HLA TAYİNİNDE KULLANILAN YÖNTEMLER,SORUNLAR ve ÇÖZÜM ÖNERİLERİ Dr. Türkan Patıroğlu Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Hematoloji ve İmmünoloji Bilim Dalları Kayseri
HLA TAYİNİNDE KULLANILANYÖNTEMLER,SORUNLAR
ve ÇÖZÜM ÖNERİLERİ
Dr. Türkan Patıroğlu
Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi
Pediatrik Hematoloji ve İmmünoloji Bilim Dalları Kayseri
HLA-Klinik önemi
• Antropolojik çalışmalar
• Babalık tayini
• Hastalıklarla ilişki
• Transplantasyon:
Renal: Graft ömrünü etkiler,
Renal ve pankreas:HLA-DR daha önemli
KİT: Tam uyum (GvHH)
Güvenirlik
• HLA-klas I ve klas-II için %97
HLA Tiplendirme Testleri
Serolojik test
Mikrolenfositotoksisite
Moleküler testler
(PCR’a dayalı testler)SP,SSO,SSPC,SBT
Hücresel testler (Miks lenfosit Reaksiyonu)
Serolojik Testler
MakroaglütinasyonMikrolenfositotoksisite
Seroloji Plakları
Klas-I ve II
Kuyucuk sayısı:
60,72,120,144
Kullanılan Hücrelerin Özellikleri
• Viabilite
• Saflık
• Temizlik
• Hücrelerin izolasyonu
-48 st içinde kullanılmalı
-Buffy coat eldesi
-Magnetik boncuklar ile T-B hücre
saflaştırılması
Mikrolenfositotoksisite Yöntem
• Plak oda ısısında eritilir
• Kompleman hazırlanır(1viyal 2 ml distile su)
• 1 µl hücre süsp. kuyucuklara konur
• Oda ısısında(18-22 C) 30 dk beklenir
• 5 µl tavşan komplemanı eklenir
• 1 µl boya solüsyonu eklenir
• +4 C’de 15 dk. karanlıkta saklanır
• Okuma (floresan ataçmanlı mikroskopta)
Mikrolenfositotoksisite Skorlama
Ölü hücre % Skor Değerlendirme
0-10 1 (-)
11-20 2 Olası (-)
21-50 4 Zayıf (+)
51-80 6 (+)
81-100 8 Kuvvetli (+)
Mikrolenfositotoksisite Sorunlar
Yalancı pozitiflik:
• Lenfosit kalitesinin kötü olması
• Kontaminasyon
• Komplemanın kuvvetli olması
• İnkübasyon sürelerinin uzaması
• Isının yüksek olması
• Diğer hatalı teknik detaylar
Mikrolenfositotoksisite Sorunlar
Yalancı negatiflik• Trombosit ve granülosit kontaminasyonu• Komplemanın unutulması• İnkübasyon sürelerinin kısa olması• Isının düşük olması• Hastanın aldığı ilaçlar• Diğer hatalı teknik detaylar
– Antiserumun bozuk olması, – Uygunsuz taşınma– Kuyucuklardaki hücre sayısının fazlalığı
Mikrolenfositotoksisite
Avantajları
• Basit• Hızlı
Dezavantajları
• Hata payı yüksek (ölü hücrelerin değerlendirilmesi subjektif)
• Yetersiz B lenfosit izolasyonu(klas-II için)
• CREG• Tekrarı zor (Ag-Ab-C birleşmesine bağlı)
• Saptanamayan aleller veya tek alelsaptanması
• Yanlış saptanan aleller
Mikrolenfositotoksisite Sonuç net değilse?
Zayıf (+)ise: • Bw4,Bw6 değerlendirmesi B44 (+) ise Bw4 (+) olmalı• Eleme yöntemiA32:A32 ve A10 (+) ama A25,26,34-• Broad veya split Ag belirlemesi: A25 (+) ise A10 da (+)
olmalı• CREG tablolarının kullanılması• Linkeage disequilibriumReaksiyonlarEtnik farklılıklara göre Ag tanımlanabilir
Bw4, Bw 6 Birliktelikleri
Bw4 Bw6
B5 B53 B7 B41 B65(14)
B5102 B57(17) B703 B42 B67
B5103 B58(17) B8 B45(12) B70
B13 B59 B14 B46 B71(70)
B17 B63(15) B18 B48 B72(70)
B27 B77(15) B22 B50(21) B73
B37 B2708 B54(22) B75(15)
B38(16) A9 B35 B55(22) B76(15)
B44(12) A23(9) B39(16) B56(22) B78
B47 A24(9) B 3901 B60(22) B81
B49(21) A2403 B3902 B61(40)
B51(5) A25(10) B40 B62(40)
B52(5) A32(19) B4005 B64(14)
Marsh SGE, Parham P, Barber LD, 2000
Mikrolenfositotoksisite Sonuç net değilse?
Zayıf (+)ise: • Bw4,Bw6 değerlendirmesi B44 (+) ise Bw4 (+) olmalı• Eleme yöntemiA32:A32 ve A10 (+) ama A25,26,34-• Broad veya split Ag belirlemesi: A25 (+) ise A10 da (+)
olmalı• CREG tablolarının kullanılması• Linkeage disequilibriumReaksiyonlarEtnik farklılıklara göre Ag tanımlanabilir
Cross Reaktif Antijen Grupları (CREG),
Bw4 Bw6 Bulunduran Antijenler
CREG Yer Alan Antijenler
A01C A1, A3, A11, A29, A30, A31, A36, A80
A10C A10, A11, A19, A25, A26, A32, A33, A34, A43, A66, A74
A02C A2, A9, A23, A24, A28, A68, A69, A203, A210, A2403, B17,
B57, B58
B05C B5, B18, B35, B51, B52, B53, B78, B5102, B5103
B07C B7, B8, B13, B22, B27, B40, B41, B42, B47, B48, B54, B55,
B56, B59, B60, B61, B67, B81, B82, B703
B08C B8, B14, B16, B18, B38, B39, B59, B64, B65, B67, B3901,
B3902
B12C B12, B13, B21, B37, B40, B41, B44, B45, B47, B49, B50, B60,
B61, B4005
B21C B5, B15, B17, B21, B35, B46, B49, B50, B51, B52, B53, B57,
B58, B62, B63, B70, B71, B72, B73, B75, B76, B77, B78,
B4005, B5102, B5103
Çapraz Reaksiyonlar
Isı, süre,komplemanınşiddeti çapraz reakoluşturabilir
Aynı kuyuda 2 farklı Ag
ile reaksiyona giren 2
farklı Ab olabilir
Antiserum 2 farklı Ag
üzerinde de bulunan
ortak bir antijenik epitop
ile reaksiyon verebilir
(CREG)
Homozigotluk durumunda beklenmeyen çapraz reaksiyon olabilir. A2 için homozigot ise, A28 ile
çapraz reaksiyon
CREG
Çin’de yapılan bir çalışmada: A 19, B62,B40,B75
Tan et al.Transplantation Proceedings 2000:32
Kadaverik renal transplantasyonda CREG ile graft ömrü ilişkili bulunmuş
Laux G, Opelz G. Transplantation 2004
Mikrolenfositotoksisite Sonuç net değilse?
Zayıf (+)ise: • Bw4,Bw6 değerlendirmesi B44 (+) ise Bw4 (+) olmalı• Eleme yöntemiA32:A32 ve A10 (+) ama A25,26,34-• Broad veya split Ag belirlemesi: A25 (+) ise A10 da (+)
olmalı• CREG tablolarının kullanılması• Linkeage disequilibriumReaksiyonlarEtnik farklılıklara göre Ag tanımlanabilir
• Aile çalışmaları
Haplotip belirleme
Antijenik birliktelikler
Eksik Ag tanımlama
Homozigotluğun tanımlanması
Etnik özelliklerin gösterilmesi
• Moleküler çalışma
Moleküler Teknik Avantajları
• Güvenilir (seroloji=düşük çözünür )• Hızlı (SSP 4 st, kadavra için bile zaman uygun)
• Canlı hücre gerektirmez
• DNA, herhangi bir çekirdekli hücreden elde edilebilir
• Örnek volümü daha az
• Lenfosit kalitesi kötü olsa bile sonuç verir
• Homozigot ise tam gösterim
• Otomasyona daha uygun
• Serolojide tanımlanamayan aleller bulunabilir
Kalitesi kötü lenfosit
• Yetersiz sayıda lenfosit
(Lösemi veya aplastik anemi,kemoterapi)
• Uzun süreli hemodiyaliz
• İzole edilen lenfositlerde ölü hücre oranının yüksek olması
Moleküler Teknik Avantajları
• Güvenilir (seroloji=düşük çözünür )• Hızlı (SSP 4 st, kadavra için bile zaman uygun)
• Canlı hücre gerektirmez
• DNA, herhangi bir çekirdekli hücreden elde edilebilir
• Örnek volümü daha az
• Lenfosit kalitesi kötü olsa bile sonuç verir
• Homozigot ise tam gösterim
• Otomasyona daha uygun
• Serolojide tanımlanamayan aleller bulunabilir
Mikrolenfositotoksisite Moleküler yöntem Karşılaştırmaları
• İki yöntem arasında hata %23; HLA-A:%8.8,HLA-B:%14.2• En sık hata: B15:%13.9, A32:%7.2, A31:%5.7• Klas-I’de hata %8.5• Klas-II’de hata %20
Mytilineos J et al.Human Immunol 1998;59
��KİT hastalarında %30.6 sonuç yok�En sık hata:HLA- A10, A19 ve B15
Seyhun Y ve ark.Gaziantep Tıp Dergisi2008,41�Kord kanı HLA çalışması %13.8
Li D et al.ZhonghuaXue YeXueZaZhi 2000;21
Mikrolenfositotoksisite-Moleküler yöntem Karşılaştırmaları
A33;%4.5
Saptanamayan
aleller
B15;%24,
A32;%7.9
A33;%4.5
Homozigot ?
B15 %15
B53 %8.1
A32 %6.9
Mikrolenfositotoksisite-Moleküler yöntem Karşılaştırmaları
A(%) B(%)
• Tan(n:525) 9 12.2
• Mytilineous(n:421) 4.8 10.5
• Kulcsarova(n:50) 9 11
• Seyhun(n:1567) 24.1 15.8
Mikrolenfositotoksisite-Moleküler yöntem Karşılaştırmaları
HLA-C ekspresyonu A ve B’ye göre daha zayıf
1 alel noksanlığı %78.2
Yanlış sonuç %13.7, Cw7 aleli Cw5 olarak değerlendirilmişTorio a et al.Transplantation Proceedings2004;34
Serolojik HLA-Cw n:1203HLA-Cw noksanlığı n:26Tek Cw noksanlığı n:132 Cw alel noksanlığı n:13
Mytilineous et al.Tissue Antigen1997;50
Moleküler Yöntemler
• SSP: Sequence Specific Priming (bir alel veya alelgrubuna yönelik primerler)
• SSO: Sequence Specific Oligonucleotid (tüm bölgeyi içeren primerler)
• SSCP:Sequence Specific Conformational Polymorphism
• SBT: Sequence Based Typing
SSP
Primer hangi alel için hazırlanmış ise DNA’nın o kısmına bağlanır. Primer’e özgü segment varsa Amplifikasyon olur
Yöntem:DNA izolasyonu
DNA amplifikasyonu
Elektroforez
Görüntüleme
Verilerin sisteme girilmesi
Analiz
SSP: Tekrar Gereken Durumlar
• Kuyularda (+) bandın yokluğu ile birlikte internal kontrol bandın olmayışı
• Reaksiyon olmayan kuyu ile tezat bir sonuç varsa;Örnek:DRB1 için23+(DR53),8+(DR4),9(DR7) çalışmamış ise
• İkiden fazla sonuç veriyorsa; (DR15 ve DR11, DR15 ve DR13vb.DR11?DR13?)
• Seroloji ile uyumsuz bir sonuç varsa;
• Nonspesifik bandlar fazla ise;
• Bandlar çok soluk ise,
• Aile içinde klas-I tam uyumlu ama klas-II’de uyumsuzluk varsa
SSP: Sorunlar-I
Reaksiyon yok• Az veya kalitesiz DNA
Reaksiyonun zayıf olması• Az veya kalitesiz DNA
Bir lokusta beklenenden çok alele özgü band var• Yeni bir alel olabilir• Kontaminasyon varsa, bantların koyu olması gerekir
Tüm lokuslarda çok sayıda alel spesifik bandlar olması• PCR kaynaklı olabilir;• Program kesintileri etkiler (nonspesifik bağlanmalar nedeni ile)• Örnek veya master mix kontaminedir
SSP: Sorunlar-II
Bir lokusta alele uygun band yok? • Bilinmeyen bir alel için homozigotluk• Kitler doğru koşullarda saklanmamışsa• Hatalı master mix
Alele özgün band var ama kontrol bandı yok?
Kontrole ait band var ama alele özgün band yok? • Hatalı master mix• Cihazın kullanımı ile ilgili sorunlar olabilir
Çalışmanın bir kısmı sorunlu ?• Genellikle cihazın kullanımı ile ilgilidir
Hasta A*02
A*26
B*38
B*51
DRB1*10
DRB1*13
Kardeş
(Kord kanı)
A*02
A*26
B*38
B*51
DRB1*13
DRB1*13??
Anne DRB1*04
DRB1*13
Baba DRB1*10
DRB1*15
SSP: Sorunlar ve Öneriler
DNA kalitesini artırmak için; • Daha az DNA, 2 kat taq polimeraz konmalı• DNA zaman içinde bozulmuşsa,örnek yenilenmeli
Bandlar soluk ise; • Daha fazla DNA• Master mix yeniden hazırlanmalı• Taq miktarı artırılmalı
Beklenenden çok alel varsa;• Yeni bir alel mi? Sekans yapılmalı
• Cihaz hatalarında çalışma tekrarlanmalı, cihaz kalibre edilmeli, • Hata belli bir lot ile oluyorsa, değiştirilmeli• Özellikle verici akraba dışı ise yüksek çözünürlükte çalışma yapılmalı
SSO
• Bir HLA bölgesine özgün primerler kullanılarak çoğalma sağlanır
• Specific oligonucleotidlerin boncuk gibi katı bir ortamda bağlanması
• Reaktif eklenmesi
• Hibridizasyon
• Yıkama işlemi
• Enzim işaretli avidin eklenmesi ile DNA’nın enzimle işaretlenmesi
• Enzimin substratının ortama ilavesi ile hangi oligonükleotid probun bağlandığı saptanır
SSO Dezavantaj
• Bölgeye özgün olanlardan başka gruba özgün çalışmaların yapılması
Moleküler Yöntem Dezavantajları
• Çok sayıda tüp,primer ve işlem gerektirir
• Doğru sonuç için tüm eksonlar değerlendirilmeli
• HLA alelleri arasında ortak dizilimlerden dolayı karışıklıklar olabilir. Bu nedenle duyarlılığı artırıcı yöntemler (“nested PCR”, ”multiplex PCR”) kullanılabilir
Neden Multiplex?
• Farklı allellere özgü olan farklı probları taşıyan farklı renklerdeki (~100 renk) boncukları kullanarak aynı anda pekçok allelin varlığının test edilebilmesi
• HLA allellerinin düşük/orta/ yüksek çözünürlükte belirlenebilmesi
Luminex
Mikro boncukların kullanımına dayalı, çoklu analiz imkanı olan, floresan ölçümü yapabilen hibridizasyonve floresan tayin yöntemlerini birlikte kullanan multiplex bir sistem
Luminex:Yöntem
• DNA izolasyonu
• DNA amplifikasyonu
• Hibridizasyon
• Quicktype for LifeMatch
kullanarak hasta girişleri
• Çalışmanın okutulması
• Analiz
Luminex:Sorunlar ve çözüm
• DNA’nın bozulması veya az olması reaksiyonda yetmezliklere neden olur.DNA kalitesine duyarlı olan lokuslar sırasıyla: C > A > B > DQ > DR dir.
• DNA kontaminasyonu karmaşık sonuçlar alınmasına yol açar.
• Sık DNA sorunu varsa hibridizasyon öncesi jel elektroforezi uygulanarak amplifikasyonun kontrol edilmesi gerekir
• Materyalin taşınması , ısı ve ışıktan ( probeMixve SA-PE) koruması, süreye uyum önemlidir
• Çalışma için sadece rekombinant Taq polimeraz kullanılmalıdır.
• İyi karışmayan boncuklar, düşük prob sayımlarına ve verilerin analiz edilemesine sebep olur.
Luminex:Sorunlar ve çözüm
• Plastik malzemelerin kalitesiz olması, boncukların bu malzemenin çeperine yapışmasına neden olur ve analiz sorunlarına yol açar
• Hibridizasyon sırasında olabilecek buharlaşmalar, bazan yetersiz sonuç alınmasına sebep olabilir.
• Hazırlanan SA-PE solusyonunun iyi karışmaması çalışmada farklı tip sonuçlara neden olur
• Amplifiye olmus ürünler en kısa sürede işleme konmalıdır,yükleme cihaza hemen yapılamayacaksa ürün 3 gün boyunca 2-8˚C’de saklanabilir. En çok 1 hf.-20˚C’de saklanabilir.
• Her koşulda bir negatif ve bir pozitif kontrol kullanılması gerekir.
SBT
Aleller, nükleotid dizilerinin incelenmesi ile
bulunur
• Klas-I için:Ekson 2-3
• Klas-II için:Ekson 2
İlk adım:
Lokusa veya alel sekansına özgü primerler
Ampflikonların oluşması
İkinci adım:Reaksiyonun durdurulması
SBT:Avantajları
• Seroloji ile saptanamayan aleller
• Benzer alellerin ayırımı
• Mutasyonların saptanması
Miks Lenfosit Reaksiyonu(MLR)
• Kültür ortamındaki lenfositlerin aynı ortamdaki ikinci bir seri hücrenin yüzey Ag’lerine karşı çoğalmasıdır
• Bir hücre serisi ışınlama veya mitomisin-C ile immün cevapsız hale gelir
• Uyarılan hücrelerin çoğalması radyoaktif yöntemlerle ölçülür
• HLA-Klas II antijenlerinin uyum veya uyumsuzluğu gösterilir
Öneriler
• İyi bir değerlendirme için: Irk,haplotip bilgisi, popülasyondaki alelsıklığı dikkate alınmalı
• Alıcı-verici için: HLA-A,B,DR çalışılmalı
• Hasta KİT’e hazırlanıyorsa moleküler yöntem tercih edilmeli
• Uygun donör taraması için seroloji yapılmalı
• Donör arama:Hastanın 1 derece akrabaları taranmalı
• Hematolojik malignite varsa moleküler yöntem tercih edilmeli
SBT
Ne zaman yapalım ?
• Diğer yöntemlerle saptanamayan HLA tiplerinde
• KİT için akraba dışı donör aranmasında
Sorunlar ?
Eğitimin sürekliliği
Uluslar arası kalite kontrolu
EFI veya ASHI akreditasyonu