Top Banner
Studies on Epidermis Reconstructed with and without Melanocytes: Melanocytes Prevent Sunburn Cell Formation but not Appearance of DNA Damaged Cells in Fair-Skinned Caucasians Muriel Cario-Andre Â, Catherine Pain, Yvon Gall,* Jose  Ginestar,* Osamu Nikaido,² and Alain Taõ Èeb Unite  de Dermatologie, Universite  Victor Se Âgalen Bordeaux II, Bordeaux, France; *Institut de Recherche Pierre Fabre, Immeuble Zodiaque 2, Toulouse, France; Pierre Fabre Dermo-cosme Âtique, Center de recherche, Alle Âe Camille Soula, Vigoulet-Auzil, Castanet-Tolosan, France; ²Division of Radiation Biology, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Kanawaza University, Kanawaza, Japan To assess the photoprotective role of melanocytes in the epidermis, we studied the effects of ultraviolet B on an epidermis reconstructed with and without melanocytes. To address more speci®cally the role of melanin in fair-skinned individuals, experiments were done with cells obtained from human skin of low phototypes (II±III). To study the effect of consti- tutive melanin and possibly that of newly synthesized melanin precursors, a single dose of ultraviolet B (0.10 or 0.15 J per cm 2 , corresponding to a 4±5 mini- mal erythema dose in vivo) was administered to reconstructs and the effects were monitored over the ®rst 24 h. When reconstructs with and without mela- nocytes were compared, no difference was found for DNA damage/repair assessed with antibodies to cyclobutane pyrimidine dimers and 6±4 photopro- ducts. More necrotic/apoptotic cells, however, were noted 24 h following ultraviolet B irradiation in reconstructs lacking melanocytes. Twenty-four hours following ultraviolet B irradiation the number of necrotic/apoptotic cells and the number of cyclobu- tane pyrimidine dimer positive cells was coarsely concentration-dependent. The number of cyclobu- tane pyrimidine dimer positive cells, however, was independent of the type of reconstruct used (with/ without melanocytes). In conclusion, low phototype melanocytes seem to protect epidermal basal cells against ultraviolet B-induced apoptosis/necrosis and may preserve the overall integrity of the epidermis after ultraviolet B irradiation. On the contrary, such melanocytes do not seem to have a protective role against DNA damage and may not prevent cancer. Key words: photoprotection/ultraviolet B. J Invest Dermatol 115:193±199, 2000 I n humans, melanin produced by epidermal melanocytes is generally considered as a natural photoprotective factor against ultraviolet (UV) irradiation. The incidence of skin cancers, especially melanoma, has increased since the 1950s in lightly pigmented individuals exposed to recreational sun exposure. Black or heavily pigmented (phototype V and VI individuals) are comparatively spared by the epidemic. This is probably the best argument to link melanogenesis with photo- protection. The photoprotective effect of eumelanin is concentra- tion-dependent (Yohn et al, 1992). Although eumelanin is most certainly photoprotective, however, phaeomelanin which is more abundant in low phototype individuals is considered as a poor photoprotector (Menon et al, 1983) and as a generator of free radicals following UV irradiation. Phaeomelanin could produce 100 times more free radicals than eumelanin (Duval and Poelman, 1995). In culture, melanocytes obtained from eumelanic skin become phaeomelanic (Hunt et al, 1995). After irradiation, pheomelanogenesis is inhibited and eumelanogenesis is stimulated (Harmand et al, 1996), but after a single dose exposure no melanogenesis is induced in low phototype melanocytes (Barker et al, 1995). Markers of DNA acute UVB photodamage, more speci®cally cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) and 6±4 photoproducts (6± 4PP), have already been studied in cultured mammalian cells in vitro, and in vivo in mammalian skin including normal human skin. Following solar-simulated radiation (Schothorst et al, 1991) and UVB (312 nm) irradiation (De Leeuw et al, 1995), the same amount of thymine dimers is found in human cultured melanocytes and keratinocytes. In mammalian skin (Mitchell et al, 1990), organ- cultured normal human skin (Muramatsu et al, 1992) following UVB irradiation, and in normal human skin following solar- simulated radiation (Young et al, 1996), CPD are produced in higher amounts than 6±4PP but 6±4PP are repaired more rapidly than CPD. Another effect of acute UVB damage on the epidermis is sunburn cell (SBC) formation. Such cells, which are considered as apoptotic keratinocytes (Danno and Horio, 1982; Schwarz et al, 1995), are located in the suprabasal, spinous and granular layers and Manuscript received December 22, 1999; revised February 2, 2000; accepted for publication April 4, 2000. Reprint requests to: Dr. Alain Taieb, Unite  de Dermatologie; Laboratoire de Pathologie Mole Âculaire et The Ârapie Ge Ânique; Universite  Victor Se Âgalen; 146, rue Le Âo Saignat; Batiment TP ouest, 4e Áme e Âtage; 33076 Bordeaux cedex; France. Email: Alain.Taieb@dermatol. u-bordeaux2.fr Abbreviations: CPD, cyclobutane pyrimidine dimers; MED, minimal erythema dose; ODC, ornithine decarboxylase; PCNA, polymerase cell nuclear antigen; REK, reconstructed epidermis with keratinocytes; REM, reconstructed epidermis with keratinocytes and melanocytes; SBC, sunburn cell; 6±4PP, 6±4 photoproducts. 0022-202X/00/$15.00 ´ Copyright # 2000 by The Society for Investigative Dermatology, Inc. 193
7

Studies on Epidermis Reconstructed with and without Melanocytes: Melanocytes Prevent Sunburn Cell Formation but not Appearance of DNA Damaged Cells in Fair-Skinned Caucasians

May 15, 2023

Download

Documents

Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Page 1: Studies on Epidermis Reconstructed with and without Melanocytes: Melanocytes Prevent Sunburn Cell Formation but not Appearance of DNA Damaged Cells in Fair-Skinned Caucasians

������� � ����� �� ������������ ���� �� ������������������ ���������� ������ ����� ���� ��� ������� �� ��������� �� ��� �� � �� ����� � ����!�"������������

������ ������ ���� ��������� ����� ��� ������ ���� ���������� ����� ����� �� �� ����� ������ ����� � !������"��� ���������� #�$�� %��"���� &� ���' ((� &� ���'� )���$�* �(������� � +�$���$�� ������ )����� (������� , ��-�� .�������� )���$�* ������ )���� !���$������-��� ������ � ��$���$��� ������ ������� %���� #�"������/��� �������������� )���$�* �!������ 0+� ����� &��"1� )�$���1 0 ������$����$�� %$���$��� 2���3�/� ��������1� 2���3�/�� ��4��

#� ������ ��� ��������������� ���� �� ��������� ���� ������ ��$ �� ������� ��� ������� �� ����������� %� � ������ �� ������������ ���� �� ������� ���������& #� ������� ��� �����'����� ��� ���� �� ���� � ����!�"��� ����������$ �(���� ������� ��� ���� ����� ������� ��� �� � �"� ����� ���������� )**+***,& #� ����� ��� ������ �� �����!������ ���� �� �������� ���� �� ���� �������-�� ���� ����������$ � �� �� ���� �� ����������� %).&/. �� .&/0 1 ��� � 2$ ���������� �� � 3+0 ��! �� ������ � ���� �� ����, ��� �� �������� ������������� �� ��� ������� ���� ������� ���� ���'��� 23 �& 4�� ����������� ���� �� ������� ���!������ ���� �� �����$ � ��������� ��� ���� ������ �� � �5������ �������� ���� ��������� ������������ ���� ���� �� ��� �� 6+3 ��������!�����& ���� �������5��������� �����$ �������$ ����

���� 23 � ������� ����������� % ���������� ������������ ���"� ���������& #����!���� ������������ ����������� % ���������� ��� � ��� ���������5��������� ����� �� ��� � ��� �� �������!��� ���� ���� �� �� �������� ����� ��� ������������������!�������& #�� � ��� �� �������!��� ���� ���� �� �� �������� �����$ �������$ ����������� �� ��� ���� �� ���������� ���� )����5������� ���������,& * ��������$ ��� ��������� ��������� ��� �� ������� ������ �� ����� ������ ���� ����������� %!������ ���������5������� �� �� �������� ��� ������� ��� ���� �� ��� ������ ������� ����������� % ����������& 7 ��� �������$ ���� ��������� �� �� ��� �� ���� � ���������� ����� ���� ��� �� � � �� �� �� ������ �����&��� ���� ���� ������������������� �� � ������������� ����������� !"""

(� ������� ������� 4� �$� �1 �4� ����� �����$1��� ��"�������1 $��� ��� �� � ������� 4��4���$���� 0�$���"����� ���������� 5 #6 ���� �����7 ��� ��$� ��$� 0 ����$��$���� ��4�$����1 �������� ��� ��$����� ���$� ��� 89:;��� ��"���1 4�"����� �� ��� ���� �'4�� � ��$�������� ���

�'4����7 &��$� � ������1 4�"����� 54���14� # �� #(�� ��� ����6 ��� $�4��������1 �4��� �1 ��� �4� ���$7 ���� ��4�����1 ��� ���� ��"����� � ���� �����"������ 3��� 4��4���$���7 ��� 4��4���$���� �00�$� 0 ��������� �� $�$�������� �4�� ��� 5��� �� ��� 899.67 �����"� ��������� �� ���$�������1 4��4���$����� �3����� 4���������� 3��$� �� ������� ��� �� �3 4���14� �� ��� ���� �� $��� ��� �� � 4�4��4���$�� 5���� �� ��� 89<=6 �� �� � "������� 0 0���

�� �$��� 0��3��" # ���� �����7 ����������� $�� 4� �$�8;; ����� ��� 0��� �� �$��� ���� ��������� 5!���� �� �������899:67 (� $������� �����$1��� ������ 0�� ��������$ ������$�� 4���������$ 5>��� �� ��� 899:67 �0��� ���� ������4�������"������ �� �������� �� �������"������ �� ��������� 5>����� �� ��� 899?6� ��� �0��� � ���"�� �� �'4���� ������"������ �� �� �$� �� �3 4���14� �����$1��� 5&������� ��� 899:67������� 0 !�� �$��� #& 4�� ���"�� ��� �4�$�@$���1

$1$������� 41���� ��� ����� 5��!6 �� ?AB 4��4� �$�� 5?AB��6� ���� ����� 1 ���� ��� �� �� $������ ��������� $���� ������� �� �� ��� �� ��������� ���� ��$�� ��" ����� ����� ����7)��3��" ������������ �� ����� 5%$������ �� ��� 89986 �� #& 5=8. ��6 ���� ����� 5!� C���3 �� ��� 899:6� ��� ���� �����0 ��1���� ����� �� 0�� �� ����� $������ �����$1��� �� �������$1���7 (� ��������� ���� 5���$���� �� ��� 899;6� �"��$������ ����� ����� ���� 5��������� �� ��� 899.6 0��3��" #& ���� ������ �� �� ����� ����� ���� 0��3��" ������������ �� ����� 5���" �� ��� 899?6� ��! ��� 4� �$� ����"��� ������ ���� ?AB�� ��� ?AB�� ��� ��4���� ��� ��4� �1���� ��!7������ �00�$� 0 �$��� #& ���"� � ��� �4� ����� ��

������� $��� 5%&�6 0������7 %�$� $����� 3��$� ��� $��� ��� ���44���$ �������$1��� 5!��� �� >��� 89<.* %$�3��/ �� ���899:6� ��� �$��� �� ��� ��4�������� �4���� �� "������� ��1��� ��

�����$��4� ��$���� !�$����� ..� 8999* ������ )������1 .� .;;;*�$$�4�� 0� 4����$���� �4��� B� .;;;7+�4���� ��-����� �D !�7 ����� ������ ����� � !������"��*

C�������� � �����"�� ����$������ �� ������4�� �����-��* ����������#�$�� %��"����* 8B?� ��� C�� %��"���* &������� �� ����� B�E�� ����"�*==;F? &� ���' $� �'* )���$�7 G����D �����7�����H ������7��� ���'.70�������������D ��!� $1$������� 41���� ��� �����* �G!� �������

��1����� ��* �!�� �������� �$���'1����* ����� 4�1������ $�����$���� ����"��* +G2� ��$�����$�� �4� ����� 3��� �������$1���* +G����$�����$�� �4� ����� 3��� �������$1��� �� �����$1���* %&��������� $���* ?AB��� ?AB 4��4� �$��7

;;...;.IJ;;JK8:7;; L �41��"�� � .;;; �1 ��� %$���1 0� (������"����� !������"1� (�$7

/89

Page 2: Studies on Epidermis Reconstructed with and without Melanocytes: Melanocytes Prevent Sunburn Cell Formation but not Appearance of DNA Damaged Cells in Fair-Skinned Caucasians

���$� ��'���� �������� �� ���� .B � �0��� ���� ����� 5���$������� ��� 89<8* !��� �� >��� 89<F* ���"� 89<F* &�1��� �� ���899:67 ��� ������ 0 %&� ��� 0��� ���� ��� �� � ������ 04�� ���"� 5���� �� 2�� ��1� 89<;* M�0 �� ��� 899:67 %�������� ���� ���������� � ���� ���3��� %&� 0������ �� !�� ���"� � ��4��� �$�����1 5���"� 89<F* &�1��� �� ��� 899:67 (�4����$����� ����� ��� ������� �44���$ 4���3�1� 3��$� $�� ��� �%&� 0������� �����1 4:= �4�� ��� 5%��$��/ �� G��� "��899:* C� �� ��� 899F6 � 4:=�� �4�� ��� 4���3�1� �� �$� �1$��4����� ���� ��$���� 0�$��� ����"� ��� 4:: ��$�4�� 5%$�3��/�� ��� 899F6� �� �1 �8����"���� 5���� �$�� �� ��� 899F67��� ��� 0 ���� ��� 1 3�� � �������� �4� ����� ��$�����$�� ��

4��4���$���� �� �� 4����$���� �'����� ��� 4��4���$������� 0 �����$1��� �� �3 4���14� $��$����� ����7 )� ����4��4��� 3� $�4��� ��� �00�$� 0 � ���"�� �� 0 #&���� ����� �� �4� ����� ��$�����$�� 3��� �� 3����� �����$1���7

���G+(�C% ��! �G�>�!%

���������� �� ������������ ������ �� %��� ���4��� 3��� ������ 0�� ����� ����� � ���� 0 4���14�� (( � ((( �� ��"��" 4�����$���"��1 � 0�� $��� ���N� 0������ ������ �� $��$��$����7 G4� �������$�����$��� 3��� �����$1��� 3�� $����� �� �� ��$���� 4�������15&���� �� ��� 899:6 �� ����"�� $� �����7 ����� ��� �� 4����"�� . � =3��� ��� � �� B� 8;: $���� 4�� $�. �� � 8D.; �����$1��J�������$1������7 ����� ��$�����$���� 3��� 4��0��� 3��� 4��� �������$1��$�������7 � ���� 0 8B �'4�������� ����" �00����� �� ���$�� 3��� ����$�� ��" @�� $�4����" ��$�����$�� �4� ����� 3��� �������$1��� �� �����$1��� 5+G�6 �� 3����� �����$1��� 5+G267

*��������� ��������� +�$�����$�� 3��� ����� �� 4��4������00��� ������ ��0�� ���� ������ �0��� < �� ��� ���A��-�� �����0�$�7 #&���� ������ =8. ��� 3�� ������� 3��� � &�����$ ���$� 5#�����C������ ����� C� #������� )���$�67 �0��� 4���������1 ������"� �3 ��"�� 3��� ��� �� � �����1 ;78; �� ;78: � 4�� $�.7 ������ $������ 0 ������ ���� ��$�����$�� �� 3��� �� �������� ���� ��$�����$��7��� �4�$���� ���������� 0 ��� #& ���4 3�� �� ������$�� � =8. ��7

��� ��O� 4��� 3�� �� =8. ��� ��� ����� 3�� ��3�1� � ���� 4��� ��=?: �� 5�� /67 �0��� ���� ������ 0���� �� ��� 3�� � � �� ��$�����$��3��� 4��$� �� �� ��$������ ���� @'� �� BP 0���� ��1 � �� �00��������� 4���� �$$� ��" � ��� �'4��������� ���"�7

�������� �� ������� +�$�����$�� 3��� ���� � �� 4���0@�� $�� ��:�� ��$���� �� ������ 3��� �����'1���A���� � ������ ��� "��������4��"1 0 ��� �4� ����� �� ��� ����� 0 %&�7 �����$1��� �� ������� 3��� �������/� ����" ��� )�����A����� ����� �� � ������4�1$���� ����� 1 �"����� ��� %8;; 4����� 5��$������ ��3$������4� �1��� 267��$���� ����� ��� ?B�. �� �!�. �"����� ?AB�� �� ��!�

���4�$�����1� 3��� ����� �� $����$����/� �� ��$���� �1 ��� �� ��5899867(��������$����$�� �������" 3�� 4��0��� �� ��$���� �1 Q�� �� ��

5899B6� �� 8D:;; 0� �!�. �� 8D8;; 0� ?B�. ��� �� 4��4������00��� ������7 (� � @��� ���4� 3� ��� ��� $��������� �&� ���� 0����4�� � ���� �������" 5!��� ���44��� )���$�6� �� �� � ��$� � ���

G�#���� R ��� 5!��� ���44��� )���$�6� 3��$� �����$�� �������" ����������17 ������ ���� � ���� ���� ���� ��$�����$�� 3��� ������ �������� ���� ��$�����$�� 3��� ����� ��� �"����� ��! � ?AB��7 �� ��"�����$����� 3� ��� ��1 ��� ��$� ��1 ����� 1 �� � �������" 3�������� 7 �� 3� ��� � � ��� ������ ���� ��$�����$�� �� ��4��"�$$������ 3� �$� � � ��� ���� �� �������� $����� 0� ���������$�������17 ����� ��� ������ 0 ��! � ?AB�� 4������ $���� �������� ���� ��$�����$�� 3�� ������$�� � ��� ������ 0 4������ $������ ���� ���� ��$�����$��7 !���� �������" 3�� 4��0��� 3��� �!�. �?B�. �� %8;; 4������ � �������� �0 �����$1��� 3��� 4�� ���"� 7 ����� 3�� � $���������� � 0�$������� $��� $����7� �������� ��� 4��$����"� 0 %&�� �!�. �� ?B�. 4������ $�����

:;; $���� 3��� $���� 4�� ��$���7 ��� ���0�$� 0 ��� ��$���� �������� 3�� $��$����� ����" �� ���"� ����1/�� 5&�$� .;;� C�� ���� )���$�67��� ������� 3��� �'4����� �� ��� 4��$����"� 0 4������ ����4����$ $����

������ � �� ���� $���� �1 �44�'������1 :;; $���� 0� ���������$�������1� �� ���$��1 ������ � ��� 4��$����"� 0 ������ $���� 0�%&�7 � ������ ���� � �������� ���� ��$�����$� 0 ��$� �14� ����� ��$���� 0� ��$� ������ 0 �'4��������7)� ���$��� ��$��$41 ����1���� 4��$� ��4���� 0 ��$�����$�� 3���

@'� �� � ?7.:P "������� ��1 �� ;78� $�$ 1���� ������� ���� ����� ��$�$ 1���� ;78� ��00��7 ���1 3��� ���� � �� �4� �� ;7?�� ��$����3��� �'����� �0��� ����� ����'� � 4��@'���� 3��� � �� 8; 5�����4�6���$��� ��$��$4�7

����������� ������� %�������$�� �00����$�� 3��� �������� ����" %�� ���N�� ����7 !��� ��� 4������� �� ��� ����� %G� 0 �3 � ����� ��$�����$��0� ��� ���� 4����7

�� ��� /& �������� ����������� �� �������� � ����� �� ��� :;%<�������� ���� � ���� � ���� �����&

�� ��� 2& ���������� ������� � ���� �%���� ����& $07 �� 3#7 �3���10�� ���� 0��3��" #& ���� ������ �����$1��� ����������1 �$���/� $��� � ��� ����� ��1�� �� ������� ������� $���� 5���6 ��� �$���/� �����1 ����� �4���� ��1��7 (��������$�������1 �$���/���� 0 �����$1��� �1 %8;; ����� ��� �� %&��1 �����'1���A���� �� +G� 0��3��" #&���� ����� 5;78: � 4�� $�.67 ����� ��D .:��7

/83 ��+(���!+G� �� �� �>G �� +��C �) (�#G%�(���(#G !G+����C���

Page 3: Studies on Epidermis Reconstructed with and without Melanocytes: Melanocytes Prevent Sunburn Cell Formation but not Appearance of DNA Damaged Cells in Fair-Skinned Caucasians

+G% C�%

���������� ������� ��� ������ �� ��� ���� � �����������!������� ��� +�$�����$�� 3��� �� 3����� �����$1��� �� � ������� ��$��$4�$ ��4�$� ��0������ �����7 �3��" � ��� 4���14�� ����$�� �� ��� @���'4�������� $�4����" +G� �� +G2� ��$��$4�$4�"�������� 3�� �� ���$�����7 ��� 4�����$� 0 �����$1��� ����� �4� ����� 3�� �������� �1 %8;; 4����� �������" 5�� 267 4� .P 0 �����$1��� 3��� ������ �� ��� ����� ��1�� 0 +G��3��� ��������� �� �4�� ��� 0 ��� $������ :P $�$�������� ����� ��" � ��4� ����/� �����7 � ������� 3�� ���$�����3��� ��� )�����A����� ��$���-�� ��0�� � �0��� ���� �������$���� 0 ��� �3 4���14� 0 ���7 �����$1���� �3�����3��� ������/� �� ��� ���� 0 ��$�����$���7 &1 ���$�����$��$41� 3� $�@��� ���� �����$1��� 3��� 4������ ��+G� �� ���� ��������� 3��� 3����1 ������/� � 3��� ���O���1 0 4������������7 ������������ $�� �� �00��������� 0�� ����������� �1 ����� ��� ���4� �� ����� ������� $������ 3��$� �� "��4� �� $������� �� ��3� ���� 95�67 ������� ��� ��������� 3��� 0�� 3������������$1��� �0��� ���� ������ ��""�����" � ��$������ 0 �����0��

0�� �����$1��� 5�� 9#67 (� +G2� � ��� ���� �� �����$1��4�� ��$��� $�� �� ��� �0��� %8;; �������"7�3���10�� ���� �0��� #& ���� ������ ����� $���"�� 3���

��� 3��� +G� �� +G2 3��� $�4��� 7 (� +G2� � $��������14��4����� 0 ������ ��4������� �� �4���� $��� ��1��� 3�� ��3�1������� �� ��� �3 #& ��"�� ��� 5�� 367 (� +G�� ��14��4�����$ �������$1��� 3��� ��� �� ;78; � 4�� $�.7 ����� 3��� ����� $�������� 3��� �� 4���14�7�����$1���� �$� 4���$��� �"����� $��� ���� 3�� $�$��

������ �4�� ��� 5�� 067 ��� ���� $���� �44�����$� 0 %&� 3��-���� ������� 0� ��� �3 �14�� 0 ��$�����$��7 ���� ? �� �� $����$����4� � � %&�7 �� .B �� �� 3�� �0@$���� ��4�$����1 0� +G2�� ������S��$�� ��" � �GC ����1� 4��0��� �� 4������� 5 ��� ����3�6S��� ������ 0 ��� �� $���� 5%&� � ��$���$ $����6 ���� ����� "������� ��1��7 %� 3� ��0���� ������ �� $���� ��TT����4����$ $����NN � TT����4����$ ��������NN7+�"�� ��" ����1 %&� 0������� ������� $���� 3��� 0�� ��

+G2 �� +G� ?� �0��� ���� ����� �� ����� �� ��4������� ��1���7�3���10�� ���� �0��� ���� ������ �3����� %&� 3��� �������� �� 0��� $������� �� +G2� 3������ �� +G� ���1 3����$��� �� ��� ��4������� �� �4���� ��1��� �� �����1 0�� ��$�������7 M��� #& ��"� 3�� ��$����� 0�� ;78; � ;78: � 4��$�.� ��� ������ 0 ����4����$ $���� 4�� �������� ��$����� ��� ��+G� �� +G2� ��� 3��� �00����$��7 �� ;78; � 4�� $�.� ���"������� ��1�� � �� $����� ����4����$ $���� �� +G�� 3�������� ;78: � 4�� $�. ����4����$ $���� $�� �������� �� ��� 7��������1 �� +G2� ����4����$ �������� 3�� ������ �� ���������� "�������� ��� �� ;78; �� ;78: � 4�� $�. 5�� 367

�������� ���� **+*** ��������� �� �� ������� ��������� �� � ���� ��� �� � � )� +G2 �� +G�� ��� ��� $�$�����" ?AB�� �� ��! 3��� �������� ��""�����" ���������$1��� �� 4���$� �������$1��� �"����� !�� ���"�5�� 667 #& ��"�� � �� ��"��@$����1 � �01 ��� 0������ 0?AB�� 5�� =67 )� ��! 0������� ����� 3�� � $�$�������� �4�� ��� �00�$� ���� 3�� �� �������� �1 ��� 4�����$� 0�����$1��� �� ��� ��$�����$�� 5�� >67 �� ��3� �� �� =� ��������� 0 ?AB�� 4������ $���� 4���� ���3��� 8 �� . � �0������� ������ �� ��4��� 3�� ����� $�4���� ? � �0��� ���� �����7��� ��4��� ������$� 0 ?AB�� 3�� ��4����$7 �� ��3� �� �� >���!4������ $���� 4���� ���3��� . �� : � �� �������� ���$� 4��� 3�� ���� �� ���� .B �7 ��� ������ 0 4������ $����3�� �������� ������� �� . �� .B �� ��� �� .B � ��� �������" 3��$�������1 ���� ����� ���� �� . � 5 ��� �� ��3�67 ��� ������ 0?AB�� 4������ $���� 3�� ������ �3�� ���� ��� ������ 0 ��!4������ $���� �� +G2 �� +G� �� 0� ��� �3 #& ��"��7

!(%� %%(��

���� ��� 1 ��""���� ���� $��$����� �����$1��� ���� � ������4���$���� ��� �"����� !�� ���"� ����" ��� @��� .B � 0��3��" #& ���� ����� �� ��"�� $����4� ��" � ���� BA: �G! �����7 ���1 ���� �3����� � ������1 4���$���� �� ����� 0 $��� ���� �� �$���� � 4������� �� ���$��1 ������ � ��� �������4�������� 0 �4� ����� !�� ���"� �� �� �'4��������7 (�+G2� � $������� �14��4����� 3�� ��� 0� ��� �3 ��"�� ����� ���� �'4��������7 )�� ���� � ����� �14��4����� 3�� ������ ��+G�� 4�����1 ��$���� �14��4�����$ ����� 3��� ������ 0$���1 ��� 0 �����$1��� � $������ ��0��$����� �����$1��� ����� ���� 0 ���� �����7 (� ��� ���� ��3� ���� #& ��"�� $���� �$� �� ��$����� �� �������� �$���'1���� 5�!�6 $����� ������� 5C3� �� ��� 89<;6 �� ���� �4� ������ ��� ��" ��4� ����� �14��4����� �� ����� �������� ��$� 5&���� �� ��� 899F67�!� �� ��� �����������" ��/1�� �� 4�1����� �1�������� �� ��$����� �$�����1 4��$� �� ������ 4���0������ �� ���1 �'4��������� �1����� 5���"�� 89<F67 (� ����� ���� ����� �� � -������������������ 0 #& ���� ����� ���3 3��$� �� �$��� 0 �4� ������!� 0���� � $$�� 5C3�� 89<;67 ��� ������� 0 �!��� �$��� ��"�� �� �3�� �� +G2 ���� �� +G�7 ��� ��� ��""�����3����� ���� #&�� �$� �4� ����� �14��4����� �� $�$�����

�� ��� 9& ������� �� ��� ����-�� �� ���������� �� "������!�����& ��������� 5����6 ������ �1 ���$��� ��$��$41 ���������$1��� 0 +G�D 5�6 ��0�� ���� ����� �� 5 6 .B � 0��3��" #&���� ����� 5;78: � 4�� $�.67 ����� ��D 8��7

#�C7 88:� ��7 . � � %� .;;; �� ��%(�� �GC������G% ��! % �& +� /80

Page 4: Studies on Epidermis Reconstructed with and without Melanocytes: Melanocytes Prevent Sunburn Cell Formation but not Appearance of DNA Damaged Cells in Fair-Skinned Caucasians

��� �4�� ��� �� +G�� 3��$� �� $�4������ 3��� ��� �'�����$� 0� ������� 7 (� �� �!� �� �$��� �� ����� �� ��4��������������$1��� �� ����� �4� ����� 5#����� �� ��� 89<F67 ���4�����$� 0 $���������� ������� �� +G� �� ���� �$���� $�� �'4���� � �00�������� �� �$��� 0 �!� ���3��� +G� �� +G27(� �"������� 3��� �� ���� �� ��� ��� ��� 0 ����� ���� 0��

4���14� ( �� (( �� ��� ���� ��������� ���� %&� �44��� =;����0��� �$��� #& ���� ����� 0 ���� B �G! �� ���$� � ��'����

.B � �0��� ���� ����� 5&�1��� �� ��� 899:67 (� +G�� %&� 3����$��� �� �4���� �� "������� ��1��� .B � �0��� ���� ����� �� ��3��� ��� 5���� �� ��� 89FB67 �� ;78; � 4�� $�. ��� ����4����$ $����

�� ��� 3& �������� �����������$ ����� ������� ���� �� ������ ���� ����� � ����!������� ������� ���������$ 23 � ������� :;% ����������& 5�6 � %&� 0������ �� ��14��4����� �� ������ ���� +G27 5 6 >����"�$��� ��$� 0 "������� $��� ����� %&� $������� 5�����6 �� �4� ����� $������� �14��4����� �� +G2.B � 0��3��" #& 5;78; � 4�� $�.67 ����� ��D:;��7

�� ��� 0& #�� ������� �� ��������� � ����������� ������������� �� ���� �����& ������ ��4������ ��� ���� $���� �44�����$� 0����4����$ $���� 5�44���$ �� ��$���$ $����6 �0��� #& ���� ����� 587;�� ;78: � 4�� $�.6 �� +G2 �� +G�7 ��� �������� �� �$���� ��"��@$���54U;7;: � ����6 �00����$�� ���3��� ���� ���� +G2 � +G� $�4��� ����� ������ ���� $�����7

�� ��� 6& #�� ������� �� ��������� ���� �� ��� � ��� � ����� ��� ����������� �� ���!�������� ����� � �����������& ��!4������ $���� . � 0��3��" #& 5;78; � 4�� $�.6 �� 5�6 +G� �� 5 6 +G27����� ��D .:��7

/86 ��+(���!+G� �� �� �>G �� +��C �) (�#G%�(���(#G !G+����C���

Page 5: Studies on Epidermis Reconstructed with and without Melanocytes: Melanocytes Prevent Sunburn Cell Formation but not Appearance of DNA Damaged Cells in Fair-Skinned Caucasians

3��� ��� �� +G2 ���� �� +G�� ��� �� ;78: � 4�� $�. ���"��@$��� �00����$� 3�� 0�� �� ����4����$ $��� �������7 %&�3��� ��� ����� �� +G2� 3������ �� +G� ���1 3��� �$��� ����� ��4������� �� �4���� ��1��� 4�����1 ��$���� ����� �������$1��� ��� 4���$�� �1 �����$1���� �� �����1 0�� �� $�������7 ������� �� ��� �44���� �� +G2� 3� ��44�� ���� ��� 4��������1���� �3 ���"�����" $���� ��� �44���$ �� ���� �44���$ $������$����� ��$� ���� ����" �������"����� ��� ��"���� ��������" ��$������ 0������7%&� �'����� ���� !����4��� �$�����1 ���� ����� �������$1����

��""�����" ���� !�� ���"� � ����4���� !�� ���"� �������� �� %&� 0������ 5!��� �� >��� 89<F* ���"�89<F67 ��� �00����$� ��� ���3��� +G� �� +G2 �� ���'4�������� $�� �� �'4����� �1 ��$� � �00����$� �� !�� ��4���$�4�$��17 M� � ��� �3����� ���$��1 ������� ��/1����$ !����4��� �$�����1 � � ���� ���� 4���7 �� ����������� �'4�������3�� �� � 4���$���� �00�$� 0 $���������� ������� �� +G�7

2��1���� �� �� 5899<6 ���� ��������� ���� � ��4����$����������� 4���$�� �"����� #&�� �$� !�� ���"� 5��! �� ?AB��67(� �� � �1 ���$��� ��$��$41 3� ������ � ��O���1 0

4����������� 3��$� 3��� ��14�$���1 ������/� �� �����0���� � �������$1���� ��� $�44��" 3�� �� ��� 7 (� �$$� ��$� 3����� @� ��"�� &����� �� �� 5899:6 0�� ���� �����"������ �� ���� �$� �0��� � ���"�� ���� ����� �� ��"���1 4�"����� �����$1���7M� 0������ �'����� 3������ %&� 0������ 3�� ����� � 4:=�'4������ �� �� � ��7 (� ����� ���� ����� �'4�� � #������ �� � $�4���� �����$� 0 4:= 5������ �� ��� 899:67 (� ��� ��� 4���������1 �'4�������� ��3� ���� 4:= 3�� 4������ �������� ���� ���� �� 3�� �$����� �0��� ���� ������ 3������ %&�3��� ��� 5 ��� �� ��3�6� ��""�����" ���� %&� 0������ ��"���� 4:=�� �4�� ���7(� �$��� 0 $��� ���� �� "������� ��1��� 3�� �������� 0�� ��

+G� �� ;78: � 4�� $�. �� ���� $�������1 �� +G2 �� ��� #

�� ��� =& #�� ������� �� ��������� � ����������� ���� �� ����� 6+3 �� ���������& 2�����$� 0 �44�����$� 0 ?AB �� 4������$���� �� +G2 �� +G� �0��� #& ���� �����7 5�6 ;78; � $�A.* 5 6 ;78: �$�A.7 ��� �������� �� �$���� ��"��@$��� 54 U ;7;:6 �00����$� 0�� $�������4��� 5������ ���� +G� � +G267

�� ��� >& #�� ������� �� ��������� � ����������� ���� �� ����� ��� ��� ����& 2�����$� 0 �44�����$� 0 ��!4������ $���� ��+G2 �� +G� �0��� #& ���� �����7 5�6 ;78: � $�A.* 5 6 ;78; � $�A.7 ����������� �� �$���� ��"��@$��� 54 U ;7;:6 �00����$� 0�� $���� ���4���5������ ���� +G� � +G267

#�C7 88:� ��7 . � � %� .;;; �� ��%(�� �GC������G% ��! % �& +� /8=

Page 6: Studies on Epidermis Reconstructed with and without Melanocytes: Melanocytes Prevent Sunburn Cell Formation but not Appearance of DNA Damaged Cells in Fair-Skinned Caucasians

��"��7 ���� 4������� ��1 ��� �� ����� � ��$����� !�� ���"� �� ��4���$�� �������$1��� �����" ��"���� ��� ��4� �1����"��� ��� �4� �����7 !��� �� >�� 589<.6 ���� ��""���� ���� # ���� ����� �$$�������� �4� ����� �������7 (� �� �3 $�������� %&� ��� �������$1��� ���� ��� �� 0���1 �00��������� 7 %&����� � ������� 0 ���� �4� ����� �00���������� �� ���� ��� �$� ���"���� �� ���4����� �'4������� 5&�1��� �� ���899:67 # �� ����� $�� �$$������� ��� 4�"��� 0 $��� ������������� �00���������� 0 �������$1��� ����" $��� ��� �� ��4�$����/� 0�� 0 �44���� �1 ����3��� �� >���� 5899B67���$��� 5899:6 ��� ��""���� ���� ����� ��� � �00����$�� ��

#�� �$� �� ��$����� ��������� ����� �� $������ �����$1����� �������$1���7 ���� $�� �'4���� 3�1 � �00����$� $�� �� ���$�� 0� ?AB�� �� ��! �� +G� �� +G27 )������������������� �� �� 5899.6 �������� � ������� 0� �� �$��� 0!�� 4�� ���"� �� �"��$������ ����� ����� �����1 :;��4�� $�. 0� ��! �� .;;�� $�. 0� ?AB��� 3��$�� �� ����� 0� ?AB��� 3�� �� ���$�� �� �� ��� 17 ��� �3�� ��"� ��� �� ���'4�������� 3�� ��� � � 4������� ��� ����$���� 0 ��� �4� �������$�����$��7(� �� �'4��������� ��� 4��� 0 ��! �� ?AB�� 3�� 0�� ��

���� . �7 ���� @� ��" ��1 �� �� � ��� ������ 0 ���4��� ��� 7(� �� � ��! �� ?AB�� 3��� �'����� � ������ �� ������� !��7 % �� �� 4������ ���� ��������1 �0��� ���� ����� ���4��4� �$�� 3��� ����� ����� �� ��� !�� �� �� �$$�������� ��� ����� ���7 ��$� ��� !�� ��"�� � ������� � �'4�� ���4��� ��/1��� �� ��� ����� ���� $����� ��� 4��4� �$����3����� ���1 ��1 ��$�� ��� �$$������� � ��� ����� ���7 ������1 �� ��� ����� 3�1 ��� 4��4� �$�� 3��� ���$����� �� . �$�4��� 3��� ��� @��� ������� 0��3��" ���� �����7

�� ���� �� �� ��� $�4������� ��� ��� 0 ����� �4� ������������$1��� ������ 0�� 4���14� (( ���� 5+���$� �� ��� 89<<6��� ��$� � ������� ���� $���� 0 ��! ������ �0��� #&���� �����7 ��� ������$� 0 ��4��� 3��� ��4����$ 3��� �� ������� ��4� ��4��� 4���� �� ��� @��� ��� 0��3��" ���� �����7 �3���10������ �0��� ���� ������ ��4��� 3�� 4��$��$���1 $�4���� 5+���$��� ��� 89<<67 (� 4���14� (A(( ����� ���� 5���" �� ��� 899?6���! �� ?AB�� 4� �$��� �� $�$�������� �4�� ��� �� ��� �� ?AB�� ��� ��4���� ��� ��4� �1 ���� ��! �0��� ������������ �� �����7 )� 4���14�� ( �� (( �� ������� ����� �� � ��"��@$��� �00����$� �� ��� ��4��� ������$� 0 ?AB�� �� 0 ��! �4 � B< ��0��� ������������ �� ����� 5���" �� ��� 899?67 �� 4�������1��4��� 3��� #& � ����� ���� 5)������� 89<<6� 3� 0�� ������� ��� ��� ��������� ���3��� ��� �00����� ��$�����$�� �� ��������� 0 !�� ���"� $���� �� ��� ���� 0 !�� ��4���7 M�3��� �� ���� � ���$� �00����$�� �� ��� ���� 0 !�� ���"�J��4��� $�4�$��1 0� ��� �3 �14�� 0 ��$�����$�� ����� � ��$����4�� ���"� ��������1 $�� �� �� -��������� 3��� �����������$����$�� ��$���-��7 M� $���������1 ��� � �3��������� ?AB�� 4������ $���� 3��� ���� ������� ���� ��!4������$����� �� ���� ?AB�� 3��� ��4���� ��� ��4� �1 ���� ��! �� ������� ���� �� ��� 5���" �� ��� 899?67 %������ 4�������'4�������� ���� ���� 4�� 0�3�� � ��$� �� ��� ��4��� 0 �$����"���� �1 �����$��4��� �4�� ��� ��$���� � �'$���� ��4���5�����$��4��� $�4�� ��4���6 5+���� �� ��� 899B6� ��� ����������0 �����$��4����� �4�� ��� ��$���� � �'$���� ��4��� 0 ���$���� "���� 5+����� 899B6� �� ��� 4��������1 ���� ?AB�� ��1�� �$� ��� ������� 0 ��� !�� ����' 5%/1��3��� �� ��� 899=67(� ��� ��� $�4����" �������� ����� %��D>+8 ��$� �� ����1

%��$�� ��$� 5&���� �� ��� 899F6 ��� �� �$��� ���� 0 ��! �� ?AB�� 3�� ��"��@$����1 "������ �� ��� %��D>+8 ������� ��� � �00����$� 3�� ���$�� �� ��4��� ������$� ���3��� ��� �3 �������7��� 0������ 0 ��� 4��4� �$�� 3�� $�$�������� �4�� ��� �� ���$�� � ��'���� �� =;;�� 4�� $�. 0� ��� %��$��������7 �� ��� �����4��� ���� ���� � �� �� �������� � �� �� ����3�� �� ����� $����� 3� �14�����/� ���� ������� ��1 �� �$� �������� ����� 0 4���$��� 0 ����� $����� 3��$� �� �� ����� ��������� 0 !�� ���"� $����� ��� ��1 �$����� ��� ������ 0$���� $������ � �44����7 ���� �00����$� ��"�� �� �� �

���� 5�!�� 4�1������6� ��� �����0�� 0 3��$� 0�������$1��� � �������$1��� ��� ���� ��������� �1 (1��"��5899<6 �0��� #� ���� ����� �� ���"���� ����� �� ������" 4���������� �� �� �4�"����� �����7 +G2 ��"�� �� ���������� � �4�"����� ������ �� +G� � ���"���� �����7 ����� �����$� 0���� �����0�� $�� ��� �� !�� ��4��� �� �������$1���7)���������� ���� �����0�� �� ���$���� 3��� ������� �����0��5(1��"��� 899<6 �� ��� �'4������ �� $�$�������� �4�� ��� �0��� #� ���� �����7 � ���1� !�� ��4��� �� +G2 $�� ��������������1 �'4���� ��� "������ ������ 0 %&� ���� �� .B �7 ������������� �'4������� $�� �� � �00�������� ������1 0� -���$���"0��� �� �$��� ���3��� +G2 �� +G�7 # �'4���� 0 ����"�������� � ��� 0 0��� �� �$�� �4�$��� �1 �� 1�� ����1��$����$����/� ��$�������7 ������� �� ��� 4��$����� ���������1 ���� � ���4 ���� #�� �$� 0��� �� �$��� 5%$����/�� ��� 899:6 �� � ������ �����4��1 ���3��� �������$1��� �� �����$1��� $$��� ������" ����'� ��� �0����� �� �����"������5&������1� �� ��� 899<67 �0��������1� ����� �� � ����� ��������� 0 ����'� ��� �0����� �� ���4��� � � ����0 #&���� ����� 5���$� �� ��1��� 899;* (�/�3� �� ��� 899B67 �0��� �$��� #& ���� ������ ��4� 4��'� � ������ ��$������ 4��� �� 8< � �� ��"�� � �$����� ������0���7 (� $������� ��4��'� � ���������$������� �� "��������� 4��'� ��� �$����� �� ��� @��� .B � �� �����-�����1 ��$����� � 4��� ���� =; � 5(�/�3� �� ��� 899B67 C����1� #& �� �$�� ���1� 4�"��������� 3��$� 3�� �� �44��$�������$���� 3� �'����� ��� ����1 ���� $���� 0 ������7 �3���10������ �0��� ���� ������ ��1 $���������� ������� �� �������4��$����� ��"�� �� 4������7 ����� 4��$����� $�� ����� ���4���$���� '1"�� �4�$���� ���� �$������" �44���� �1 4��������" ���"� � $��� $���������� 5!��� 4������� ��4� �67�44���� �� 0��� $��� ��� �� � ��O� ���0 �0���� ��$������

�"����� $������� ���"�7 ��� �$����� �� $���� $������ ��44���� �� �� � �� 3��� �����$1��� 3��� 4������ $�� ��$��� ��� �� � 4��� '7 M� ��""��� ���� ���� �� 0��������� �� ��� ����� �����$1��� $�������� � 4���$� ��� �4� ����� ��������"����� ������ ������� 5�������� �00�$��6 ��� 0�$��� �� 1��� ����@� ��� �� ��$�������1 ���$���� 3��� �� �� 4�"��������7����� 0�$��� ��$� �� $���������� �������� ������� 4��$������ ����� $������� �����$1��$ 0�$��� ��1 ���������7 (� $�� ��� ���4�$����� ���� �� ��� ��" ����� �3����� ��� $������� ����4���� !�� ���"� ���$���� 3��� �� �$� �44���� ����$�� ��$����� ��� ���� 0 ���� $��$�� �� ��$� �3 4���14��� ��� ����7 %�� ��� $�4����" �3 �� ��"� 4���14� �����$1��� �� ���� $���'� 3�� �� ���40�� � � ���� ���� �����7���� � �� ��1 ��� ���4 �� ��� 1��" 4��4���$��� �� �����

��4�$����1 �O�$���� ����$���� ����������� �� ��1 $�������� ������ ������ ��� ��� �� ���� @�� 7

�� ����� ������������ ����������������� �� ��� ���� �� � ! ����"���# $��

$������� ���������%� �� ���%������ ����������# ����� �������# $� & �� �������

�''����# ��� ��� (�)%�� �*������� �� +������� ������

+G)G+G��G%

&����� !� !�'� 2� �� ��� GG� �� ��D ��4����� 0 ��� ���4��� 0 ����������$1��� 3��� �00����� ������� $������ � ���������� & �� �����7 ,�����(�� ::DB;B8AB;B?� 899:

&�1��� �� ����� %� ��� (� ���" G�D �����$����/���� 0 ������� $���� �0��� �'4����� ���������� ��"��7 $�����'��� $���''��� $��'�� 88D8B9A8:B� 899:

&���� �� ���$���� !C� )��$��� %�� C$������ �)D G4� ����� 4���0������ ��� ����� -������1 0 !�� 4�� ���"� �� $������� 3��� #(� �$� ���� ����$��$��"������7 � ������ &��'��� 8;9D=B;A=BF� 899F

&���� %� %����E��&�/����� �G� %����� G� ������ �D G' ��� ��$�����$��� 0 ����4� ����� 3��� �����$1��� �� ��� ��V���$� 0 #&7 $�%'��� ,��� (�� <D.B8A.B9� 899:

&������1� %� ��$�� �� �����$� #� %����E��&�/����� �G� ���� �� ������ �D�������$ ����� �4� ����� ��$�����$�� � ��� 1 ��� ��� 0 �����$1�� �� �������$1��� �� 4�"�������� �� 4��4���$���7 � ������ &��'��� 888D88;=A88;<� 899<

!��� 2� >�� �D )������ 0 #�� �$� �44���� ������� � ��� $��� $1$��7 �� �&��'��� 8;FDB.=AB.<� 89<.

/8> ��+(���!+G� �� �� �>G �� +��C �) (�#G%�(���(#G !G+����C���

Page 7: Studies on Epidermis Reconstructed with and without Melanocytes: Melanocytes Prevent Sunburn Cell Formation but not Appearance of DNA Damaged Cells in Fair-Skinned Caucasians

!��� 2� >�� �D %������ $���D )�$��� ������ �� ��� 0������7 $�����'$�� �� B:D?<=A?9;� 89<F

!� C���3 %�� %���� �M(�� #������ &�� %$������� ��D ��4����� 0�����$1��� �� �������$1��� �� ������������ �$� !�� ���"� 4��������� ��1����� �� �����"��D �44��$������1 0 ���������� �$��� �4�$���0� ���� ���������7 � ������ &��'��� 8;:D.:9A.?=� 899:

!���� �� ������ ��D %$����"�� �00�$� 0 ������� G �� ���������� � 0��� �� �$���"������� �1 4������ ���� 4���������7 � $���' ��� <BD8;FA88;� 899:

)������ %GD #������� �� �'$���� ��4��� 0 #&�� �$� 41���� ��� ����� ��!�� 0 ����� ���� �� ����7 � ������ &��'��� 9;D<8BA<8F� 89<<

���"� +MD �$��� �00�$�� 0 ���������� �� ����� �� ��� ����7 (�D )��/4����$� �&�G���� �,� M�00 2� )��� ���" (M� ������ 2) 5� �67 &��'���%" �� -������!�������� =� � �7 ��3 ���D �$���3 >���� 89<F� 44 8B:8A8B:F

���$��� � D �4�� -������� �� 4�����"1 (((7 ������� �� 4��4���$���7$�����' $�� �� � ��� .9D<FA<9� 899:

���$����� &�� %��� ��� %�00 �%� ���� ��D ��� ����� ������� ���$���D>����"�$ �� ��$����$�� ��� ���7 � �' ���� &��'��� :DB88AB..� 89<8

���� �$�� +� >����� �� M��0 >�D �3 4���3�1� 0� �� �$��� 0 �44���� �1���������� �� ����� �� $������� ����� �������$1���7 � ������ &��'��� 8;9D8?=A8?9� 899F

���� �C� 2�� ��1 2>D %���$����� 4������ ������� $��� 0������ �� ����� ����7 ������� &��'��� F:D=?=A=?B� 89<;

>����� �)� ��O� �� ��0���� �D G00�$�� 0 �1 �-����� � ��� �1������� 04����������7 ,��� ��� �.��� 8.D=<?� 899?

>��� �� 21�� %� (� %� M�������� 2� � �� �� 1 ��D G�������� �� 4��������� $������ 0 ����� �4� ����� �� $������ �����$1���7 $�% ,���(�� <D.;;A.;<� 899:

(�/�3� �� 2�� �� ��"��� >� �������� >� ��3� �D C�"���� 0��3�4 ��� 1 0$���"�� �� ��4� 4��'� � ������ �� ��� �$�����1 0 ��4��'� � ���������$������� �� "��������� 4��'� ��� �� ���� ���� �0��� �$��� �� $����$ #���� �����7 ���� &��'��� (�� .<?DBFA:.� 899B

(1��"�� &D ��� ��� 0 �����$1��� �� ��� ��4��� 0 # ������ !�� !���"� ���������$1���7 $�%'��� ,��� (�� 88D88;A88=� 899<

2��1���� �� ����"�3� �� ��������� �� �� ��D %�4����$���� ������� $�4� �� �$����������� �� �$� !�� 4��4� �$�� �� ����� �4� �����7 � ������ &��'���88;D<;;A<8;� 899<

C� �� > #�� ���$���� !C� ������ ��� ��� #�D !�00���������� �4�� ��� 4:=��"������ 0 ��$���� � �'$���� ��4��� �� �������$1���7 �' � $���� 8:;D8B:FA8B?B� 899F

C3� �D G4� ����� �������� �$���'1����� 4�1������� $��� 4���0������ �� ���� 4�����7 ���� &��'��� 88?D<..A<.:� 89<;

C3� �� 2 C� &��� ��"� �D ��������� ��"�� �� �$�� ����� �4� ����� �������� �$���'1���� �$�����17 �� � &��'��� 8;=D8<� 89<;

���� �2� ����� %� >������� >)� 2����� ��D � $�4������� ��� 1 0 ��� 4�1��$���� $����$�� 4�4������ 0 �������� ������ 0�� ����� ���$� �� �� ����7 ������� &��'��� <;D.;.A.;?� 89<=

���$���� !C� ������� �G� G4����� �GD +�4��� 0 41���� ��� 5?AB6 41���� ��4��4� �$�� �� ���� ����7 � ������ &��'��� 9:D::A:9� 899;

��� �� ������ �� >����� �� �������"� �� (���� �� ����� �D %����������������������� 0 ��$���� ����� ��� �4�$�@$ 0� ������ $1$�������41���� ��� ���� � 5?AB6 4��4� �$� 0�� ��� ���� ���� ������/� 3��� �������������� ���� !��7 $�����' $�� �� :BD..:A.=.� 8998

��������� �� 2��1���� �� �� � >� ����O� �� %����� �� ��� �� ������� �D

(� �$��� �� ��4��� 0 #&�� �$� $1$������� 41���� ��� ����� �� 5?AB6 4��4� �$�� �� �"��$������ ����� ����� ����7 ���� &��'���.<BD.=.A.=F� 899.

���� +C� ��1�� �� G������ ��D ����������� �$� �� ��� ��� $��� ��������/����7 �,���� $���� 8D8.;A8.:� 89FB

���$� &�� ��1�� �)D G00�$�� 0 ���"�� �� ���������� �� ����� � ���� ��4��'� � ��������� $������� �� '������� '� ��� �� �������� ��$�7 � ������ &��'���9:D.8=A.8?� 899;

����3��� ++� >���� �+D �44����D ��� ���� 0�� � ��3 4���4�$����7 ,��� &����&��� 8D89A=8� 899B

������ )� &���� &� +�� ,�� ������� �� ������ �D ��������� ��"�� �� �$�� �'4������0 4:= �� 4.8 �� ����� ����D G00�$� 0 ����$���� �� $���������� 4.8�'4������ �� ���� �44�� �"��7 � ������ &��'��� 8;:DB;.AB;?� 899:

Q�� I� ,���" %� ���������� �� � � >� ����/��� �� %�/��� �� ����� ��(�����3� �D !���$��� 0 �$���� #4��4� �$� ��4��� �� ����1 ���� ����� �1 -����������� ���������$�������17 ,����� ���� <=D.98A.9<� 899B

+���$� �2� ���"�� 2� C�� � %�� >���3��� ��D ��4������� ������ 041���� ��� ����� 0�� ����� �4� ����� �������$1��� �� ��� �� �� ����7 ������� &��'��� 98D=B9A=:.� 89<<

+���� >��� %����� ���� #�� C���� �>�� 2����� >� ,����� ��� ������ ���C>)D %���� �4�$�@$ ������ 0 $1$������� 41���� ��� ����� 0�� �/0 "����� ��� �4� ����� 0 #&���� ���� �������� ��$�7 1��%��� 9D=B.FA=B=.� 899B

%��$��/ �� G��� "� %�D %�44� 0� ��4����7 ������"� 8FD:B:A:B<� 899:%$����/ %� ����� �!� ����� ��� �/�����1 ��� ����3 2D !��� ��� 0 ��������

�� ������� 4��$����� �� 4��4���$���� �� 4���'�$ �"����D ��������� 0���������� �� ����� �� �$� ��4� 4��'� ����7 $�����' $�� �� ?8D?:;A?::� 899:

%$������ ��� G���� C�� �/ 2�� ��� )��� +� ,����� ��D �1���� ��� ������ �$��� �� ��4��� �� $������ ����� ���� �������$1��� � �����$1��� �0������� ����� 3��� ��$������$ ���������� �� �����7 � ������ &��'��� 9?D98?A9.;� 8998

%$�3��/ �� &��� 3�O +� ���"��� �� �� ��D ��������� &�� �$� �44���� 0�������$1���D G�� ��$� 0� 4������ ���������� 0 ���� ��$���� 0�$����4���� ��� 0������ 0 ������� $����7 � ������ &��'��� 8;BD9..A9.F� 899:

%$�3��/ �� ������ 2� C�"�� ��� %$�3��/ �D ����'�01����� �� �$�� ��� 0������0 ������� $����7 �.� &��'��� ?D8A:� 899F

%/1��3��� !G� C�3���$� �M� M +!D +�4��� �1 ����� $��� �'���$�� 0 ���"��5?AB6 �� $1$������� ��1������1���� 4��4� �$�� �� !��7 $�� 2������� ��� 3�� 9;D9<.=A9<.F� 899=

#����� �� ������ C� C�$�� �� ������ �D (��������$����$�� �$���/���� 0�������� �$���'1���� �� ����� ����7 � &��'��� 8BD88.A88F� 89<F

M�0 �� �' �� ����� !&� 2��4�� �CD %���$����� �� �B�: ��4���� �00�� ������� ������1 � 4���$� �"����� ������������ �$� ������� $��� 0����������������� 0 �� ����$ �4� ����� $����� �� �$�� ��44������ 0 $���$��14������������17 � ������ &��'��� 8;BD.<FA.9.� 899:

��� ��� C1�� �&� ����� !�D ������� ����� �����$1��� 0�� ���$� �� 3���� ��� ���� �00����� �����"�� �� ���������� � �� ����� �������������7 � ������&��'��� 99DB:BAB:9� 899.

���" �+D ��� ������� $���7 $�����'���%" BD8.FA8=B� 89<F���" �+� ��� 3�$� ��� >������ �(� >�3� �C�� ����� �� ����� �%D ��� ��

���� ��4��� ������$� 0 �4� ����� ��1���� ����� �� ?AB 4��4� �$�� ������� ���� �14� ( �� ((7 � ������ &��'��� 8;?D8=;FA8=8=� 899?

#�C7 88:� ��7 . � � %� .;;; �� ��%(�� �GC������G% ��! % �& +� /88