7/21/2019 Subsdio - Oxidao de Alfa cidos No Lpulo
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Universidade de So Paulo
Instituto de Qumica de So Carlos
Reatividade de iso--cidos e seus derivadoshidrogenados frente ao radical 1-hidroxietila:
implicaes na perda de qualidade sensorial dacerveja
Natlia Ellen Castilho de Almeida
Dissertao apresentada ao Instituto deQumica de So Carlos, da Universidade deSo Paulo, como um dos requisitos para oobteno do ttulo de Mestre em Cincias.
rea de Concentrao: Qumica Analtical
Orientador: Prof. Dr. Daniel Rodrigues Cardoso
So Carlos2011
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Este exemplar foi revisado e alteradoem relao verso original, sob aexclusiva responsabilidade do autor.
So Carlos, 11/03/2011
___________________________
Natlia Ellen Castilho de Almeida
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DEDICATRIA
Aos meus pais, Antnio e lia, e ao
meu irmo Kayo, pelo apoio, incentivo
constante e amor. A minha av Maria
pelos ensinamentos e carinho.
Ao meu namorado Gustavo Metzker
pelo carinho, apoio, conselhos e
ajuda.
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EPGRAFE
"A diferena entre o possvel e o
impossvel est na vontade humana"
(Louis Pasteur)
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AGRADECIMENTOS
Agradecimentos
Agradeo primeiramente a Deus por me acompanhar sempre. O meu Deus
o Deus do impossvel.
Ao Prof. Dr. Daniel R. Cardoso pela orientao e ensinamentos. Ao Prof. Dr.
Douglas W. Franco pela infra-estrutura utilizada.
Aos amigos Clayston e Tatiane (Fefe) por compartilharem momentos bons e
difceis.
A Rafaela e Leandro pelo companheirismo desde 2004 (Turma de
Bacharelado do IQSC-USP).
Aos colegas do Laboratrio da Qumica da Aguardente e Laboratrio de
Qumica Analtica e Inorgnica, IQSC-USP, pela convivncia. Em especial, agradeo
ao Wendel Aquino, Fernanda Seixas, Juliana Grippa e Andr (Barbie) pela ajuda e
amizade.
Ao Sr. Julio Landmann (Hopsteiner) pela gentileza de doar o extrato de lpulo
isomerizado.
Ao Prof. Dr. Antnio Gilberto Ferreira e Eduardo Sanches pela disponibilidade
na realizao dos experimentos de ressonncia magntica nuclear (DQ - UFSCar).
Ao Instituto de Qumica de So Carlos (IQSC), Universidade de So Paulo
(USP) pela oportunidade.
Ao Prof. Dr. Antonio C. Burtoloso e a Viviana pela ajuda nas snteses (IQSC -
USP).
A FAPESP pelo auxlio financeiro.
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SUMRIO
SUMRIO
Lista de EsquemasLista de Figuras
Lista de Tabelas
Abreviaturas
Resumo
Abstract
1. INTRODUO 18
2. OBJETIVOS 333. MATERIAL E MTODO 34
3.1. Reagentes 34
3.2. Isolamento das trans-isohumulonas 35
3.3. Isolamento das cis-isohumulonas 36
3.4. Preparo das dihidro-isohumulonas 37
3.5. Preparo das tetrahidro-isohumulonas 38
3.6. Caracterizao qumica dos compostos 39
3.6.1. Estudo eletroqumico das isohumulonas 40
3.7. Reatividade dos compostos de interesse frente ao radical1-hidroxietila
41
3.7.1. Estudos com o radical 1-hidroxietila: formao eestabilidade do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH]
41
3.7.2. Determinao das constantes de velocidade aparentesdecorrentes das reaes dos compostos de interesse frente ao radical1-hidroxietila
43
3.8. Clculo quntico, ab initio DFT, na determinao daspropriedades eletrnicas das isohumulonas
45
3.9. Caracterizao qumica dos produtos da reao entre oradical 1-hidroxietila e os iso--cidos
46
4. RESULTADOS E DISCUSSO 47
4.1. Isolamento das isohumulonas 47
4.2. Preparo dos derivados reduzidos/hidrogenados dasisohumulonas
48
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SUMRIO
4.2.1. Preparo das dihidro-isohumulonas 48
4.2.2. Preparo das tetrahidro-isohumulonas 49
4.3. Caracterizao qumica das isohumulonas isoladas e seus
derivados reduzidos/hidrogenados
50
4.3.1. Caracterizao qumica das trans-isohumulonasisoladas
50
4.3.2. Caracterizao qumica das cis-isohumulonas isoladas 57
4.3.3. Caracterizao qumica das dihidro-isohumulonas 61
4.3.4. Caracterizao qumica das tetrahidro-isohumulonas 65
4.3.5. Estudo eletroqumico das isohumulonas 70
4.4. Reatividade dos iso--cidos e seus derivados e algunsfenis frente o radical 1-hidroxietila
73
4.4.1. Estudos com o radical 1-hidroxietila: formao do adutoradical [4-POBN/CH(CH3)OH]
73
4.4.2. Estudos com o radical 1-hidroxietila: estabilidade doaduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH]
79
4.4.3. Estudos com o radical 1-hidroxietila: determinao dasconstantes de velocidades aparentes da reao entre o radical
1-hidroxietila e os compostos de interesse
83
4.4.3.1. Reatividade dos iso--cidos e seus derivados frenteo radical 1-hidroxietila
85
4.4.3.2. Reatividade de alguns fenis frente ao radical 1-hidroxietila
93
4.5. Identificao dos produtos de reao 96
4.6. Mecanismo da reao 99
5. CONCLUSES 102
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 105
APNDICES
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LISTA DE ESQUEMAS
Lista de Esquemas
Esquema 1. Reao de isomerizao trmica das humulonas cis-(2-ac) e trans-isohumulonas (1-ac) durante o cozimento do mostofermentado e adicionado de lpulo. A relao trans-/cis-ishumulonas emcondies normais de fabricao da cerveja de 32:68. (a) iso-n-humulona, (b) isocohumulona, (c) isoadhumulona
23
Esquema 2. Reao de degradao fotoqumica dos iso--cidos emcerveja
27
Esquema 3. Formao e reaes subseqentes dos radicais1-hidroxietila, em destaque, e 2-hidroxietila em cerveja, de acordo com o
proposto dor Andersen e Skibsted
30
Esquema 4.Reao de Fenton 31
Esquema 5. Reao de formao do spin radical [4-POBN/CH(CH3)OH] 41
Esquema 6. Ilustrao da reao de competio entre a armadilhaqumica 4-POBN e a isohumulonas pelo radical 1-hidroxietila
44
Esquema 7. Reao de formao das espcies aduto oxidado e4-POBN ligado a duas molculas de radical 1-hidroxietila
82
Esquema 8. Esquema de reao propondo o efeito de polifeniscontendo o grupo catecol na oxidao do etanol no vinho e na cerveja.Adaptado de Elias e Andersen
96
Esquema 9. Mecanismo proposto para a reao entre as isohumulonase o radical 1-hidroxietila
101
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LISTA DE FIGURAS
Lista de Figuras
Figura 1. Consumo mdio anual de cerveja per capita por pas e grficoda distribuio de bebidas alcolicas no mercado brasileiro 18
Figura 2. Fluxograma do processo industrial cervejeiro 19
Figura 3. Estrutura qumica dos -cidos (1a-c) e -cidos (2a-c). (1a) n-lupulona, (1b) colupulona, (1c) adlupulona, (2a) n-humulona, (2b)cohumulona, (2c) adhumulona
22
Figura 4. Estrutura qumica das isohumulonas em sua forma molecular(a) e aninica (b)
24
Figura 5. Estrutura qumica da dihidro-isohumulonas (1a-c) e tetrahidro-isohumulonas (2a-c), derivados reduzidos e hidrogenados dos iso--cidos, respectivamente. (1a) dihidro-iso-n-humulona, (1b) dihidro-isocohumulona, (1c) dihidro-isoadhumulona, (2a) tetrahidro-iso-n-humulona, (2b) tetrahidro-isocohumulona, (2c) tetrahidro-isoadhumulona
28
Figura 6. Estrutura qumica de alguns fenis presentes na cerveja. (a)quercetina, (b) morina, (c) kaempferol, (d) cido p-cumrico, (e) cidoclorognico, (f) cido cafeico
32
Figura 7. Ilustrao esquemtica da separao dos diastereoismeros
por complexao com a -ciclodextrina
48
Figura 8. Evoluo dos precursores isohumulonas - e produtos dareao dihidro-isohumulonas - no sistema de cromatografia planarutilizando slica gel como fase estacionria e hexano/ter etlico (1:4 v/v)acidificado com cido actico como fase mvel. (R) reao; (M) mistura;(P) precursores
49
Figura 9. Evoluo dos precursores isohumulonas - e produtos dareao tetrahidro-isohumulonas - no sistema de cromatografia planar
utilizando slica gel como fase estacionria e hexano/ter etlico (1:1 v/v)acidificado com cido actico como fase mvel.(R) reao; (M) mistura;(P) precursores
50
Figura 10. Espectro eletrnico de absoro das trans-isohumulonasisoladas em soluo contendo 10 mL de etanol e 1 mL de soluoaquosa de HCl (2,0 mol L-1). Concentrao de trans-isohumulonas de 3,210-5mol L-1
51
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LISTA DE FIGURAS
Figura 11. (a) Cromatograma de ons total da amostra comercialcontendo as isohumulonas, formas cis- e trans- (em vermelho) e dastrans-isohumulonas isoladas (em azul). (b) Espectro de massas(ESI(-)MS) da espcie trans-coisohumulona referente ao pico 2, tr= 11,4
min. (c) Espectro de massas (ESI(-)MS) da espcie trans-iso-n-humulonareferente ao pico 4, tr= 16,5 min
52
Figura 12. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das trans-isohumulonasisoladas, em CDCl3. Os sinais marcados com (*) indicam impurezaspresentes na amostra
54
Figura 13. Cromatograma caracterstico das trans-isohumulonas emmeio alcolico (5,0 10-3mol L-1) submetido a separao em uma colunaLUNA C-18 e eluio isocrtica 56% do solvente B. Vazo da fase mvel2,5 mL min.-1 Volume de injeo 500 L. Comprimento de onda de
monitoramento = 270 nm
55
Figura 14. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo diretada frao 1 contendo trans-isohumulona
56
Figura 15. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo diretada frao 2 contendo trans-isohumulonas
56
Figura 16. Espectro eletrnico de absoro das cis-isohumulonasisoladas em soluo contendo 10 mL de etanol e 1 mL de soluoaquosa de HCl (2,0 mol L-1). Concentrao de 4,6 10-5mol L-1
57
Figura 17. (a) Cromatograma de ons total da amostra comercialcontendo as isohumulonas, formas cis- e trans-, (em vermelho) e das cis-isohumulonas isoladas (em azul). (b) Espectro de massas (ESI(-)MS) daespcie cis-isocohumulona referente ao pico 1, tr= 10,5 min. (c) Espectrode massas (ESI(-)MS) das espcies cis-isoadhumulona e cis-iso-n-humulona referente ao pico 3, tr= 14,7 min. Os sinais marcados com (*)indicam impurezas presentes na amostra
58
Figura 18. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das cis-isohumulonasisoladas, em CDCl3. Os sinais marcados com (*) indicam impurezas
presentes na amostra
59
Figura 19. Cromatograma caracterstico das cis-isohumulonas em meioalcolico (1,0 10-3mol L-1) submetido a separao em uma coluna LUNAC-18 e eluio isocrtica 56% do solvente B. Vazo da fase mvel 2,5mL min.-1 Volume de injeo 500 L. Comprimento de onda demonitoramento = 270 nm
60
Figura 20. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo diretada frao 1 contendo cis-isohumulonas
61
Figura 21. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo diretada frao 2 contendo cis-isohumulonas
61
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LISTA DE FIGURAS
Figura 22. Espectro eletrnico de absoro das dihidro-isohumulonas,formas cis- e trans-, em soluo contendo 10 mL de etanol e 1 mL desoluo aquosa de HCl (2,0 mol L-1). Concentrao de 2,3 10-5mol L-1
62
Figura 23. (a) Cromatograma de ons total das dihidro-isohumulonas. (b)Espectro de massas (ESI(-)MS) da espcie trans- e cis-dihidro-isocohumulona referente aos picos 1 e 2, tr= 6,3 e 7,6 min. (c) Espectrode massas (ESI(-)MS) da espcie trans- e cis-dihidro-iso-n-humulonareferente aos picos 3 e 4, tr= 8,2 e 10,0 min. (d) Espectro de massas(ESI(-)MS) da espcie cis- e trans-dihidro-isoadhumulona referente aospicos 5 e 6, tr= 11,7 e 15,1 min
63
Figura 24. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das dihidro-isohumulonas,formas cis- e trans-, em CDCl3. Os sinais marcados com (*) indicam
impurezas presentes na amostra
65
Figura 25. Espectro eletrnico de absoro das tetrahidro-isohumulonas,formas cis- e trans-, em meio etanol. Concentrao de 2,3 10-5mol L-1
66
Figura 26. (a) Cromatograma de ons total das tetrahidro-isohumulonas,formas cis- e trans-. (b) Espectro de massas (ESI(-)MS) da espciecis- etrans-tetrahidro-isocohumulona referente aos picos 1 e 2, tr= 19,2 e 21,5min., respectivamente. (c) Espectro de massas (ESI(-)MS) das espciescis- e trans-tetrahidro-iso-n-humulona referente ao pico 3, tr= 26,0 min.(d) Espectro de massas (ESI(-)MS) das espcies cis- e trans-tetrahidro-
isoadhumulona referente ao pico 4, tr= 29,6 min
68
Figura 27. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das tetrahidro-isohumulonas,formas cis- e trans-, em CDCl3. Os sinais marcados com (*) indicamimpurezas presentes na amostra
69
Figura 28. Voltamograma cclico das trans-isohumulonas em sua formaaninica, em acetonitrila contendo 0,2 mol L-1 de perclorato detetrabutilamnio como eletrlito suporte. Eletrodos: diamante dopadocom boro (trabalho), platina (contra-eletrodo), ferroceno (referncia
interna). A velocidade de varredura foi 50 mV s
-1
71
Figura 29. Voltamograma cclico das trans-isohumulonas em sua formamolecular, em acetonitrila contendo 0,2 mol L-1 de perclorato detetrabutilamnio como eletrlito suporte. Eletrodos: diamante dopadocom boro (trabalho), platina (contra-eletrodo), ferroceno (refernciainterna). As velocidades de varredura foram: a = 10 mV s-1,b = 50 mV s-1,c = 100 mv s-1, d = 200 mV s-1
72
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LISTA DE FIGURAS
Figura 30. (a) Cromatograma de ons total dos produtos decorrentes dareao de formao do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH]
sobatmosfera de O2. T = 25
0 C; t = 5 minutos. (b) Espectro de massas(ESI(+)MS) do eluato em tr= 6 min referente espcie 4-POBN
74
Figura 31. (a) Cromatograma de ons total dos produtos decorrentes dareao de formao do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH]
sobatmosfera de Ar. T = 250 C; t = 5 minutos. (b) Espectro de massas(ESI(+)MS) com atribuio dos ons do eluato em tr = 7,9 min. (c)Espectro de massas (ESI(+)MS) com atribuio dos ons do eluato em tr= 8,6 min. (d) Espectro de massas (ESI(+)MS) com atribuio dos onsdo eluato em tr = 9,2 min. (e) Espectro de massas (ESI(+)MS) comatribuio dos ons do eluato em tr= 12,8 min
77
Figura 32. Estruturas qumicas das quatro espcies formadas da reaoentre 4-POBN e o radical 1-hidroxietila: (a) aduto oxidado; (b) adutoradical; (c) e (d) 4-POBN ligado a duas molculas do radical 1-hidroxietil;(e) aduto reduzido
77
Figura 33. Espectro de ressonncia paramagntica de eltrons (RPE)registrado em banda-X (9,521 GHz) do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH]
obtido em soluo aquosa gua/etanol ( 5%) atemperatura de 250C
78
Figura 34. Decaimento do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] na
presena e ausncia de catalase (47,4 mg mL-1). T = 250C
80
Figura 35. rea dos picos cromatogrficos referentes s espcies adutooxidado, aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH]
e 4-POBN contendo duasmolculas do radical 1-hidroxietila em funo do tempo de reao e napresena de catalase
81
Figura 36. Grfico (F/F-1)*k2*[4-POBN] vs. concentrao de trans-isohumulonas. Medidas obtidas por espectrometria de massas (ESI-(+)-MS/MS e espectroscopia de ressonncia paramagntica de eltrons
(EPR). T = 25
o
C; 1 minuto de reao
85
Figura 37. Configurao espacial das cis-isohumulonas (a) e trans-isohumulonas (b), com os respectivos momentos de dipolo eltrico
90
Figura 38. Ilustrao dos orbitais moleculares ocupados de maiorenergia (HOMO) calculados para os diastereoismeros cis- (a) e trans-isohumulonas (b)
91
Figura 39. Representao das ligaes C-H envolvidas na abstrao dotomo de hidrognio na reao. (a) trans-isohumulonas; (b) cis-isohumulonas
92
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LISTA DE FIGURAS
Figura 40. Espectro de on isolado 240,1 m/z decorrente da reao doradical 1-hidroxietila e 4-POBN (pico 1), na presena de cidoclorognico (pico 2) ou cido cafeico (pico 3). As injees foramrealizadas em batelada
94
Figura 41. Espectros de ressonncia paramagntica de eltrons (RPE)registrados em banda-X (9,521 GHz) do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH]
decorrente da reao controle (em preto), reaoprocessada na presena cido clorognico (em vermelho) e reaoprocessada na presena do cido cafeico (em azul). Os espectros foramobtidos a temperatura de 25oC
95
Figura 42. (a) Cromatogramas de ons total da soluo alcolicacontendo as trans-isohumulonas (em vermelho) e dos produtos
decorrentes da reao das trans-isohumulonas e o radical 1-hidroxietila(em azul),sob atmosfera de Ar, T = 250C, t = 1 minuto de reao. (b)Espectro de massas (ESI(-)MS) com atribuio do on do eluato em t r=17,7 min. (c) Espectro de massas (ESI(-)MS) com atribuio do on doeluato em tr= 21,5 min
98
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LISTA DE TABELAS
Lista de Tabelas
Tabela 1. Percentuais de isohumulonas no extrato de lpulo pr-isomerizado 53
Tabela 2. Dados cinticos com respeito ao decaimento do aduto radical[4-POBN/CH(CH3)OH]
no meio reacional e a temperatura de 25 0C80
Tabela 3. Constantes de velocidade aparentes da reao entre o radical1-hidroxietila e os iso--cidos e seus derivados, em sua forma aninica,determinadas por EPR e ESI-(+)-MS/MS, em 1 minuto de amostragem
86
Tabela 4. Constantes de velocidade aparentes da reao entre o radical1-hidroxietila e as iso-n-humulonas, em sua forma molecular,determinadas ESI-(+)-MS/MS, em 1 minuto de amostragem
88
Tabela 5. Propriedades eletrnicas dos diastereismeros cis- e trans-iso--cidos, em sua forma molecular, calculadas usando o mtodo M06/6-31+G(d)
89
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ABREVIATURAS
Abreviaturas
4-POBN - -4-piridil-1-xido-N-tert-butilnitrona-CD - -ciclodextrina
BDE - Bond Dissociation Energy
CDCl3 - Clorofrmio deuterado
CID - Colision Induced Dissociation
ESI-MSn - Espectrmetro de Massas
DFT - Density Functional Theory
IEF-PCM - Integral Equation Formalism as PolarizableContinuum Model
HER - 1-hydroxyethyl radical1H RMN - Ressonncia Magntica Nuclear de Hidrognio
HOMO - Highest Occuped Molecular Orbital
IAA - Iso--cidos
LC-MSn - Liquid Chromatography/Mass Spectrometry
MBT - 3-metil-but-2-eno-1-tiolNHE - Normal hydrogen electrode
Rf - Riboflavina 5-monofosfato de sdio
RPE - Ressonncia Paramagntica de eltrons
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RESUMO
RESUMO
Os iso--cidos so os principais constituintes responsveis pelo sabor amargo da
cerveja, sendo estes facilmente degradados durante o seu processo de
envelhecimento ou exposio a radiao luminosa, em particular o diastereoismero
trans-. O radical 1-hidroxietila o radical majoritrio formado na cerveja durante o
processo de envelhecimento. O presente trabalho descreve a reatividade dos iso--
cidos frente ao radical 1-hidroxetila atravs do uso da tcnica de spin-trappingcom
deteco por espectroscopia de ressonncia paramagntica de eltrons (RPE) e
espectrometria de massas (ESI-(+)-MS/MS). Observou-se que ambos os
diastereoismeros cis-e trans-iso--cidos so degradados na presena do radical
1-hidroxietila com constantes de velocidade aparentes de 1,8 108e 9,2 109L mol-1s-
1, respectivamente. A reatividade dos dihidro-iso--cidos com o radical estudado foi
similar reatividade da mistura diastereoisomrica dos iso--cidos, apresentando
constante de velocidade aparente de 1,5 109L mol-1s-1. Os anlogos tetrahidro-iso-
-cidos no apresentaram reatividade para com o radical 1-hidroxietila, sugerindo
os hidrognios allicos como stio reacional. Adicionalmente, os clculos ab initiopor
DFTdemonstraram que os valores de BDEpara os hidrognios allicos das cadeias
laterais prenila e isohexenoila so equivalentes e, desta maneira, sugerindo a maior
reatividade do diastereoismero trans- a ser creditada a um fator entrpico, j queambos os grupos esto no mesmo plano espacial. Os produtos de oxidao foram
determinados por LC-ESI-MSn e verificou-se a formao dos hidroxi-allo-iso--
cidos, recentemente descritos na literatura. O conjunto de resultados obtidos
possibilitou a proposta de mecanismo para processo de oxidao e perda dos cidos
amargos da cerveja, observado no envelhecimento da bebida.
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ABSTRACT
ABSTRACT
The iso--acids are the main responsible constituents for the bitter taste of beer, they
are easily degraded during the aging and light exposed process, specially the trans-
diastereoisomer. The 1-hydroxyethyl radical is the major radical produced during the
beer aging process. The present work describes the reactivity of iso--acids towards
the 1-hydroxyethyl radical as probed by the spin-trapping technique and detected by
electron paramagnetic resonance (EPR) and mass spectrometry (ESI-(+)-MS/MS). It
was observed that both diastereoisomers cis- and trans-iso--acids are degraded in
the presence of 1-hydroxyethyl radical with apparent rate constant of 1.8 108e 9.2
109L mol-1s-1, respectively. The reactivity of dihydro-iso--acids towards the studied
radical was similar to the reactivity of the iso--acids diastereoisomeric mixture,
showing apparent rate Constant of 1.5 109 L mol-1 s-1. The tetrahydro-iso--acids
analogues did not observed reactivity towards the 1-hydroxyethyl radical suggesting
the allilic hydrogens as the reaction sites. In addition, the ab initioDFT calculations
demonstrated that the BDE values for the allilic hydrogens of the prenyl and
isohexenoyl side chains are equivalents and according to that suggesting the higher
reactivity of the trans- diastereoisomer to be accounted to an entropic factor since
both goups are in the same plane of the space. The oxidation products were
determined by LC-ESI-MS
n
and its was verified the formation of hydroxyl-allo-iso-
-acids. The data colected allows a mechanism to be proposed for the oxidation
process and loss of bitter acids of beer during the beverage aging.
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1. INTRODUO
A cerveja cons
com um consumo mun
produo anual em torn
apresenta uma mdia
bebidas alcolicas no pa
Figura 1. Consumo mdio analcolicas no mercado brasile
INTRODUO
iderada a bebida alcolica mais consu
dial mdio per capita ao redor de 21
o de 1,22 106hectolitros1. O consumo
de 47,6 litros/ano2, representando 66
s, Figura 1.
ual de cerveja per capita por pas e grfico da diiro1.
ida mundialmente,
,9 litros/ano e uma
per capita no Brasil
% do mercado de
tribuio de bebidas
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INTRODUO
Por regulamentao, a cerveja produzida a partir de gua de boa qualidade,
malte de cevada, fermento e lpulo (Humulus lupulus), podendo ainda ser utilizadas
outras fontes de carboidratos como co-adjuntos tais como arroz, milho e trigo3
. A
cerveja , por definio, uma bebida carbonatada de baixo teor alcolico que tem
atrado consumidores h mais de 100 anos por apresentar atributos sensoriais
peculiares, tais como frescor, aroma e amargor caracterstico4.
O processo industrial para a produo de cerveja encontra-se ilustrado na
Figura 2. O incio do processo ocorre pela moagem do malte de cevada juntamente
com a gua, resultando em uma suspenso que submetida a aquecimento a
temperatura de aproximadamente 60 oC para que as enzimas, amilase e protease,
degradem o amido e protenas do malte, formando uma mistura de glicose e
aminocidos tambm denominada mosto doce.
Figura 2. Fluxograma do processo industrial cervejeiro.
MOAGEMgua
FILTRAO
FERVURA
FERMENTAO
FILTRAO
MATURAO
ENVASE PASTEURIZAO
lpulo
CO2
leveduras
malte de cevada
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INTRODUO
Logo aps a etapa de filtrao, h adio do lpulo#e em seguida aplica-se
um gradiente de temperatura, podendo chegar at 95 oC, durante aproximadamente
uma hora; tem-se ento o processo de fervura/cozimento dos mosto doce. Em
seguida, os materiais suspensos provenientes do lpulo so retidos e a mistura
ento resfriada para a adio das leveduras; dar-se- a fermentao. Esta etapa
dividida em dois estgios: aerbico e anaerbico. No estgio aerbico ocorre o
crescimento das leveduras na presena de oxignio, ao passo que no estgio
anaerbico, as leveduras transformam a glicose em etanol e dixido de carbono,
sendo este ltimo recuperado e armazenado para o reaproveitamento ao final do
processo. Existem dois tipos de leveduras que so utilizadas no processo cervejeiro,
Saccharomyces carlsbergensis e Saccharomyces cerevisiae, as quais conferem o
tipo de fermentao empregado. Utilizando leveduras do tipo Saccharomyces
carlsbergensis tem-se uma cerveja de baixa fermentao, as quais decantam
durante a produo de etanol, ao passo que uma cerveja tida como de alta
fermentao so empregadas leveduras do tipo Saccharomyces cerevisiae, as quais
ficam suspensas no final do processo e suportam altas concentraes de etanol.
Ao final da fermentao, as leveduras so removidas, obtendo uma cerveja
denominada green beer, esta ltima ainda no adequada ao consumo imediato por
apresentar compostos de sabor e aroma indesejveis. Consequentemente, requerido um perodo denominado de maturao, no qual a cerveja mantida em
torno de 0 oC por um tempo relativamente grande (semanas) para que tais
compostos sejam vagarosamente degradados/transformados at atingirem nveis de
concentrao abaixo de seus valores crticos (limiares de sensao). Ainda,
comumente empregada, ao final do processo cervejeiro, uma correo do amargor
#O lpulo pode ser adicionado ao processo cervejeiro atravs da adio direta de flores secas (innatura),pelletsou extratos3.
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INTRODUO
da cerveja acabada adicionando-se extrato de lpulo pr-isomerizado. Por fim, a
cerveja segue para o envase, aps filtrao e adio de dixido de carbono,
podendo ainda passar ou no pelo processo de pasteurizao5,6
.
De acordo com a Lei da Pureza da Cerveja (Reinheitsgebot), promulgada
pelo Duque Guilherme IV da Baviera em 1516, foi institudo na Alemanha o uso
apenas do malte de cevada, gua, lpulo e fermento como ingredientes para a
fabricao da cerveja7. Desta forma, o uso do lpulo no processo de fabricao da
cerveja foi reforado. Este ingrediente foi introduzido na cervejaria durante a Idade
Mdia pelos monges europeus que refinaram as tcnicas de produo. Inicialmente,
o lpulo era adicionado como um preservativo de ao bactericida de origem natural
para que a cerveja pudesse ser estocada por longos perodos; porm, passou a ser
um agente de aroma essencial e singular da cerveja.
O lpulo uma planta trepadeira perene, pertencente famlia
Cannabinaceae, espcie Humulus lupulus, cuja composio qumica complexa,
compreendendo uma gama muito grande de metablitos secundrios localizados
especialmente nas glndulas localizadas atrs das brcteas do cone de lpulo.
Estas glndulas so cobertas com um p resinoso amarelo chamado de lupulina.
Entre as diversas classes de compostos qumicos presentes na lupulina encontram-
se os leos essenciais (0,5 5% v/m), polifenis (3 6% m/m) e os -cidos e -cidos (4 30% m/m)5,8, tambm denominados humulonas e lupulonas
respectivamente, os quais possuem grande impacto na qualidade da cerveja. As
estruturas qumicas dos -cidos e -cidos esto apresentadas na Figura 3.
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INTRODUO
Figura 3. Estrutura qumica dos -cidos (1a-c) e -cidos (2a-c). (1a) n-lupulona, (1b) colupulona,(1c) adlupulona, (2a) n-humulona, (2b) cohumulona, (2c) adhumulona.
Desta forma, o lpulo e seus componentes so considerados essenciais na
produo de cerveja e responsveis pela distino desta de qualquer outra bebida
alcolica carbonatada. Ainda, dentre os componentes utilizados no processo
industrial da cerveja, o lpulo representa o de menor custo6 e, neste contexto,
interessante enfatizar que apenas as plantas femininas formam o cone de lpulo e,
portanto, somente estas so comercializadas.
Apesar de no possurem impacto direto nas propriedades sensoriais dacerveja, os -cidos so os precursores dos iso--cidos, comumente chamadas por
isohumulonas, responsveis pelo amargor caracterstico e qualidade da espuma da
cerveja9,10. Conforme j mencionado, as humulonas so introduzidas ao processo
cervejeiro pela adio do lpulo ao mosto e, aps a fervura deste, h converso das
humulonas, pouco solveis em meio aquoso (60 mg L-1a 100 oC), s espcies mais
hidroflicas denominadas isohumulonas, conforme ilustrado no Esquema 1.
1a-c 2a-c
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INTRODUO
Esquema 1. Reao de isomerizao trmica das humulonas cis- (2-ac) e trans-isohumulonas(1-ac) durante o cozimento do mosto fermentado e adicionado de lpulo. A relao trans-/cis-ishumulonas em condies normais de fabricao da cerveja de 32:68. (a) iso-n-humulona, (b)isocohumulona, (c) isoadhumulona9.
Estes compostos contendo um anel de 5 membros consistem em pares de
diastereoismeros, trans-isohumulonas (1a-c, Esquema 1) e cis-isohumulonas (2a-c, Esquema 1), cada qual com 3 anlogos: iso-n-humulona (a), isocohumulona (b) e
isoadhumulona (c), Esquema 1. A configurao absoluta cis-/trans- determinada
pela orientao do grupo hidroxila em C4 e a cadeia lateral prenila em C5, sendo a
denominao trans- referente direo oposta de ambos os substituintes com
respeito ao anel de 5 membros. Verifica-se que, aps a fervura do mosto, a razo
cis-/trans- em geral 7:3, uma vez que os diastereoismeros cis- so
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INTRODUO
termodinamicamente mais estveis (configurao de menor energia), visto que os
grupos laterais volumosos prenila e isohexenoila esto transposicionadas9.
O valor de pKa varia sensivelmente para cada anlogo de iso--cidos; porm,
este pode ser aproximado para 311,12. Sabe-se que o pH da maioria da cerveja gira
em torno de 4,2 e 4,4, principalmente para cervejas do tipo large11,12. Desta forma,
as isohumulonas encontram-se predominantemente na forma aninica na bebida
(aproximadamente 84%), cuja frmula estrutural est apresentada na Figura 4b.
Evidentemente, esta afirmativa pode no ser verdadeira para cervejas mais cidas,
estando presentes, neste caso, os iso--cidos em sua forma molecular, Figura 4a.
Figura 4. Estrutura qumica das isohumulonas em sua forma molecular (a) e aninica (b).
A concentrao de iso--cidos presentes no produto acabado varia entre 15
a 80 mg L-1 (4,1 10-5a 2,2 10-4mol L-1), conferindo diferentes graus de amargor13.
Desta forma, as isohumulonas representam aproximadamente 80% de todo
componente derivado do lpulo presente na cerveja10.
Quimicamente, a cerveja pode ser considerada uma soluo alcolica com
concentrao hidrogeninica (CH+) de 10-4,2 mol L-1, contendo centenas de
substncias dissolvidas14. Entretanto, os constituintes de uma cerveja fresca, recm
engarrafada, no esto em equilbrio qumico. Termodinamicamente, uma garrafa de
cerveja um sistema fechado e ir empenhar-se para alcanar uma condio demenor energia e mxima entropia. Por conseguinte, muitas converses de seus
(a) (b)
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INTRODUO
constituintes so termodinamicamente possveis, sendo que sua relevncia para a
qualidade de cerveja , em sua maioria, determinada pelas velocidades de reao
em condies prticas de armazenamento do produto14
.
Com o aumento da exportao da cerveja, principalmente devido
globalizao do mercado, problemas relacionados ao tempo de prateleira do produto
(shelf-life) tornam-se de extrema importncia para a indstria cervejeira. Sabe-se
que a cerveja suscetvel a sofrer diversas reaes durante o seu armazenamento,
as quais levam a perda de amargor e frescor do produto, bem como o
desenvolvimento de compostos que conferem aroma e sabor indesejveis14. Desta
forma, o conhecimento dos possveis caminhos, mecanismos e constantes de
velocidade especficasdas reaes que ocasionam a perda da qualidade sensorial
do produto podem auxiliar no desenvolvimento de tcnicas e mtodos para a
conservao do produto.
Neste aspecto, as isohumulonas so particularmente sensveis a degradao
durante o armazenamento15, o que leva no somente a perda sensorial de amargor,
mas tambm formao de compostos volteis de aroma, tais como 4-metil-2-
pentanona e 3-penteno-2-ona14,15. Existem indcios fortes que apontam o
envolvimento dos iso--cidos na formao de aromas indesejveis tpicos de
cerveja velha, podendo estes cidos sofrerem degradao oxidativa, mesmo na
ausncia de oxignio molecular12.
Diversos estudos reportaram que o envelhecimento da cerveja est
diretamente relacionado com a degradao das trans-isohumulonas, visto que a
configurao cis- mostrou-se mais estveis e menos suscetveis aos processos
A velocidade de cada reao ir determinar a viabilidade de cada caminho e est intrinsecamenterelacionada a constante de velocidade especfica da reao e ao teor dos reagentes.Constante de velocidade especfica refere-se constante de velocidade determinada diretamentepelo decaimento ou formao da espcie de interesse.
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INTRODUO
deteriorativos4,5,16. Todavia, produtos de oxidao de ambos os diastereoismeros,
cis- e trans-isohumulonas, formados durante o armazenamento da cerveja contida
em garrafa PET, foram apontados em estudos recentes17,18
. Estes compostos foram
chamados de hidroperoxi-allo-isohumulonas e hidroxi-allo-isohumulonas e so
decorrentes de reaes de degradao dos iso--cidos via radicalide, na presena
de traos de metais de transio, tais como ons de ferro, e oxignio molecular17.
Durante um tempo considervel a reao de degradao via foto-oxidao
das isohumulonas foi estudada com muito afinco11,19-22. Neste contexto, verificou-se
que os iso--cidos sofrem degradao na presena de luz e riboflavina,
fotosensibilizador naturalmente presente na cerveja19,20. Este tipo de reao tem
impacto direto na qualidade sensorial da bebida no somente pela perda do amargor
caracterstico do produto, mas, sobretudo, pelo impacto negativo de alguns produtos
de degradao.
A ttulo de exemplificao, pode-se citar a formao do 3-metil-2-buteno-1-tiol
(MBT)19-22, cujo mecanismo de formao est ilustrado no Esquema 2. Verifica-se
que aps iniciada a reao com a transferncia de 1 eltron do cromforo
-tricarbonila das isohumulonas para a riboflavina no estado tripleto excitado (3RF*),
excelente aceptor de eltrons (E = + 1,77 V vs. NHE)22, o radical alcoxila formado
sofre uma clivagem de Norrish do Tipo I gerando o cido dihidrohumulnico e oradical 4-metilpenta-3-enol. Este radical sofre rpida descarbonilao e, na presena
de radicais tiis (SH) o MBT ento formado11,21. A presena desta substncia
confere um odor extremamente desagradvel ao produto, lembrando o odor
decorrente dos tiis secretados pelas glndulas anais do gamb listrado (Mustela
Vison L.), fato este agravado pelo baixo limiar de percepo do produto formado
(aproximadamente 1 ng L-1)19,22.
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INTRODUO
Esquema 2. Reao de degradao fotoqumica dos iso--cidos em cerveja11,21.
Em adio, Lusk e Murakami23revelaram recentemente a existncia de dois
novos compostos formados a partir da exposio da cerveja luz. Pouco se
conhece sobre a estrutura destes compostos; no entanto, sabe-se que estes so
decorrentes da fotodegradao dos iso--cidos sensibilizado pela riboflavina. Como
resultado, atravs da anlise sensorial dos mesmos, verificou-se que estas
substncias possuem aroma indistinguvel ao conferido pelo MBT, alm de
apresentarem a mesma massa molecular.
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INTRODUO
Verifica-se uma crescente busca pelas indstrias cervejeiras por
aperfeioamento em seu processo industrial, cuja finalidade consiste em atribuir ao
produto acabado melhorias referentes estabilidade, qualidade sensorial e aumento
do tempo de prateleira do mesmo. De fato, os derivados hidrogenados e reduzidos
dos iso--cidos, em especial tetrahidro-isohumulonas (2a-c, Figura 5) e dihidro-
isohumulonas (1a-c, Figura 5), vm sendo empregados no processo industrial da
cerveja por serem reconhecidamente menos sensveis* a degradao via
fotoqumica que os seus precursores, isohumulonas.
Figura 5. Estrutura qumica da dihidro-isohumulonas (1a-c) e tetrahidro-isohumulonas (2a-c),
derivados reduzidos e hidrogenados dos iso--cidos, respectivamente. (1a) dihidro-iso-n-humulona,(1b) dihidro-isocohumulona, (1c) dihidro-isoadhumulona, (2a) tetrahidro-iso-n-humulona, (2b)tetrahidro-isocohumulona, (2c) tetrahidro-isoadhumulona.
Assim, o uso dos derivados reduzidos dos cidos amargos do lpulo vem de
encontro melhoria na qualidade sensorial do produto, uma vez h, em parte, uma
minimizao na formao de aromas indesejveis e perda sensorial de amargor19-22.
Entretanto, na prtica, vrios problemas so detectados, j que os derivados
reduzidos tambm podem sofrer decomposio via radicalide, levando a formao
de produtos de degradao especficos, tais como 4-metil-3-pentenal, o qual lembra
o odor de papelo e assim conferindo um aroma tpico de cerveja velha22. A
exposio das tetrahidro-isohumulonas luz conduz a formao do composto
* O atributo menos sensvel est relacionado ao menor impacto sensorial dos fotoprodutos dedegradao e no a estabilidade qumica da espcie.
(1a-c) (2a-c)
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INTRODUO
4-metilpentanal, sendo, neste caso, a descarbonilao do radical 4-metil-pentanoil
competitiva com a abstrao de hidrognio a partir de um doador apropriado22.
Entretanto, os produtos de degradao dos derivados hidrogenados e reduzidos dos
iso--cidos no apresentam um impacto negativo to expressivo quanto ao
conferido ao MBT, formado a partir da isohumulonas.
Adicionalmente, a presena das tetrahidro-isohumulonas na cerveja resulta
em uma maior estabilidade da espuma, bem como o aumento no poder de amargor
do produto. Por outro lado, o uso das dihidro-isohumulonas no processo cervejeiro
culmina em uma reduo do amargor, bem como o decrscimo da estabilidade da
espuma5,24. Neste contexto, um aspecto importante a ser lembrado o fato de que o
uso dos derivados de iso--cidos, os quais no so de origem natural, no
permitido na fabricao de cervejas destinadas ao mercado Alemo em decorrncia
do Reinheitsgebot.
A partir desses exemplos de alteraes que ocorrem durante o
armazenamento da cerveja, segue que a natureza das mudanas do sabor um
processo complexo e depende principalmente do tipo da cerveja, concentrao de
oxignio dissolvido e das variaes de temperatura submetidas ao produto durante o
transporte e estocagem.
Sabe-se que a concentrao de radicais gerados durantes o processo deenvelhecimento natural da cerveja aumenta com o teor de oxignio dissolvido, com
elevadas temperaturas de armazenamento14ou com o aumento das concentraes
de alguns metais de transio, tais como ons de ferro e cobre. Entretanto, pelo fato
do radical hidroxila (OH) apresentar alta reatividade (E0= + 2,7 V vs. NHE) e baixa
seletividade, Andersen e Skibsted25 demonstraram, atravs de experimentos de
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INTRODUO
spin-trapping e ressonncia paramagntica de eltrons, que o radical 1-hidroxietila
(HER) o radical predominante formado na cerveja.
O radical HER proposto por originar-se da reao entre o etanol, co-
solvente, com o radical hidroxila, conforme ilustrado o Esquema 325,26. De fato,
verificou-se que radicais hidroxila abstraem tomos de hidrognio de molculas de
etanol com uma constante de velocidade de 1,9 109L mol-1s-1. Esta abstrao de
tomo de hidrognio ocorre preferencialmente no carbono C1 (85%), formando o
radical 1-hidroxietila, sendo em menor extenso no carbono C2 (13%), resultando no
radical 2-hidroxietila25. Sabe-se ainda que ambos os radicais formados durante a
oxidao do etanol reagem com o oxignio molecular (O2), resultando na formao
do radical hidroperoxila (OOH) e acetaldedo como produto principal ao final25.
Esquema 3. Formao e reaes subseqentes dos radicais 1-hidroxietila, em destaque, e2-hidroxietila em cerveja, de acordo com o proposto dor Andersen e Skibsted25.
Ainda, Elias e Andersen27 demonstraram recentemente que o radical HER
quantitativamente a espcie radical responsvel pela oxidao do vinho. Desta
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INTRODUO
forma, o radical 1-hidroxietila formado a partir da oxidao do etanol pelo radical
hidroxila decorrente da reao de Fenton25,28, Esquema 4.
Esquema 4.Reao de Fenton25,28.
interessante ressaltar que compostos fenlicos, presentes tanto na cerveja
quanto no mosto, so reativos frente ao radical 1-hidroxietila29,30. Estas substncias
fenlicas esto presentes na bebida em teores considerveis, os quais giram em
torno de 460 mg L
-1
(2,7 10
-3
mol L
-1
expresso em equivalente de cido glico)
30-32
.Dentre estes compostos fenlicos, pode-se citar compostos pertencentes classe
dos flavonides, tais como: quercetina, kaempferol e morina; bem como alguns
cidos cinmicos como cido cafeico, clorognico e p-cumrico, cujas estruturas
qumicas esto apresentadas na Figura 6.
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INTRODUO
Figura 6. Estrutura qumica de alguns fenis presentes na cerveja. (a) quercetina, (b) morina, (c)kaempferol, (d) cido p-cumrico, (e) cido clorognico, (f) cido cafeico.
Substncias fenlicas so conhecidas pela suas propriedades antioxidantes,
sendo ento de extrema importncia na preservao de alimentos ao evitar ou inibir
processos oxidativos que levam a deteriorao o produto. Neste contexto, Marfak e
Trouillas30determinaram as constantes de velocidade da reao entre o radical HER
e alguns flavonides, tais como quercetina (4,0 104 L mol-1 s-1), kaempferol
(3,1 104 L mol-1 s-1) e morina (2,9 104 L mol-1 s-1). Consequentemente, esta
reatividade ocasiona a decomposio destes antioxidantes naturais e, portanto, a
diminuio da capacidade redox do produto.
(a) (b)
(c) (d)
(e) (f)
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OBJETIVOS
2. OBJETIVOS
Aparte do melhor conhecimento a respeito do processo de deteriorao
oxidativa da cerveja, os principais objetivos e metas do presente trabalho podem ser
resumidos conforme descrito a seguir:
- Estudo da reatividade de isohumulonas frente ao radical 1-hidroxietila;
- Estudo da reatividade dos derivados reduzidos e hidrogenados dos
iso--cidos, dihidro-isohumulonas e tetrahidro-isohumulonas respectivamente,
frente ao radical 1-hidroxietila;
- Determinao dos produtos de reao;
- Estudo eletroqumico da forma molecular das trans-isohumulonas;
- Propor o mecanismo de degradao das isohumulonas via radicalide, bem
como elucidar o stio de reao e verificar a dependncia estereoqumica da reao;
- Estudo da reatividade de alguns fenis, presentes na cerveja, frente ao
radical 1-hidroxietila.
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MATERIAL E MTODO
3. MATERIAL E MTODO
3.1. Reagentes.
Acetonitrila, cido clordrico 36-38% e etanol foram obtidos da J. T. Baker;
acetato de etila e metanol foram obtidos da Tedia, cido frmico 98-100%, cloreto de
ferro (II) (FeCl2.4H2O), hidrxido de amnia e o perxido de hidrognio 30% foram
obtidos da Merck; acetato de amnio, cido p-cumrico, borohidreto de sdio,
-4-piridil-1-xido-N-tert-butilnitrona (4-POBN), -ciclodextrina 98%, catalase de
fgado bovino, catalisador paldio suportado em carbono 10%, diciclohexilamina
99%, ferroceno, quercetina e o perclorato de tetrabutilamnio foram obtidos da
Sigma-Aldrich; sulfato de sdio (Hexis); clorofrmio deuterado (Acros Organics);
gases argnio (5,0), hidrognio (4,5), Helio (5,0) e nitrognio foram obtidos da White
Martins. O extrato de lpulo pr-isomerizado (30% massa/volume) foi gentilmente
cedido pela empresa Hopsteiner. A gua de alta pureza (18 M cm-1) utilizada foi
previamente destilada e purificada utilizando um sistema de purificao Milli-Q
(Millipore). Placas de TLC com matriz slica gel suportadas em alumnio contendo
200 m de espessura de camada e indicador fluorescente (254 nm) foram obtidas da
Fluka Analytical. Todos os reagentes utilizados foram de grau analtico e utilizados
sem prvio tratamento. Os solventes foram de grau cromatogrfico (HPLC) utilizados
sem prvio tratamento, com exceo do acetato de etila que foi tratado seguindo
procedimento descrito na literatura33.
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MATERIAL E MTODO
3.2. Isolamento das trans-isohumulonas.
Os diastereoismeros trans- foram isolados utilizando metodologia proposta
por Khatib e Verpoorte34, na qual se partiu de uma soluo aquosa comercial
contendo uma mistura de sais de potssio das isohumulonas na forma cis- e trans-
(6,6 g). A esta soluo foi adicionada uma soluo aquosa de -ciclodextrina (1,5 g,
em 12 mL de gua), gota a gota, mantida a 70 oC, utilizando-se a razo molar
(Riso--cidos/-ciclodextrina) 4:1. A mistura reacional foi mantida sob agitao a 70oC
durante 30 minutos, ocorrendo a complexao seletiva ao formar complexos de
-ciclodextrina com os trans-iso--cidos. A seguir, a mistura reacional foi
devidamente armazenada a 4 oC, sob o abrigo de luz e em repouso, por 48 horas.
Ao trmino da reao de complexao, formou-se um precipitado amarelo
claro, o qual foi filtrado e lavado vrias vezes com etanol/gua (1:2 v/v) e acetato de
etila. Na etapa seguinte, adicionou-se 50 mL de metanol ao complexo, sob agitao,
para que houvesse a liberao das trans-isohumulonas, as quais ficaram em
soluo enquanto que a -ciclodextrina precipitou. Por conseguinte, um novo
processo de filtrao foi realizado utilizando-se um filtro de placa porosa e o solvente
removido por roto-evaporao a presso reduzida. Ento, adicionou-se acetato de
etila (25 mL) para que resqucios de -ciclodextrina fossem precipitados e, por fim, asoluo resultante de uma nova filtrao foi roto-evaporada at a secura. Obteve-se,
desta forma, uma mistura contendo as trans-isohumulonas na sua forma aninica, a
qual foi posteriormente caracterizada por espectroscopia eletrnica de absoro
(UV-vis), ressonncia magntica nuclear (1H RMN) e cromatografia lquida hifenada
ao espectrmetro de massas (LC-ESI-MSn).
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MATERIAL E MTODO
Adicionalmente, a trans-isocohumulona foi cromatograficamente separada da
trans-iso-n-humulona utilizando-se um sistema de cromatografia lquida de alta
eficincia (HPLC) semi-preparativo, detector de arranjo de diodos na regio do
UV-vis. A separao foi obtida atravs de uma coluna LUNA C-18 10 m (20 cm x
0,7 cm); fluxo 2,5 mL min.-1; fase mvel solvente A H2O/cido frmico (99:1 v/v) e
solvente B Etanol/cido frmico (99:1 v/v); sistema isocrtico, cuja relao da fase
mvel foi 56% do solvente B em A. Uma soluo alcolica contendo apenas os
diastereismeros trans- (20 mg/injeo) foi ento injetada para obter o perfil
cromatogrfico desejado, coletando as fraes dos analitos de acordo com os
respectivos tempos de reteno. As fraes foram posteriormente caracterizadas por
LC-ESI-MSn.
3.3. Isolamento das cis-isohumulonas.
Os cis-iso--cidos foram isolados partindo-se se uma soluo comercial
contendo sais de potssio dos diastereismeros cis- e trans- (1,6 g). A esta soluo
contendo a mistura diastereoisomrica foi adicionada vagarosamente a uma soluo
aquosa equimolar de -ciclodextrina (1,5 g, em 12 mL de gua)(Riso--cidos/-ciclodextrina= 1:1)
34, mantida a 70 oC. A reao seguiu durante 30 minutos,
sob agitao a 70 oC, havendo a complexao das trans-isohumulonas com a
-ciclodextrina. A mistura reacional foi armazenada a 4 oC, sob o abrigo de luz e em
repouso, por 48 horas e, aps a precipitao do complexo, este foi isolado atravs
de uma prvia filtrao e o sobrenadante, contendo os cis-iso--cidos dissolvidos,
foi centrifugado a 7.000 rpm, 4 oC, por 30 minutos, com o intuito de precipitar
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MATERIAL E MTODO
resqucios de complexo na soluo. Em seguida, todo complexo foi retido no filtro de
placa porosa e a soluo resultante liofilizada.Adicionou-se cuidadosamente acetato
de etila (25 mL) ao slido resultante e -ciclodextrina remanescente foi retida em um
filtro de placa porosa, sendo a soluo sobrenadante roto-evaporada at a secura.
Por fim, obteve-se uma mistura contendo os diastereoismeros cis- em sua forma
aninica, a qual foi caracterizada por UV-vis, 1H RMN e LC-ESI-MSn.
Ainda, a cis-isocohumulona foi separada dos homlogos cis-isoadhumulona e
cis-iso-n-humulona aplicando as mesmas condies experimentais empregadas na
separao dos trans-iso--cidos, partindo-se de uma soluo alcolica contendo os
trs anlogos de cis-iso--cidos. Em seguida, as fraes foram caracterizadas por
LC-ESI-MSn.
3.4. Preparo das dihidro-isohumulonas.
As dihidro-isohumuloonas foram preparadas partindo-se de uma mistura de
cis- e trans-iso--cidos (400 mg; 1,1 10-3mol) em metanol (27 mL) e adicionando-
se borohidreto de sdio (92,0 mg), sobre agitao, por 23 horas, a temperatura
ambiente (25
o
C). Aps o trmino da reao, a mistura reacional foi acidificada comcido clordrico (12 mol L-1) a pH 1 e o solvente foi removido por roto-evaporao a
presso reduzida. O resduo foi ento re-dissolvido em gua (20 mL) e a soluo
resultando extrada com acetato de etila (3 x 20 mL), sendo a fase orgnica
posteriormente seca com Na2SO4. Aps seca, o solvente da fase orgnica foi
removido por roto-evaporao, obtendo uma mistura cis- e trans-dihidro-
isohumulonas, a qual foi caracterizada por UV-vis, 1H RMN e LC-ESI-MSn.
7/21/2019 Subsdio - Oxidao de Alfa cidos No Lpulo
38/115
MATERIAL E MTODO
O desenvolvimento da reao foi monitorado atravs de cromatografia planar,
TLC, utilizando-se placas de matriz slica gel suportada em alumnio contendo
200 m de espessura de camada e indicador fluorescente (254 nm). Como solvente
de eluio foram utilizados Hexano/ter etlico (1:4 v/v) acidificado com cido actico
e como revelador foi utilizado o permanganato de potssio (KMnO4).
3.5. Preparo das tetrahidro-isohumulonas.
Os derivados hidrogenados dos iso--cidos foram obtidos seguindo a rota
sinttica descrita por Verzele e De Keukeleire9. Assim, a hidrogenao das olefinas
das cadeias laterais conectadas aos carbonos C5 e C4, referentes aos grupos
prenila e isohexenoila respectivamente, foi obtida partindo-se de uma soluo
contendo os diastereismeros cis- e trans- (200 mg; 5,52 10-4 mol) em metanol
(25 mL), com adio do catalisador paldio suportando no carbono 10% (59,0 mg),
sob atmosfera de hidrognio (H2) (presso ambiente). Depois de decorrido 6 horas
de reao, sobre agitao vigorosa e a temperatura ambiente (25 oC), o catalisador
foi retido e a mistura reacional roto-evaporada at a secura para a obteno da
mistura cis- e trans- tetrahidroisohumulonas. Os produtos da reao seguiram paraposterior caracterizao qumica por UV-vis, 1H RMN e LC-ESI-MSn.
A reao foi monitorada atravs de cromatografia planar TLC, utilizando-se
placas de slica gel e solventes de eluio Hexano/ter etlico (1:1 v/v) acidificado
com cido actico.
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MATERIAL E MTODO
3.6. Caracterizao qumica dos compostos.
A pureza dos compostos isolados e sintetizados foi avaliada por
Espectroscopia Eletrnica de Absoro (UV-vis), Cromatografia Lquida hifenada ao
Espectrmetro de Massas (LC-ESI-MSn) e Ressonncia Magntica Nuclear
(1H RMN).
- LC-ESI-MSn: Sistema de HPLC Shimadzu Prominience LC20AD hifenado ao
espectrmetro de massas de mltiplo estgio do tipo ion-trap Bruker modelo
Esquire 4000.
Coluna: Agilent C-18 extended (5 m, 2,1 x 150 mm); fluxo 0,5 mL min -1; fase
mvel35solvent A Acetato de Amnio (5 10-3mol L-1)/H2O/Etanol (80:20 v/v), pH
aparente ajustado a 9,4 com hidrxido de amnia, solvente B Acetonitrila/Etanol
(60:40 v/v); gradiente 0,3 min: 0% B isocrtico, 3 4 min.: 0 16% B, 4 - 54 min.: 16
30% B, 54 57 min.: 30 95% B, 57 65 min.: 95% B isocrtico.
Espectrmetro de Massas (ESI-MSn): utilizou-se um divisor de fluxo na
interface HPLC/MS, cujo fluxo que chegou at o espectrmetro de massas foi 150
L min-1. Condies de nebulizao: presso 40 psi, fluxo do gs (N2) 9 L min-1;
temperatura de desolvatao 365 oC, voltagem do capilar 3500 V; modo de deteco
de ons negativo.- 1H RMN: para realizar as anlises de ressonncia magntica nuclear, os
compostos foram previamente dissolvidos em uma soluo etanol/cido frmico
(99:1 v/v) e todo solvente foi removido por roto-evaporao a presso reduzida. Este
procedimento foi requerido para garantir que os iso--cidos e seus derivados
estivessem em sua forma protonada. Assim, os espectros de ressonncia magntica
nuclear foram obtidos utilizando-se clorofrmio deuterado (CDCl3) como solvente,
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MATERIAL E MTODO
nos equipamentos: Bruker 200 MHz, 4,7 T, AC200, Instituto de Qumica de So
Carlos (IQSC), Universidade de So Paulo (USP); Bruker, 400,21 MHz, DRX 400-9.4
T, Departamento de Qumica (DQ), Universidade Federal de So Carlos (UFSCar).
- UV-vis: os espectros eletrnicos de absoro na regio do ultravioleta visvel
dos compostos foram obtidos em um espectrofotmetro Hitachi modelo U-3501.
Utilizou-se uma cela de quartzo de caminho tico 1,0 x 1,0 cm. As medidas de
absoro foram efetuadas pela leitura direta dos espectros, sendo utilizado como
referncia o prprio solvente.
3.6.1. Estudo eletroqumico das isohumulonas.
As medidas eletroqumicas foram realizadas em um potenciostato AUTOLAB
modelo PGSTAT100, utilizando-se o eletrodo de diamante dopado com boro como
eletrodo de trabalho, fabricado pela Adamant Technologies S.A., Sua, com
dopagem 8.000 ppm de boro e rea superficial 6,25 mm2. O contra-eletrodo utilizado
foi uma rede de platina, cuja rea superficial de 3,0 mm 2. O potencial do eletrodo
de referncia foi checado contra o potencial padro do par de ferroceno (Fe+1/Fe).
Neste caso, o potencial medido relatado contra o Eletrodo Normal de Hidrognio(NHE) usando Eo= 0,630 V vs. NHEpara o Fe+1/Fe, em acetonitrila36.
Variou-se a taxa de velocidade de varredura de 10 mV s -1 a 200 mV s-1.
Ainda, as medidas foram efetuadas em meio orgnico (perclorato de
tetrabutilamnio em acetonitrila 0,1 mol L-1), a temperatura ambiente (25 oC), sob
atmosfera inerte (N2).
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MATERIAL E MTODO
3.7. Reatividade dos compostos de interesse frente ao radical 1-hidroxietila.
3.7.1. Estudos com o radical 1-hidroxietila: formao e estabilidade do
aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH].
O radical 1-hidroxietila foi gerado, conforme j demonstrado no Esquema 3, a
partir do radical hidroxila, o qual resulta da Reao de Fenton25,28, Esquema 4.
Entretanto, em funo da dificuldade na deteco direta da maioria dos radicais
devido seus baixos tempo de meia vida, a reao deste com os compostos de
interesse, presentes na cerveja, foi estudada utilizando-se o 4-POBN como
armadilha qumica (spin-trap), formando o aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH],
Esquema 5.
Esquema 5. Reao de formao do spin radical [4-POBN/CH(CH3)OH].
O valor da constante de velocidade especfica da reao entre o 4-POBN e o
radical 1-hidroxietila est relatada na literatura com o valor de 3,1 107L mol-1s-1 37.
Como um todo, a reao foi conferida adicionando-se 60 L de uma soluo
de FeCl2.4H2O (2,0 10-3mol L-1) levemente acidificada (pH ~ 4,5) a 1 mL de uma
soluo contendo o 4-POBN (3,2 10-3 mol L-1) a 6% de etanol (ca. 1 mol L-1). A
mistura reacional foi cuidadosamente desgaseificada com argnio, seguida do
acrscimo de 80 L de soluo de H2O230% (59,0 10-3mol L-1) para promover a
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MATERIAL E MTODO
formao do radical 1-hidroxietila e posterior gerao do aduto radical. A reao foi
monitorada at os 5 primeiros minutos aps a adio do perxido de hidrognio,
verificando as espcies formadas. Vale ressaltar que a concentrao analtica do
perxido de hidrognio foi determinada atravs do espectro eletrnico de absoro
(= 240 nm; 240= 39,4 L mol-1cm-1)38.
A reao foi ento monitorada atravs de duas tcnicas: Espectroscopia de
Ressonncia Paramagntica de Eltrons (RPE) e Cromatografia Lquida hifenada ao
Espectrmetro de Massas (LC-ESI-MSn).
Parmetros instrumentais:
- Espectrmetro de Ressonncia Paramagntica de Eltrons (RPE):
Espectrmetro Bruker modelo EMX operando na banda-X.
Campo magntico central: 3.378 G; freqncia: 9,53 GHz; atenuao: 23 dB;
potncia: 1 mW; modulao da freqncia: 100 KHz; modulao da amplitude: 1 G.
- LC-ESI-MSn: Sistema de HPLC Shimadzu Prominience LC20AD hifenado ao
espectrmetro de massas de mltiplo estgio de tipo ion-trap Bruker Esquire 4000.
Coluna Agilente C-18 extended (5 m; 2,1 x 150 mm); fluxo 0,3 mL min.-1;
fase mvel solvente A H2O/cido Frmico (99,9:0,1 v/v), solvente B
Acetonitrila/cido Frmico (99,9:0,1 v/v); gradiente 0 - 15 min.: 0 25% B, 15 20
min.: 25 100% B, 20 23 min.: 100% B isocrtico, 23 25 min.: 100 0% B.Espectrmetro de Massas (ESI-MSn): utilizou-se um divisor de fluxo na
interface HPLC/MS, cujo fluxo que chegou at o espectrmetro de massas foi
100 L min.-1. As condies de nebulizao foram presso 30 psi, fluxo de gs (N2)
9 L min.-1, temperatura 250 oC, voltagem do capilar de 3.000 V, operando no modo
de deteco de ons positivo.
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MATERIAL E MTODO
Avaliou-se tambm a influncia da adio de catalase na estabilidade do
aduto radical, a qual decompe o excesso de perxido adicionado que
supostamente pode interferir na quantificao do aduto [4-POBN/CH(CH3)OH]
.
Assim, foi realizado um estudo sobre a estabilidade do aduto radical na presena e
ausncia de catalase. Desta forma, para o estudo na presena de catalase,
adicionou-se 100 L da enzima (47,4 mg mL-1)38 mistura reacional aps decorrido
o tempo de amostragem da reao, seguindo para a anlise por ESI-(+)-MSn,
segundo os parmetros instrumentais abaixo:
Espectrmetro de Massas (ESI-(+)-MSn): utilizou-se um divisor de fluxo na
interface HPLC/MS, cujo fluxo que chegou at o espectrmetro de massas foi
100 L min.-1. As condies de nebulizao foram presso 30 psi, fluxo de gs (N2)
9 L min.-1, temperatura de desolvatao 250 oC, voltagem do capilar de 3000 V.
Modo de deteco de ons positivo.
3.7.2. Determinao das constantes de velocidade aparentes
decorrentes das reaes dos compostos de interesse frente ao radical 1-hidroxietila.
Para estimar as constantes de velocidade de segunda ordem de capitao do
radical 1-hidroxietila pelos iso--cidos e seus derivados, foi utilizada a abordagem
de cintica de competio39,40. Neste contexto, o 4-POBN compete com os
compostos de interesse pela captao do radical 1-hidroxietila formado, conforme
ilustrado no Esquema 6.
Constante de velocidade aparente refere-se constante de velocidade determinada indiretamenteatravs da utilizao de uma sonda qumica.
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MATERIAL E MTODO
Esquema 6. Ilustrao da reao de competio entre a armadilha qumica 4-POBN e aisohumulonas pelo radical 1-hidroxietila.
Desta forma, os compostos foram primeiramente dissolvidos em etanol. No
caso dos cidos amargos derivados do lpulo, as concentraes destes foram
determinadas atravs da leitura da soluo pelo espectrofotmetro UV-vis, de
acordo com os respectivos coeficientes de absortividade (279 nm = 11.150
L mol-1 cm-1, iso--cidos; 279 nm = 11.150 L mol-1 cm-1, dihidro-isohumulonas;
254 nm= 17.690 L mol-1cm-1, tetrahidro-isohumulonas)9.
Seguindo uma cintica de competio, volumes diferentes da soluo de iso-
-cidos foram adicionados em 60 L de uma soluo aquosa de FeCl2.4H2O
(2,0 10-3mol L-1) levemente acidificada (pH ~ 4) e 1 mL de uma soluo de 4-POBN
(3,2 10-3 mol L-1) a 6% de etanol (1 mol L-1). Desgaseificou-se a mistura por 5
minutos para ento acrescentar 80 L da soluo de H2O230% (59,0 10-3mol L-1). A
reao foi monitorada pelo aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] aps decorrido 1
minuto da adio do perxido de hidrognio, acrescentando 100 L de catalase
(47,4 mg mL-1) ao final.
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MATERIAL E MTODO
interessante ressaltar que a sonda utilizada foi o aduto radical
[4-POBN/CH(CH3)OH], sendo este monitorado pelas tcnicas RPE e
ESI-(+)-MS/MS.
Parmetros instrumentais:
Espectrmetro de Ressonncia Paramagntica de Eltrons (RPE):
Espectrmetro Bruker modelo EMX operando na banda-X.
Campo magntico central: 3.378 G; frequncia: 9,53 GHz; atenuao: 23 dB;
potncia: 1 mW; modulao da frequncia: 100 KHz; modulao da amplitude: 1 G.
Espectrmetro de Massas (ESI-(+)-MS/MS): utilizou-se um divisor de fluxo na
interface HPLC/MS, cujo fluxo que chegou at o espectrmetro de massas foi
100 L min.-1. As condies de nebulizao foram presso 30 psi, fluxo de gs (N2)
9 L min.-1, temperatura de desolvatao 250 oC, voltagem do capilar de 3000 V.
Modo de deteco de ons positivo.
3.8. Clculo quntico, ab initio DFT, na determinao das propriedades
eletrnicas das isohumulonas.
Para a determinao das configuraes espaciais mais estveis das
molculas dos diastereoismeros cis- e trans-isohumulonas foi utilizado o clculo de
dinmica molecular por DFT (Teoria de Densidade do Funcional), com o mtodo
B3LYP, base 6-311+G(d,p), otimizando em um contnuo dieltrico simulado em
etanol com o formalismo da equao integral como modelo contnuo polarizado
(IEF-PCM). Por outro lado, as entalpias de dissociao dos hidrognios (BDE),
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MATERIAL E MTODO
momento dipolo eltrico e energia dos orbitais de fronteira HOMO foram obtidas
atravs de clculo usando o mtodo DFTutilizando a base M06/6-31+G(d).
3.9. Caracterizao qumica dos produtos da reao entre o radical
1-hidroxietila e os iso--cidos.
Os produtos da reao entre os iso--cidos e o radical 1-hidroxietila foram
caracterizados por LC-ESI-MSn.
- LC-ESI-MSn: Sistema de HPLC Shimadzu Prominience LC20AD hifenado ao
espectrmetro de massas de mltiplo estgio do tipo on-trap Bruker modelo
Esquire 4000.
Coluna: Agilent C-18 extended (5 m, 2,1 x 150 mm); fluxo 0,3 mL min -1; fase
mvel solvente A H2O/cido frmico (99,9:0,1 v/v), solvente B Acetonitrila/cido
frmico (99,9:0,1 v/v); gradiente 0 5 min: 0 30% B, 5 20 min.: 30 50% B, 20 -
35 min.: 50 65% B, 35 55 min.: 65 100% B, 55 60 min.: 100 0% B.
Espectrmetro de Massas (ESI-MSn): utilizou-se um divisor de fluxo na
interface HPLC/MS, cujo fluxo que chegou at o espectrmetro de massas foi
100 L min
-1
. Condies de nebulizao: presso 30 psi, fluxo do gs (N2) 9 L min
-1
;temperatura de desolvatao 365 oC, voltagem do capilar 3500 V; modo de deteco
de ons negativo.
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RESULTADOS E DISCUSSO
4. RESULTADOS E DISCUSSO
4.1. Isolamento das isohumulonas.
Primeiramente, foi testada uma metodologia clssica consolidada por Verzele
e De Keukeleire9para promover o isolamento dos diastereoismeros cis- e trans-.
De acordo com este procedimento, formam-se sais de diciclohexilamina das trans-
isohumulonas ao final. No entanto, este mtodo eficaz somente na situao em
que se tem ao menos 30% das espcies trans- em soluo comparado com a forma
cis-. Como no se obteve os sais de diciclohexilamina dos diastereoismeros trans-,
sups ser devido presena de contaminantes oriundo da oxidao do extrato, o
que em princpio pode inibir a precipitao dos sais de deciclohexilamina. Deve-se
dizer que no se obteve sucesso mesmo aps exaustivas tentativas.
As trans- e cis-isohumulonas foram isoladas e purificadas eficientemente com
o emprego da -ciclodextrina para promover a complexao estreo-seletiva dos
diastereoisomeros trans-32. A Figura 7 ilustra esquematicamente o processo de
separao dos iso--cidos por complexao seletiva com -ciclodextrina, o qual se
d pelas interaes hidrofbicas entre a cavidade interior da -ciclodextrina(hidrofbica) com as cadeias laterais isohexenoila e prenila dos ismeros trans-,
conectadas aos carbonos C4 e C5, respectivamente.
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Figura 7. Ilustrao esque-ciclodextrina.
4.2. Preparo dos
4.2.1. Prepar
Os derivados
com a metodologia des
monitorada atravs de c
dos compostos na placa
reao foi completada c
representado pela letra
passo que o fator de
representado pela letra
de reduo foi de 87%.
RESULTADOS E DISCUSSO
tica da separao dos diastereoismeros p
erivados reduzidos/hidrogenados das is
das dihidro-isohumulonas.
reduzidos dos iso--cidos foram pr
crita anteriormente no item 3.4. A evo
omatografia planar (TLC). Desta forma,
de slica gel, apresentada na Figura 8,
om 23 horas de amostragem. Neste ca
P apresentaram um fator de reteno
reteno (Rf) verificado para os pro
R foi igual a 0,32. O rendimento final
or complexao com a
ohumulonas.
parados de acordo
luo da reao foi
atravs da evoluo
constatou-se que a
o, os precursores
(Rf) igual a 0,35, ao
dutos da reao
btido para a reao
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RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 8. Evoluo dos precursores isohumulonas - e produtos da reao dihidro-isohumulonas -no sistema de cromatografia planar utilizando slica gel como fase estacionria e hexano/ter etlico(1:4 v/v) acidificado com cido actico como fase mvel. (R) reao; (M) mistura; (P) precursores.
4.2.2. Preparo das tetrahidro-isohumulonas.
Os derivados hidrogenados dos iso--cidos foram preparados de acordo
com a metodologia proposta por Verzele e De Keukeleire9. A reao foi
acompanhada utilizando-se uma placa de slica gel (TLC), em um sistema de
cromatografia planar, conforme consta na Figura 9. Desta forma, de acordo com os
fatores de reteno (Rf) dos precursores e produtos da reao, 0,11 e 0,20
respectivamente, aps 6 horas de amostragem todos precursores foram
consumidos, sendo ento a reao finalizada. O rendimento verificado para a reao
de hidrogenlise foi de 89%.
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RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 9. Evoluo dos precursores isohumulonas - e produtos da reao tetrahidro-isohumulonas - no sistema de cromatografia planar utilizando slica gel como fase estacionria ehexano/ter etlico (1:1 v/v) acidificado com cido actico como fase mvel.(R) reao; (M) mistura;(P) precursores.
4.3. Caracterizao qumica das isohumulonas isoladas e seus derivados
reduzidos/hidrogenados.
4.3.1. Caracterizao qumica das trans-isohumulonas isoladas.
Primeiramente, os diastereoismeros trans- foram caracterizados por
espectrofotometria UV-vis pela leitura direta das trans-isohumulonas isoladas em
soluo contendo 10 mL de etanol e 1 mL de soluo aquosa de HCl (2,0 mol L-1).
Desta forma, atravs da leitura do espectro eletrnico de absoro, Figura 10, nota-
se a presena de duas bandas centradas em 227 e 279 nm, cujos coeficientes de
absortividade molar so 10.200 e 11.150 L mol-1 cm-1, respectivamente. Estes
valores esto de acordo com os reportados na literatura9 para a espcie trans-
isohumulona.
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RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 10. Espectro eletrnico de absoro das trans-isohumulonas isoladas em soluo contendo10 mL de etanol e 1 mL de soluo aquosa de HCl (2,0 mol L-1). Concentrao de trans-isohumulonasde 3,2 10-5mol L-1.
A segunda tcnica utilizada na caracterizao qumica das trans-
isohumulonas isoladas foi a LC-ESI-MSn. Comparando-se o perfil cromatogrfico dos
diastereoismeros trans- isolados (em azul) com o cromatograma da soluo
comercial de iso--cidos contendo as formas cis- e trans- (em vermelho), Figura
11, constata-se que h uma sobreposio do segundo pico do cromatograma
inerente a soluo das isohumulonas com o primeiro pico do cromatograma das
trans-isohumulonas, cujo tempo de reteno (tr) 11,4 minutos. Estes picos so
referentes aos diastereoismeros trans-, sendo o pico em 10,5 minutos (tr) do
cromatograma da soluo de isohumulonas referente forma cis-. Esta informao
deve-se ao fato de que os compostos trans- esto presentes em menor proporoque as formas cis-, pois a formao deste ltimo termodinamicamente favorecida9.
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RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 11. (a) Cromatograma de ons total da amostra comercial contendo as isohumulonas, formascis- e trans- (em vermelho) e das trans-isohumulonas isoladas (em azul). (b) Espectro de massas(ESI(-)MS) da espcie trans-coisohumulona referente ao pico 2, tr= 11,4 min. (c) Espectro de massas(ESI(-)MS) da espcie trans-iso-n-humulona referente ao pico 4, tr= 16,5 min.
A Figura 11bapresenta o espectro de massas do pico 2 do cromatograma
das trans-isohumulonas isoladas, no qual se observa o on [M-H]-347 m/z referente
molcula desprotonada. Este on referente espcie trans-isocohumulona, a
qual apresenta uma massa molecular igual a 348 g mol-1.
Por outro lado, o pico 4, tr = 16,5 minutos, refere-se a trans-iso-n-humulona,
cuja massa molecular 362 g mol-1, resultando no on referente molcula
0 5 10 15 20 25 Time [min]
0
2
4
6
5x10
Intens.
0 5 10 15 20 25 Time [min]
0
2
4
6
5x10
Intens.
251.1278.1 329.2
347.2
369.2
-MS, 11.3-11.5min #(1117-1137), Background Subtracted
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
4x10Intens.
100 150 200 250 300 350 m/z
265.2283.3 343.2
361.3
383.2
-MS, 16.1-16.7min #(1595-1653)
0
1
2
3
4
4x10
Intens.
100 150 200 250 300 350 m/z
soluo comercial de iso--cidos
trans-isohumulonas isoladas
1
2
3
4
5
[M-H]-
[M-H-H2O]-
[M-H-prenila]-
[M-H-isohexenoila]-
[M-H]-
[M-H-H2O]-
[M-H-isohexenoila]-
(a)
(b)
(c)
-
-
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RESULTADOS E DISCUSSO
desprotonada [M-H]-= 361 m/z , Figura 11c. interessante ressaltar que a trans-
isoadhumulona, por estar presente inicialmente no extrato de lpulo isomerizado em
pequena quantidade, sua complexao no foi efetiva; consequentemente, no foi
detectada a trans-isoadhumulona na soluo final das trans-isohumulonas isoladas.
Ainda, pela da anlise cromatogrfica do extrato de lpulo pr-isomerizado
(cromatograma em vermelho apresentada na Figura 11a), concedido gentilmente
pela Hopsteiner, constatou-se um excesso de 70% dos ismeros cis- em relao aos
trans-iso--cidos, sendo os percentuais dos compostos apresentados na Tabela 1.
Como um todo, a pureza verificada para a soluo aquosa comercial contendo as
formas cis- e trans-iso--cidos foi de 90%.
Tabela 1. Percentuais de isohumulonas no extrato de lpulo pr-isomerizado.
cis-
isocohumulona
trans-
isocohumulona
iso-n-humulona
(cis- e trans-)
isoadhumulona
(cis- e trans-)25,9% 3,6% 66,0% 4,5%
As trans-isohumulonas isoladas foram caracterizadas ainda por 1H RMN, cujo
espectro obtido encontra-se na Figura 12. A partir deste, foram identificados alguns
sinais caractersticos dos diastereoismeros trans-9,13, cujos deslocamentos
qumicos () so: 2,14 ppm (1H, m); 2,40 ppm (2H, m); 2,70 ppm (2H, d, J = 7 Hz);
3,27 ppm (2H, d, J = 7 Hz); 5,00 ppm (1H, t, J = 7 Hz); 5,18 ppm (1H, t, J = 7 Hz).
Ainda, interessante ressaltar que o sinal em 2,70 ppm caracterstico das trans-
isohumulonas, sendo este parmetro utilizado para a distino destes compostos
dos seus ismeros cis- pela leitura dos espectros de ressonncia magntica nuclear.
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RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 12. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das trans-isohumulonas isoladas, em CDCl3. Os sinaismarcados com (*) indicam impurezas presentes na amostra.
Portanto, constata-se que as formas trans- foram isoladas com sucesso a
partir da complexao seletiva utilizando a -ciclodextrina, resultando em uma
pureza estimada de 95%.
Utilizando um sistema HPLC semi-preparativo, buscou-se isolar os anlogos
trans-isocohumulona e trans-iso-n-humulona. Para tal, testou-se vrias condies
cromatogrficas, variando-se desde a composio da fase mvel at o tipo de
coluna utilizada. Referente fase mvel, testou-se diversos solventes de eluio,
acidificados ou no, bem como a aplicao de gradiente de eluio ou no modo
isocrtico, variando, neste ltimo, a proporo entre os solventes empregados.
Dentre as colunas testadas, Waters X-Bridge C18 5 m (10 mm x 250 mm) e LUNA
C-18 10 m (20 cm x 0,7 cm), a coluna LUNA foi aquela que apresentou maior
eficincia na separao dos anlogos. Desta forma, as melhores condies obtidas
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RESULTADOS E DISCUSSO
na separao esto descritas no item 3.2, na qual foi empregado um sistema
isocrtico com a relao de fase mvel de 56% do solvente B sobre o solvente A.
O cromatograma resultante est apresentado na Figura 13, no qual se pode
notar a presena de dois picos majoritrios P.1 e P.2. De fato, o primeiro pico
apresenta o tempo de reteno de 15,0 minutos e refere-se trans-isocohumulona,
ao passo que o pico 2, tr = 18,6 minutos, referente eluio da trans-iso-n-
humulona.
Figura 13. Cromatograma caracterstico das trans-isohumulonas em meio alcolico (5,0 10-3mol L-1)submetido a separao em uma coluna LUNA C-18 e eluio isocrtica 56% do solvente B. Vazo dafase mvel 2,5 mL min.-1 Volume de injeo 500 L. Comprimento de onda de monitoramento= 270 nm.
Assim, os compostos foram coletados em duas fraes respectivas aos picos
P.1 e P.2. No espectro de massas da frao 1, Figura 14, verificou-se a presena
dos ons das molculas desprotonadas [M-H]- 347 e 361 m/z, os quais so
referentes a trans-isocohumulona, [Ma-H]-, e resqucios da trans-iso-n-humulona,
[Mb-H]-, respectivamente. Ainda, os ons 379 e 393 remetem a produtos (impurezas
na amostra) decorrentes da oxidao dos iso--cidos. Como um todo, o percentual
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RESULTADOS E DISCUSSO
verificado para a trans-isocohumulona foi de 55% com relao aos demais
compostos presentes, no obtendo uma boa separao cromatogrfica.
Figura 14. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo direta da frao 1 contendo trans-isohumulona.
Por outro lado, pelo espectro de massas da frao 2, apresentado na Figura
15, obteve-se um percentual de 85% referente a trans-isocohumulona. Aqui, nota-se
a presena dos mesmos ons contidos no espectro de massas da frao 1;
entretanto, a intensidade relativa ao on da molcula desprotonada [M-H]-361 m/z,
respectivo a trans-isocohumulona, bem maior que os demais ons.
Figura 15. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo direta da frao 2 contendo trans-isohumulonas.
251.0
347.1
361.1
379.1
393.1
-MS, 0.2-2.5min #(27-297)
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.505x10
Intens.
100 150 200 250 300 350 m/z
265.0347.1
361.1
379.1
393.1
-MS, 0.2-1.6min #(20-187)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.05x10
Intens.
100 150 200 250 300 350 m/z
[Ma-H]-
[Mb-H]-
[Mb-H+O2]-
[Ma-H+O2]-
[Ma-H-isohexenoila]-
-
[Ma-H]-
[Mb-H]-
[Mb-H+O2]-
[Ma-H+O2]-
[Ma-H-isohexenoila]-
-
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RESULTADOS E DISCUSSO
4.3.2. Caracterizao qumica das cis-isohumulonas isoladas.
O espectro eletrnico de absoro da soluo contendo as cis-isohumulonas
isoladas, apresentado na Figura 16, foi similar ao espectro apresentado pelas trans-
isohumulonas, Figura 10. De fato, as bandas centradas em 227 e 279 nm aqui
apresentadas so condizente com os dados reportados na literatura9, sendo os
coeficientes de absortividade molar (227 nm = 10.200 e 279 nm = 11.150 L mol-1cm-1)
iguais para ambos os diastereoismeros cis- e trans-iso--cidos.
Figura 16. Espectro eletrnico de absoro das cis-isohumulonas isoladas em soluo contendo 10mL de etanol e 1 mL de soluo aquosa de HCl (2,0 mol L-1). Concentrao de 4,6 10-5mol L-1.
Caracterizou-se as cis-isohumulonas isoladas por LC-ESI-MSn, obtendo ento
o perfil cromatogrfico apresentado na Figura 17. Neste, possvel observar a
sobreposio do primeiro pico do cromatograma de ons total inerente soluo
comercial de iso--cidos (em vermelho) com o pico 1 do cromatograma de ons
total dos diastereoismeros cis- isolados (em azul). Conforme j mencionado no
texto, estes picos, cujo tempo de reteno 10,5 minutos, so referentes s formas
cis-, sendo que as formas trans- eluem em 11,4 minutos, representado pelo pico 2.
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RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 17. (a) Cromatograma de ons total da amostra comercial contendo as isohumulonas, formascis- e trans-, (em vermelho) e das cis-isohumulonas isoladas (em azul). (b) Espectro de massas(ESI(-)MS) da espcie cis-isocohumulona referente ao pico 1, tr= 10,5 min. (c) Espectro de massas(ESI(-)MS) das espcies cis-isoadhumulona e cis-iso-n-humulona referente ao pico 3, tr= 14,7 min.Os sinais marcados com (*) indicam impurezas presentes na amostra.
Pelo espectro de massas do pico 1 contido cromatograma das cis-
isohumulonas isoladas, nota-se o on [M-H]- 347 m/z respectivo molcula
desprotonada referente forma cis-isocohumulona, Figura 17b. Por outro lado, o
espectro de massas do pico 3, Figura 17c, cujo tempo de reteno 14,7 minutos,
0 5 10 15 20 25 30 Time [min]
0
2
4
6
8
5x10
Intens.
0 5 10 15 20 25 30 Time [min]
0
2
4
6
8
5x10
Intens.
182.0 233.1
251.0
278.1
329.1
347.1
-MS, 10.2-10.3min # (1018-1026), Background Subtracted
0
2
4
6
4x10Intens.
100 150 200 250 300 350 m/z
196.0
265.1 343.1
361.1
-MS, 14.6-14.8min # (1456-1475), Background Subtracted
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
5x10
Intens.
100 150 200 250 300 350 m/z
1
2
3
4
soluo comercial de iso--cidos
cis-isohumulonas isoladas
(a)
(b)
(c)
-
-
[M-H-prenila-isohexenoila] -
[M-H-isohexenoila-H2O]
-
[M-H-isohexenoila]-
[M-H-prenila]-[M-H-H2O]
-
[M-H]-
[M-H-prenila-isohexenoila]-
[M-H-isohexenoila]- [M-H-H2O]-
[M-H]-
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RESULTADOS E DISCUSSO
aponta o on 361 m/z como sendo o on das molculas desprotonadas. Este
referente s formas cis-isoadhumulona e cis-iso-n-humulona.
Por fim, as cis-isohumulonas isoladas foram caracterizadas por1
H RMN,
sendo possvel identificar alguns sinais caractersticos destes compostos9,13,
conforme consta na Figura 18. Pela leitura do espectro, pode-se identificar alguns
sinais caractersticos das espcies cis-, cujos deslocamentos qumicos () so:
2,43 ppm (2H, m); 3,30 ppm (2H, d, J = 6,5 Hz); 5,01 ppm (1H, t, J = 6,5 Hz);
5,19 ppm (1H, t, J = 6,5 Hz). Ainda, podem ser notados alguns sinais referentes a
impurezas presentes na amostra, os quais esto marcados no espectro e so
referentes a possveis produtos de oxidao advindos do extrato de lpulo.
Figura 18. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das cis-isohumulonas isoladas, em CDCl3. Os sinaismarcados com (*) indicam impurezas presentes na amostra.
Logo, constata-se que as cis-isohumulonas foram isoladas de forma eficaz ao
empregar a complexao seletiva com a -ciclodextrina, obtendo uma pureza
estimada de 90%.
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RESULTADOS E DISCUSSO
Empregando a mesma metodologia utilizada ao buscar isolar cada anlogo
das trans-isohumulonas isoladas, os anlogos dos diastereoismeros cis- foram
tentativamente isolados atravs do sistema HPLC semi-preparativo. Pela leitura do
cromatograma contido na Figura 19, verifica-se que os picos P.2 e P.3 referem-se
eluio dos homlogos cis-iso-n-humulona e cis-isoadhumulona da coluna, em 16,9
e 18,6 minutos (tr), respectivamente. O pico P.1 remete a cis-isocohumulona, cujo
tempo de reteno 13,9 minutos.
Figura 19. Cromatograma caracterstico das cis-isohumulonas em meio alcolico (1,0 10-3mol L-1)submetido a separao em uma coluna LUNA C-18 e eluio isocrtica 56% do solvente B. Vazo dafase mvel 2,5 mL min.-1Volume de injeo 500 L. Comprimento de onda de monitoramento = 270nm.
O espectro de massas do pico P.1, Figura 20, apresenta os ons majoritrios
das molculas desprotonadas [M-H]-361 m/z, [Mb-H]-, e 347 m/z, [Ma-H]
-, os quais
so referentes cis-iso-n-humulona e cis-isocohumulona, respectivamente. Logo, o
percentual verificado da cis-isocohumulona foi estimado em 60% com relao aos
demais compostos presentes; portanto, no se obteve uma separao
cromatogrfica eficiente.
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RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 20. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo direta da frao 1 contendo cis-isohumulonas.
No espectro de massas dos picos P.2 e P.3, Figura 21, o on 361 m/z
consiste no on das molculas desprotonadas, o qual referente aos homlogos cis-
isoadhumulona e cis-iso-n-humulona. De fato, a amostra apresentou uma pureza
estimada em 95%, verificando uma boa separao cromatogrfica.
Figura 21. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo direta da frao 2 contendo cis-isohumulonas.
4.3.3. Caracterizao qumica das dihidro-isohumulonas.
Conforme j exposto, a reduo da funo carbonila do isohexenoila dos iso--cidos conduz a formao dos dihidro-iso--cidos. Logo, verifica-se que estes
251.1265.1
329.1
347.1
361.1
-MS, 3.9-6.8min #(462-815)
0
1
2
3
5x10
Intens.
100 150 200 250 300 350 m/z
265.1 343.1
361.1
-MS, 4.3-7.2min #(518-870)
0
2
4
6
8
5x10
Intens.
100 150 200 250 300 350 m/z
[Ma-H]-
[Mb-H]-
[Ma-H-H2O]-
[Ma-H-isohexenoila]-
[Mb-H-isohexenoila]-
-
[M-H]-
[M-H-H2O]-
[M-H-isohexenoila]-
-
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RESULTADOS E DISCUSSO
compostos reduzidos apresentam um centro quiral a mais na molcula, o qual se
situa no carbono contendo o grupo hidroxila formado.
Pela leitura do espectro eletrnico de absoro dos dihidro-iso--cidos,
contido na Figura 22, nota-se uma similaridade com os espectros apresentado pelos
precursores, iso--cidos. Este resultado est de acordo com relatos na literatura9,
sendo ento os coeficientes de absortividade molar 10.200 e 11.150 L mol -1 cm-1
respectivos s bandas centradas em 227 e 279 nm.
Figura 22. Espectro eletrnico de absoro das dihidro-isohumulonas, formas cis- e trans-, emsoluo contendo 10 mL de etanol e 1 mL de soluo aquosa de HCl (2,0 mol L-1). Concentrao de2,3 10-5mol L-1.
O perfil cromatogrfico resultante da caracterizao dos derivados reduzidos
dos iso--cidos por LC-ESI-MSn est apresentado na Figura 23. Nota-se a
presena de 6 picos majoritrios, cujos tempos de reteno so: 6,3 minutos, pico 1;
7,6 minutos, pico 2; 8,2 minutos, pico 3; 10 minutos, pico 4; 11,7 minutos, pico 5;
15,1 minutos, pico 6.
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RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 23. (a) Cromatograma de ons total das dihidro-isohumulonas. (b) Espectro de massas(ESI(-)MS) da espcie trans- e cis-dihidro-isocohumulona referente aos picos 1 e 2, tr= 6,3 e 7,6 min.
(c) Espectro d