I����, ��� �� �� � �� ���������� �� 0������ �� ��� � ����� �� �� ����� ����� ��� ���� � �� �� ��������� �� ��� � �� �� ��������0�� ���� ��� ���� �� �� �0�������������������� . ��� � ������ ����� ���� ���� �� �� ������� ���������� � �� �������� ����� ��� �� 2�� ����� �������� � ��� ��� !-�� � ���� � '��� ������ � �� ���� �� ��� ����� � ����� ���� � ����� ������ !-��� J9�$� � (������� G������� �(' ������� �� �� �;(��$?AD6 ���� ��� ��� �� #)��?� �� �� �� ��������0�� ���� ��� ������ ��� ��� ��� � ��� ������ ��� ��� � ��� �� ���� ���� �������� ��� � ��� ������ � �� ������� ?�� 3������ �� ��� ��� �� �� ����� �������������� �� ��� ������ � ��� ��� �� ���� ��� ����� � ������� �� 8 �� ������ !��� �;(��$?AD6�� �� ����� ���� ��� �� �� �� ��� � 9�;��� ������, (�������� )�������� ;(' � ����� ������ � �� ���� ������ �� �� ���� � ��� �������� �� ��� �� ��� ������� ���� � ���������� ������� !� ������99� & -�*� ������ �������' ������ �� ���� ���� �� �� ���� � ��� �� ����� ������ �� �� �� ��� �� �� ��� � ���� � � ��������� ���� �� /��� ������ � ��������� �� ��#)��?� �� �� /�� ��� 2� ���� �� ������� ����� � !��� �� ��� ��� � ���� ��� ����� ������'� ����� �� �� ��� ��� ���*�� ������������ ��� ��� �� �*� � �� ��������� . ��� ���������� ����������� ��� ���4 9�� � ?$ !�� ������ ��� ' ��� ��&+ A�=�()�);�K+)D$� ! ��2�������'� ���� � ��-��� ������ � ���� (���������9��� !.��� �� -(', ��� � ����� ���� �� ���� ��!������� :�'� �� ����� � �� ;�� �� � 9��� ����;�� !J ��� ����� 96'� �� ���8� ��� �� �� � �������� � ��������� �� �� ������ �� �� ���� �������� ���� !�� �� �� 8 �� $ B$A �' ��� 2� ��� �� ������ �� ���� ������ ������ ����� � �� ����� � ����� � �� ���� ���

.� �������� ������

�� ������� �� �� ��� ����� ������ � ����� ������� ������ �� �� �� �� �� � ������� � �� ��������� ������ � $?�A��6 ���� ����� ����� �� ������������� $ �6 �� $ �� �2�*� ����� ������ �A �� ����������������� ���� !�� � ��%' ��� ��� �D� � ��� L $ � � C���� �� � �� ������ � �� ( ���� ���� $ �6 �� ��� ��� $ ��G� ������ ������� ��� ���� �� �� ���� �� ����� ����� ������� �� ����� ��� � �� �� ��?1�; � �� �� � ��� ��� �� �� �I���� $ �6 �� ���

� ��� ��� �������� ���� � ���� � �� �� �� ����� � ��� ��� � ������� ��� ���� � ��� � ����� ������ ��� !-��� ?1 , J� ��� ���� (���� ;('�� $A ����� ��� �� ���� �� ��� 2� ��� �� ������ �� ����� ���� ������ ������ �����

������������ :� ������� ��� �� � �� ����������� � ���� � �� �A�; ��� � ;�� ����� :�

��� ��� ( ���6 ��0��� �� �� ����� ��� ���� �� ���� � �� �� ������� ���� � ����� �� 0��� ���� ���� ��� ������� � :� ���� ��� ����� ����� ����� ����� � �� �� �� �� ���� ��� ���� ���� �� � �������� �� � ��� ��� �� ���� ������������ ��� A �6 �� �A � G��;:?� �� 1� ���� :� ������� ��� ����� �� ��������� ������� ���� ���� �� ����� $? �> � ��� � ��$ �(# !3� �6��� ��� 9������ 9�������� � ���� $1 �=� =�����M�� 9����� �' 8�� � �� ���� � $� ;�):& ���������� �� �� :� ������� ��� ���� � �� ? ���

�� ���� ������ � E � ������ ��� ������ ���� ��������� ����� � %A� ������ 2� ���� �� �� ������� )� �* !�� �� $%+%'� �� � ��� ������ ���� ��� ���� �� � � �6 �� ����� ���� ��� �� ������� ��� �� �� ����� �� 6�� � � ��� !$%A$'� 6��������� �� �� �� ���� �� �� � ���� ������ ���������� ���� � � ���� � ��� � 6�;� 0������������� !-��� 69��A , 6������ G>'�

*��-!�� �), ,(��-��(+)

.����� � � #���� ����� ����� *�� ��� � ������/� � ��� ������� ����

�� ���������� ��� ��������� ����� �� �� ����� �� ��������� ��� ��� ������� �� ��� �� �� ���������� ����� � ����� ���� �� ���� ��� ��� ����� ������ � ������� �2��� !�:�'� ��� ��� ��2 ������� !>�' �� �� ��������� �� ����� ���� �� ��������� (� �� � 3�� ?� ����� ��*������� ��� �� ����� ����� � � ������ 8 �� � �� ��� ��� �� �� ��� ��� �� ����� ��� ��� ��� � ��� ���� ��� <������ ��*� ����� � 2��� ���� ����� !���� ��� �����'� ��� �� � ������ ��� ��

� ������� ������ ��� ��� ��� � ��� ���� !3�� ?� ���� 9' � ���� ���� ��

����� � � ��� ��� *� �� ������������ :� ���������� � ����� ��2 �������� =� �� ��� � ��� ���� �� �� ����� �������� �� ���� �� �� ������������� ���������� �� ������� ;:� ��� ���*���� �������� (�� ����� $1B� � �� ����� �� ����� ������ ��*� ����� � ��� & ��� � ��� !�$B�& �' �������� ��*� ����� � !���� 9'� �� �:� ����� �����!���� 99' ��� �� ����� � ���� ��� ��� ������ �� ��� �� 9� ��� ����2�� ��� ����� � �8�� ���� ������ �� ���� :� � �� ����� ����� ������� ��� ��� � ���� �� � ��� �� ����� ������� ���� ������� :� �� � � ����� ����� -��� ���� ������ �� ���� ��� ���������� :� ������� �������

3,* 52��67�8�9�4: �8; 52�6842866<284 =�9� 3> 8�� 3 ?$86 ,! �!!�

Page 5: Sustained hydrogen photoproduction byChlamydomonas reinhardtii: Effects of culture parameters

!� ��0���� �� ����� ���� ���� � �� �� ������� ����� �' ��� � ;�� ����� :� ��� �� ������ �� �������� �� �� �� �� ��� � �� !3�� &'� ���� � ��:� ������� ������� ����� �� ����� ���� �� :�

���������� �������� ������ � �� �� �� � �:�

��� �� � ������ �� �� ��� ��� �� ����� �� ��������� ��� ����� � �������� ��� � ���� ����!;�� � ���� � $, -�� � ���� � ' ��� ��� �������������� �� �)99 ����� ��� � �� ����� ������ �� �� �� .����� � ��� !$%%+'�

.�� �� :� ������ ���� � �� ���� ����* �� �� ��2 ������� ��� �� �� �� �� ������

���� � �� ��� �2����� E& �J �� ���� �$ �� �? �J� �� ��� ��� ���� !���� 999' � �� ������ ������� �� ���� ������� !���� 9J'� 9�� �������� �� ���� � ����� & ��� � � � !���� 9' ������ ��*� ���� !&$ �, ���� ?%B&? �' ���� � �������� ��*� ����� � !&A �, ���� &$B&% �'� 9� ������ ���� �� ���� � �� � ������� � � ������ ���� � �� ������� & � ���� � �� � ������ � ��� ��� �� ��� ��� �������� !���� 9'� ��� ��� ������ � � ������ 2����� �� �� ���� ���� 2� ������ � ��� ��� ����� ������ � ����� ���� ������� �� :� ��� � �� ����� ���� !)� � � ����$%%+'� 9�� ������� ���� � ����� ��*� ���� �0� � ���� � �� �� ��� ��� �������� !�����$A � ����� � �� $ � �� ������� ��*� ����' ��� �� � ������� ��� �� !���� 9'� �� ���8���� �� ������ ����� � �������� =� �� �� ���� ������������ �� ��2 ������� � �� � ���� ���� ���� � ��2��� ����� ���� !� �$ �� �? �J' ��� �� �� ��� �� �� �� �� �� �� ;:� �������� ������ � �� �� ��� � �2����� �� ��� ������� ��� �� !"� � � � ���� � �, -�� � ����� '� . ���� ��� �� ���� �� ���8� �� �� ��

� �������� ��������� �� �� ������ �� ���� �������� ���� !���� 99� �� ����� ������' ��� ��� ������ ��*� ���� ����� � �� ������� ��*� ����!?��1 F �+? ��� A�1& F �? ����� �� � �� ;���$ ���$� �������'� :� �� ��� ����� �� 8��� ���� ���� ������� �� �� $& �� 2� ��� � ���������� ��� � ���� ���� �� ����� � !����� ���& ��� ��+&�����'� ��� 8����� ������ �� ����� � � ���������� ��*� ��� ��������� �� ��� �� �� �4��������� ����� � ��� � �� ������ ���� ������������ ������ ���� �� �8���� ����� � �� �������� ��*� ����� �� �� ���� ������� ���� !����9J' � ������� �� � � ������ ���� !���� J'�=� �� ��� ����� �� ���������� ���� ���� 2��� ����� :�������� ��� �� ��� � ������� ��� ����� � ���� ��� ����

������� � 0 �� � �� ���� � � ��� � ���� ��������� �� � ������ �� .��� � ������1,������ ��������

� ���� � 2� ���� ����� ���� �� ����� ��� ���� � ����� �� ����� ��� �� ����� ����� � ������� �� �� ����� �� �� ����� ��� ����� � ���� �

������ � ;����� � �:� !������� �2���'� >� ! ��2 ��������

������ � ��� �� �� ��� �� ��� ��'� ��� ��� ��� � ��� �����

�� ��� ������� �� �� �� �������� �� ����� ��*� ���� ���

����� ��� �� ��������� 3� � ������ ����� ������ �� 9BJ �

���8�� )���� ��*� ����� � !E& � =D6� � 3�� $' � ���� ��

����� ��� ������ ��� �� ;�� ������ ���� ��� ��� ����� ��

� ����� ��� �� �� %B$� �� ;�� � ���$ !&BA � $ � ���� � �6�$'�

�� �� �� ��� ����� � 3�� ? �� ���� �� ���������� ����� � � ������ �� ���� ��� �� �� 8� �5 �� ����� ���8� ���� �����

������ ! N ' �� �� ����� �� ���� � ���� � ���� ������ � �� 8� ������� 2� ����� G� ����� ��� ����� �� �� �����

���� ��� ����� �� ������

( ��� ����� � :��;��������� ����� � (�� ��� ����� � ���� ������� ����� �

��� �� ��� ����� )�� � >��D)�� � >��D)�� � >��D)�� � >��

<������ ��*� �$B�& ?$B& &$B&% �$� )���� ��*� $1B� �AB�1 ?%B&? �$�

@�/�$<�= 6� �9�� 1�<�.6�6</ �AA67�284 �94�9 �:;<�468 1����1<�;$7�2�8 3,#

Page 6: Sustained hydrogen photoproduction byChlamydomonas reinhardtii: Effects of culture parameters

. ������� ���� ����� 0������ �� ����� ������ �� ���� ��� ������� ������ ���� ���� ������ �� ������� �������� ������� �� �� ��������� �� �� � � ����� �� ���� �� ������

�� ����� ������ ����� �� ����� �� ����� ����� ����� ��� �� �� ����� ����� �� ����� � 9� ���2� ����� �� ���������� ���� � ����� A ��� ��(������������ ����� ������� � �� �������� ����� ��� �� ������� ���� � ��� ��� ������ !� -�� �� ��� -�����'� ��� ��� ����� ��� ����� �� �� ����� ���� �� ������� ������� �� ��� �� ������ ������

(������ �� ����� 0������ �� ������ !$��ABA ��-�):& 8��� ������ �����' �� ����� ������ ������������ ����� � �� ���� �� �� � �� ����� ������ ���� � �� �� ���� �� ���� ������ ���� ������� ��� � ��� ������� !3�� A'� )��8������� ����� ��� �� �� �� � ��� ���� � ��������� ������ ����� ���� �� ��� � �� ��� ���� !���� 999'���� ���� ���� ������� �� ������ �� �� � �������� ������ ����� ����� ����� �� ���� �� ����� ���� �� ��� � ����� ��� ��� �� ��� ������ ��������� �� ��� ����� ��� �� ��� �� �������� � ��������� �������� ����� ���� ��� ��� ������ ��� �� � �� ���������� !" ������� � '����� � �� �C��� �� ��� �� ������� �� � ��� ���� �� �� ��� ���� � �� ���������� � ������� �� ��� ������

�� ��2��� 5�� �� ����� ������� ��� ���� �� � ����� ��*� ��� ��������� ������������ �A �� ������� �� ���� � ���� 99 !�� �� �� ? ��A ������� 2� ����' ��� 8�� � ���� �������� ��� ��������� �� ����� �� �� ���� ����������� �� ��� �� ���� $ � !�� ���� ���� � ������� �� �� �� �� �� $& �� 2� ���'� ��� �� 8������ �� �� ��� � ����� � $���6 ����� �� ���� �� ���& �� 1�%A ����� !+ �� �&$ �6� � �� ������ ���� �� ��' ����� � �� ���� �� ���� ���������� ������� �� ���� ���8� �� �� �� � ��������� ��� � �� ��� �2����� ?��1 �� A�%& ����� � ��

�� �� ��� )���� � �� ���� �� ��� � ������ �� �� �� ��������� �� ����� ������ ����� ���� ������� ��� �5 �� ������ �����

�� ����� ����� � J���� � ���� F ������ � ������� �� �� ����8� ������� 2� �����

)���� ������ ����� ��/����� �� ��

��� ��� ����� �

/����� �� ��

���� ������� ����� �

)��8� ���� �� ��

�� � ��������� ����� �

�� ;���$ � ��$

����� ��� �� �� ���

$& ��� ����� !� $�� 6

�� ����� '

)���� ��*� ����� �

�AB�1 ?%B&? ?��1 F �+? ���& F $� �

$��A ??B?� ?+B?% A�$A F ��� 1��? F $�&�

�A ?AB?+ ?+B&$ A�%& F �A� 1�%A F $�+A

A ?AB?1 ?%B& ?�%� F �& ?�� F �?

$ B �+� B $�+A�

<������ ��*� ����� �

?$B& &$B&% A�1& F �? ��+& F ��?

$��A ? B?1 ?%B&1 ��& F �?� &�$% F �&�

�A ?AB?1 &&B&1 A�?$ F �$ A� � F �?�

A ?�B?+ &?B&% ?�%% F ��� ��? F �+%

$ B $&&� B $�&��

�?? ����� �� N $ �6 �� ��� �� 2� ����� �������� ��� ��������:� 2� ����

������ �� ;����� � ������������ :��������� ��� �� ��� �

������ !�������' � ����� ��*� ��� ������� ��*� ����� ����� �

��� ����� ������� #��� � ���� � ��� � ;�� ����� :�

��� �� �� ����� ����� ��0���� �� ����� �� �� ������ ����

G� ����� ��� ���� ���� �� �� ���� ��� ����� �� ������

3,B 52��67�8�9�4: �8; 52�6842866<284 =�9� 3> 8�� 3 ?$86 ,! �!!�

Page 7: Sustained hydrogen photoproduction byChlamydomonas reinhardtii: Effects of culture parameters

;���$ � ��$ !%% �� $+ �6 � �� ;���$ � ��$'� �� �� �������� ��� � �� 8 �� ��� ����� �� � �� ��� ������� �� �� � ������� �� �� ����� ������ ������ �� ����� � � � ����� �� ������ �� A �������� ��� �� ����� � ���� �� ���� �� ���8� ���� �� � ������� ��� �� �� ����� ������ �� ��� ��� ������ �� �� ������ �� �� ���� ������� �����

�� 5�� �� ����� ����� �� �� ������ ��������� ������� ��*� ���� � ���� ��� ��� � ���������� ��2��� �� ��� ��� �� ��� ��? ����� !$%$�6' � ����� � ��������� ��� A �� ������������ � �� ��+& ����� !+� �6' � ���� �� ����� �

���� ����� ����� ������� �� ��2��� �� �� ����� ���8� ������ ��� ����� ���� ������ ��$��A �� ������ !� �� A�1& �� ��& ����� � �� ;���$ ���$ � $1& �� $%& �6 � �� ;���$ � ��$'� �� ��� �� ������ �� ����� ��*� ��� ������� ��*� ���� ������� ������ ����� C�� ��� ��� � �� ����������� �� �� ���� � �� ��� ���� �� ����� �� �� ��� �� � �� ���� ���8� �� �� �� � ������� ������ ������ �� ��� ���� �� ������ !O�A �� �� ����� ��*� ��� O $��A �� �� ������� ��*� ����'� ���� ���� �� ���� �� �� ��� ���� ������������� �� ��� ������ ���� �� � ���8���� �� ��� �� ������ ����� �� �� ����� ��

(����� �� ������ �� ������ ����� ��� ���� A �� ����� � � ���8���� ���� � �� ��� � �� �� ���� ������� ���� !�� O �+B$&& �' ��� � � �� �� ��� �� ������ � ���� ����� ��*� ��� ������� ��*����� !$�+AB$�&� ����� � A��&? �6� ������� �� $ �� ����� ������� ��� ����� ��� � ������� ��� � �� ����2� �� �� ��� ����� �� ����� �������

������ �� ;����� � ������ !�' ����� ���� ������ ��� !�' � ���

������� ��� ������� �� ������ �� ����� ��*�� ����� ������

��� ��������� �� �� � � �� �������� ������ ������ ����� �

�����4 �� !�', $��A �� !�', �A �� !�',A �� !�'�

�� �� ���� �� �C��� �� ������ ������� �� ����� �������

����� ��*� ����� � �� ��� ����� ������ �� ���� � �� ��

2� ���� �� ���� � ������ � $ ������� ����� �0�� � ��

� ��������� � ��

;�� ������ ���� � $ �D�6

�� �)� � �� $��A �� �A �� A ��

A� A

� &�� A��� A��? A�+

&A &�$& ?�11 ?�++ A� 1

$ ��1+ ?�?1 ?�1? &� �

������ �� >5�� �� ����� ����� �� � �� ����� �� ������ �� !�'

����� ��*� ��� !�' ������� ��*� ����� ������ ����� � �� ��

����������� �� ���� � ������� $��$ �� ����� �� ���� ;�� ����

��� ����� � ����� $ ��D�6� ��� � �� �� �� 2� ���� �����

� ���� 99�

@�/�$<�= 6� �9�� 1�<�.6�6</ �AA67�284 �94�9 �:;<�468 1����1<�;$7�2�8 3,3

Page 8: Sustained hydrogen photoproduction byChlamydomonas reinhardtii: Effects of culture parameters

(�2����� � ������� ,������ ��� ��� �� � �� ���� �

�� ���� �� �������� ���� �� �� �� � �������8� ������ ���� ������ �� ��� ���� !O�A ���� ����� ��*� ��� O $��A �� �� ������� ��*�����' �� ������ � ����� �� �� ������ �� �� ������� ������ � ���� � �� ���� ���8� ��� ���� � ������� � �� ������� ��*� ��� ������������ ��� �� ���� ������ ������ ����� �� �� �� ���� ����� �� ����� !&�& �� $$�& ��D�6'� 9� ��� 2�� ����� ����� ������ ����� ����� � � ���������� ��� A �� ������� /���� ������� �������� �� �� ����� ������ ��� ��������� ����� ��� ���� �� �� � �� ���� ������ ������ ����!3�� A�'� �� ����� ����� � � ����� �� �� �������� �� 2� ��� �� ��� �� � ���� ������ ������� ����� !%�� �� �+�& ��D�6' �� �� ��� � �� �� ���� �������� �����

3�� 1� ����� ���� �� ���� ���8� ��� �� ��

� ������� � ����� �� �� ����� ����� �������� ���� � ������� �� �� ���� ������ ������ ������ ���� �� ��2��� ���8� ��� � ������ ����� ����� � ��� ���� ������ ������ ����� ���� A��D�6 � �� ��� �� �� ��� ���������� !����� $ ��D�6�� �� �� �� �� � �������'� ��� ����� �� �� ��������� ���� ������ �� �� ���� ���8� ��� �� ��

� ������� ��� ������� �� ��� ���� �� ������ ��� ���� �� �� �� ��� ���� ������� � �� ��� ����� �� :� �� ��� ����� �� A �� ����� �������� ��� �� � ���� � �� ������ �� �� ���� �������� ���� ��� �� ���� ����� ����� !3�� 1�'�3� 2����� � �� �� � �� ���� ���� ������ ������� ���� �� � � �� $&�& ��D�6 �� &�& ��D�6 ������ � ���� � �� ������ �� �� � ������� � �� ?� ���� �� <�� �� ��� ��������� � ��� �� �� ��� �� � �� ����� �� �� :� ���������� ���� !����99� ���� 9J'� ��� ���� ������ �� ���� �� � �������� � � ������� �� ��� ������ �� ���� ������ ������� ���� ���� ����� � �� ������ �� � ������������� ���� ��� ���� �� ���� � �� �� � ��������� ��� ������ � ��� ���8� ������ � � �� �� �� ���� �� ����� �� ����� ����� 2������� �� ��� � ���8� ������ ��� �� ��� ������ ��*� ��� ������� ��*� ���� ������� � ��� ��� �� ������ ������ ����� ���� �A ��� $��A��� ��������

������� � ������ *�1���� � �*��������� �� ������ �� *������3����1+4���� � ����������

�� ���� ����� ���� ��� �� 0����� �� ��� �� ������� �� ����� ������ ����� �� ������ �5��� ��

� ������� � ����� ��� �� ����� �� . ����������� ������ 2���������� 3 ��� ���� ����� ���� ������ � �� �� ��������� �� �������� ��� �����

�*��� ����� �� ������ 3) ��� � !���� � ����$%%&'� (�� ������� ���� ����� ���� ����� �� ������ ������ �� �)99� /��� ��������� �� ��� ������ 2�� �� �� ��� ��� ���� � ��� ���� �)99������ ���� �� �� �� ������� :� ������ ���� ������ ���� ��� � �� ���� �� ��� ����� ������������ � � ����� � �� ���� �� ������ ������ ����� :� �������� :� ����������� ��� �� ��������

�� ���� ���� �� �� �� � ���8� ������ ���� � ������� ��� �������� ��� �� �� �� � ���� ����� ������� � ���� � ��� ����� ������ ������ ��*� ����� � �� �� ������ �� �� ���� �������� ���� ���� � ";D����� ������ ����� !�-�� ��� ��� -�����'� )���� ��*� ��� ���� �������� ��*� ����� � � ����� �� ��� 2� �������� �� �� � �� ����� �� ����� ������!3��� A ��� �'� 3�� + ����� ���� ������� �� ������� ��� ��� �� �� �� �� � ��� ����� ���8�

������ �� �� �C��� �� ����� ����� ���� � �� ;�� ������

� ����� !��D�6' �� �� ������ �� �� ���� ������� ���� �� !�'

�� ���� ���8� �� �� �� � ������� ��� !�' �� ��� �� ���� ���

� ������� ��� �� ��� �� ������� �� �� � ������ <������ ��*��

����� ������ ����� � ��������� ��� A �� ����� �� � �

���� ;��� ��� ����� ���4 ?? ����� �� � $ �6 �� $�� % � ����

���� ;�� ������ ����� �� �� ��� � �� ����� �� ����� ���� � ��

&�& �� $$�& ��D�6�

3,> 52��67�8�9�4: �8; 52�6842866<284 =�9� 3> 8�� 3 ?$86 ,! �!!�

Page 9: Sustained hydrogen photoproduction byChlamydomonas reinhardtii: Effects of culture parameters

������� ��� ���� � �� ����� ��������� ��� A �� ������� 9� ��� �� ��� �� �� ��� � ���� ����8� ���� ������� ��� ��� ����� �� ������ ��� ������� �� $��AB�A �� ������ � ��� �� �� �� �� ��� �� ������� �� ��� ����� �������

�� ��� ������ 2�������� �� �� �� �� � �����8� ��� �� �� � ������� � ���� �� ������� �������� �� ��� �� ����� ������ �� �)99� #���������� �� �� ������ ������� � ����� ��� �� ��������� � �� � ��� �� �)99 ��� �� � ����� � ����� ���� ���� ���� �� ���� + � �� �� ��� ��� 0� ��� ���� ������� � ���� � �� �� ����� ��� ��2����� ������ � �)99 !"� � � � ���� � �'��� �� � � ���� � :��������� ��� �� ��� �������� �� �� ���� � ���� ��� � ;�� ����� :� ���� ��� 9� ��� ���� ����� ������ � ���� � �� ��� ���� � �� �� ������ �� ���� ������� ���������� ��� �� ;�� ����� ��� �� ����� � ��� :��������� ��� �� ���� � ���� � ��� �� ���������� � :� �� ��� � ��� � 3�� % ����� ���� ������� �� ������ �� �� ������ �� �� 2� ����� ��� ���� �� ������� �� :��������� ��� ��� ��� � ������ � �� ���� ���� � �� �� ��� � �� ������ ������� �����

�� �� � ������� ���� 3�� % ����� ����2��� ������� ��� �� � ����� � �� !� �������'

�� ���� �)99 ��� �� �� ��� � ���� ��� � ������������ ��� ��� ��� ���� ���� C�� �� ���������� �� ���� � ��� ��� ���� ��� ���� �� �� ���P����� �� ���� �� �� ������� ������ � :� ������� ���� ��� ��� ��� �������� �� ����� � ��2� ������� �� ������ )��8������ ��� :� ������� ������������ �� ������� �� ��� ��� ��������� ������� ���� �� �� �� �� ��� � ������ �� ������ ������ � * � �� :� � ����� �� ��� �� 2�� ������� ����� �� ����� �� �� ;�� � ��� ���G� ������ � QQ����� �������@@ ��� �������� � ����� ��� ���� ������ ��� ��� � ���� �� ��� ������� �� ��� �� � ������� �� �� ����� ��� ������:� ��� �� ������ ��� ���� �� �� ����� -��� ��� !� ' ������� ���� � ��� �� ������ � 0� � �� �� � ������� � ��� ����� ��� "� � �� ��� !� �' ������� ���� �� �� ��� � � ����� ������ � �� ������ �������� � ����� � ���� ������� �� ������ �� �� ������� ���� ��� ����� ���� ��� ����� ������� � ��� ������ K���� ��� ��� !� $' ������ ��� ���� ��� �� �������� �������� ���8�� ��� ��������

9� ���������� ����*���� �� �� � ������� � �������� ��� � ����� �� �� ����� ���� ���� �������� �� ����� � �� ���� �� �� �� �� ����� �� ������ :� �� �� ����� �� � ��� �� �� ��

������ �� ;������ �� ��� ����� ������ ���� � �� �� �� ��

�� � ������� �� �� ������ �� �� ���� ������� ���� � ����

�� ��*�� ����� ������ ����� � �� � ������� �� ���� ����� ��

� � ;�� ������ ���� �� � ��� $? ��D�6�

������ �� >5��� �� ����� ������ �� ������� �� :��������� ���

�� ��� � ������ ���� � �� �� ������ �� �� ���� �������

���� � ����� ����� ����� ��

�� �� ��� �� 5��� �� ���� ���� ������ ������ ���� �� �� ���������� ����� � �� ��� � ������ �� ���� �� �5 �� ������ ������ ����

� �� �� 2� ��� � � ����� <������ ��*�� ����� ������ ����� � ��������� ��� A �� ����� �� N � ����

9���� ���� ������

������ ����� ��D�6

( ��� ����� � :��;��������� ����� � (�� ��� ����� � ���� ������� ����� �

)�� � >��D)�� � >��D)�� � >��D)�� � >��

&�& �& A? �� $$%

+�$ �$ &1 A% $�$

%�+ �$ ?+ &1 $��

$&� �� �% ?� O$&

@�/�$<�= 6� �9�� 1�<�.6�6</ �AA67�284 �94�9 �:;<�468 1����1<�;$7�2�8 3,C

Page 10: Sustained hydrogen photoproduction byChlamydomonas reinhardtii: Effects of culture parameters

���� ������ ����� �� �� ���� ����� �������� �� ����� ������ �� �)99 ���� ���� ���� �� �� ���� ��� �� �� � ������� ������ /�� �� �� ��� � �������� �� ��� ���� ����� !���� A ��' ��� ���� ��� �� 2� ���� �� ��� ������� ����� � �� �� ������� ���� �� �� � ������� ��� ��� � �� 8��� ��� ���� � ����� !���� 99'� ;�� ����� ��� ����� ��*����� � ���� ��� ���� �� ��� �� 9� ��� ����2�� � ���� ���� �������� 2� ���� � ����� � �� ��� �� � �� � ��� ������� ��� �������� ��� ��� � ���� ���� � ��������� �� �� �� �� ����� �� � ������

3������ ������������� ���� ������� �� ����� ������� ����� ����� � ��� �� ������� �� �� �� <�)�=�� ���� �� >� �� �� � ������� ���� ������ ����� ��� �� � � ���� � � ���� ������� ����� ��� ��G#>6 !.�� (���� ���������'� ���� � � ���� �� ����� �� ����� � ��� �� ���� ����� ��� ��� 0� �������� !���� �� ��� � ���8� ������'��� ��� �� !���� �� �� ����� ���� ������ ���� � ����� �� �����' �� ������ �� �������� ��� ������� -� �� � ���� ���� �� ������� ��� � � � �����2 ��� ��� ��� �� � ��� ������ ���������� � ��������

. ����� = � (� )�� �� � �� �� � ���� ���� �� ��

������ �� ��� ������ ��������

*���������

(��� M� )����* #� $%%+� ��� ��� �������� � � ������ ���

�2���� ������������4 ��� ������ �� ��� ���� ������ �

���� �� � � �� ��2 �����R M �������� �������� &14$B

$$�

(���� H� -��� M� $%%%� ������������� ��� ��� � �������� M

/��� /��� ++4$B��

/������ J(� ��5���� �� $%%&� ������������ ��� ����� �����

��� � � ��� ���� ��� ��� ����4 :��� ��� �������� ���

��������� ������������� ? 4A�1BAA��

/� ��� J/� ��������� ((� #�� KK� ���� =:� � � ��� ���

� ������� �� �������� ������� �� �K+& ��� ������� ������

��������� /������� /��� �%4&1+B&+A�

;�� �� S���� 6� -�� (� � $� /�� ��� ��� ������� � �����

�� �� �� ���� �� ����� ��� �� ���� �� � �� ��� !;��� ������'�

M (��� ������ $?4�AB?&�

"�5 �� �� #��� M� $%&�� 3 ������ ��� ����������� � �����

��� �� ��� ��� � ����� M "� ������ ��4�$%B�& �

"��� #�� "��� -� $%+&� 3 ������ �������� �� �� ������

����� ����������� 94 (������ �� � ������ � ������ � �� ��� ��

� �� � ��� ����� ����� ������ 1A4�$�B�$+�

"� � � -6� ������� #K� )� � -� $%%1� :2��� ������� ��

����� ���� �������� (��� /���� /���� �?4$&$B$A$�

"� � � -6� K���� �� )� ��������� (� )� � -� � ��

� ������ �� �� � =:> ��� ��� � �� �� #��� G#>6D

;��A1 ��++% � T:���U ����4DD���� ��������D��� ���D����D

�++% ��������

"� � � -6� S���� 6� 6 M.� 3���� �� )� � -� " ����� >�

-�� (� � �� -� �����4 ( � � ��� � �� ����� ���

� ��� /������� $+4A �BA$$�

"��� -� "��� #�� ;�� ;� $%+�� 3 ������ �������� ��

�� ���������� ����������� 994 �������������� �� ������ �����

������ +�4$� B$���

"������ 9G� $%1+ #��������� � ��� ��� �������� ����

��� ����� ��� �� ����� � ������ ���� ���� �� /����

�+4$+$B$+��

" ����� >� $%+�� ������������ ��� ��� ��� �2��� � �������4

K��� ������ )��� $%�4+1%B++ �

" ����� >� "���� � ##6� )���� ."� $%+?� ��� ��� ��� �2��

�� ������ ������� �� �� ������� �������� ��������

?14�&%B�AA�

" ������ (� � � (�������� �� �� ���������� ���������� �� ��

��� �� �� ������ � ���� $A$4� $B��&�

���� �� -��� /� G�� M=� $%%&� 9�������� �����*���� ��� ����

������ �� ��� ����� � �� � ������ �� ���������� �����

������� >� M /���� ���41�%B11&�

�� � >�� $%+%� �� ;������������ ��� �����4 ( ���� ����

��� �� ������ ��� ���� ��� � ��� )�� =��4 (����� � ���

1+ ��

���� 3�� $%1 � �� ������� �� ��� ��� ������� �� �� ����

������� ��������� ����� ������ &A4$A?B$A%�

K���� �� )� ��������� (� "� � � -6� )� � -� � $� � ��� $���

9��� ;���� �� ������������ ;)9#= ��������� -���� �� (���

� ���� !������������� ����D��� $'�

6�� � :�� #��� ���� GM� 3� (6� #������ #M� $%A$� � ���

���� ��� ��� �� 3��� ����� ����� M /�� ;�� $%?4 ��AB

�1A�

-�� (� S���� 6� 3� �� -� "� � � -6� )� � -� � � )���

���� ������������� ��� ��� ��� � ������� ���� � ���

��������� �� �2��� ������� � �� � � ���� �� ����������

����������� ����� ������ $��4$�1B$?��

#���� ;� )�� �� $%+A� �� ������� �� �� ��� ����������� �

���� ������ ��� ��� ������� � ���������� �� ������

�������� �������� &�4AA?BAA1�

#�� KK� ���� =:� $%%�� ��� ��� � ������� �� ��������� �4

�������� � ����� ��� � ������� M -� /������� &4$ B$A�

#���� �"� 6� )� $%+&� (������� ��� �� ���� ������� �� ���

� ����� � �� ����������� ����� ������ 1�4$ +�B$ +%�

)� � -� 3���� �� /���� =� � ��� >� "� � � -6� $%%+� =���

����� �� ������ ��� �� ��� � ���� � �� ��� ���8�

����� �� ���� ������ ����� ������� ��� �� ��� :� ��� ����

9�4 S��� ��� :#� ��� � /���� ���� G� H� �4 ����� � ���

�� ��1B�?&�

)� � -� 3���� �� "� � � -6� � $� )� ���� �� �� ����

�2��� ��� ��� �� ����� ��� ��� � �������� 9�4 -��� M�

-�������� �� )�� �� � (� ��� �� /���� ��� 99� G� H� �4

� ������ �� �AB1��

��������� ((� /� ��� J/� #�� KK� ���� =:� $%%%� �� ������

� ������� �� ����� ����� �� �������� ������� �� (�;; �%&$?

��� �� ������ �K+& � � ������� ���� � /������� /���

�&41 %B1$A�

.�� �3� 6� )� )� � -� $%+ � ������������� � ������� ��

��� ���� )��� >� �� �&4?B&A�

.�7 ���� � #� )�� �� )����* #� � $� >��� �� �������� ������

� ����������� � �� � � ���� ���������� �� ������ /����

/����� (��� $A ?4�1$B�1+�

.���5 ==� =��� M�� -�� (� " ������ (#� $%%+� �� �������

�� ������������ ��� �� � ����� � �� �� ��� �� �� ����� �

�� ���������� ����������� ����� ������ $$14$�%B$?%�

3*! 52��67�8�9�4: �8; 52�6842866<284 =�9� 3> 8�� 3 ?$86 ,! �!!�