STUDI AKTIVITAS ANTIBAKTERI DAN IDENTIFIKASI FRAKSI .../Studi-Ak... · Identifikasi dengan skrining fitokimia menunjukkan bahwa fraksi etil asetat mengandung senyawa alkaloid, terpenoid,

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

i

STUDI AKTIVITAS ANTIBAKTERI DAN IDENTIFIKASI

FRAKSI TERAKTIF DAUN MIMBA (Azadirachta indica A. Juss)

Disusun oleh :

RISKHA KURNIA MURTI

M0306055

SKRIPSI

Ditulis dan diajukan untuk memenuhi sebagian persyaratan

mendapatkan gelar Sarjana Sains

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA

Oktober, 2011

Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´» ©·¬¸±«¬ ¬ ·̧ ³»¿¹» ¾§ °«®½¸¿·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷


commit to user

ii



commit to user

iii

STUDI AKTIVITAS ANTIBAKTERI DAN IDENTIFIKASI FRAKSI TERAKTIF DAUN MIMBA (Azadirachta indica A. Juss)

RISKHA KURNIA MURTI

Jurusan Kimia, Fakultas MIPA. Universitas Sebelas Maret

ABSTRAK

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri fraksi daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) terhadap beberapa bakteri patogen dan mengidentifikasi fraksi teraktifnya. Serbuk daun mimba dimaserasi dengan etanol dan difraksinasi dengan kromatografi vakum cair berturut-turut menggunakan eluen heksana, etil asetat, dan etanol. Aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar, kemudian fraksi teraktif antibakteri ditentukan berdasarkan Diameter Daerah Hambat (DDH). Fraksi teraktif antibakteri ditentukan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan nilai bandingnya terhadap amoksisilin dan kloramfenikol. Selanjutnya fraksi ini diidentifikasi menggunakan skrining fitokimia dan Kromatografi Gas-Spektrofotometer Massa (GC-MS).

Fraksi daun mimba hasil pemisahan KVC mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, dan Shigella flexneri. Fraksi etil asetat menunjukkan fraksi teraktif antibakteri terhadap semua bakteri uji. Fraksi etil asetat memiliki KHM 0,075% terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis, 0,05% terhadap bakteri Bacillus cereus dan Shigella flexneri. Aktivitas antibakteri fraksi etil asetat dibandingkan dengan amoksisilin adalah 0,01% untuk bakteri S. epidermidis, 0,02% untuk bakteri B. cereus, dan 0,02% untuk bakteri S. flexneri, sedangkan dibandingkan dengan kloramfenikol adalah 0,04% untuk bakteri S. epidermidis, 0,02% untuk bakteri B. cereus, dan 0,06% untuk bakteri S. flexneri. Identifikasi dengan skrining fitokimia menunjukkan bahwa fraksi etil asetat mengandung senyawa alkaloid, terpenoid, steroid, tanin (polifenolik), antrakuinon, dan asam lemak. Hasil GC-MS menunjukkan bahwa fraksi etil asetat mengandung senyawa asam palmitat, etil linoleolat, asam stearat, trans-fitol, DOF (di oktil ftalat), dan dimungkinkan 1 senyawa golongan asam lemak serta 5 senyawa golongan triterpenoid.

Kata Kunci : Azadirachta indica A. Juss, fraksi etil asetat, aktivitas antibakteri,

identifikasi fraksi teraktif



commit to user

iv

STUDY OF ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND IDENTIFICATION THE MOST ACTIVE FRACTION OF NEEM LEAVES

(Azadirachta indica A. Juss)

RISKHA KURNIA MURTI Department of Chemistry. Faculty of Mathematics and Natural Sciences

Sebelas Maret University

ABSTRACT

The purpose of this research was to evaluate antibacterial activity of Neem (Azadirachta indica A. Juss) leaves fraction against some pathogenic bacterial and to identificate the most active fraction. Leaves powder of Neem was macerated with ethanol and factionated by vacuum liquid chromatography using hexane, ethyl acetate and ethanol as eluent, respectively. The antibacterial activity of the fraction was evaluated by diffusion method, then the most active fraction of antibacterial was evaluated by zone of inhibition. The most active fraction of antibacterial was evaluated for Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and equivalent value, compared with amoxicillin and chloramphenicol, then identified using phytochemical screening and Gass Chromatography-Mass Spectroscopy (GC-MS).

The fraction of Neem leaves fractionated by vacuum liquid chromatography had antibacterial activity against Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, and Shigella flexneri. The ethyl acetate fraction showed the most active fraction of antibacterial against all bacterial tested. The ethyl acetate fraction had MIC 0.075% against Staphylococcus epidermidis 0.05% against Bacillus cereus and Shigella flexneri. The antibacterial activity of ethyl acetat fraction compared to amoxicillin was 0.01% for S. epidermidis, 0.02% for B. cereus, and 0.02% for S. flexneri. Then compared to chloramphenicol was 0.04% for S. epidermidis, 0.02% for B. cereus, and 0.06% for S. flexneri. Identification using phytochemical screening showed that the ethyl acetate fraction contained alkaloids, terpenoids, steroids, tannins (polyphenolics), anthraquinones, and fatty acid. The result of GC-MS showed that the ethyl acetate fraction contained palmitic acid, ethyl linoleolate, stearic acid, trans-phytol, DOP (di octyl phthalate), and suggested 1 class of compound fatty acid and 5 classes of compound triterpenoids.

Keywords : Azadirachta incica A. Juss, ethyl acetate fraction, antibacterial

activity, identification the most active fraction



commit to user

v

MOTTO

“ Sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan. Maka apabila kamu

telah selesai dari sesuatu urusan, kerjakanlah dengan sungguh-sungguh

urusan yang lain”

“ Bacalah apa yang telah diwahyukan kepadamu, yaitu Al-Quran dan

dirikanah Sholat. Sesungguhnya Sholat itu mencegah perbuaan

keji dan mungkar”

“ Tugas kita bukanlah untuk berhasil. Tugas kita adalah untuk mencoba,

karena di dalam mencoba kita menemukan dan belajar membangun

kesempatan untuk berhasil”



commit to user

vi

PERSEMBAHAN

Karya kecilku ini kupersembahkan untuk :

“Bapak dan Ibu” atas kasih sayang, dukungan, motivasi, dan doa yang tiada henti…

“Rima”…terimakasih atas supportnya selama ini…

…thanks for everything…keep spirit!!!



commit to user

vii

KATA PENGANTAR

Segala puji syukur penulis panjatkan kehadirat Alloh SWT atas limpahan

rahmat dan karunia dan ridho-Nya sehingga skripsi yang berjudul “Studi Aktivitas

Antibakteri dan Identifikasi Fraksi Teraktif Daun Mimba (Azadirachta indica A.

Juss) ini dapat terselesaikan dengan baik.

Dalam kesempatan kali ini penulis mengucapkan banyak terima kasih

kepada semua pihak yang telah banyak membantu sehingga penulis dapat

menyelesaikan penulisan skripsi ini, khususnya kepada :

1. Bapak Ir. Ari Handono Ramelan, M.Sc.,PhD selaku Dekan FMIPA UNS.

2. Bapak Dr. Eddy Heraldy, M.Si selaku Ketua Jurusan Kimia FMIPA UNS.

3. Ibu Nestri Handayani, M.Si, Apt selaku pembimbing I yang telah

memberikan bimbingan dan arahan selama menyelesaikan skripsi.

4. Bapak M. Widyo Wartono, M.Si selaku pembimbing II yang telah

memberikan bimbingan dan arahan selama menyelesaikan skripsi.

5. Bapak Dr. rer.nat Fajar Rakhman Wibowo, M.Si selaku pembimbing

akademik yang telah memberikan saran dan motivasi kepada penulis

selama masa studi.

6. Bapak I.F. Nurcahyo, M.Si. selaku Ketua Laboratorium Kimia Dasar

FMIPA UNS dan Bapak Tjahjadi Purwoko, M.Si. selaku Ketua Sub

Laboratorium Biologi Laboratorium Pusat FMIPA UNS.

7. Seluruh Dosen Jurusan Kimia FMIPA UNS atas ilmu yang berguna dalam

penyusunan skripsi ini.

8. Para Laboran di Laboratorium Kimia FMIPA UNS dan Sub Laboratorium

Biologi atas bantuan dan kerjasamanya dengan baik.

9. Bapak, Ibu dan Rima, terimakasih atas motivasi, dukungan, dan doanya

selama ini, sehingga terciptalah karya kecil ini.

10. Untuk teman-teman seperjuangan “Anne, Marsih, Idul, Isna, Ester, Eva,

Mb Esmy” terimakasih atas kebersamaan dan persabatannya selama ini.

Untuk “Ovi, Nurul” terimakasih atas bantuannya.



commit to user

viii

11. Teman-teman Kimia’06, kakak dan adik tingkat yang tidak mungkin

disebutkan satu persatu, terimakasih atas semua dukungan dan

persahabatannya selama ini.

12. Semua pihak yang telah membantu penulis dalam pelaksanaan serta

penyusunan skripsi ini yang tidak dapat penulis sebutkan satu- persatu.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kata sempurna. Oleh

karena itu penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang membangun demi

kesempurnaan skripsi ini.

Akhirnya penulis berharap semoga skripsi ini bisa memberikan manfaat

dan dapat menambah pengetahuan bagi para pembaca pada umumnya dan penulis

pada khususnya.

Surakarta, Oktober 2011

Riskha Kurnia Murti



commit to user

ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ................................................................................ i

HALAMAN PENGESAHAN .................................................................... ii

HALAMAN PERNYATAAN ................................................................... iii

ABSTRAK ................................................................................................ iv

ABSTRACT ............................................................................................. v

MOTTO .................................................................................................... vi

HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................ vii

KATA PENGANTAR .............................................................................. viii

DAFTAR ISI ............................................................................................ x

DAFTAR TABEL ..................................................................................... xiii

DAFTAR GAMBAR ................................................................................. xiv

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................. xiv

BAB I. PENDAHULUAN ........................................................................ 1

A. Latar Belakang Masalah ................................................................. 1

B. Perumusan Masalah ........................................................................ 3

1. Identifikasi Masalah .............................................................. 3

2. Batasan Masalah ................................................................... 4

3. Rumusan masalah ................................................................. 4

C. Tujuan Penelitian .......................................................................... 5

D. Manfaat Penelitian ......................................................................... 5

BAB II. LANDASAN TEORI ................................................................... 6

A. Tinjauan Pustaka ........................................................................... 6

1. Mimba (Azadirachta indica A. Juss) ..................................... 6

a. Klasifikasi Tanaman .......................................................... 6

b. Deskripsi Tanaman ........................................................... 7

c. Manfaat Tanaman ............................................................. 7

d. Kandungan Kimia Tanaman ................................................ 7

2. Bakteri dan Klasifikasi Bakteri Uji ....................................... 11

3. Metode Pengujian Aktivitas Antibakteri ............................... 15



commit to user

x

4. Antibiotik ............................................................................. 16

5. Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan Uji Banding .. .... 19

6. Ekstraksi ............................................................................... 20

7. Skrining Fitokimia ............................................................. ..... 20

8. Kromatografi Vakum Cair (KVC) .. ....................................... 21

9. Kromatografi Gas-Spektrofotometer Massa (GC-MS) ........... 21

B. Kerangka Pemikiran ...... ................................................................ 22

C. Hipotesis ....................................................................................... 23

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN .................................................. 25

A. Metode Penelitian .......................................................................... 25

B. Tempat dan Waktu Penelitian ........................................................ 25

C. Alat dan Bahan .............................................................................. 25

1. Alat ....................................................................................... 25

2. Bahan ................................................................................... 26

D. Prosedur Penelitian ........................................................................ 26

1. Identifikasi Sampel ............................................................... 26

2. Preparasi dan Ekstraksi Sampel ............................................. 27

3. Pengujian Golongan Senyawa Ekstrak Etanol ....................... 27

4. Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol ..................... 30

5. Pemisahan Ekstrak Etanol ...................................................... 31

6. Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi-Fraksi Hasil Pemisahan

KVC ..................................................................................... 32

7. Pengujian Golongan Senyawa Fraksi Teraktif Antibakteri ..... 32

8. Kromatografi Gas-Spektrofotometer Massa (GC-MS) ........... 32

E. Teknik Analisa dan Pengumpulan Data ......................................... 33

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................. 34

A. Identifikasi Sampel ....................................................................... 34

B. Persiapan dan Ekstraksi Sampel .................................................... 34

C. Pengujian Golongan Senyawa Ekstrak Etanol ............................... 36

D. Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol ............................. . 36

E. Pemisahan Ekstrak Etanol ............................................................. 38



commit to user

xi

F. Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi-Fraksi Hasil Pemisahan KVC

............... ........................................................................................ 39

G. Penetapan KHM dan Nilai Banding .................. ............................. 40

1. Penetapan KHM Fraksi Etil Asetat ...................................... ... 40

2. Penetapan KHM Amoksisilin dan Kloramfenikol ................. . 42

3. Penetapan Nilai Bandung Fraksi Etil Asetat dengan Amoksisilin

dan Kloramfenikol .................................................................. 45

H. Pengujian Golongan Senyawa Fraksi Teraktif Antibakteri ............ 46

I. Kromatografi Gas-Spektrofotometer Massa (GC-MS) ................... 48

BAB V. PENUTUP .................................................................................. 58

A. Kesimpulan ................................................................................... 58

B. Saran ............................................................................................ 58

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................ 59

LAMPIRAN LAMPIRAN ........................................................................ 66



commit to user

xii

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Hasil Skrining Fitokimia (Uji Tabung) Ekstrak Etanol ........ ...... . 35

Tabel 2. Hasil Skrining Fitokimia (Uji KLT) Ekstrak Etanol ................. .. 36

Tabel 3. Hasil Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol ................ 37

Tabel 4. Hasil Pemisahan Kromatografi Vakum Cair Ekstrak Etanol Daun

Mimba ....................................................................................... 39

Tabel 5. Hasil Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi-Fraksi Hasil Pemisahan

KVC ............................................................................................. 39

Tabel 6. Hasil Uji Penetapan KHM Fraksi Etil Asetat ............................ .. 41

Tabel 7. Hasil Uji Penetapan KHM Amoksisilin .................................... .. 43

Tabel 8. Hasil Uji Penetapan KHM Kloramfenikol ................................ .. 44

Tabel 9. Hasil Penetapan Nilai Banding Fraksi Etil Asetat terhadap

Amoksisilin dan Kloramfenikol ............................................... ... 46

Tabel 10. Hasil Skrining Fitokimia (Uji Tabung) Fraksi Etil Asetat ........... 47

Tabel 11. Hasil Skrining Fitokimia (Uji KLT) Fraksi Etil Asetat .............. . 47

Tabel 12. Fragmentasi Senyawa Puncak 3 Dibandingkan dengan Standar

...................................................................................................... 50


...................................................................................................... 52


................................................................................. .................... 53


................................................................................. .................... 54


................................................................................. .................... 56



commit to user

xiii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Tanaman Mimba (Azadirachta indica A.Juss) ...................... 6

Gambar 2. Bakteri Staphylococcus epidermidis ...................................... 12

Gambar 3. Bakteri Bacillus cereus .......................................................... 13

Gambar 4. Bakteri Shigella flexneri......................................................... 15

Gambar 5. Struktur Kimia Amoksisilin ................................................... 16

Gambar 6. Struktur Kimia Kloramfenikol ............................................... 17

Gambar 7. Kromatogram GC Fraksi Etil Asetat Daun Mimba ................. 49

Gambar 8. Spektra Senyawa 1 ................................................................. 50

Gambar 9. (a) Spektra Senyawa 3…………………………………. ........ 50

(b) Spektra Massa Senyawa Asam Palmitat ………………….. 50


(b) Spektra Massa Senyawa Etil Linoleolat..………………….. 51

Gambar 11. Senyawa Puncak 5 ................................................................ 52


(b) Spektra Massa Senyawa Asam Stearat..………………….. 53


(b) Spektra Massa Senyawa Etil Linoleolat..………………… 54

Gambar 14. Spektra Senyawa 8 ................................................................ 55

Gambar 15. (a) Spektra Senyawa 9 ......................................................... 55

(b) Spektra Massa Senyawa DOP......................................... ... 55

Gambar 16. Spektra Senyawa 10........................................................... ...... 56

Gambar 17. Spektra Senyawa 11........................................................... ...... 56

Gambar 18. Spektra Senyawa 12............................................................. .... 57



commit to user

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Diagram Alir Prosedur Penelitian………………………..….. 66

Lampiran 2. Hasil Determinasi Tanaman Mimba......................................... 69

Lampiran 3. Perhitungan Rendemen Ekstrak Etanol dan Fraksi-Fraksi Hasil

Pemisahan KVC……………………………………………… 70

Lampiran 4. Hasil Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun

Mimba....................................................................................... 72

Lampiran 5. Out Put Analisa One way ANOVA Pengaruh Variasi Bakteri

pada Masing-Masing Konsentrasi Ekstrak Etanol…………… 73

Lampiran 6. Hasil Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi-Fraksi Hasil

Pemisahan KVC………………………………………………. 76

Lampiran 7. Out Put Analisa One way ANOVA Pengaruh Variasi Fraksi pada

Masing-Masing Bakteri pada Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi-

Fraksi Hasil Pemisahan KVC................................................... 78

Lampiran 8. Hasil Pengujian Penetapan KHM Fraksi Etil Asetat………… 84

Lampiran 9. Analisa One Way ANOVA Pengaruh Variasi Bakteri pada

Masing-Masing Konsentrasi Fraksi terhadap Penentuan KHM

Fraksi Etil Asetat…………………………………………….. 85

Lampiran 10. Hasil Pengujian Penetapan KHM Amoksisilin........................ 88

Lampiran 11. Analisa One Way ANOVA Pengaruh Variasi Konsentrasi

Amoksisilin pada Masimg-Masing Bakteri Pada Uji Penetapan

KHM Amoksisilin.................................................................... 89

Lampiran 12. Analisa One Way ANOVA Pengaruh Variasi Bakteri Pada

Masing-Masing Konsentrasi Amoksisilin pada Uji Penetapan

KHM Amoksisilin.................................................................... 94

Lampiran 13. Perhitungan Nilai Banding Fraksi Etil Asetat terhadap

Amoksisilin.............................................................................. 97

Lampiran 14. Hasil Pengujian Penentuan KHM Kloramfenikol.................... 102



commit to user

xv

Lampiran 15. Analisa One Way ANOVA Pengaruh Variasi Konsentrasi

Kloramfenikol pada Masing-Masing Bakteri pada Uji Penetapan

KHM Kloramfenikol ........................................................... 103

Lampiran 16. Analisa One Way ANOVA Pengaruh Variasi Bakteri pada

Masing-Masing Konsentrasi Kloramfenikol terhadap Penentuan

KHM Kloramfenikol ........................................................... 108

Lampiran 17. Perhitungan Nilai Banding Fraksi Etil Asetat Terhadap

Kloramfenikol ..................................................................... 111

Lampiran 18. Hasil Uji KLT Ekstrak Etanol dan Fraksi Etil Asetat……….. 115

Lampiran 19. Analisis GC-MS Ekstrak Etil Asetat Daun Mimba………..... 116



commit to user

1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah

Pemanfaatan tanaman obat untuk mengobati suatu penyakit semakin

diminati seiring dengan semakin meningkatnya perhatian masyarakat dunia

terhadap gerakan “kembali ke alam” (back to nature), tidak terkecuali masyarakat

Indonesia. Hal ini dikarenakan efek samping dari tanaman obat jauh lebih aman

dibandingkan obat-obat kimia (Djauharia dan Hernani, 2004). Namun supaya obat

tradisional dapat diterima dalam pengobatan modern, beberapa persyaratan yang

harus dipenuhi, terutama adalah kandungan zat aktifnya. Sehingga khasiat dan

tingkat keamanannya dapat diketahui dengan mudah (Atamini, 2001).

Mimba (Azadirachta indica A. Juss) merupakan tanaman yang banyak

ditemukan di Negara Tropis, salah satunya adalah Indonesia. Di Indonesia

tanaman mimba tumbuh di Jawa Tengah, Jawa Timur, Jawa Barat, Bali dan Nusa

Tenggara (Herawati, 2004). Tanaman ini memiliki manfaat yang sangat banyak

bagi kehidupan manusia. Daun mimba dimanfaatkan untuk penambah nafsu

makan, disentri, borok, malaria dan antibakteri (Sudarsono dkk., 2002). Selain itu

daun mimba juga dapat digunakan untuk menurunkan gula darah (Csurhes, 2008),

menurunkan total kolesterol dalam darah, LDL- dan VLDL-kolesterol, trigliserid

dan total lipid dalam serum (Chattopadhyay dkk., 2005). Khasiat daun mimba

dipengaruhi oleh kandungan metabolit sekundernya. Daun mimba diketahui

mengandung senyawa golongan terpenoid, flavonoid, alkaloid, saponin, tanin (Biu

dkk., 2009), asam lemak (Khan dkk., 2010), steroid dan triterpenoid (Aslam dkk.,

2009). Ekstrak etanol dari biji mimba dilaporkan mengandung asam palmitat,

asam stearat, asam oleat, etil oleat, asam oktadekanoat, etil ester oktadekanoat dan

ester dioktil heksadioat (Suirta dkk., 2007). Penelitian lain menyebutkan bahwa

ekstrak air daun mimba mengandung senyawa azadirachtin A, B, D, H, I,

desacetylnimbin, azadiradione, nimbin, salanin, azadirone, nimbolin, nimbinen,

dan nimbolide (Sadeghian, 2007).



commit to user

2

Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun mimba yang dilakukan

terhadap bakteri Staphylococcus aureus menunjukkan bahwa pada konsentrasi

10%, 20%, 30%, 40% dan 50% dengan DDH rata-rata 0,580; 0,670; 0,818;

0,972; 1,013 cm (Nugraheni, 2007). Selain itu Pritima dan Pandian (2008) juga

menyebutkan bawa ekstrak daun mimba mampu menghambat Bacillus cereus,

Enterococcus faecalis, Eschericihia coli, Kleibsiella pneumoniae, Neisseria

gonohorreae, Proteus mirabilis, dan Staphylococcus aureus. Menurut El-

Mahmood (2010) ekstrak heksan biji mimba memiliki KHM 6,25 mg/ml terhadap

bakteri E. coli, 50 mg/ml terhadap P. aeruginosa, 12,5 mg/ml terhadap S.

pyogenes, dan 12,5 mg/ml terhadap S. aureus. Sedangkan aktivitas antibakteri

fraksi daun mimba terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus,

dan Shigella flexneri belum pernah dilakukan penelitian secara ilmiah.

Staphylococcus epidermidis merupakan bakteri gram positif yang

menyebabkan penyakit melalui kemampuannya berkembang biak dan menyebar

luas dalam jaringan (Jawetz dkk., 2005). Bakteri ini terdapat pada kulit, selaput

lendir, bisul, jerawat dan luka. Bacillus cereus merupakan bakteri gram positif

yang dapat tumbuh pada makanan dan menghasilkan enterotoksin yang

menyebabkan keracunan makanan. Bakteri ini kadang-kadang dapat

menyebabkan penyakit meningitis, endokarditis, endoftalmitis, konjugtivis atau

gastroenteritis akut. Shigella flexneri merupakan bakteri yang menyebabkan

penyakit disentri basiler, yaitu suatu penyakit yang ditandai dengan peradangan

usus, terutama kolon dan disertai nyeri perut, tenesmus dan buang air besar yang

sering mengandung darah dan lendir (Plezar dkk., 1986). Selain itu juga dapat

menyebabkan demam tinggi, nyeri kepala, dan kejang-kejang.

Penyakit infeksi sampai saat ini masih menjadi masalah utama kesehatan

masyarakat Indonesia. Pengobatan terhadap penyakit infeksi biasanya digunakan

antibiotik sintetis dan telah banyak dikembangkan. Namun penggunaan antibiotik

sintetis ini kadang-kadang memberikan efek samping terhadap tubuh yang tidak

diinginkan (Aliero dkk., 2008). Situasi ini menunjukkan perlunya dilakukan

penelitian untuk mengembangkan obat antibakteri baru yang berasal dari tanaman.



commit to user

3

Penelitian in bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri fraksi daun

mimba terhadap Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, dan Shigella

flexneri dan mengidentifikasi komponen kimia fraksi teraktifnya. Hasil dari

penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi dan bukti ilmiah untuk

mengembangkan antibiotik baru dari bahan alam khususnya daun mimba.

B. Perumusan Masalah

1. Identifikasi Masalah

Tanaman mimba merupakan tanaman obat tradisional Indonesia yang

tumbuh di Jawa Tengah, Jawa Timur, Jawa Barat, Bali dan Nusa Tenggara.

Tanaman ini mempunyai kandungan kimia yang berbeda-beda pada setiap

bagiannya. Biji mimba dilaporkan mengandung senyawa golongan asam lemak,

sedangkan daun mimba mengandung senyawa golongan terpenoid. Penelitian uji

aktivitas antibakteri tanaman mimba menunjukkan bahwa pada setiap bagiannya

mempunyai aktivitas antibakteri yang berbeda-beda.

Isolasi senyawa daun mimba dapat dilakukan dengan metode maserasi,

shokletasi, dan perkolasi. Penggunaan pelarut yang berbeda pada waktu isolasi

akan menghasilkan senyawa yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi aktivitas

antibakteri yang dihasilkan. Dari hal tersebut perlu diperhatikan cara isolasi

senyawa daun mimba dengan pelarut yang tepat.

Beberapa penelitian menunjukkan bahwa daun mimba mempunyai

aktivitas antibakteri, sehingga perlu dilakukan pengujian untuk mengetahui

potensi ekstrak tersebut terhadap beberapa bakteri patogen. Bakteri yang

digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri sangat beragam antara lain

Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa dan Proteus

mirabilis untuk bakteri gram negatif. Sedangkan untuk bakteri gram positif antara

lain Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, Streptococcus pyogenes,

Bacillus subtilis dan Enterococcus faecalis.

Uji potensi suatu zat antibakteri bertujuan untuk mengetahui potensi zat

tersebut apabila dibandingkan dengan suatu zat pembanding yaitu antibiotik

sintetik. Beberapa antibiotik sintetik yang sering digunakan adalah antibiotik



commit to user

4

golongan penisilin dan turunannya. Untuk mengetahui potensi zat antibakteri

dilakukan dengan mencari nilai banding zat tersebut terhadap antibiotik sintetik

yang digunakan.

2. Batasan Masalah

Berdasarkan identifikasi masalah di atas, maka masalah dalam penelitian

ini dibatasi pada :

1. Penelitian ini menggunakan daun tanaman mimba yang berasal dari daerah

Klaten, Jawa Tengah.

2. Isolasi senyawa pada daun mimba dilakukan dengan cara maserasi

menggunakan pelarut etanol, kemudian dilanjutkan pemisahan dengan

Kromatografi Vakum Cair (KVC) menggunakan pelarut heksana, etil asetat,

dan etanol secara berurutan.

3. Bakteri yang digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri fraksi daun

mimba adalah Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, dan Shigella

flexneri serta dilakukan penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM)

terhadap fraksi teraktif antibakterinya.

4. Uji potensi fraksi teraktif antibakteri daun mimba dilakukan dengan mencari

nilai banding antara fraksi tersebut terhadap amoksisilin dan kloramfenikol.

3. Rumusan Masalah

Berdasarkan batasan masalah di atas, maka perumusan masalah dalam

penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. Apakah fraksi daun mimba hasil pemisahan KVC mempunyai aktivitas

antibakteri terhadap Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, dan Shigella

flexneri dan fraksi mana yang teraktif antibakteri dilihat dari parameter DDH

(Diameter Daerah Hambat)?

2. Bagaimana potensi antibakteri fraksi teraktif antibakteri daun mimba

dibandingkan dengan amoksisilin dan kloramfenikol?

3. Komponen kimia apa sajakah yang terkandung dalam fraksi teraktif antibakteri

daun mimba?



commit to user

5

C. Tujuan Penelitian

1. Mengetahui aktivitas antibakteri fraksi daun mimba hasil pemisahan KVC dan

mengetahui fraksi teraktif daun mimba terhadap Staphylococcus epidermidis,

Bacillus cereus, dan Shigella flexneri.

2. Mengetahui potensi antibakteri fraksi teraktif daun mimba dibandingkan

dengan amoksisilin dan kloramfenikol.

3. Mengetahui komponen kimia fraksi teraktif daun mimba.

D. Manfaat Penelitian

1. Segi praktis, dapat memberikan informasi ilmiah untuk pengembangan obat

tradisional terutama tentang khasiat daun mimba sebagai antibakteri.

2. Segi teoritis, diharapkan dapat bermanfaat untuk ilmu pengetahuan, yaitu

memberikan informasi tentang analisis kulitatif tentang aktivitas antibakteri

fraksi teraktif daun mimba terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis,

Bacillus cereus, dan Shigella flexneri dan komponen kimia fraksi teraktifnya.



commit to user

6

BAB II

LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka

1. Mimba (Azadirachta Indica A. Juss)

Mimba (Azadirachta Indica A. Juss) adalah tanaman asli dari India yang

saat ini telah banyak dibudidayakan di Indonesia, tanaman ini memiliki banyak

manfaat bagi manusia (Kardinan dan Agus, 2003). Mimba tumbuh di daerah

panas, di ketinggian 1-700 meter dari permukaan laut dan tahan tekanan air

(Kardinan, 2000). Tanaman mimba dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Tanaman Mimba

a. Klasifikasi tanaman

Divisio : Spermatophyta

Subdivisio : Angiospermae

Kelas : Dycotiledonae

Ordo : Rutales

Family : Meliaceae

Genus : Azadirachta

Jenis : Azadirachta indica A. Juss (sinonim : Melia azadirachta)

(Rukmana dan Oesman, 2002)



commit to user

7

b. Deskripsi tanaman

Mimba merupakan pohon dengan ketinggian 10-15 m. Batang tegak,

berkayu, berbentuk bulat, permukaan kasar, percabangan simpoidal dan

berwarna cokelat. Daun majemuk, letak berhadapan, berbentuk lonjong, tepi

bergerigi, ujing lancip, pangkal meruncing, pertulangan menyirip, panjang 5-7

cm, lebar 3-4 cm, tangkai daun panjangnya 8-20 cm dan berwarna hijau. Bunga

majemuk, berkelamin dua, letak di ujung cabang, tangkai silindris, panjang 8-

15 cm. Kelopak berwarna hijau. Mahkota halus dan berwarna putih. Benang

sari silindris dan berwarna putih kekuningan. Putik lonjong dan berwarna

cokelat muda. Buah bulat telur dan berwarna hijau. Biji bulat, diameter sekitar

1 cm, dan berwarna putih. Akar tunggang. Mimba tumbuh baik didaerah panas,

di ketinggian 1-700 m, dan tahan cekaman ait. Di daerah yang banyak hujan

bagian vegetatif sangat subur, tapi sulit untuk menghasilkan biji (generatif).

Perbanyakan melalui biji (Kardinan, 2000).

c. Manfaat Tanaman

Tanaman mimba mempunyai beberapa kegunaan antara lain digunakan

untuk pembangkit selera makan, obat disentri, borok, malaria. Minyaknya

digunakan untuk mengobati eksema, kepala kotor, kudis, dan kulitnya untuk

mengatasi gangguan lambung (Mardisiswojo dan Rajakmangunsudarso, 1985).

Sudarsono dkk. (2002) mengatakan bahwa daun mimba digunakan untuk

penambah nafsu makan, menanggulangi disentri, borok, malaria dan

antibakteri. Beberapa penelitian lain juga menyebutkan bahwa daun mimba

dapat menurunkan gula darah, menyembuhkan penyakit kulit (Csurhes, 2008),

memiliki efek gastro protektif pada mukosa lambung terhadap ulkus peptikum

(Ofusori dkk., 2008), menurunkan total kolesterol dalam darah, LDL dan

VLDL-kolesterol, trigliserid dan total lipid dalam serum (Chattopadhyay dkk.,

2005).

d. Kandungan Kimia Tanaman

Dari beberapa penelitian daun mimba diketahui mengandung senyawa

golongan terpenoid, flavonoid, alkaloid, saponin, tanin (Biu dkk., 2009), asam

lemak (Khan dkk., 2010), steroid dan triterpenoid (Aslam dkk., 2009).



commit to user

8

1. Terpenoid

Terpenoid berasal dari molekul isoprene (CH2=C(CH3)-CH=CH2

dan kerangka karbonnya dibangun oleh penyambungan dua atau lebih

satuan C5 ini. Terpenoid ini dibagi menjadi beberapa macam, yaitu

monoterpena dan siskuiterpena (C10 dan C15) yang mudah menguap dan

biasanya menjadi komponen utama penyusun minyak atsiri, triterpenoid

dan steroid (C30) yang tidak mudah menguap, dan pigmen karotenoid

(C40). Mekanisme terpenoid sebagai antibakteri tidak begitu jelas, tetapi

kemungkinan berhubungan dengan pengrusakan membran sel oleh

senyawa lipofilik (Cowan, 2000).

Senyawa terpenoid yang berhasil diisolasi dari bagian daun

tanaman mimba antara lain azadirachtin A, B, D, H, I, desacetylnimbin,

azadiradione, nimbin, salanin, azadirone, nimbolin, nimbinene, dan

nimbolide (Shadeghian, 2007). Senyawa-senyawa tersebut masuk dalam

golongan triterpenoid. Senyawa triterpenoid lain yang berhasil diisolasi

dari biji mimba dan kulit batang mimba yaitu nimonol, epoxyazadirodione,

azadirechterpinol A, azaditerpinol B (Moslem dan El-Kholie, 2009; Trag

dkk., 2005).

Minyak atsiri bunga mimba juga diketahui mengandung sejumlah

-candinen, copaen,

-cububen, dan fitol (Aromdee dan Sriubolmas, 2005). Senyawa

steroid yang pernah diisolasi dari kulit batang mimba adalah stigmas-5,7-

dien- -ol- -D-glukosida (Trag dkk., 2005), selain itu Govind (2011) juga

-sitosterol. Terpenoid dapat

menghambat aktivitas enzim autolisin dengan cara membentuk interaksi

yang kuat dengan sisi aktif dari residu enzim autolisin (Daisy dkk., 2008).

2. Flavonoid

Flavonoid merupakan golongan senyawa yang digambarkan

sebagai deretan senyawa C6-C3-C6, yang artinya kerangka karbonnya

terdiri atas dua gugus C6 (cincin benzene tersubstitusi) disambungkan oleh

rantai alifatik tiga-karbon. Sesuai dengan struktur kimianya yang termasuk



commit to user

9

flavonoid yaitu flavonol, flavon, flavanon, katekin, antosianidin dan

kalkon (Harborne, 1984). Pengelompokan flavonoid dibedakan

berdasarkan cincin heterosiklik-oksigen tambahan dan gugus hidroksil

yang tersebar menurut pola yang berlainan pada rantai C3.(Robinson,

1995).

Bunga tanaman mimba dilaporkan mengandung senyawa flavanon

terprenilasi antara lain 5,4 -dihydroxy-7-metoxy-8-prenylflavanone, 5,7,4 -

trihydroxy-3,8 -diprenylflavanone, 5,7,4 -trihydroxy-8-prenylflavanone,

5,7,4 -trihydroxy-3 -5 -diprenylflavanone (Nakahara dkk., 2003). Tanaman

mimba juga disebutkan mengandung flavonoid rutin dan quersetin yang

mempunyai aktivitas antiborok dan antiinflamatori (Dorababu dkk., 2006).

Aktivitas antibakteri flavonoid dimungkinkan karena kemampuan

flavonoid membentuk kompleks dengan ekstraseluler, protein terlarut dan

dinding sel bakteri dan semakin lipofilik suatu flavonoid, berarti semakin

merusak membran mikroba (Cowan, 2000).

3. Alkaloid

Alkaloid merupakan golongan senyawa aktif tumbuhan yang

mengandung atom nitrogen yang sering kali terdapat dalam cincin

heterosiklik. Penggolongan alkaloid didasarkan pada sistem cincinnya,

misalnya piridina, piperidina, indol, isokuinolina, dan tropana. Senyawa

ini biasanya terdapat dalam tumbuhan sebagai garam berbagai senyawa

organik dan sering diisolasi dalam bentuk garamnya dengan asam

hidrokloroda dan asam sulfat (Robinson, 1995).

Di dalam penelitian Muhtadi (2008) tanaman mimba dilaporkan

mengandung senyawa alkaloid jenis -karbolin, antara lain 4-metoksi-1-

vinil-karbolin dan 4,8-dimetoksi-1-vinil karbolin. Mekanisme alkaloid

menjadi senyawa antibakteri berhubungan dengan tingginya senyawa

aromatik quarterner dari alkaloid.



commit to user

10

4. Saponin

Saponin merupakan glikosida terpenoid dan sterol (Robinson,

1995), terdiri dari gugus gula yang berikatan dengan aglikon atau

sapogenin.

Saponin mempunyai sifat polar, jadi saponin dapat larut dalam air

dan etanol, tetapi tidak larut dalam eter. Saponin dapat berfungsi sebagai

antibakteri karena adanya gugus monosakarida dan turunannya (Cheeke,

2000).

5. Tanin

Tanin merupakan golongan senyawa aktif tumbuhan yang bersifat

fenol, artinya mempunyai rasa sepat dan mempunyai kemampuan

menyamak kulit. Tanin bisa dijumpai dalam jumlah banyak pada

tumbuhan berpembuluh, dalam angiospermae terdapat khusus dalam

jaringan kayu (Harborne, 1984).

Secara kimia senyawa tanin dibagi menjadi 2 golongan utama yaitu

tanin terkondensasi yang biasanya terdapat dalam paku-pakuan dan

gimnospermae, serta tersebar luas dalam angiospermae, khususnya pada

tumbuhan berkayu. Jenis tanin yang kedua adalah tanin terhidrolisis yang

biasa ditemukan pada tumbuhan berkeping dua. Tanin bersifat antibakteri

melalui aktivitas molekulnya yaitu membentuk kompleks dengan protein

melalui ikatan hydrogen dan ikatan hidrofobik (Cowan, 2000).

6. Asam lemak

Asam lemak yang ditemukan di alam, biasanya merupakan

monokarboksilat dengan rantai tidak bercabang dan mempunyai jumlah

atom karbon genap (Winarno, 2002). Asam lemak terdapat dua golongan

yaitu asam lemak jenuh dan asam lemak tidak jenuh sederhana dengan

panjang rantai C16 atau C18 (Harborne, 1984). Asam lemak tidak jenuh

berbeda dalam jumlah dan posisi ikatan rangkapnya, serta dalam bentuk

molekul keseluruhannya dengan asam lemak jenuh (Winarno, 2002).

Biji mimba dilaporkan mengandung senyawa-senyawa asam lemak

antara lain asam palmitat, asam stearat, asam oleat, etil oleat, asam



commit to user

11

oktadekanoat, etil ester oktadekanoat, ester dioktil heksadioat (Suirta dkk.,

2007). Penelitian lain juga menyebutkan bahwa kulit buah mimba

mengandung senyawa etil palmitat, etil oleat, metil 14-metil

pentadekanoat (Siddiqui dkk., 2003). Kemampuan asam lemak sebagai

antibakteri dikarenakan asam lemak bersifat hidrofobik, sehingga dapat

menyebabkan kerusakan struktur membran sel bakteri dan membran

menjadi permeabel, kemudian akan menyebabkan kerusakan membran

sitoplasma, sehingga terjadi koagulasi pada nukleoid (Nalina dan Rahim,

2007; Hornitzky, 2003).

2. Bakteri dan Klasifikasi Bakteri Uji

Bakteri merupakan protista tingkat rendah dan banyak tersebar di udara,

air, tanah, kulit, dan lain-lain. Suatu sifat taksonomi utama bakteri adalah reaksi

pewarnaan gram. Bakteri dibagi menjadi dua golongan yaitu bakteri gram positif

dan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif adalah bakteri yang tahan terhadap

alkohol tetapi dapat mengikat warna pertama pertama (kristal violet) sehingga

berwarna ungu. Sedangkan bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak tahan

terhadap alkohol sehingga warna pertama yang diberikan luntur dan akan

mengikat warna kedua sehingga bakteri berwarna merah (Bonang dkk., 1982).

Dalam bekerja, bakteri meningkatkan kemampuannya untuk bertahan dan

meningkatkan kemungkinan penyebaran. Bagian di dalam tubuh, dimana bakteri

harus menempel atau melekat pada sel inang biasanya adalah sel epitel. Setelah

bakteri mempunyai kedudukan yang tetap untuk menginfeksi, mereka mulai

memperbanyak diri dan menyebar secara langsung melalui jaringan atau lewat

sistem limfatik ke aliran darah. Infeksi sementara atau menetap (Jawetz dkk.,

2005).

a. Sthapylococcus epidermidis

Klasifikasi

Kingdom : Bacteria

Phylum : Firmicutes

Class : Bacilli



commit to user

12

Order : Bacillales

Family : Staphylococcaceae

Genus : Staphylococcus

Spesies : Staphylococcus epidermidis (Salle, 1961)


berbentuk bola atau kokus berkelompok yang tidak teratur dan bersifat

fakultatif aerobik. Bakteri ini mempunyai diameter 0,8-

membentuk spora,tidak bergerak dan koloni berwarna putih.

Staphylococcus epidermidis terdapat pada kulit, selapu lendir, bisul,

jerawat, dan luka. Bakteri ini dapat menimbulkan penyakit melalui

kemampuannya berkembang biak dan menyebar luas dalam jaringan (Jawetz

dkk., 2005). Secara klinis, bakteri ini menyerang orang-orang yang rentan atau

imunitas rendah, seperti penderita AIDS, paseien yang kritis, pengguna obat-

obat terlarang, bayi yang baru lahir, dan pasien rumah sakit yang dirawat dalam

waktu lama. Gambar bakteri Staphylococcus epidermidis ditunjukkan pada

Gambar 2.

Gambar 2. Staphylococcus epidermidis

b. Bacillus cereus

Klasifikasi

Kingdom : Bacteria

Phylum : Firmicutes

Class : Bacilli

Order : Bacillales



commit to user

13

Family : Bacillaceae

Genus : Bacillus

Species : Bacillus cereus (Salle, 1961)

Bacillus cereus merupakan bakteri yang berbentuk batang besar, tergolong

dalam gram positif, dan bersifat fakultatif aerob. Kebanyakan anggota spesies

ini adalah organisme saprofit yang lazim terdapat dalam tanah, air, udara, dan

tumbuh-tumbuhan. Bakteri ini menggunakan sumber nitrogen dan karbon

sederhana untuk energi dan pertumbuhannya.

Bacillus cereus dapat tumbuh pada makanan dan menghasilkan

enterotoksin yang menyebabkan keracunan makanan. Keberadaan B. Cereus

dalam jumlah besar (lebih dari 106 organisme/g) dalam makanan merupakan

indikasi adanya pertumbuhan dan pembelahan sel bakteri secara aktif dan

berpotensi membahayakan kesehatan. Organisme ini kadang-kadang dapat

menimbulkan penyakit pada orang dengan fungsi imun yang terganggu

(misalnya meningitis, endokarditis, endoftalmitis, konjungtivis, atau

gastroenteritis akut).

Gejala keracunan bahan makanan yang tercemar oleh bakteri Bacillus

cereus dibedakan menjadi dua yaitu mual disertai muntah dan kejang perut

yang hebat disertai diare. Spora bakteri ini resisten terhadap perubahan

lingkungan, tahan terhadap panas kering dan desinfektan kimia tertentu dalam

waktu yang cukup lama dan dapat bertahan selama bertahun-tahun pada tanah

yang kering (Jawetz dkk., 2005). Gambar bakteri Bacillus cereus ditunjukkan

pada Gambar 5.

Gambar 3. Bacillus cereus



commit to user

14

c. Shigella flexneri

Klasifikasi

Kingdom : Bacteria

Phylum : Proteobacteria

Class : Gamma Proteobacteria

Order : Enterobacteriales

Family : Enterobacteriaceae

Genus : Shigell

Species : Shigella flexneri (Salle, 1961)

Shigella flexneri merupakan bakteri gram negatif, berbentuk batang dan

bersifat fakultatif aerobik. Genus Shigella dapat tumbuh pada suhu 37°C dan

sensitif terhadap panas dan tahan terhadap konsentrasi garam 5-6%. Koloni

shigella cembung, bundar, transparan dengan diameter sampai kira-kira 2 mm

dalam 24 jam (Jawetz dkk., 2005). Habitat bakteri ini adalah terbatas pada

saluran pencernaan manusia dan primata lainnya dimana sejumlah spesies

menimbulkan shigellosis atau sering disebut disentri basiler. Disentri basiler

merupakan salah satu dari berbagai gangguan yang ditandai dengan

peradangan usus, terutama kolon dan disertai nyeri perut, tenesmus dan buang

air besar yang sering mengandung darah dan lendir (Plezcar dkk., 1986).

Shigella flexneri dapat membentuk enterotoksin yang dapat diresorpsi ke

dalam darah dan menimbulkan gejala hebat seperti demam tinggi, nyeri kepala,

dan kejang-kejang. Genus Shigella mempunyai susunan antigen yang

kompleks. Terdapat banyak tumpang tindih dalam sifat serologic berbagai

spesies dan sebagian besar kuman ini mempunyai antigen O yang juga dimiliki

oleh kuman enteric lainnya. Antigen somatik O dari Shigella adalah

lipopolisakarida. Gambar bakteri Shigella flexneri ditunjukkan pada gambar 4.



commit to user

15

Gambar 4. Shigella flexneri

3. Metode Pengujian Aktivitas Antibakteri

Antibakteri adalah zat yang membunuh atau menekan pertumbuhan atau

reproduksi bakteri (Dorland, 2002). Zat antibakteri dapat diperoleh dari hasil

fermentasi, sintetik dan dapat diperoleh dari hasil isolasi tanaman. Metode

pengujian aktivitas antibakteri yang biasa dilakukan adalah metode difusi agar,

dilusi dan turbidimetri. Metode difusi agar dibagi menjadi dua bagian yaitu

metode perforasi (lubang) dan metode gores silang.

a. Metode lubang (perforasi)

Bakteri uji yang umurnya 18-24 jam disuspensikan ke dalam media agar

pada suhu sekitar 45°C. Suspensi bakteri dituangkan ke dalam cawan petri

steril. Setelah agar memadat, dibuat lubang-lubang dengan diameter 6-8 mm.

Kedalam lubang tersebut dimasukkan larutan zat yang akan diuji aktivitasnya

udian diinkubasikan pada suhu 37°C selama 18-24 jam.

Aktivitas antibakteri dapat dilihat dari daerah bening yang mengelilingi lubang

perforasi.

b. Metode gores silang

Zat yang akan diuji diserapkan kedalam kertas saring dengan cara

meneteskan pada cakram kertas kosong larutan antibakteri sejumlah volume

tertentu dengan kadar tertentu juga. Kertas saring diletakkan diatas permukaan

agar padat, kemudian digores dengan suspensi bakteri 90% pada agar

mengenai/melalui kertas saringnya, diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu

37°C. Aktivitas antibakteri dapat dilihat dari daerah bening yang tidak

ditumbuhi bakteri di dekat kertas saring.



commit to user

16

4. Antibiotik

Beberapa infeksi disebabkan oleh bakteri yang secara umum dianggap

patogen tidak menampakkan gejala (asimptomatik). Suatu penyakit terjadi jika

bakteri atau reaksi imunologi yang ditimbulkannya menyebabkan suatu bahaya

bagi seseorang. Maka untuk menghambat daya infeksi agar tidak berkelanjutan

lebih tinggi, bahkan kematian, perlu adanya antibakteri atau antibiotik sebagai

obatnya (Jawetz dkk., 2005).

Antibiotik adalah zat-zat kimia yang dihasilkan oleh fungi dan bakteri

yang memiliki khasiat mematikan atau menghambat pertumbuhan bakteri,

sedangkan toksisitasnya bagi manusia relatif kecil. Antibiotik dapat dibuat dengan

cara fermentasi, semi sintetis dan sintesis. Penggunaan antibiotika khususnya

berkaitan dengan penyakit infeksi.

Amo -laktam dengan spektrum luas,

digunakan untuk pengobatan infeksi pada saluran nafas, saluran empedu dan

saluran seni, gonorhoe, gastroenteritis, meningitis dan infeksi karena Salmonella

sp., seperti demam tipoid (Siswandono dan Soekardjo, 2000). Amoksisilin

mempunyai spektrum antibiotik serupa dengan ampisilin. Beberapa keuntungan

amoksisilin dibanding ampisilin adalah absorbsi obat dalam saluran cerna lebih

sempurna, sehingga kadar darah dalam plasma dan saluran seni lebih tinggi. Efek

terhadap Bacillus dysentery amoksisilin lebih rendah dibanding ampisilin karena

lebih banyak obat yang diabsorbsi oleh saluran cerna (Siswandono dan Soekardjo,

2000). Amoksisilin dapat juga menyebabkan gangguan-gangguan usus dan kulit

tetapi lebih jarang dibandingkan ampisilin (Tjay dan Rahardja, 2002). Struktur

amoksisilin ditunjukkan pada gambar 5.

NH2

NH

O

HO

N

O

H

COOH

Gambar 5. Struktur kimia amoksisilin



commit to user

17

Amoksisilin merupakan turunan dari penisilin semi sintetik dan stabil

dalam suasana asam lambung. Amoksisilin diabsorpsi dengan cepat dan baik pada

saluran pencernaan, tidak tergantung adanya makanan. Amoksisilin terutama

diekskresikan dalam bentuk tidak berubah di dalam urin. Ekskresi Amoksisilin

dihambat saat pemberian bersamaan dengan probenesid sehingga memperpanjang

efek terapi (Siswandono dan Soekardjo, 2000).

Kloramfenikol adalah antibiotik yang dihasilkan oleh Steptomyces

venezuelae (Perlman, 1970). Antibiotik ini mempunyai spektrum kerja seperti

tetrasiklin namun sekarang sudah jarang dipakai. Indikasi kloramfenikol untuk

mengobati tifus, paratifus dan menginitis (Mutschler, 1991). Kloramfenikol

termasuk antibiotik spesifik untuk bakteri gram negatif dan juga masih sensitif

terhadap golongan anaerob. Golongan bakteri yang sensitif terhadap

kloramfenikol adalah Streptococcus, Proteus, Klebsiella, Neiseria.

NO2 CH

OH

HC

CH2OH

NH C

O

CH

Cl

Cl

Gambar 6. Struktur kimia kloramfenikol

Kloramfenikol merupakan penghambat sintesis protein yang kuat pada

mikroorganisme. Obat ini menghalangi pelekatan asam amino pada rantai peptide

yang baru timbul pada unit 50S pada ribosom, dengan mengganggu daya kerja

peptidil transferase. Kloramfenikol pada dasarnya bersifat bakteriostatik,

spektrum, dosis serta kadarnya dalam darah mirip dengan tetrasiklin. Resistensi

kloramfenikol merupakan akibat dari perusakan obat oleh suatu enzim yang

dikendalikan oleh plasmid (Jawetz dkk., 2005).

Kloramfenikol kadang menyebabkan gangguan saluran pencernaan, mual,

muntah. Efek toksin lain yang jarang terjadi adalah terjadi reaksi hipersensitivitas

dan penglihatan yang kabur. Pada pemberian pada jangka waktu yang lama,

kloramfenikol menekan perkembangan sel sumsum tulang dan dapat

menyebabkan anemia aplastik yang bersifat ireversibel dan biasanya fatal.



commit to user

18

Pemberian kloramfenikol pada bayi dapat menyebabkan gray sindrome karena

mekanisme normal detoksifikasi belum terbentuk (Jawetz dkk., 2005)

Antibakteri obat atau senyawa kimia yang digunakan untuk membasmi

bakteri, khususnya bakteri yang merugikan manusia. Berdasarkan sifat toksisitas

selektif, ada antibakteri yang bersifat menghambat pertumbuhan bakteri, dikenal

aktivitas bakteriostatik. Kadar minimal yang diperlukan untuk menghambat

pertumbuhan bakteri atau membunuhnya, masing-masing dikenal dengan Kadar

Hambat Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM). Antibakteri tertentu

aktivitasnya dapat meningkatkan kemampuan bakterisida. Aktivitas antibakteri

dibagi dalam lima kelompok :

a. Antibakteri yang menghambat metabolisme sel bakteri

Pada mekanisme ini diperoleh efek bakteriostatik. Antibakteri yang

termasuk dalam golongan ini adalah sulfonamide, trimetoprim, asam p-

aminosalisilat dan sulfon. Kerja antibakteri ini adalah menghambat

pembentukan asam folat, bakteri membutuhkan asam folat untuk kelangsungan

hidupnya dan bakteri memperoleh asam folat dengan mensintesis sendiri dari

asam para amino benzoat (PABA). Sulfonamid dan sulfon bekerja bersaing

dengan PABA dalam pembentukan asam folat. Sedang trimetoprim bekerja

dengan menghambat enzim dihidrofolat reduktase (Setiabudy dan Gan, 1995).

b. Antibakteri yang menghambat sintesis dinding sel bakteri

Dinding sel bakteri terdiri dari peptidoglikan, sintesis peptidoglikan akan

dihalangi oleh adanya antibiotik seperti penisilin, sefalosporin, basitrasin,

vankomisin, sikloserin. Sikloserin akan menghambat reaksi paling dini dalam

proses sintesis dinding sel sedang yang lainnya menghambat di akhir sintesis

peptidoglikan, sehingga mengakibatkan dinding sel menjadi tidak sempurna

dan tidak mempertahankan pertumbuhan sel secara normal, sehingga tekanan

osmotik dalam sel bakteri lebih tinggi daripada tekanan di luar sel maka

kerusakan dinding sel bakteri akan menyebabkan lisis, yang merupakan dasar

efek bakterisidal pada bakteri yang peka (Setiabudy dan Gan, 1995).



commit to user

19

c. Antibakteri yang mengganggu membran sel bakteri

Sitoplasma dibatasi oleh membran sitoplasma yang merupakan penghalang

dengan permeabilitas yang selektif. Membran sitoplasma akan

mempertahankan bahan-bahan tertentu di dalam sel serta mengatur aliran

keluar-masuknya bahanbahan lain. Jika terjadi kerusakan pada membran ini

akan mengakibatkan terhambatnya pertumbuhan sel atau matinya sel (Pelczar

dkk., 1986).

d. Antibakteri yang menghambat sintesis protein sel bakteri

Kehidupan sel bakteri tergantung pada terpeliharanya molekul-molekul

protein dan asam nukleat dalam keadaan alamiah. Jika kondisi atau substansi

yang dapat mengakibatkan terdenaturasinya protein dan asam nukleat dapat

merusak sel tanpa dapat diperbaiki kembali. Suhu tinggi dan konsentrasi pekat

beberapa zat kimia dapat mengakibatkan koagulasi (denaturasi) yang bersifat

irreversible terhadap komponen-komponen seluler yang vital ini (Pelczar

dkk.,1986).

e. Antibakteri yang menghambat sintesis atau merusak asam nukleat sel bakteri

Protein, DNA, dan RNA berperan penting dalam proses kehidupan normal

sel bakteri. Apabila terjadi gangguan pada pembentukan atau pada fungsi zat-

zat tersebut dapat mengakibatkan kerusakan total pada sel (Pelczar dkk.,1986).

5. Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan Uji Banding

Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) adalah konsentrasi terendah bahan

antimikroba yang masih dapat menghambat partumbuhan mikroba. KHM

merupakan petunjuk konsentrasi antibiotik yang mampu menghambat

pertumbuhan mikroorganisme dan juga memberikan petunjuk mengenai dosis

yang diperlukan dalam pengobatan penyakit. Umumnya batas keamanan

penggunaan antibiotik untuk pengobatan penyakit adalah sepuluh kali dosis KHM

(Lay, 1994).

Nilai banding merupakan kesetaraan aktivitas antibakteri ekstrak yang

diuji dengan antibakteri sintetik. Uji banding bertujuan untuk mengetahui sejauh

mana daya aktivitas antibakteri sampel bila dibandingkan dengan suatu zat



commit to user

20

pembanding. Uji banding suatu zat antibakteri dilakukan dengan cara membuat

suatu grafik atau kurva standar dari zat pembanding, dimana konsentrasi diplotkan

terhadap sumbu-x dan diameter hambatan diplotkan terhadap sumbu-y.

berdasarkan kurva tersebut dapat diperoleh konsentrasi sampel pada diameter

hambatan yang dihasilkan dan nilai diameter hambatan sampel pada konsentrasi

yang ditetapkan, sehingga dapat ditetapkan nilai uji banding sampel terhadap zat

pembanding, yaitu dengan menggunakan rumus sebagai berikut :

%100xsebenarnyasampeliKonsentras

kurvadarisampeliKonsentrasbandingujiNilai

6. Ekstraksi

Ekstraksi dilakukan untuk mengisolasi komponen senyawa kimia yang

terdapat dalam suatu tumbuhan. Suirta dkk. (2007) melakukan ekstraksi dengan

metode maserasi serbuk biji mimba menggunakan pelarut etanol teknis sampai

semua komponen habis terekstraksi. Selanjutnya ekstrak etanol yang diperoleh

diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak

kental etanol.

Sokletasi terhadap daun mimba pernah dilakukan Biu dkk. (2009)

menggunakan air suling pada suhu 60ºC selama 8 jam. Ekstrak kemudian

diletakkan pada nampan aluminium dan disimpan pada suhu kamar (27ºC).

7. Skrining Fitokimia

Tujuan penapisan fitokimia sendiri adalah untuk mengetahui kandungan

senyawa suatu tumbuhan yang berguna untuk pengobatan (Fransworth, 1966).

Senyawa-senyawa tersebut adalah senyawa organik, oleh karena itu penapisan

fitokimia biasanya dilakukan terhadap alkaloid, flavonoid, antrakuinon, terpenoid,

kumarin, saponin, tanin (polifenolat), dan sebagainya.

Skrining fitokimia uji tabung telah dilakukan oleh Biu dkk. (2009)

terhadap golongan senyawa terpenoid, flavonoid, alkaloid, saponin, tanin.

Senyawa alkaloid dideteksi dengan menggunakan pereaksi Dragendorrf, terpenoid

dengan pereaksi Liberman-Buchard, flavonoid dengan uji Pew, saponin dengan



commit to user

21

uji buih, dan tanin dideteksi dengan pereaksi FeCl3. Analisis kandungan senyawa

dalam fraksi ekstrak metanol kulit kayu mimba dilakukan dengan uji fitokimia

KLT menggunakan plat KLT silika GF254. Deteksi senyawa dilakukan dengan

reagen penampak noda yang spesifik untuk masing-masing senyawa,selain itu

juga diamati pada lampu UV 254 nm dan 366 nm (Muhtadi, 2008).

8. Kromatografi Vakum Cair (KVC)

Teknik pemisahan dengan KVC sering digunakan untuk memisahkan

fraksi bersasarkan tingkat kepolarannya. Pemisahan ini biasanya dilakukan pada

tahap awal pemisahan, misalnya pemisahan terhadap ekstrak mentah yang

diperoleh langsung dari proses ekstraksi.

Contoh penggunaan metode pemisahan KVC adalah pemisahan ekstrak

metanol kulit kayu mimba menggunakan fase diam silika gel GF254. Caranya

adalah ekstrak metanol kulit kayu mimba dilarutkan dalam aseton secukupnya dan

diimpregnasi ke dalam siliki G60 (30 mesh-70 mesh). Kemudian sampel yang

telah diimpregnasi dimasukkan ke dalam kolom KVC dan dielusi dimulai dengan

pelarut heksana-etil asetat dengan perbandingan 1:1, 4:6, 2:8, etil asetat 100%,

dan metanol-etil asetat 8-2. Masing-masing fraksi ditampung sebanyak 150 mL,

dan setelah dipekatkan, dilakukan analisa KLT menggunakan plat KLT silika

GF254 untuk dilakukan penggabungan fraksi-fraksi yang memiliki kromatogram

yang sama. Fraksi-fraksi yang diperoleh dilakukan pengujian aktivitas

antiplasmodium (Muhtadi, 2008).

9. Kromatografi Gas-Spektrometer Massa(GC-MS)

Kromatografi gas berfungsi sebagai alat pemisah berbagai campuran

komponen dalam sampel sedangkan spektrofotometer massa berfungsi untuk

mendeteksi masing-masing komponen yang telah dipisahkan pada kromatografi

gas (Agusta, 2000).

Aromdee dan Sriubolmas (2005) pernah menggunakan GC-MS untuk

mengidentifikasi kandungan senyawa yang ada dalam minyak atsiri dari bunga

mimba. Kolom yang digunakan memiliki panjang 30 m dengan diameter 2,5 mm



commit to user

22

adalah 40ºC dan setelah 5 menit suhu dinaikkan 3ºC/menit sampai suhu 250ºC

dan pada suhu 250ºC ini suhu dipertahankan selama 10 menit. Gas pembawa yang

digunakan adalah gas helium dengan tekanan 50 Kpa dan detektor MS

dioperasikan pada 70 eV dengan temperatur sumber ion 250ºC. Sedangkan

identifikasi komponennya dilakukan dengan membandingkan dengan standar

library NIST dan nilai indeks retensi linear (Davies, 1990).

B. Kerangka Pemikiran

Tanaman mimba (Azadirachta indica A. Juss) merupakan salah satu

tanaman obat tradisional. Daun mimba dapat dimanfaatkan untuk penambah nafsu

makan, disentri, borok, malaria, dan antibakteri. Daun mimba diketahui

mengandung senyawa golongan terpenoid, flavonoid, alkaloid, saponin, tanin,

asam lemak, steroid dan triterpenoid. Dari berbagai penelitian dikatahui bahwa

ekstrak daun mimba mampu menghambat bakteri yang menyebabkan infeksi pada

kulit, mulut, saluran pencernaan, saluran pernafasan, dan saluran kencing.

Berdasarkan hal tersebut diperkirakan fraksi daun mimba mampu menghambat

pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, dan Shigella

flexneri.


menyebabkan penyakit melalui kemampuannya berkembang biak dan menyebar

luas dalam jaringan. Bakteri ini terdapat pada kulit, selaput lendir, bisul, jerawat

dan luka. Bacillus cereus merupakan bakteri gram positif yang dapat tumbuh pada

makanan dan menghasilkan enterotoksin yang menyebabkan keracunan makanan.

Bakteri ini kadang-kadang dapat menyebabkan penyakit meningitis, endokarditis,

endoftalmitis, konjugtivis atau gastroenteritis akut. Shigella flexneri merupakan

bakteri yang menyebabkan penyakit disentri basiler, yaitu suatu penyakit yang

ditandai dengan peradangan usus, terutama kolon dan disertai nyeri perut,

tenesmus dan buang air besar yang sering mengandung darah dan lendir.

Senyawa-senyawa antibakteri dalam daun mimba dapat diisolasi dengan

maserasi menggunakan pelarut etanol. Namun kandungan senyawa yang terdapat



commit to user

23

dalam ekstrak etanol masih sangat kompleks. Oleh karena itu perlu dilakukan

pemisahan menggunakan pelarut dengan kepolaran yang semakin meningkat.

Pemisahan dilakukan dengan metode kromatografi vakum cair dan pelarut yang

digunakan berturtut-turut adalah heksana, etil asetat, dan etanol. Pemisahan

tersebut menyebabkan senyawa-senyawa yang terdapat dalam ekstrak etanol

terpisah ke dalam masing-masing fraksi hasil pemisahan dan mempengaruhi

aktivitas antibakteri masing-masing fraksi. Dalam hal ini etil asetat merupakan

pelarut semi polar sehingga dia dapat menarik senyawa-senyawa metabolit

sekunder yang bersifat polar ataupun non polar, sehingga fraksi etil asetat

diperkirakan memiliki aktivitas antibakteri yang paling tinggi.

Berdasarkan sifat kepolaran senyawa-senyawa kimia yang terdapat dalam

daun mimba diperkirakan bahwa fraksi teraktif antibakteri daun mimba

mengandung senyawa tanin, terpenoid, steroid, dan asam lemak. Terpenoid,

steroid, dan asam lemak merupakan senyawa-senyawa non polar, sehingga

diperkirakan dapat tertarik oleh etil asetat yang bersifat semi polar. Tanin

merupakan senyawa polar dan diketahui kandungannya dalam daun mimba cukup

tinggi.

Potensi antibakteri suatu bahan alam dapat diketahui dengan

membandingkan aktivitas antibakterinya dengan antibiotik sintesis. Amoksisilin

merupakan antibiotik sintetis yang berspektrum luas, sedangkan kloramfeniko l

merupakan antibiotik sintesis yang digunakan untuk mengobati infeksi saluran

pencernaan. Beberapa penelitian mengenai aktivitas antibakteri dari bahan alam

disebutkan bahwa potensi antibakteri bahan alam lebih kecil dibandingkan dengan

antibiotik sintesis.

C. Hipotesis

1. Fraksi daun mimba hasil pemisahan dengan KVC mempunyai aktivitas

antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, dan

Shigella flexneri dan fraksi teraktif antibakteri daun mimba adalah fraksi etil

asetat.



commit to user

24

2. Potensi antibakteri fraksi teraktif antibakteri daun mimba lebih kecil

dibandingkan dengan amoksisilin dan kloramfenikol.

3. Komponen kimia yang terkandung dalam fraksi teraktif antibakteri daun

mimba adalah tanin, terpenoid, steroid dan asam lemak.



commit to user

25

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode eksperimental di

laboratorium. Tahap pertama adalah pembuatan serbuk simplisia sampel. Serbuk

simplisia sampel dimaserasi dengan menggunakan pelarut etanol. Ekstrak etanol

kemudian dipisahkan dengan menggunakan kolom Kromatografi Vakum Cair

(KVC) menggunakan eluen dengan tingkat kepolaran semakin meningkat, yaitu

heksana, etil asetat dan etanol.

Fraksi-fraksi yang diperoleh kemudian dilakukan pengujian aktivitas

antibakteri. Fraksi yang memiliki aktivitas antibakteri yang paling tinggi

kemudian dilakukan uji golongan senyawa dengan uji tabung lalu ditegaskan

dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan analisis data Gas Chromatography-

Mass Spectroscopy (GC-MS). Penentuan potensi aktivitas antibakteri fraksi

teraktif antibakteri dilakukan dengan mencari nilai Konsentrasi Hambat Minimum

(KHM) fraksi dan nilai banding fraksi terhadap amoksisilin dan kloramfenikol.

B. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia Dasar FMIPA Universitas

Sebelas Maret, Sub. Lab. Biologi Laboratorium Pusat Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta selama bulan November

2010 – Juli 2011.

C. Alat dan Bahan

1. Alat

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah blender, neraca timbang

(Denver INST.TL603D dan Mettler Toledo AT400), vacuum rotary evaporator

(Bibby RE 200B), statif dan klem, kolom Kromatografi Vacum Cair (KVC),

penyaring Buchner, penangas air, lumping porselen, selang, heating mantle (J.P.

SELETA., s.a), selang air, water pump, hotplate-stirer (RCT Basic Labortechnik),



commit to user

26

oven (Memmert Model 500), autoklaf (Presoclave 75 P-Selecta), perforator

diameter 6 mm, cawan petri, jarum ose, pembakar spirtus, spatula logam, laminar

air flow (Minihelik II, dwyer), mikropipet 10- hand mixer (Vortex mixer

VM 300), incubator (Hotcold M P-Selecta), bejana KLT, botol semprot, lemari

asam, pipa kapiler, UV (PUV/BDH), GC-MS (QP2010S SHIMADZHU) dan

peralatan gelas lainnya yang biasa digunakan dilaboratorium.

2. Bahan

a. Bahan yang Diteliti

Bahan yang diteliti adalah daun mimba yang berasal dari Klaten, Jawa Tengah.

b. Bahan-Bahan yang Digunakan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain etanol 96%, heksana

(redestilasi), etil asetat (redestilasi), aseton teknis, akuades, silika GF254, silika

adsorb G60, plat KLT silika GF254 (E. Merck), metanol (pro analisis), H2SO4

pekat, asam formiat (pro analisis), asam asetat glasial (pro analisis), serbuk

AlCl3, HCL 2M, serbuk NaCl, toluen (pro analisis), dietil amin (pro analisis),

serbuk Bismuth nitrat, serbuk KI, Iodin, dietil eter (pro analisis), serbuk SbCl3,

kloroform (pro analisis), etanol absolute (pro analisis),serbuk FeCl3, serbuk

KOH, benzena (pro analisis), Nutrien Agar (E. Merck), Amoksisilin,

Kloramfenikol, Dimetil Sulfoksida (DMSO), dan buffer phospat pH 7 (Merck),

dan alkohol 70%.

c. Bakteri Uji

Bakteri uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah Staphylococcus

epidermidis, Bacillus cereus, dan Shigella flexneri yang diperoleh dari

Universitas Setiabudi, Surakarta.

D. Prosedur Penelitian

1. Identifikasi Sampel

Daun mimba diperoleh dari Klaten, Jawa Tengah. Daun mimba

sebelumnya diidentifikasi di Bagian Biologi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah

Mada.



commit to user

27

2. Preparasi dan Ekstraksi Sampel

Daun mimba yang sudah kering dihaluskan dengan blender untuk

memberoleh simplisia serbuk. Kemudian serbuk daun mimnba dimaserasi dengan

pelarut etanol selama 3x24 jam. Ekstrak etanol yang diperoleh selanjutnya

diuapkan dengan vacuum rotary evaporator dengan suhu 50ºC sampai diperoleh

ekstrak pekat etanol.

3. Pengujian Golongan Senyawa Ekstrak Etanol

Skrining fitokimia terhadap ekstrak etanol dilakukan dengan uji tabung

dan uji secara KLT. Skrining fitokimia dilakukan terhadap alkaloid, flavonoid,

terpenoid dan steroid, antrakuinon, saponin, tanin(polifenolik), dan asam lemak.

Metode skrining uji tabung yang digunakan berdasarkan Pedrosa (1978),

Harborne (1987), dan Sofiana (2009).

a. Alkaloid

Ekstrak diambil sebanyak 20 mg, ditambah dengan HCL 2M, dipanaskan

diatas penangas air sambil diaduk, kemudian didinginkan hingga suhu ruang.

NaCl serbuk ditambahkan, diaduk, dan disaring, kemudian filtrat ditambah HCl

2M sampai volume tertentu. Filtrat dibagi dalam 2 tabung reaksi, tabung 1

ditambah reagen wagner dan tabung lainnya sebagai blangko. Tabung 1

diamati terbentuknya endapan dan dibandingkan dengan larutan blangko pada

tabung satunya. Jika tidak terbentuk endapan, berarti bahan tidak mengandung

alkaloid dan jika terbentuk endapan berarti bahan mengandung alkaloid.

b. Flavonoid

Sebanyak 0,3 g ekstrak ditambah dengan methanol 30%, kemudian

dipanaskan selama kurang lebih 5 menit. Larutan disaring dan filtrat ditambah

dengan larutan H2SO4. Terbentuknya warna merah mengindikasikan adanya

flavonoid.

c. Terpenoid dan Steroid

0,1 g ekstrak ditambah dengan 5 mL etanol 30%, lalu dipanaskan selama 5

menit. Larutan disaring dan filtrat yang diperoleh diuapkan. Kemudian filtrat

ditambah dengan eter. Lapisan eter diambil dan ditambah dengan Liberman



commit to user

28

Buchard. Terpenoid dan steroid menunjukkan hasil positif jika terbentuk warna

merah sampai ungu atau hijau.

d. Antrakuinon

Ekstrak ditambah 5 mL H2SO4 2 N, lalu dipanaskan sebentar dan

didinginkan. Kemudian ditambahkan 10 ml benzene, dikocok dan didiamkan.

Lapisan benzene dipisahkan dan disaring. Filtrat berwarna kuning

menunjukkan adanya antrakuinon.

e. Saponin

Ekstrak diambil sebanyak 0,1 g, lalu ditambah dengan 5 mL akuades dan

dipanaskan selama kurang lebih 5 menit. Kemudian larutan dikocok dan

didiamkan. Jika terbentuk buih yang stabil setinggi kurang lebih 1 cm dan jika

ditambah HCl buih tetap stabil maka bahan mengandung saponin.

f. Tanin(Polifenolik)

0,1 g ekstrak ditambah dengan 5 mL akuades, kemudian didihkan selama 5

menit. Larutan disaring dan filtrat yang diperoleh ditetesi dengan FeCl3 1%.

Jika terbentuk warna biru tua sampai kehitaman berarti bahan mengandung

senyawa tanin(polifenolik).

g. Asam Lemak

5 mL ekstrak diuapkan sampai kering, lalu ditambahkan 5 mL KOH 0,5 N

dalam etanol, direfluks sehingga tidak terlihat tetesan minyak pada permukaan

cairan. Etanol dihilangkan dengan cara dipanaskan pada suhu 80ºC. sisa

dilarutkan dalam air panas dan diekstraksi dengan eter 2x10 mL. Fraksi air

diasamkan dengan HCl dan diekstrak lagi dengan eter. Ekstrak eter diuapkan,

jika sisa berminyak maka mengandung asam lemak.

Uji KLT menggunakan plat silika gel F254 (E. Merck). Ekstrak ditotolkan

pada plat dan dielusi dengan larutan pengembang tertentu, selanjutnya disemprot

dengan reagen spesifik dan bercak diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan

UV 365 nm. Uji KLT yang digunakan berdasarkan metode Wagner (1983) dan

Harborne (1996). Uji KLT hanya dilakukan terhadap golongan senyawa yang

mempunyai hasil positif terhadap uji tabung.



commit to user

29

a. Alkaloid

Larutan pengembang yang digunakan adalah toluena : etil asetat : dietil

amin (7 : 2 : 1). Plat kemudian dideteksi dengan reagen penyemprot pereaksi

Dragendorrf. Kemudian plat diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan UV

365 nm. Alkaloid akan memberikan warna coklat dibawah sinar tampak dan

pada UV 365 nm akan memberikan warna fluorosens kuning atau biru.

b. Terpenoid dan Steroid

Larutan pengembang yang digunakan untuk analisa terpenoid dan steroid

adalah heksana : etil asetat (95% : 5%). Plat kemudian dideteksi dengan reagen

penyemprot SbCl3 dalam kloroform untuk steroid dan Liberman Buchard untuk

terpenoid. Terpenoid dan steroid akan memberikan warna ungu jika diamati

pada cahaya tampak dan dibawah sinar UV 254 nm.

c. Antrakuinon

Larutan pengembang yang digunakan adalah etil asetat : metanol : air (100

: 13,5 : 10). Plat dikeringkan kemudian disemprot dengan pereaksi KOH

etanolik 5%. Selanjutnya plat diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan

UV 365 nm. Antrakuinon akan memberikan warna kuning pada cahaya tampak

dan fluorosens kuning jika diamati pada UV 365 nm.

d. Tanin(Polifenolik)

Fase gerak yang digunakan adalah etil asetat : metanol : air (100: 13,5 :

10). Deteksi menggunakan reagen penyemprot FeCl3 1%. Kemudian plat

diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm.

e. Asam Lemak

Uji asam lemak menggunakan eluen benzene : dietil eter (95% : 5%).

Deteksi asam lemak menggunakan reagen penyemprot 0,5 % rodamin B

dalam etanol. Kemudian plat diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan

UV 365 nm. Asam lemak akan memberikan warna ungu pada UV 254 nm dan

365 nm.



commit to user

30

4. Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol

Ekstrak etanol dibuat konsentrasi tertentu dengan pelarut dimetil

sulfoksida (DMSO). Pengujian menggunakan metode difusi agar yaitu metode

perforasi dengan tahap kerja sebagai berikut :

a. Sterilisasi alat

Alat-alat yang akan digunakan untuk uji aktivitas antibakteri disterilkan

dalam autoklaf dengan suhu 121ºC selama kurang lebih 20 menit.

b. Pembuatan media agar miring

Sebanyak 1 g NA (Nutrien Agar) dilarutkan dalam 50 mL akuades, lalu

larutan tersebut dipanaskan dan distirrer diatas hotplate-stirrer sampai larutan

menjadi kuning bening. Kemudian sebanyak 5 mL larutan NA tersebut

dimasukkan ke dalam tabung reaksi, tabung reaksi tersebut ditutup dengan

kapas dan aluminium foil, kemudian distrelisasi pada suhu 121ºC selama 20

menit. Selanjutnya tabung reaksi diletakkan ditempat yang miring dan

dibiarkan memadat pada suhu kamar.

c. Pembuatan biakan bakteri

Sebanyak 1 ose bakteri uji digoreskan pada media agar miring dengan pola

zig zag. Proses ini dilakukan dalam keadaan steril pada ruang isolasi yang telah

disinari dengan sinar UV. Biakan diinkubasi selama kurang lebih 18 sampai 24

jam pada suhu 37ºC.

d. Pembuatan suspensi bakteri uji

Sebanyak 1 ose bakteri dimasukkan kedaalam tabung reaksi yang telah

diisi dengan 3 mL akuades steril.

e. Pengujian aktivitas antibakteri

Sebanyak 3 g NA (Nutrien Agar) dilarutkan dalam 150 mL akuades, lalu

larutan tersebut dipanaskan dan distirrer diatas hotplate-stirrer sampai larutan

menjadi kuning bening. larutan NA tersebut disterilisasi pada suhu 121ºC

kedalam cawan petri steril, kemudian ditambahkan 15 mL larutan NA steril.

Cawan petri digoyang supaya bakteri dan larutan NA tarcampur rata dan

didiamkan sampai agar memadat. Setelah agar membeku, dibuat lubang



commit to user

31

sampel yang telah dibuat konsentrasi tertentu menggunakan pelarut DMSO.

Langkah ini dilakukan 3 kali pengulangan, kemudian cawan petri dibungkus

dengan kertas dan diinkubasi dalam inkubator selama 18-24 jam pada suhu

37ºC. Setelah itu diameter daerah hambat diukur menggunakan jangka sorong.

Diameter daerah hambat ini ditunjukkan dengan daerah bening disekitar lubang

yang berisi sampel.

5. Pemisahan Ekstrak Etanol

Pemisahan ekstrak pekat etanol dilakukan dengan menggunakan

Kromatografi Vakum Cair (KVC). Kolom KVC yang digunakan memiliki

diameter 6 cm. Sebelum dilakukan pemisahan, perlu dilakukan persiapan kolom

KVC dan persiapan sampel. Sebanyak 35 g silika Gel F254 dimasukkan kedalam

kolom KVC, silika tersebut dipadatkan dengan cara divakum dan ditekan-tekan.

Sebanyak 5 g sampel dilarutkan dengan aseton, lalu diimpregnasi dengan silika

adsorb G60 sebanyak 10 g sampai tercmpur rata. Setelah homogen sampel

dibiarkan beberapa saat sampai kering. Proses ini diulangi sebanyak 5 kali untuk

memaksimalkan hasil rendemen.

Sampel yang sudah kering selanjutnya dimasukkan kedalam kolom KVC

yang sebelumnya telah diisi dengan silika Gel F254. Kemudian sampel dielusi

dengan menggunakan pelarut heksana, etil asetat dan etanol secara berurutan.

Eluen yang digunakan sebanyak 200 mL heksana, 200 mL etil asetat, dan 200 mL

etanol.

Fraksi-fraksi yang diperoleh dari hasil pemisahan kemudian diuapkan

pelarutnya menggunakan vacum rotary evaporator dengan suhu kurang lebih

50ºC. Sehingga diperoleh fraksi pekat heksana, fraksi pekat etil asetat,dan fraksi

pekat etanol.



commit to user

32

6. Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi-Fraksi Hasil Pemisahan KVC

a. Uji aktivitas antibakteri fraksi-fraksi hasil KVC

Fraksi-fraksi hasil KVC dilakukan pengujian aktivitas antibakteri

menggunakan tahapan kerja seperti pada pengujian aktivitas antibakteri ekstrak

etanol untuk mendapatkan fraksi teraktif antibakteri.

b. Penetapan KHM fraksi teraktif antibakteri

Penetapan KHM dilakukan untuk mengetahui konsentrasi terkecil sampel

uji yang masih bisa menghambat pertumbuhan bakteri uji. Penetapan KHM ini

dilakukan dengan metode yang sama dengan pengujian aktivitas antibakteri,

yaitu dengan melakukan variasi konsentrasi sampel. Penetapan KHM

dilakukan terhadap fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi.

c. Penetapan KHM pembanding

Pembanding yang digunakan adalah amoksisilin dan kloramfenikol

dengan perlakuan yang sama dengan sampel uji. Tetapi dalam pengenceran

Amoksisilin digunakan buffer fosfat pH 7, sedangkan kloramfenikol

menggunakan DMSO dalam pengencerannya.

7. Pengujian Golongan Senyawa Fraksi Teraktif Antibakteri

Pengujian golongan senyawa dalam fraksi teraktif antibakteri dilakukan

dengan metode yang sama dengan ekstrak etanol.

8. Kromatografi Gas-Spektrofotometer Massa (GC-MS)

Analisis GC-MS dilakukan untuk mengidentifikasi komponen kimia fraksi

teraktif antibakteri daun mimba. Kondisi alat GC-MS adalah sebagai berikut :

Jenis pengion : EI (Electron Impact)

Jenis kolom : Rastex RXi-5MS

Panjang kolom : 30 meter

Diameter kolom : 0,25 milimeter

Suhu kolom : 60°C

Suhu injektor : 310°C



commit to user

33

E. Teknik Pengumpulan dan Analisis Data

Penelitian ini akan dihasilkan berbagai data. Pada tahap pengujian

aktivitas antibakteri ekstrak, fraksi-fraksi, amoksisilin, dan kloramfenikol akan

diperoleh data diameter hambat untuk masing-masing bakteri uji pada berbagai

konsentrasi tertentu. Dari uji aktivitas antibakteri ini dapat diketahui fraksi mana

yang mempunyai aktivitas antibakteri paling tinggi terhadap bakteri uji, yaitu

didasarkan dari perolehan data diameter hambat. Fraksi yang mempunyai aktivitas

antibakteri paling tinggi tersebut kemudian dilakukan uji penentuan KHM

(Konsentrasi Hambat Minimum) dan uji banding. Selanjutnya fraksi tersebut

dianalisis dengan uji tabung dan KLT (Kromatografi Lapis Tipis) dan GC-MS

(Kromatografi Gas-Spektroskopi Massa).

Pada penentuan konsentrasi hambat minimum diperoleh data nilai KHM.

Pada uji banding potensi fraksi terhadap standar amoksisilin dan kloramfenikol

diperoleh nilai potensi fraksi terhadap ketiga bakteri uji. Pada analisis KLT

diperoleh golongan senyawa pada fraksi teraktif. Pada analisis GC-MS akan

diperoleh data berupa kromatogram GC yang akan diperoleh informasi jumlah

senyawa yang terdeteksi dan persentase komponen senyawa sedangkan dari MS

akan dilakukan analisis data untuk menentuka struktur senyawa dengan

membandingkan dengan data sekunder dari literatur. Data-data diameter hambat

dan variasi kosentrasi hasil pengujian aktivitas antibakteri dilakukan analisa

menggunakan One Way ANOVA.



commit to user

34

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Identifikasi Sampel

Identifikasi tanaman mimba yang berasal dari daerah Klaten, Jawa Tengah

dilakukan di Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada.

Hasil identifikasi menunjukkan bahwa sampel yang digunakan adalah

Azadirachta indica A. Juss. Hasil determinasi dapat dilihat pada Lampiran 2.

B. Preparasi dan Ekstraksi Sampel

Daun mimba yang sudah kering dilakukan penyerbukan dengan blender,

sehingga diperoleh bentuk serbuk. Luas permukaan simplisia dalam bentuk serbuk

lebih luas, sehingga memungkinkan interaksi antara sampel dengan pelarut lebih

banyak dan senyawa yang terekstrak lebih banyak. Kemudian sebanyak 1,23 kg

serbuk daun mimba dimaserasi selama 3x24 jam menggunakan pelarut etanol

96% sebanyak 560 mL. Maserasi merupakan salah satu metode ekstraksi dengan

cara perendaman sampel dalam waktu tertentu. Pada proses ini pelarut akan

menembus dinding sel sampel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung

senyawa aktif. Hal ini terjadi karena perbedaan konsentrasi senyawa aktif di

dalam sel dan di luar sel. Larutan terpekat didesak keluar sel (Anonim, 1986).

Penggunaan etanol sebagai pelarut karena alkohol merupakan pelarut universal

yang baik untuk mengekstraksi semua golongan senyawa metabolit sekunder

(Kristanti, 2008). Kemudian ekstrak etanol yang diperoleh diuapkan pelarutnya

menggunakan vacuum rotary evaporator dengan suhu 50ºC, sehingga diperoleh

eksrak pekat etanol sebanyak 58,182 g dengan rendemen 4,73%. Perhitungan

rendemen dapat dilihat pada Lampiran 3.

C. Pengujian Golongan Senyawa Ekstrak Etanol

Proses identifikasi senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam

ekstrak etanol dilakukan dengan skrining fitokimia. Skrining fitokimia ekstrak

etanol yang dilakukan dapat memberikan informasi mengenai ada tidaknya



commit to user

35

senyawa metabolit sekunder dalam daun mimba yang berpotensi sebagai zat

antibakteri.

Skrining fitokimia dilakukan dengan uji tabung dan uji penegasan KLT.

Uji penegasan KLT hanya dilakukan terhadap senyawa metabolit sekunder yang

memberikan hasil positif terhadap uji tabung. Hasil skrining fitokimia dapat

dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Hasil Skrining Fitokimia (Uji Tabung) Ekstrak Etanol

No. Kandungan Senyawa

Hasil Uji Teori Kesimpulan

1. Alkaloid Warna orange dan Terbentuk endapan

Terbentuknya suatu endapan1)

+

2. Flavonoid Warna hijau kehitaman

Warna merah2) -

3. Trepenoid dan Steroid Warna Hijau Warna merah, ungu

atau hijau2) +

4. Saponin Tidak terbentuk buih Adanya buih yang stabil setinggi ±1 cm2) -

5. Tanin(Polifenolik) Warna biru kehitaman Biru tua, hitam2) +

6. Antrakuinon Warna kuning keruh Warna kuning3) + 7. Asam Lemak Sisa berminyak Sisa berminyak2) +

Keterangan : (+) = Ada golongan senyawa kimia 2) = Harborne (1987) (-) = Tidak ada golongan senyawa kimia 3) = Sofiana (2009)

1) = Pedrosa (1978)

Hasil skrining fitokimia uji tabung menunjukkan bahwa ekstrak etanol

mengandung senyawa metabolit sekunder alkaloid, terpenoid, steroid,

tanin(polifenolik), antrakuinon, dan asam lemak. Selanjutnya senyawa-senyawa

tersebut dilakukan uji penegasan KLT menggunakan eluen yang sesuai dan

disemprot dengan reagen penyemprot yang spesifik untuk masing-masing

senyawa. Hasil skrining fitokimia uji penegasan KLT dapat dilihat pada Tabel 2.



commit to user

36

Tabel 2. Hasil Skrining Fitokimia (Uji KLT) Ekstrak Etanol Setelah Dideteksi dengan Pereaksi Spesifik

No.

Kandungan Senyawa

Rf Sinar Tampak UV254 UV365 Kesimpulan Hasil Teori Hasil Teori Hasil Teori

1. Alkaloid 0,88 Tidak terlihat

Coklat, orange1)

- - Fluoresens biru

Fluoresens kuning/biru1) +

2. Terpenoid 0,18 Ungu Ungu2) - - - - + 3. Steroid 0,16 Ungu Ungu2) - - - - +

4. Tanin (Polifenolik)

0,9 Hijau

Hijau, merah, ungu, biru1)

- - - - +

5. Antrakuinon 0,48 Kuning Kuning1) Ungu Flouresens1) - - +

6. Asam

Lemak

0,12 0,31 0,53

- - Ungu Ungu2) Ungu Ungu2) +

Keterangan : (+) = Ada golongan senyawa kimia 1) = Wagner (1983) (-) = Tidak ada golongan senyawa kimia 2) = Harborne (1996)

Hasil skrining fitokimia uji penegasan KLT menunjukkan bahwa di dalam

ekstrak etanol mengandung senyawa metabolit sekunder alkaloid, terpenoid,

steroid, tanin(polifenolik), antrakuinon, dan asam lemak. Beberapa hasil yang

diperoleh ini sama dengan hasil skrining fitokimia ekstrak etanol daun mimba

yang dilakukan oleh Aslam dkk. (2009), dan yang sebelumnya dilakukan oleh

Nugraheni (2007).

D. Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol

Ekstrak etanol hasil maserasi dilakukan pengujian aktivitas antibakteri.

Pengujian aktivitas antibakteri ini bertujuan untuk mengetahui potensi antibakteri

ekstrak etanol awal terhadap bakteri yang digunakan sebelum dilakukan langkah

selanjutnya. Pengujian dilakukan terhadap beberapa konsentrasi dengan

menggunakan metode difusi agar khususnya perforasi. Konsentrasi dibuat dengan

mengencerkan ekstrak dalam DMSO (Dimetil Sulfoksida) dan konsentrasi yang

digunakan adalah 100%, 75%, 50%, dan 25%. Digunakannya DMSO sebagai



commit to user

37

pelarut dikarenakan DMSO mampu melarutkan ekstrak dengan sempurna. Selain

itu DMSO juga tidak mempunyai daya antibakteri terhadap bakteri uji yang

digunakan, sehingga tidak mempengaruhi hasil uji antibakteri (Kustyaningsih,

2004). Bakteri yang digunakan pada penelitian ini adalah Staphylococcus

epidermidis, Bacillus cereus, dan Shigella Flexneri.

Hasil uji menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun mimba mampu

menghambat pertumbuhan ketiga bakteri uji. Hasil pengujian aktivitas antibakteri

dapat dilihat pada Tabel 3, sedangkan hasil pengujian selengkapnya ditunjukkan

pada Lampiran 4. Kemampuan suatu zat antibakteri dalam menghambat ataupun

membunuh bakteri tergantung pada konsentrasi zat antibakteri (Schlegel dan

Schmidt, 1994). Semakin besar konsentrasi zat antibakteri maka semakin besar

juga daerah hambat pertumbuhan bakteri.

Tabel 3. Hasil Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol

Konsentrasi (g/mL)

Diameter Daerah Hambat Rata-Rata (mm) S. epidermidis B. cereus S. Flexneri

100 14,02±0,19 14,61±0,05 14,41±0,11 75 13,66±0,09 14,36±0,10 14,08±0,10 50 13,45±0,04 13,97±0,16 13,60±0,30 25 13,05±0,27 13,04±0,34 12,58±0,39

Keterangan : Diameter lubang = 6 mm

Dari hasil pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol selanjutnya

dilakukan analisis data statistik untuk mengetahui secara pasti apakah terdapat

perbedaan aktivitas antibakteri yang nyata diantara keempat konsentrasi ekstrak

etanol diatas. Metode analisa yang digunakan adalah metode One Way ANOVA.

Data hasil analisa dapat dilihat pada Lampiran 5. Hasil uji ANOVA menunjukkan

bahwa terdapat pengaruh variasi bakteri terhadap penghambatan bakteri uji untuk

konsentrasi 100%, 75%, dan 50% karena sig < 0,05. Sedangkan pada konsentrasi

25% variasi bakteri tidak berpengaruh terhadap penghambatan bakteri uji.

Selanjutnya untuk mengetahui perbedaan aktivitas antibakteri antar bakteri

dilakukan analisa LSD. Hasil analisa LSD disimpulkan bahwa pada konsentrasi

100% bakteri S. epidermidis menunjukkan perbedaan aktivitas yang nyata



commit to user

38

terhadap semua bakteri uji, sedangkan B. cereus dan S. flexneri hanya

menunjukkan perbedaan aktivitas yang nyata terhadap bakteri S. epidermidis saja.

Pada konsentrasi 75% bakteri S. epidermidis, B. cereus, dan S. flexneri

menunjukka perbedaan aktivitas yang nyata terhadap semua bakteri uji. Pada

konsentrasi 50% hanya S. flexneri yang tidak menunjukkan perbedaan aktivitas

yang nyata terhadap semua bakteri uji, sedangkan B. cereus menunjukka

perbedaan aktivitas yang nyata terhadap S. epidermidis, begitu juga sebaliknya.

Pada konsentrasi 25% bakteri S. epidermidis, B. cereus, dan S. Flexneri

mempunyai pengaruh yang beda terhadap semua bakteri uji.

E. Pemisahan Ekstrak Etanol

Berdasarkan hasil uji antibakteri ekstrak etanol, diketahui bahwa ekstrak

etanol daun mimba dapat menghambat ketiga bakteri uji, sehingga daun mimba

bisa dikembangkan sebagai antibiotik baru. Namun kandungan senyawa ekstrak

etanol masih terlalu kompleks, sehingga perlu dilakukan pemisahan untuk

mengetahui zat-zat yang aktif sebagai antibakteri. Pemisahan dilakukan dengan

KVC (Kromatografi Vakum Cair). KVC merupakan kromatografi yang

dimodifikasi dengan pompa vakum untuk mempercepat proses elusi.

Dalam penelitian ini digunakan perbandingan antara sampel dengan fase

diam adalah 1 : 7. Sebanyak 5 g sampel dilarutkan dengan aseton, kemudian

diimpregnasi dengan silika adsorb G60 sebanyak 10 g dan dibiarkan sampai

kering. Selanjutnya sampel dimasukkan pada bagian atas fase diam yang telah

dipadatkan. Fase diam yang digunakan disini adalah silika GF254 dan jumlah yang

digunakan adalah 35 g. Pemisahan dilakukan sebanyak 5 kali, sehingga jumlah

total sampel yang dipisahkan adalah 25 g.

Eluen yang digunakan untuk mengelusi sampel adalah heksana, etil asetat,

dan etanol. Proses elusi dimulai dengan eluen yang paling non polar sampai polar

dan setiap fraksi yang diperoleh ditampung (Hostettman dkk ., 1986). Eluen yang

digunakan adalah 200 mL heksana, 200 mL etil asetat, dan 200 mL etanol. Hasil

fraksinasi ekstrak etanol dapat dilihat pada Tabel 4, sedangkan hasil perhitungan

rendemen dapat dilihat pada Lampiran 3.



commit to user

39

Tabel 4. Hasil Pemisahan Kromatografi Vakum Cair Ekstrak Etanol Daun Mimba

Pelarut Berat Fraksi (g) Warna Persentase (%) Heksana 0,480 Kuning 1,92

Etil asetat 10,560 Hijau kehitaman 42,24 Etanol 8,058 Coklat kehitaman 32,23

F. Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi-Fraksi Hasil Pemisahan KVC

Fraksi-fraksi hasil pemisahan KVC diuji aktivitas antibakterinya

menggunakan metode yang sama dengan pengujian aktivitas antibakteri ekstrak

etanol awal. Tujuannya adalah untuk mencari fraksi yang mempunyai aktivitas

antibakeri yang paling tinggi untuk selanjutnya dilakukan analisis lebih lanjut.

Hasil uji aktivitas antibakteri fraksi-fraksi hasil pemisahan KVC ditunjukkan pada

Tabel 5, sedangkan hasil pengujian selengkapnya ditunjukkan pada Lampiran 6.

Tabel 5. Hasil Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi-Fraksi Hasil Pemisahan KVC

DDH (mm) F Konsentrasi (g/mL)

100 75 50 25

S. epidermidis 1 6,00±0,00 6,00±0,00 6,00±0,00 6,00±0,00 2 12,74±0,19 12,20±0,16 11,61±0,35 10,72±0,23 3 9,58±0,34 9,24±0,25 8,38±0,14 7,67±0,23

B. cereus 1 6,00±0,00 6,00±0,00 6,00±0,00 6,00±0,00 2 12,76±0,15 12,18±0,14 11,63±0,31 11,13±0,04 3 11,14±0,09 9,72±0,09 8,97±0,21 8,16±0,20

S. flexneri 1 6,83±0,12 6,55±0,14 6,23±0,06 6,00±0,00 2 13,32±0,21 12,75±0,24 12,13±0,11 11,13±0,07 3 8,88±0,13 8,05±0,06 7,67±0,27 7,16±0,23

Keterangan : Diameter lubang = 6 mm F 1 = Fraksi heksana F 2 = Fraksi etil asetat F 3 = Fraksi etanol

Hasil uji aktivitas antibakteri fraksi-fraksi hasil pemisahan KVC

menunjukkan bahwa fraksi etil asetat mempunyai aktivitas antibakteri paling

tinggi dibandingkan dengan fraksi lainnya. Berdasarkan hasil pengujian aktivitas

fraksi-fraksi daun mimba hasil pemisahan KVC selanjutnya dilakukan analisis

data ststiatik untuk mengetahui secara pasti apakah terdapat pengaruh perbedaan



commit to user

40

aktivitas antibakteri yang nyata diantara masing-masing fraksi. Hasil pengujian

ANOVA yang ditunjukkan pada Lampiran 7 dapat disimpulkan bahwa semua

fraksi yaitu fraksi heksana, fraksi etil asetat, dan fraksi etanol terdapat perbedaan

yang nyata terhadap ketiga bakteri uji. Kemudian selanjutnya dilakukan pengujian

lebih lanjut menggunakan LSD untuk mengetahui perbedaan aktivitas antibakteri

antar fraksi. Hasil uji menunjukkan bahwa terdapat perbedaan nyata antara fraksi

heksana dengan fraksi etil asetat dan fraksi etanol dalam menghambat

pertumbuhan bakteri S. epidermidis, B. cereus, dan S. flexneri. Berdasarkan

analisis tersebut dapat disimpulkan bahwa fraksi etil asetat mempunyai aktivitas

antibakteri tertinggi dan nyata terhadap bakteri S. epidermidis, B. cereus, dan S.

flexneri. Setelah diketahui bahwa fraksi etil asetat yang mempunyai aktivitas

antibakteri tertinggi, selanjutnya dilakukan uji penetapan KHM terhadap ketiga

bakteri uji tersebut.

Berdasarkan hasil pengujian aktivitas antibakteri fraksi-fraksi daun mimba

dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol mempunyai aktivitas antibakteri yang

lebih besar dibandingkan dengan fraksi-fraksi hasil pemisahan KVC. Jawetz dkk.

(2005) menyatakan bahwa aktivitas kerja gabungan beberapa senyawa antibakteri

bisa lebih efektif dibandingkan dengan aktivitas kerja dari masing-masing

senyawa.

G. Penetapan KHM dan Nilai Banding

1. Penetapan KHM Fraksi Etil Asetat

Fraksi etil asetat daun mimba diketahui memiliki aktivitas antibakteri

tertinggi, sehingga dilakukan penetapan KHM terhadap ketiga bakteri uji. KHM

merupakan konsentrasi terkecil zat antibakteri yang masih mampu menghambat

pertumbuhan bakteri uji. Penetapan KHM dilakukan dengan memvariasi

konsentrasi etil asetat secara menurun. Konsentrasi dimulai dari 0,75% sampai

dengan 0,025%. Hasil penetapan KHM fraksi etil asetat dapat dilihat pada Tabel

6, sedangkan hasil pengujian selengkapnya terdapat pada Lampiran 8.



commit to user

41

Tabel 6. Hasil Uji Penetapan KHM Fraksi Etil Asetat

Konsentrasi (g/mL)

Diameter Daerah Hambat Rata-Rata (mm) S. epidermidis B. cereus S. Flexneri

0,75 7,80±0,12 7,94±0,01 7,91±0,06 0,5 7,48±0,13 7,66±0,03 7,65±0,10

0,25 7,15±0,02 7,35±0,03 7,34±0,09 0,1 6,96±0,09 7,21±0,08 7,21±0,09

0,075 6,32±0,24 6,93±0,21 6,83±0,20 0,05 6,00±0,00 6,44±0,21 6,83±0,20

0,025 6,00±0,00 6,00±0,00 6,00±0,00 Keterangan : Diameter lubang = 6 mm

Hasil uji penetapan KHM menunjukkan bahwa KHM fraksi etil asetat

terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis adalah 0,075% dengan diameter

hambat rata-rata 6,32±0,24 mm, sedangkan untuk bakteri Bacillus cereus adalah

0,05% dengan diameter hambat rata-rata 6,44±0,21 mm dan Shigella flexneri

adalah 0,05% dengan diameter hambat rata-rata 6,83±0,20 mm. Dari data dapat

disimpulkan bahwa fraksi etil asetat mempunyai nilai KHM paling kecil untuk

bakteri B. cereus dan S. flexneri. Ini artinya bahwa fraksi etil asetat mempunyai

aktivitas antibakteri yang lebih besar terhadap bakteri B. cereus dan S. flexneri

dibandingkan dengan bakteri S. epidermidis. Sedangkan potensi fraksi etil asetat

terhadap bakteri S. flexneri> B. cereus> S. epidermidis.

Adanya perbedaan aktivitas antibakteri tersebut di atas kemungkinan

karena adanya perbedaan komponen penyusun dinding sel antara bakteri gram

positif dan negatif. Menurut Pelczar dkk. (1986), dinding sel bakteri gram positif

relatif lebih sederhana, sehingga senyawa antibakteri lebih mudah masuk ke

dalam sel dan menemukan sasaran untuk merusak struktur dinding sel. Sedangkan

struktur dinding sel bakteri gram negatif lebih kompleks yang terdiri dari 3

lapisan, yaitu lapisan luar yang berupa lipoprotein, lapisan tengah yang berupa

lipopolisakarida, dan lapisan dalam yang berupa peptidoglikan. Lapisan luar yang

terdapat dalam bakteri gram negatif berfungsi sebagai lapisan pelindung bakteri

terhadap zat-zat yang bersifat racun termasuk zat antibakteri yang dapat

menghambat sintesis peptidoglikan. Hal ini menyebabkan bakteri gram negatif

lebih resistan terhadap zat antibakeri dibandingkan bakteri gram positif. Selain hal



commit to user

42

tersebut perbedaan aktivitas antibakteri suatu zat antibakteri tergantung pada tipe

ekstrak, spesies tanaman, dan spesies bakteri itu sendiri (Durmas dkk., 2006).

Dari hasil diatas di atas kemudian dilakukan analisis statistik untuk

mengetahui perbedaan secara pasti antara konsentrasi fraksi dengan bakteri uji.

Metode analisa yang digunakan adalah analisa One Way ANOVA, hasilnya

ditunjukkan pada Lampiran 9. Hasil uji ANOVA disimpulkan bahwa 0,75% dan

0,5% tidak menunjukkan perbedaan yang nyata. Analisis lebih lanjut

menggunakan LSD diketahui bahwa secara umum terdapat perbedaan yang nyata

antara konsentrasi satu dengan yang lain. Namun ada beberapa yang tidak

menunjukkan perbedaan yang nyata yaitu antara konsentrasi 0,25% dengan 0,1%

dan konsentrasi 0,05% dengan 0,025% terhadap bakteri S. epidermidis.

Konsentrasi 0,25% dengan 0,1% juga tidak menunjukkan perbedaan yang nyata

terhadap bakteri B. cereus. Sedangkan terhadap bakteri S. flexneri konsentrasi

0,25% dengan 0,1% juga tidak menunjukkan perbedaan yang nyata.

2. Penetapan KHM Amoksisilin dan Kloramfenikol

Zat pembanding yang digunakan dalam penelitian aktivitas antibakteri

daun mimba adalah amoksisilin dan kloramfenikol. Pemilihan amoksisilin sebagai

zat pembanding dikarenakan amoksisilin merupakan antibiotik dengan spektrum

luas dan biasa digunakan untuk mengobati untuk pengobatan infeksi pada saluran

nafas, saluran empedu dan saluran seni, gonorhoe, gastroenteritis, meningitis dan

infeksi karena Salmonella sp., seperti demam tipoid (Siswandono dan Soekardjo,

2000). Selain itu Mutschler (1991) menyebutkan bahwa amoksisilin mampu

meghambat pertumbuhan bakteri gram positif dan negatif seperti Staphylococcus

aureus, Bacillus cereus, Psudomonas aeruginosa, dan Eschericia coli. Hasil uji

penetapan KHM amoksisilin ditunjukkan pada Tabel 7, hasil selengkapnya

terdapat pada Lampiran 10.

Amoksisilin dapat menghambat pertumbuhan bakteri dengan cara

menghambat pembentukan mukopeptida yang diperlukan untuk sintesis dinding

sel mikroba. Dinding sel bakteri yang terhambat adalah komponen peptidoglikan,



commit to user

43

yang merupakan komponen dinding sel yang penting dalam menstabilkan sel

bakteri (Khan, 2011).

Penetapan KHM amoksisilin dilakukan dengan membuat variasi

konsentrasi amoksisilin. Pelarut yang digunakan adalah buffer phospat pH 7. Hal

ini dikarenakan buffer phospat pH 7 dapat melarutkan amoksisilin dengan

sempurna tidak memiliki hambatan terhadap mikroba, sehingga dapat berfungsi

sebagai blanko ( Downes dan Ito, 2001).

Tabel 7. Hasil Uji Penetapan KHM Amoksisilin

Konsentrasi Diameter Daerah Hambat Rata-Rata (mm) ppm (g/mL) S. epidermidis B. cereus S. flexneri

2 2,0.10-4 10,05±0,07 9,07±0,08 9,83±0,07 1,75 1,75.10-4 9,57±0,06 8,69±0,06 9,32±0,09 1,5 1,5.10-4 9,23±0,30 8,42±0,09 8,82±0,08

1,25 1,25.10-4 9,05±0,08 7,72±0,35 8,29±0,14 1 1,0.10-4 8,76±0,05 7,11±0,04 7,92±0,13

0,75 7,5.10-5 7,91±0,04 6,00±0,00 7,15±0,16 0,5 5,0.10-5 6,85±0,05 6,00±0,00 6,00±0,00

0,25 2,5.10-5 6,00±0,00 6,00±0,00 6,00±0,00 Keterangan : Diameter lubang = 6 mm

Berdasarkan data di atas dapat diketahui bahwa KHM amoksisilin untuk

bakteri Staphylococcus epidermidis adalah 5,0.10-5% dengan diameter hambat

rata-rata 6,85±0,05 mm, terhadap Bacillus cereus adalah 1,0.10-4% dengan

diameter hambat rata-rata 7,11±0,04 mm, dan terhadap Shigella flexneri adalah

7,5.10-5% dengan diameter hambat rata-rata 7,15±0,16 mm.

Dari data yang diperoleh, selanjutnya dilakukan analisis data statistik

menggunakan metode One Way ANOVA. Hasil uji yang terdapat pada Lampiran

12 diketahui bahwa terdapat perbedaan yang nyata untuk semua konsentrasi

terhadap ketiga bakteri uji. Analisis lebih lanjut menggunakan LSD diketahui

bahwa secara umum terdapat perbedaan yang nyata antara konsentrasi satu

dengan yang lain. Beberapa tidak menunjukkan perbedaan yang nyata yaitu antara

konsentrasi 5,0.10-5% dengan 2,5.10-5% terhadap bakteri S. flexneri. Konsentrasi

7,5.10-5% dengan 5,0.10-5% dan 7,5.10-5% dengan 2,5.10-5% juga tidak

menunjukkan perbedaan yang nyata terhadap bakteri B. cereus.



commit to user

44

Zat pembanding kedua yang digunakan dalam penelitian ini adalah

kloramfenikol. Kloramfenikol dipilih sebagai zat pembanding dikarenakan

kloramfenikol mempunyai spektrum kerja antibakteri terhadap bakteri S.

pyogenes, S. viridians, Neisseria, Bacillus spp., dan kebanyakan bakteri anaerob

lainnya. Selain itu kloramfenikol juga mempunyai spektrum kerja seperti

tetrasilkin. Menurut Tjay dan Rahardja (2002), tetrasiklin adalah obat yang

digunakan untuk mengobati disentri basiler. Hasil uji penetapan KHM

kloramfenikol dapat dilihat pada Tabel 8, sedangkan hasil selengkapnya dapat

dilihat pada Lampiran 14. Kloramfenikol bekerja dengan menghambat sintesis

protein bakteri. Antibiotik ini terikat pada ribosom sub unit 50S dan menghambat

enzim peptida transferase sehingga ikatan peptida tidak terbentuk pada proses

sintesis protein bakteri (Gunawan dkk., 2007).

Penetapan KHM kloramfenikol dilakukan dengan variasi konsentrasi

mulai dari konsentrasi 2,0.10-3% sampai dengan konsentrasi 7,5.10-5%. Pelarut

yang digunakan adalah DMSO. Hal ini dikarenakan DMSO mampu melarutkan

kloramfenikol dengan sempurna, selain itu DMSO juga tidak menunjukkan

penghambatan terhadap ketiga bakteri uji.

Tabel 8. Hasil Uji Penetapan KHM Kloramfenikol

Konsentrasi Diameter Daerah Hambat Rata-Rata (mm) ppm (g/mL) S. epidermidis B. cereus S. Flexneri 20 2,0.10-3 13,24±0,10 12,99±0,12 11,18±0,09 15 1,5.10-3 12,20±0,02 11,60±0,10 10,79±0,09 10 1,0.10-3 11,62±0,03 11,40±0,10 9,63±0,13 5 5,0.10-4 9,60±0,02 10,32±0,13 8,94±0,05

2,5 2,5.10-4 7,91±0,02 9,51±0,08 7,45±0,03 1,25 1,25.10-4 6,79±0,03 8,10±0,10 6,00±0,00

1 1,0.10-4 6,00±0,00 7,12±0,11 6,00±0,00 0,75 7,5.10-5 6,00±0,00 6,00±0,00 6,00±0,00

Keterangan : Diameter lubang = 6 mm

Konsentrasi hambat minimum kloramfenikol terhadap bakteri

Staphylococcus epidermidis adalah 1,25.10-4% dengan diameter hambat rata-rata

6,79±0,03 mm, terhadap Bacillus cereus adalah 1,0.10-4% dengan diameter



commit to user

45

hambat rata-rata 7,12±0,11 mm, dan terhadap Shigella flexneri 2,5.10-4% dengan

diameter hambat rata-rata 7,45±0,03 mm.

Data yang diperoleh di atas, selanjutnya dilakukan analisis data statistik

menggunakan metode One Way ANOVA. Tujuannya adalah untuk mengetahui

perbedaan secara pasti antara konsentrasi kloramfenikol dengan semua bakteri uji.

Dari hasil uji ANOVA dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan yang nyata

untuk semua konsentrasi terhadap ketiga bakteri uji. Analisa lebih lanjut

menggunakan LSD diperoleh kesimpulan bahwa secara umum terdapat perbedaan

yang nyata antara konsentrasi satu dengan yang lain. Namun konsentrasi 1,0.10-

4% dengan 7,5.10-5% tidak menunjukkan perbedaan yang nyata terhadap bakteri S.

epidermidis. Selain itu antara konsentrasi 1,25.10-4% dengan 1,0.10-4%, 1,25.10-

4% dengan 7,5.10-5% dan 1,0.10-4% dengan 7,5.10-5% juga tidak menunjukkan

perbedaan yang nyata terhadap bakteri S. flexneri.

3. Penetapan Nilai Banding Fraksi Etil Asetat terhadap Amoksisilin dan

Kloramfenikol

Penetapan nilai banding dalam penelitian ini bertujuan untuk mengetahui

potensi antibakteri fraksi etil asetat apabila dibandingkan dengan antibiotik

sintetis. Antibiotik sitnetis yang digunakan dalam penelitian ini adalah amoksisilin

dan kloramfenikol. Perhitungan nilai banding dilakukan dengan cara membuat

grafik antara konsentrasi antibiotik vs rata-rata diameter daerah hambat antibiotik

untuk masing-masing bakteri uji. Dari grafik didapatkan persamaan garis linier.

Kemudian salah satu diameter daerah hambat fraksi etil asetat hasil pengujian

aktivitas antibakteri diplotkan pada persamaan garis linier yang diperoleh.

Konsentrasi fraksi etil asetat yang digunakan adalah 0,75%. Diameter daerah

hambat fraksi etil asetat konsentrasi 0,75% disubstitusikan sebagai nilai y pada

persamaan garis linier, sehingga diperoleh nilai x. Nilai x merupakan konsentrasi

fraksi etil asetat yang setara dengan antibiotik. Konsentrasi fraksi etil asetat yang

setara dengan antibiotik kemudian dibagi dengan konsentrasi fraksi etil asetat

yang diplotkan dan dikalikan dengan faktor 100%, sehingga diperoleh nilai

banding fraksi etil asetat terhadap antibiotik yaitu amoksisilin dan kloramfenikol.



commit to user

46

Hasil penetapan nilai banding amoksisilin dan kloramfenikol dapat dilihat pada

Tabel 9. Hasil uji penetapan nilai banding faksi etil asetat terhadap amokisilin

selengkapnya terdapat pada Lampiran 13, sedangkan terhadap kloramfenikol

selengkapnya terdapat pada Lampiran 17.

Tabel 9. Hasil Penetapan Nilai Banding Fraksi Etil Asetat terhadap

Amoksisilin dan Kloramfenikol

Antibiotik Nilai banding fraksi etil asetat terhadap antibiotik

S. epidermidis B. cereus S. flexneri Amoksisilin 0,01% 0,02% 0,02%

Kloramfenikol 0,04% 0,02% 0,06%

Berdasarkan hasil uji penetapan nilai banding diatas disimpukan bahwa

nilai banding fraksi etil asetat terhadap amoksisilin untuk bakteri S. epidermidis

adalah 0,01%, B. cereus adalah 0,02%, dan untuk S. flexneri adalah 0,02%.

Sedangkan nilai banding fraksi etil asetat terhadap kloramfenikol untuk bakteri S.

epidermidis adalah 0,04%, B. cereus adalah 0,02%, dan S. flexneri adalah 0,06%.

Nilai banding fraksi etil asetat terhadap amoksisilin secara umum lebih

kecil dibanding kloramfenikol untuk bakteri semua bakteri uji. Hal ini

dikarenakan setiap bakteri mempunyai sifat dan ketahanan yang yang berbeda-

beda terhadap suatu antibiotik. Berdasarkan hasil penetapan uji banding

disimpulkan bahwa fraksi etil asetat mempunyai aktivitas antibakteri yang lebih

rendah dibandingkan amoksisilin dan kloramfenikol, namun masih bisa digunakan

sebagai alternatif antibakteri baru.

H. Pengujian Golongan Senyawa Fraksi Teraktif Antibakteri

Hasil uji aktivitas antibakteri fraksi-fraksi pemisahan dengan KVC

menunjukkan bahwa fraksi etil asetat memiliki aktivitas antibakteri tertinggi

terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, dan Shigella

flexneri dibandingkan dengan fraksi yang lainnya. Sehingga dilakukan skrining

fitokimia dengan uji tabung dan uji penegasan KLT terhadap fraksi etil asetat.

Pada uji KLT plat disemprot dengan reagen penyemprot yang spesifik untuk

masing-masing golongan senyawa. Hasil skrining fitokimia uji tabung



commit to user

47

ditunjukkan pada Tabel 10, sedangkan hasil uji penegasan KLT ditunjukkan pada

Tabel 11.

Tabel 10. Hasil Skrining Fitokimia (Uji Tabung) Fraksi Etil Asetat

No. Kandungan Senyawa Hasil Uji Teori Kesimpulan

1. Alkaloid Warna orange dan Terbentuk endapan

Terbentuknya suatu endapan1)

+

2. Flavonoid Warna hijau kehitaman

Warna merah2) -

3. Trepenoid dan Steroid Warna Hijau Warna merah, ungu atau hijau2)

+

4. Saponin Tidak terbentuk buih Adanya buih yag stabil setinggi ±1 cm2)

-

5. Tanin(polifenolik) Warna biru kehitaman

Biru tua, hitam2) +

6. Antrakuinon Warna kuning keruh Warna kuning + 7. Asam Lemak Sisa berminyak Sisa berminyak2) +

Keterangan : (+) = Ada golongan senyawa kimia 1) = Pedrosa (1978) (-) = Tidak ada golongan senyawa kimia 2) = Harborne (1987)

Tabel 11. Hasil Skrining Fitokimia (Uji KLT) Fraksi Etil Asetat Setelah

Dideteksi dengan Pereaksi Spesifik

No. Kandungan Senyawa Rf

Sinar Tampak UV254 UV365 Kesimpulan Hasil Teori Hasil Teori Hasil Teori

1. Alkaloid 0,88 Tidak

terlihat Coklat, orange1)

- - Fluoresens

biru Fluoresens

kuning/biru1) +

2. Terpenoid 0,23 Ungu Ungu2) - - - - + 3. Steroid 0,13 Ungu Ungu2) - - - - +

4. Tanin (polifenolik)

0,88 Hijau

Hijau, merah, ungu, biru1)

- - - - +

6. Antrakuinon 0,88 Kuning Kuning1) Ungu Flouresens1) - - +

7. Asam

Lemak

0,04 0,12 0,29

- - Ungu Ungu2) Ungu Ungu2) +

Keterangan : (+) = Ada golongan senyawa kimia 1) = Wagner (1983) (-) = Tidak ada golongan senyawa kimia 2) = Harborne (1996)

Hasil uji skrining fitokimia menunjukkan bahwa fraksi etil asetat daun

mimba mengandung senyawa alkaloid, terpenoid, steroid, tanin(polifenolik),

antrakuinon, dan asam lemak. Hal tersebut terjadi karena pemisahan yang kurang

baik pada saat KVC, sehingga ada komponen senyawa non polar. Alkaloid di



commit to user

48

dalam daun mimba mempunyai aktivitas antibakteri dikarenakan alkaloid

mempunyai kontribusi membentuk interkhelat dengan DNA bakteri (Cowan,

2000). Selain itu Alkaloid dapat mengganggu terbentuknya jembatan silang

komponen penyusun peptidoglikan pada sel bakteri, sehingga lapisan dinding sel

tidak terbentuk secara utuh dan menyebabkan kematian sel tersebut (Ajizah,

2004).

Terpenoid yang terkandung dalam fraksi etil asetat daun mimba

mempunyai aktivitas antibakteri melalui perusakan membran sel bakteri (Cowan,

2000). Steroid merupakan senyawa yang mempunyai aktivitas antibakteri,

mekanismenya adalah dengan cara mendesak ke dalam membran lipid sel bakteri

sehingga menyebabkan kebocoran liposom sel bakteri (Raquel, 2007). Tanin

mempunyai aktivitas antibakteri melalui aksi molekulernya yaitu dengan

membentuk kompleks dengan protein melalui ikatan hidrogen dan ikatan

hidrofobik (Cowan, 2000). Senyawa kuinon dapat menyebabkan protein bakteri

menjadi inaktif dan kehilangan fungsinya (Cowan, 2000). Asam lemak dapat

bersifat antibakteri karena asam lemak bersifat hidrofobik, sehingga dapat

menyebabkan kerusakan struktur membran sel bakteri dan membran menjadi

permeabel, kemudian akan menyebabkan kerusakan membran sitoplasma,

sehingga terjadi koagulasi pada nukleoid (Nalina dan Rahim, 2007; Hornitzky,

2003).

I. Kromatografi Gas-Spektrofotometer Massa (GC--MS)

Hasil pengujian aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa fraksi etil asetat

mempunyai aktivitas tertinggi diantara fraksi yang lain. Oleh karena itu, untuk

mengetahui komponen kimia yang terdapat dalam fraksi etil asetat dilakukan

analisis menggunakan GC-MS. Dari hasil analisis diperoleh data Kromatogram

yang berasal dari analisis GC dan spektra massa dari analisis MS. Hasil

kromatogram GC menunjukkan adanya 12 puncak. Kromatogram GC dari fraksi

etil asetat ditunjukkan pada Gambar 11.



commit to user

49

Gambar 7. Kromatogram GC fraksi etil asetat daun mimba

Identifikasi senyawa lebih lanjut dilakukan dengan analisis

spektrofotometer massa. Masing-masing puncak dari kromatogram akan

diterjemahkan oleh spektrofotometer massa menjadi suatu spektra massa. Analisis

dilakukan dengan membandingkan spektra massa dari senyawa target dengan

standar yang ada pada library alat yaitu Willey 229.LIB, NIST62.LIB, dan

penelusuran pustaka sebelumnya.

Berikut ini adalah analisis spektra massa senyawa dalam fraksi etil asetat

daun mimba yang teridentifikasi dengan GC-MS beserta dengan spektra

massanya.

1. Senyawa Puncak 1

Spektra massa senyawa puncak 1 dengan waktu retensi 20,770 menit dan

kelimpahan 0,41% ditampilkan pada Gambar 8. Dari spektra massa senyawa 1

diperkirakan bahwa senyawa ini memiliki m/z 449 [M+-H], dari literatur

sebelumnya diketahui bahwa ekstrak air daun mimba mengandung senyawa

azadiradione (Sadeghian, 2007). Senyawa ini merupakan senyawa golongan

triterpenoid dan memiliki m/z 450 [M+]. Sehingga diperkirakan senyawa puncak 1

ini adalah senyawa golongan triterpenoid.



commit to user

50

Gambar 8. Spektra senyawa 1

2. Senyawa puncak 3


kelimpahan 28,27% ditampilkan pada Gambar 9a, sedangkan spektra massa dari

senyawa standar dari library ditampilkan pada Gambar 9b.

(a)

(b)

Gambar 9. (a). Spektra senyawa 3, (b). Spektra massa senyawa asam palmitat

Spektra tersebut di atas dibuat tabel fragmentasi sebagai berikut :

Tabel 12. Fragmentasi senyawa puncak 3 dibandingkan dengan standar asam

palmitat (WILEY229.LIB)

No. Senyawa Puncak Fragmentasi

1. Senyawa puncak 3 41 43 60 73 85 98 115 129 143 157 171 185 199 213 227 256

2. Standar asam

palmitat 41 43 60 73 85 98 115 129 143 157 171 185 - 213 227 256



commit to user

51

Terlihat pada Gambar 9a dan Tabel 12, spektra massa puncak 3 mirip

dengan Gambar 9b yang merupakan spektra massa dari senyawa asam palmitat,

dengan Simillarity indeks 95%. Senyawa ini mempunyai berat molekul m/z 256

dengan rumus molekul C16H32O2. Pada penelitian sebelumnya senyawa asam

palmitat juga pernah diisolasi dari biji mimba (Suirta dkk., 2007). Asam palmitat

disebutkan dapat menghambat pertumbuhan bakteri Propionobacterium acnes

(Yang dkk., 2009).

3. Senyawa puncak 4

Spektra massa puncak 4 dengan waktu retensi 23,551 menit dan

kelimpahan 1,72% memiliki fragmen yang mirip dengan spektra massa senyawa

etil linoleolat. Spektra massa senyawa puncak 4 dapat dilihat pada Gambar 10a

dan spektra massa etil linoleolat dapat dilihat pada Gambar 10b.

(a)

(b)

Gambar 10. (a). Spektra senyawa 4, (b). Spektra senyawa etil linoleolat



commit to user

52

Spektra tersebut di atas dapat dibuat tabel fragmentasi sebagai berikut :

Tabel 13. Fragmentasi senyawa puncak 4 dibandingkan dengan standar etil

linoleolat (WILEY229.LIB)


1. Senyawa puncak 4 41 55 67 79 93 108 121 135 149 163 173 191 236

2. Standar

etil linoleolat

41 55 67 79 95 108 121 135 149 163 173 - -

Tampak pada Gambar 10a dan Tabel 13 spektra massa puncak 4 mirip

dengan Gambar 10b yang merupakan spektra massa etil linoleolat dengan

Simillarity indeks 89%. Etil linoleolat memiliki berat molekul m/z 308 dengan

rumus molekul C20H36O2.

4. Senyawa puncak 5



kelimpahan 45,06% memiliki [M+] 264. Dari literature sebelumnya diketahui

bahwa daun dan ranting mimba mengandung senyawa asam heksadekatrienoat-

metil ester, senyawa ini juga memiliki [M+] 264 dan termasuk golongan asam

lemak tidak jenuh. Spektra massa puncak 5 dapat dilihat pada Gambar 11.

Sehingga diperkirakan senyawa 5 termasuk dalam golongan asam lemak.

5. Senyawa puncak 6


kelimpahan 8,39% memiliki fragmen yang mirip dengan senyawa asam stearat.

Spektra massa puncak 6 dapat dilihat pada Gambar 12a dan spektra massa dari

asam stearat dapat dilihat pada Gambar 12b.



commit to user

53

(a)

(b)

Gambar 12. (a). Spektra Senyawa 6, (b). Spektra massa senyawa asam stearat


Tabel 14. Fragmentasi senyawa puncak 6 dibandingkan standar asam stearat

(NIST62.LIB)


1. Senyawa puncak 6 41 43 60 73 85 98 115 129 143 157 171 185 199 213 227 241 255 284

2. Standar

asam stearat

41 43 60 73 85 98 115 129 143 - 171 185 199 213 - 241 256 284

Tampak pada Gambar 12a dan Tabel 16, spektra massa puncak 6 mirip

dengan gambar 12b yang merupakan spektra massa dari senyawa asam stearat

dengan Simillarity indeks 93. Senyawa ini mempunyai berat molekul m/z 284

dengan rumus molekul C18H36O2. Asam stearat juga merupakan senyawa yang

pernah diisolasi dari biji mimba (Suirta dkk., 2007). Asam stearat dikatakan

mempunyai aktivitas antijamur dan antibakteri (Agoramoorthy, 2007).

6. Spektra puncak 7


kelimpahan 1,02% memiliki fragmen yang mirip dengan senyawa trans-fitol.



commit to user

54

Spektra massa puncak 7 dapat dilihat pada Gambar 13a dan spektra massa dari

senyawa standar dari library dapat dilihat pada Gambar 13b.

(a)

(b)

Gambar 13. (a). Spektra senyawa 7, (b) Senyawa standar trans fitol

Spektra tersebut dapat dibuat tabel fragmentasi sebagai berikut :

Tabel 15. Fragmentasi senyawa puncak 7 dibandingkan dengan standar trans-fitol

(WILEY229.LIB)


1. Senyawa puncak 7

41 43 68 81 95 109 123 137 152 165 179 - 278

2. Standar

trans- fitol 41 43 68 82 95 109 123 137 151 - 179 208 278

Tampak bahwa pada Gambar 13a dan Tabel 15, senyawa puncak 7 mirip

dengan Gambar 13b yang merupakan spektra massa dari senyawa trans-fitol

dengan Simillarity indeks 86%. Senyawa ini memiliki berat molekul m/z 296

dengan rumus molekul C20H40. Senyawa fitol dilaporkan pernah ditemukan dalam

minyak atsiri bunga mimba (Aromdee dan Sriubolmas, 2005), senyawa ini

merupakan kelompok senyawa diterpen yang mempunyai fungsi sebagai

antibakteri, antideuretik, antiinflamatori, dan antikanker (Uma dkk., 2011).



commit to user

55

7. Senyawa puncak 8

Gambar 14. Spektra Senyawa 8

Spektra massa puncak 8 mempunyai waktu retensi 26,739 menit dan

kelimpahan relatif 0,74%. Dari spektra massa puncak 8 diperkirakan senyawa ini

memiliki m/z 385 [M+-H], sedangkan dari literature sebelumnya diketahui bahwa

senyawa nimolactone memiliki m/z 386 [M+]. Senyawa nimolactone yaitu

senyawa triterpenoid yang pernah diisolasi dari kulit buah segar mimba dan dapat

dilihat bahwa senyawa puncak 8 memiliki M+ yang sama dengan nimolacton.

Sehingga senyawa 8 diperkirakan termasuk dalam golongan triterpenoid. Spektra

massa puncak 8 ditampilkan pada Gambar 14.

8. Senyawa puncak 9


kelimpahan relatif 0,96% memiliki fragmen yang mirip dengan senyawa DOP (Di

Oktil Ptalat). Spektra massa puncak 9 dapat dilihat pada Gambar 15a, sedangkan

senyawa standarnya dapat dilihat pada Gambar 15b.

(a)

(b)

Gambar 15. (a). Spektra senyawa 9, (b). Senyawa standar DOP



commit to user

56


Tabel 16. Fragmentasi senyawa puncak 9 dibandingkan dengan standar DOP

(WILEY229.LIB)


1. Senyawa puncak 9 41 57 71 84 104 132 149 167 168 279

2. Standar DOP 41 57 71 84 104 132 149 167 - 279

Terlihat bahwa pada Gambar 15a dan Tabel 16, senyawa puncak 9 mirip

dengan Gambar 15b yang merupakan spektra massa dari senyawa DOF (Di Oktil

Ftalat) dengan Simillarity indeks 97%. Senyawa ini memiliki berat molekul m/z

279 dengan rumus molekul C24H38O4.

9. Senyawa puncak 10


Senyawa puncak 10 dengan waktu retensi 29,800 menit dan kelimpahan

relatif 4,81% dapat dilihat pada Gambar 16. Dari spektra massa senyawa 10

terlihat bahwa senyawa 10 memiliki M+ 424, dan dari literatur yang diperoleh

senyawa ini memiliki kesamaan M+ dengan senyawa limocinone yaitu senyawa

yang pernah diisolasi dari kulit buah segar mimba. Sehingga senyawa ini dapat

diperkirakan termasuk golongan triterpenoid.





commit to user

57



dapat dilihat bahwa senyawa ini memiliki [M+] 452, dari literatur yang diperoleh

senyawa ini memiliki kesamaan [M+] dengan senyawa nimonol yang merupakan

senyawa golongan triterpenoid yang tedapat dalam biji mimba (Moslem dan El-

Kholie, 2009). Sehingga dimungkinkan senyawa puncak 1 ini adalah senyawa

golongan triterpenoid.





dapat dilihat bahwa senyawa ini memiliki [M+] 466, dan berdasarkan literatur

yang diperoleh senyawa ini memiliki kesamaan [M+] dengan senyawa nimbolid

yaitu merupakan senyawa golongan triterpenoid. nimbolid merupakan senyawa

yang diisolasi dari ekstrak air daun mimba (Sadeghian, 2007). Sehingga

dimungkinkan senyawa puncak 1 ini adalah senyawa golongan triterpenoid.

Hasil analisis dengan GC-MS menunjukkan bahwa fraksi etil asetat

mengandung 11 senyawa yaitu asam palmitat, etil linoleolat, asam stearat, trans-

fitol, DOF (Di Oktil Ftalat), dan diperkirakan mengandung 1 senyawa golongan

asam lemak dan 5 senyawa golongan triterpenoid. Senyawa-senyawa tersebut

diperkirakan menyebabkan fraksi etil asetat daun mimba mempunyai aktivitas

antibakteri terhadap ketiga bakteri uji.



commit to user

58

BAB V

PENUTUP

A. KESIMPULAN

Berdasarkan hasil dan pembahasan dapat diambil kesimpulan sebagai

berikut :

1. Fraksi daun mimba hasil pemisahan KVC mempunyai aktivitas antibakteri

Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, dan Shigella flexneri dan fraksi

teraktif antibakteri terhadap ketiga bakteri uji adalah fraksi etil asetat.

2. Potensi antibakteri fraksi etil asetat apabila dibandingkan terhadap amoksisilin

adalah 0,01% untuk S. epidermidis, 0,02% untuk B. cereus, dan 0,02% untuk S.

flexneri, sedangkan potensi antibakteri fraksi etil asetat apabila dibandingkan

terhadap kloramfenikol adalah 0,04% untuk S. epidermidis, 0,02% untuk B.

cereus, dan 0,06% untuk S. flexneri. Potensi antibakteri fraksi etil asetat masih

lebih kecil apabila dibandingkan dengan amoksisilin dan kloramfenikol, namun

bisa digunakan sebagai alternatif antibakteri baru.

3. Fraksi etil asetat daun mimba mengandung senyawa alkaloid, terpenoid,

steroid, tanin(polifenolik), antrakuinon, dan asam lemak. Identifikasi

komponen kimia fraksi etil asetat menggunakan GC-MS menunjukkan adanya

11 senyawa yaitu asam palmitat, etil linoleolat, asam stearat, trans fitol, DOF

(Di Oktil Ftalat), dan diperkirakan mengandung 1 senyawa golongan asam

lemak serta 5 senyawa golongan triterpenoid.

B. SARAN

Perlu dilakukan pemisahan lebih lanjut terhadap senyawa-senyawa yang

terkandung dalam fraksi etil asetat daun mimba (Azadirachta indica A. Juss)

beserta uji aktivitas antibakteri komponen utamanya.


STUDI AKTIVITAS ANTIBAKTERI DAN IDENTIFIKASI FRAKSI .../Studi-Ak... · Identifikasi dengan skrining fitokimia menunjukkan bahwa fraksi etil asetat mengandung senyawa alkaloid, terpenoid,

Documents