1 POLITECHNIKA ŚLĄSKA WYDZIAŁ CHEMICZNY KATEDRA CHEMII ORGANICZNEJ, BIOORGANICZNEJ I BIOTECHNOLOGII AUTOREFERAT pracy doktorskiej Aleksandra GRUCA Syntetyczne glikozydowe pochodne genisteiny jako potencjalne związki uwrażliwiające komórki nowotworowe na cytotoksyczne działanie promieniowania jonizującego Synthetic glycosidic genistein derivatives as potential sensitizers of tumour cells to the cytotoxic effects of ionizing radiation Promotor: prof. dr hab. Zdzisław KRAWCZYK Promotor pomocniczy: dr Aleksandra RUSIN Gliwice 2014
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
1
POLITECHNIKA ŚLĄSKA
WYDZIAŁ CHEMICZNY
KATEDRA CHEMII ORGANICZNEJ, BIOORGANICZNEJ I BIOTECHNOLOGII
AUTOREFERAT pracy doktorskiej
Aleksandra GRUCA
Syntetyczne glikozydowe pochodne genisteiny jako potencjalne
związki uwrażliwiające komórki nowotworowe na cytotoksyczne
działanie promieniowania jonizującego
Synthetic glycosidic genistein derivatives as potential sensitizers of tumour cells
to the cytotoxic effects of ionizing radiation
Promotor: prof. dr hab. Zdzisław KRAWCZYK
Promotor pomocniczy: dr Aleksandra RUSIN
Gliwice 2014
2
Praca doktorska wykonana w ramach Studium Doktoranckiego Politechniki Śląskiej.
Praca finansowana ze środków UDA-POKL.04.01.01-00-114/09-01w ramach Programu
Operacyjnego Kapitał Ludzki współfinansowanego ze środków Europejskiego Funduszu
Społecznego oraz z grantu Narodowego Centrum Nauki (2012/05/N/NZ1/00022).
Praca doktorska została wykonana w Centrum Badań Translacyjnych i Biologii
Molekularnej Nowotworów Centrum Onkologii - Instytutu im. M. Skłodowskiej - Curie,
oddział w Gliwicach.
3
Podziękowania
Pragnę złożyć serdeczne podziękowania Panu prof. dr hab. Zdzisławowi Krawczykowi
za nieocenioną pomoc udzieloną w trakcie przygotowywania pracy doktorskiej, cierpliwość
i wyrozumiałość oraz motywację do krytycznego spojrzenia na problematykę badawczą.
Szczególne podziękowania pragnę złożyć Panu Profesorowi za pomoc w jasnym
formułowaniu myśli naukowej oraz inspirację do zgłębiania zagadnień naukowych.
Chciałam wyrazić głęboką wdzięczność Pani dr Aleksandrze Rusin, bez której moja praca
doktorska nie mogłaby powstać. Dziękuję za inspirację do badań, niezastąpioną pomoc
w planowaniu doświadczeń oraz kreatywne podejście w poszukiwaniu rozwiązań problemów
biologicznych. Pragnę również podziękować za pomoc w redagowaniu pracy oraz motywację
do opracowania samodzielnych koncepcji na tle istniejącej literatury naukowej.
Dziękuję Panu prof. dr hab. inż. Wiesławowi Szeji za udostępnienie związków do doświadczeń
oraz umożliwienie wykonywania badań w ramach współpracy pomiędzy Katedrą Chemii
Organicznej, Bioorganicznej i Biotechnologii Wydziału Chemicznego Politechniki Śląskiej
w Gliwicach a Centrum Badań Translacyjnych i Biologii Molekularnej Nowotworów
w Centrum Onkologii w Gliwicach.
Pragnę podziękować Panu prof. dr hab. n. med. Leszkowi Miszczykowi, kierownikowi
Zakładu Radioterapii Centrum Onkologii w Gliwicach za udostępnienie przyspieszacza
liniowego, dzięki czemu możliwe było wykonanie doświadczeń do niniejszej pracy.
Szczególne wyrazy wdzięczności składam pracownikom Centrum Badań Translacyjnych
i Biologii Molekularnej Nowotworów oraz Katedry Chemii Organicznej, Bioorganicznej
i Biotechnologii Wydziału Chemii Politechniki Śląskiej w Gliwicach za przekazaną wiedzę,
pomoc w zakresie technik eksperymentalnych oraz prawdziwie naukową atmosferę w pracy.
W szczególności pragnę podziękować Pani dr Agnieszce Gogler-Pigłowskej,
Panu prof. dr hab. Markowi Rusinowi, Pani mgr Annie Habryce, Pani dr Iwonie Domińczyk,
Panu mgr Radosławowi Kitlowi oraz Panu dr Piotrowi Świerkowi za pomoc i życzliwość.
.
Chciałabym również podziękować rodzinie oraz przyjaciołom, za nieustanne wsparcie oraz
motywację. W szczególności dziękuję mojej Mamie za pomoc w wyborze drogi zawodowej
oraz nigdy niegasnącą wiarę we mnie.
Niniejszą pracę pragnę dedykować mojej Mamie, której wieloletnie nauki wyrażone
są słowami Jana Pawła II: „Tam, gdzie jest człowiek cierpiący, musi znaleźć się człowiek,
który otoczy cierpiącego wsparciem”.
4
SPIS TREŚCI
I. WPROWADZENIE ............................................................................................................ 5
II. CEL PRACY ....................................................................................................................... 6
III. WYNIKI ............................................................................................................................. 7
III.1. Ocena właściwości cytotoksycznych badanych pochodnych genisteiny oraz
III.5. Hamowanie aktywności ścieżek przekazu sygnału zależnych od EGFR przez genisteinę
i jej pochodne ............................................................................................................... 19
III.6. Hamowanie aktywności topoizomerazy II przez genisteinę i jej pochodne ................. 22
III.7. Podsumowanie wyników badań ................................................................................... 24
IV. WNIOSKI ......................................................................................................................... 27
V. BIBLIOGRAFIA .............................................................................................................. 28
VI. DOROBEK NAUKOWY ................................................................................................. 30
5
I. WPROWADZENIE
Rozwój wiedzy w dziedzinie onkologii umożliwił scharakteryzowanie w komórkach
wielu typów nowotworów potencjalnych celów molekularnych o istotnym znaczeniu
dla skutecznej chemoterapii i radioterapii i racjonalizujących stosowanie terapii kombinowanej
[1]. Zastosowanie chemoterapii celowanej w kombinacji z radioterapią jest szczególnie
uzasadnione w przypadku pacjentów, u których niepowodzenie radioterapii związane jest
z istnieniem w masie guza komórek radioopornych, a zwiększenie dawki energii
promieniowania jonizującego (IR, ang. ionising irradiation) do wartości umożliwiającej
ich wyeliminowanie nie jest możliwe ze względu na równoczesny wzrost toksyczności terapii
względem tkanek prawidłowych. Jeśli znane są mechanizmy radiooporności komórkowej
w danym typie nowotworu, możliwe jest zastosowanie związków promieniouwrażliwiających
celujących właśnie w te, ściśle określone cele molekularne, bez dodatkowego zwiększania
toksyczności terapii [2-4].
Koncepcja pracy doktorskiej łączy ze sobą dwie strategie poszukiwania leków
do zastosowania w kombinacji z radioterapią, szeroko eksplorowane i opisane w ostatnich
latach [5-8], a mianowicie:
poszukiwanie radiouczulaczy wśród związków o znanych celach molekularnych, które
to cele zostały równocześnie określone w literaturze jako determinanty komórkowej
radiooporności;
projektowanie analogów związków pochodzenia naturalnego w oparciu o analizę SAR
(ang. structure activity relationship, związek pomiędzy strukturą chemiczną
a właściwościami biologicznymi) z nadzieją na otrzymanie pochodnych o ulepszonych
właściwościach biologicznych i farmakokinetycznych oraz równocześnie przewidywanej
niskiej toksyczności ogólnoustrojowej.
Kontrola promienioczułości komórek nowotworowych za pomocą związków
naturalnych mogłaby zwiększyć skuteczność radioterapii oraz równocześnie ograniczyć efekty
uboczne prowadząc do poprawy wyników leczenia [6]. Wśród licznych mechanizmów
molekularnych determinujących radiooporność nowotworów wymienia się często nadekspresję
genów prożyciowych oraz hiperaktywację białek prożyciowych, między innymi czynników
wzrostowych [9, 10]. Substancje radiouczulające celują w rozmaite mechanizmy
radioprotekcyjne, niektóre upośledzają również podstawowe funkcje komórkowe, takie
jak replikacja DNA, prowadząc do zablokowania podziałów komórek i w efekcie zahamowania
wzrostu guza [11, 12]. Z tego względu genisteina jako związek naturalny zdolny do hamowania
równocześnie aktywności receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR, ang. epidermal
growth factor receptor) [13] oraz enzymu uczestniczącego w replikacji DNA –
topoizomerazy II (TOPO II) [14, 15], a jednocześnie blokujący cykl komórkowy w najbardziej
radiowrażliwej fazie G2/M [16, 17], wydaje się wyjątkowo interesująca jako naturalny związek
wyjściowy do konstruowania pochodnych mogących działać jako efektywne radiouczulacze.
Należy podkreślić, że, mimo iż genisteinę testowano w kombinacji z radioterapią w badaniach
przedklinicznych [17-19], nie są znane prace, w których pokazano by, że mechanizmem
6
odpowiedzialnym za jej właściwości radiouczulające jest zdolność do hamowania aktywności
EGFR czy TOPO II.
Ze względu na to, że hiperaktywację EGFR obserwuje się w wielu typach nowotworów
[20, 21], a ponadto aktywność EGFR pobudzana jest po zastosowaniu promieniowania
jonizującego (co uznawane jest jako jeden z nowotworowych mechanizmów radiooporności)
[21-23] receptor ten jest znanym celem dla terapii przeciwnowotworowej. Zablokowanie
funkcji EGFR skutkuje obniżeniem poziomu proliferacji i wzrostu komórek nowotworowych,
obniżeniem odporności na czynniki indukujące śmierć komórkową, spadkiem poziomu
inwazyjności komórek nowotworowych oraz ich zdolności do rozsiewu i adhezji, może
też ograniczać zdolność komórek do naprawy uszkodzeń DNA [24].
Topoizomeraza II, jako enzym regulujący topologię DNA, uczestniczy
w podstawowych procesach komórkowych takich jak replikacja DNA, transkrypcja,
rekombinacja oraz utrzymanie struktury chromatyny [25-28]. Zahamowanie jej funkcji przez
związek z grupy „trucizn” TOPO II wywołuje powstanie podwójnych pęknięć w nici DNA,
co może prowadzić do śmierci komórki [29-31].
Pomimo trwających od około 20 lat intensywnych badań skierowanych na poznawanie
funkcji i właściwości przeciwnowotworowych genisteiny, izoflawon ten nie został dotychczas
wdrożony do leczenia. Wśród głównych przeszkód wymienia się zbyt niską aktywność
genisteiny, czyli działanie w zbyt wysokich stężeniach niemożliwych do osiągnięcia w osoczu
krwi oraz niską biodostępność izoflawonu i jego słabe wchłanianie z przewodu pokarmowego
[32]. W celu poprawy właściwości farmakokinetycznych genisteiny od prawie dwóch dekad
prowadzone są badania, których celem jest uzyskanie skutecznego analogu, który
wykazywałby większą stabilność w ustroju oraz działał przeciwnowotworowo w niższych
stężeniach [33].
II. CEL PRACY
Pierwszym celem niniejszej pracy było zbadanie czy i w jakim stopniu nowe
glikozydowe pochodne genisteiny zsyntezowane w Katedrze Chemii Organicznej,
Bioorganicznej i Biotechnologii Politechniki Śląskiej wykazują zwiększoną właściwość
hamowania wzrostu komórek nowotworowych w porównaniu ze związkiem macierzystym,
genisteiną. Aby to wyjaśnić dla każdego z badanych związków określono wartość IC50.
Drugim celem było zbadanie czy i które z badanych pochodnych genisteiny
hamujących proliferację komórek nowotworowych w niższym stężeniu niż genisteina
wykazują właściwość uwrażliwiania komórek nowotworowych na działanie promieniowania
jonizującego, a zatem czy mogą być brane pod uwagę jako potencjalne radiouczulacze.
Trzecim celem pracy było określenie wybranych elementów mechanizmu hamowania
wzrostu komórek nowotworowych przez glikozydowe pochodne genisteiny. W tym celu
dla każdego z badanych związków określono:
właściwość modulowania poziomu EGFR oraz aktywności/fosforylacji EGFR;
właściwość hamowania aktywności/fosforylacji elementów szlaków zależnych
od EGFR, a mianowicie szlaku AKT oraz szlaku MAPK;
7
właściwość hamowania aktywności topoizomerazy II.
Badania niniejszej pracy miały charakter przesiewowy i w zamierzeniu powinny wskazać
pochodną/pochodne o najlepszych właściwościach radiouczulających, które w następnej
kolejności można by zakwalifikować do badań in vivo.
III. WYNIKI
W niniejszej pracy doktorskiej badaniami przesiewowymi objęto 10 pochodnych
genisteiny zsyntetyzowanych w zespole prof. Wiesława Szeji. Modyfikacja cząsteczki
genisteiny polegała na wprowadzeniu podstawników przy węglu C-7 oraz C-4’. Podstawnikami
były reszty cukrowe ramnalowe bądź laktalowe związane z aglikonem wiązaniem
O–glikozydowym lub C–glikozydowym. Pochodne genisteiny, które poddano badaniom
biologicznym w niniejszej pracy doktorskiej można zaklasyfikować do czterech grup:
Grupa I, to glikozydy genisteiny, w których reszta cukrowa połączona jest z aglikonem
w pozycji C-7. Ta grupa reprezentowana jest przez pochodną o nazwie G21. Pochodna
G21 traktowana jest w niniejszej pracy jako związek referencyjny, wybrany
na podstawie wcześniejszych badań [34, 35]. G21 w początkowych badaniach
zaklasyfikowano jako strukturę wiodącą, która mogłaby zostać wykorzystana do nowych
syntez chemicznych [35].
Grupa II to glikokoniugaty podstawione w pozycji C-7, w których reszta cukrowa jest
oddalona od cząsteczki genisteiny poprzez alkilowy łańcuch, przy czym reszta cukrowa
połączona jest z łącznikiem wiązaniem O-glikozydowym. W tej grupie znajdują
się badane pochodne o nazwie RAM-2, RAM-3 i RAM-5.
Grupa III to analogi omówionych uprzednio O-glikokoniugatów podstawione w pozycji
C-7, w których reszta cukrowa połączona jest z łącznikiem alkilowym poprzez wiązanie
C-glikozydowe. W tej grupie znajdują się badane pochodne o nazwie RAM-C-3α,
RAM-C-4α i RAM-C-5α. Zastąpienie wiązania O-glikozydowego, potencjalnie
wrażliwego na hydrolizę enzymatyczną, wiązaniem C-glikozydowym miało na celu
zwiększenie stabilności pochodnych w komórkach i/lub krwioobiegu.
Grupa IV to glikokoniugaty genisteiny, w których reszta cukrowa połączona
z łącznikiem alkilowym wiązaniem O-glikozydowym podstawiona jest w pozycji C-4’
genisteiny. W tej grupie znajdują się badane pochodne o nazwie RAM-2’, RAM-3’
i RAM-5’.
Pełne nazwy związków chemicznych wraz z podziałem na klasy, stosunkiem anomerów oraz
odnośnikami literaturowymi do opisów syntez zebrano w tabeli III-1.
8
Tabela III-1. Związki chemiczne używane w doświadczeniach. W tabeli przedstawiono pełne nazwy i wzory chemiczne związków, stosunek anomerów α/β, podział na grupy
w zależności od miejsca podstawienia i rodzaju wiązania glikozydowego w strukturze związku oraz odnośniki literaturowe, w których opisana została procedura chemicznej
syntezy każdej pochodnej.
Klasa Nazwa Nazwa wg IUPAC Struktura chemiczna Stosunek anomerów Opis syntezy
Str
uktu
ra
wio
dąc
a
Genisteina 5,7-dihydroksy-3-(4-
hydroksyfenylo)chromen-4-on
- -
Wią
zanie
O-g
lik
ozy
dow
e
po
dst
awie
nie
prz
y C
-7
G21
7–O–(2,3,4,6–tetra–O–acetylo–β–D–
galaktopiranozylo)–(14)–(6–O–
acetylo–heks–2–en–α–D–erytro–
piranozylo) genisteina
tylko α Rusin et al., 2009
RAM-2
5–hydroksy–7–[(4–O–acetylo–2,3,6–
trideoksy–α–L–erytro–heks–2–
enopiranozylo)–2–O–etoksy]–3–(4–
hydroksyfenylo)chromen–4–on
α/β = 10/1
RAM-3
5–hydroksy–7–[(4–O–acetylo–2,3,6–
trideoksy–α–L–erytro–heks–2–
enopiranozylo)–3–O–propyloksy]–3–
(4–hydroksyfenylo)chromen–4–on
α/β = 4.2/1 Rusin et al., 2011
RAM-5
5–hydroksy–7–[(4–O–acetylo–2,3,6–
trideoksy–α–L–erytro–heks––
enopiranozylo)–5–O–pentyloksy]–3–(4–
hydroksyfenylo)chromen–4–on
α/β = 4/1
9
Wią
zanie
C-g
likozy
dow
e podst
awie
nie
prz
y
C-7
RAM-C-3α
5–hydroksy–7–O–[3–(4–O–acetylo–
2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks–2–
enopiranozylo)propylo]–3–(4–
hydroksyfenylo)chromen–4–on
tylko α
RAM-C-4α
5–hydroksy–7–O–[4–(4–O–acetylo–
2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks–2–
enopiranozylo)butylo]–3–(4–
hydroksyfenylo)chromen–4–on
tylko α Rusin et al., 2014
RAM-C-5α
5–hydroksy–7–O–[5–(4–O–acetylo–
2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks–
2enopiranozylo)pentylo]–3–(4–
hydroksyfenylo)chromen–4–on
tylko α
Wią
zanie
O-g
lik
ozy
do
we
po
dst
awie
nie
prz
y
C-4
’
RAM-2’
5,7–dihydroksy–3–[4–(4–O–acetylo–
2,3,6–trideoksy–β–L–erytro–heks–2–
enopiranozylo)–2–etoksyfenylo]–
chromen–4–on
α/β = ¼
RAM-3’
5,7–dihydroksy–3–[4–(4–O–acetylo–
2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks–2–
enopiranozylo)–3–propyloksyfenylo]–
chromen–4–on
α/β = 6/1 Byczek et al., 2013
RAM-5’
5,7–dihydroksy–3–[4–(4–O–acetylo–
2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks–2–
enopiranozylo)–5–pentyloksyfenylo]–
chromen–4–on
α/β = 6/1
10
Doświadczenia prowadzono na komórkach dwóch linii nowotworowych: raka gruczołu
krokowego (linia DU145) oraz raka jelita grubego (linia HCT116) pochodzących
z kolekcji ATCC (American Type Culture Collection) utrzymywanych w banku komórkowym
Centrum Onkologii. Komórki linii HCT116 charakteryzuje występowanie mutacji aktywujących
w genach K-RAS oraz PI3CK, które powodują konstytutywną aktywację szlaków RAF-MAPK oraz
PI3K-AKT niezależnie od poziomu aktywności EGFR [36]. Wybrane linie należą do szybko
proliferujących komórek nowotworowych, zawierających wysokie stężenie topoizomerazy II
oraz o wysokim poziomie ekspresji EGFR [37, 38]. Równocześnie komórki wybranych linii
wykazują zróżnicowaną radiooporność [39, 40]. Ponadto, dane z piśmiennictwa pokazują,
że w przypadku nowotworów gruczołu krokowego i jelita grubego obserwuje się słabsze efekty
działania inhibitorów EGFR w kombinacji z promieniowaniem w porównaniu do innych typów
nowotworów [41-43]. Wydaje się zatem racjonalne poszukiwanie związków o potencjalnie większej
skuteczności terapeutycznej w odniesieniu do wymienionych typów nowotworów.
III.1. Ocena właściwości cytotoksycznych badanych pochodnych genisteiny oraz IR
Właściwości cytotoksyczne pochodnych genisteiny oraz ich wpływ na wrażliwość komórek
nowotworowych na promieniowanie jonizujące badano stosując test klonogenności, w którym
wyznaczano wartość IC50 (takie stężenie związku, które powoduje obniżenie mierzonego efektu,
tu proliferacji komórkowej, o połowę). Wartości IC50, obliczone z zastosowaniem programu
CalcuSyn (http://www.biosoft.com/w/calcusyn.htm) opartego na algorytmach opracowanych przez
Chou-Talalaya [44, 45] dla każdego związku oraz promieniowania jonizującego przedstawiono
w tabeli III-2.
Tabela III-2. Wartości IC50 [µM] wraz z odchyleniami standardowymi wyznaczone w teście klonogenności
dla genisteiny oraz jej pochodnych, na które eksponowane były komórki linii nowotworowych jelita grubego
HCT116 oraz gruczołu krokowego DU145. Komórki inkubowano z pochodnymi przez 24 h. Wyznaczono również
IC50 dla IR. Wartości obliczone zostały na podstawie danych uzyskanych z przynajmniej 3 niezależnych
eksperymentów. Na czerwono zaznaczono pochodną o najniższej wartości IC50.(G21 – związek referencyjny)/
Czcionką pogrubioną zaznaczono wartości IC50 niższe od 5 μM, czyli, zgodnie z danymi literaturowymi, możliwe
do osiągnięcia w ustroju [46].
Badany związek IC50
(komórki HCT116)
IC50
(komórki DU145)
IR 1.97 ± 0.39 3.30 ± 0.65
GENISTEINA 31.3 ± 5.5 35.0 ± 8.8
G21 1.2 ± 0.3 3.0 ± 0.3
RAM-2 27.0 ± 8.2 43.8 ± 23.0
RAM-3 2.6 ± 1.5 11.0 ± 6.0
RAM-5 5.9 ± 0.1 11.0 ± 2.0
RAM-C-3α 19.4 ± 1.6 39.1 ± 4.4
RAM-C-4α 6.5 ± 0.8 3.8 ± 1.0
RAM-C-5α 12.5 ± 3.2 11.5 ± 4.3
RAM-2' 3.3 ± 0.9 5.1 ± 0.5
RAM-3' 13.2 ± 1.0 18.9 ± 5.1
RAM-5' 7.00 ± 0.1 6.7 ± 0.8
11
Otrzymane dane pokazały, że 8 spośród 10 badanych pochodnych genisteiny wywoływało
znacząco silniejsze działanie cytotoksyczne niż genisteina. Równocześnie żaden z badanych
związków nie obniżał potencjału klonogennego komórek silniej niż referencyjna pochodna G21.
Ogólnie, komórki HCT116 były bardziej wrażliwe na działanie badanych pochodnych i jedynie
związki RAM-C-4α i RAM-C-5α wykazywały silniejszy lub zbliżony efekt cytotoksyczny
w stosunku do komórek DU145.
W przypadku linii HCT116 najsilniej ograniczającymi potencjał klonogenny komórek były
dwie pochodne, a mianowicie RAM-3 oraz RAM-2’. W przypadku komórek DU145 najsilniej
cytotoksycznie działała pochodna RAM-C4α. Na podstawie przedstawionych powyżej wyników
do dalszych badań wybrano 8 związków, dla których wartość IC50 była istotnie niższa
niż dla genisteiny. Związki wyeliminowane z dalszych analiz to RAM-2 i RAM-C-3α. Potwierdzono
ponadto, że większą radiowrażliwością cechowała się linia nowotworowa ludzkiego raka jelita
grubego.
III.2. Interakcje analizowanych związków z promieniowaniem jonizującym
W celu określenia czy badane pochodne genisteiny wykazują zdolność do zwiększania
cytotoksycznego efektu promieniowania jonizującego zastosowano test klonogenności. Porównano
efekt hamowania wzrostu komórek HCT116 i DU145 przez IR oraz badane związki pojedynczo
z efektem uzyskanym po zastosowaniu kombinacji obu tych czynników. Wyniki doświadczenia
pokazane są na rycinie III.1 (komórki HCT116) i na rycinie III.2 (komórki DU145).
Przedstawione wyniki pokazują, że połączone działanie badanych związków
i promieniowania jonizującego wywoływało silniejszy efekt cytotoksyczny, niż kiedy komórki
eksponowane były na działanie każdego z czynników (IR lub badany związek) oddzielnie. Jeżeli
odrzuci się wartości skrajne (uzyskane w wyniku ekspozycji komórek na największą dawkę
promieniowania i najwyższe zastosowanie stężenie badanego związku), to w przypadku komórek
HCT116 najsilniejszy efekt cytotoksyczny występował dla kombinacji pochodnej RAM-5
w stężeniach 2.5 oraz 5 μM z dawką IR odpowiednio 1 Gy lub 2 Gy.
Dla wszystkich pozostałych związków obserwowano poprawę efektu cytotoksycznego
kombinacji terapii w porównaniu do monoterapii, jednak w stopniu słabszym niż dla RAM-5.
Najsłabszy efekt cytotoksyczny występował w przypadku pochodnej RAM-5’ stosowanej
w kombinacji z promieniowaniem. Należy zaznaczyć, że dla pochodnych RAM-5 i RAM-C-4α
w kombinacji z promieniowaniem efekt cytotoksyczny występował już przy stężeniach zbliżonych
do wartości IC50 i niższych, natomiast dla pozostałych efekt występował dla stężeń przekraczających
wartość IC50.
W przypadku komórek DU145 najsilniejszy kombinowany efekt cytotoksyczny
obserwowano dla pochodnych RAM-5, RAM-2’, RAM-3’ oraz, przeciwnie niż w komórkach
HCT116, RAM-5’. Dla pozostałych związków poza G21 oraz RAM-C-5α obserwowano poprawę
efektu cytotoksycznego kombinacji terapii w porównaniu do monoterapii. Należy zaznaczyć,
że w przypadku pochodnych RAM-5 i RAM-2’ kombinowany efekt cytotoksyczny występował
już dla stężeń zbliżonych do wartości IC50 i niższych, natomiast dla pozostałych efekt występował
dla stężeń przekraczających tę wartość.
12
Rycina III.1. Przeżycie klonogenne komórek linii HCT116 po ekspozycji na genisteinę
lub jej pochodne pojedynczo lub w kombinacji z promieniowaniem. Komórkom podawano związki i/lub
promieniowanie jonizujące w stężeniach/dawkach o stałym współczynniku proporcjonalności. Komórki były
eksponowane na pochodne genisteiny przez 24 h przed napromienianiem. Ramkami zaznaczono najlepsze
osiągnięte efekty kombinacji.
Z porównania danych przedstawionych na rycinach III.1 i III.2 wynika,
że w badanych warunkach jedynie pochodne RAM-5 i RAM-3’ wykazywały silny kombinowany
efekt cytotoksyczny zarówno wobec komórek HCT116 jak i komórek DU145, przy czym jedynie
pochodna RAM-5 wykazywała kombinowany efekt toksyczny przy stężeniach zbliżonych
lub niższych niż wartość IC50. Należy zauważyć, że powyższe dane zaznaczają jedynie tendencję
osiąganych efektów, dlatego niezbędne było przeprowadzenie analizy uzyskanych wyników
w programie CalcuSyn.
W celu określenia jaki charakter (działanie addytywne lub synergistyczne) ma efekt łączenia
działania promieniowania jonizującego z pochodnymi genisteiny wyznaczono indeks kombinacji
metodą Chou-Talalaya korzystając z programu CalcuSyn. Wartości indeksu kombinacji (CI)
pozwalają określić rodzaj efektu kombinacji, i tak:
wartości CI powyżej 1.1 oznaczają antagonizm,
CI w zakresie 0.9-1.1 oznacza efekt addytywny,
CI w zakresie 0.7-0.9 wskazuje na słaby synergizm,
wartości CI poniżej 0.7 wskazują na istnienie synergizmu.
13
Rycina III.2. Przeżycie klonogenne komórek linii DU145 po ekspozycji na genisteinę
lub jej pochodne pojedynczo lub w kombinacji z promieniowaniem. Komórkom podawano związki i/lub
promieniowanie jonizujące w stężeniach/dawkach o stałym współczynniku proporcjonalności. Komórki były
eksponowane na pochodne genisteiny przez 24 h przed napromienianiem. Ramkami zaznaczono najlepsze
osiągnięte efekty kombinacji.
Wartości CI wyznaczane są w programie CalcuSyn dla poszczególnych efektów ED50, ED75,
ED90, czyli dla efektu wywołującego obniżenie potencjału klonogennego o kolejno 50%, 75% oraz
90%. Wyniki analizy efektu kombinacji dla komórek HCT116 przedstawiono w Tabeli III-3,
a dla komórek DU145 w Tabeli III-4.
Wartości indeksu kombinacji przedstawione w poniższych tabelach pokazują,
że synergistyczne, cytotoksyczne działanie promieniowania jonizującego i badanych związków
częściej występowało w odniesieniu do komórek raka gruczołu krokowego DU145 niż komórek raka
jelita grubego HCT116.
W przypadku komórek DU145 synergizm występował dla większości badanych związków
(wyjątkiem była genisteina i pochodna G21) przy wartościach dawki efektywnej ED75 i ED90.
Dla pochodnych RAM-5, RAM-2’, RAM-3’ i RAM-5’ synergizm można określić jako silny –
wartości indeksu kombinacji CI w zakresie od 0.15 (przy ED90) dla RAM-3’ do 0.36 (przy ED50)
dla RAM-5.
14
Tabela III-3. Wartości indeksu kombinacji (CI) dla interakcji związek-promieniowanie przy różnych efektach: ED50,
ED75, ED90 wyznaczone dla komórek nowotworowych linii HCT116. W tabeli przedstawiono średnie z co najmniej
trzech niezależnych eksperymentów wraz z odchyleniami standardowymi. Kolorem czerwonym zaznaczono
wartości wskazujące na synergizm, natomiast kolorem czarnym wartości wskazujące umiarkowany efekt
synergistyczny.
HCT116 CI ED50 ED75 ED90
GENISTEINA 1.4 ± 0.2 1.1 ± 0.1 0.9 ± 0.1
G21 0.7 ± 0.2 0.6 ± 0.2 0.6 ± 0.18
RAM-3 1.0 ± 0.6 0.9 ± 0.5 0.8 ± 0.5
RAM-5 0.8 ± 0.2 0.6 ± 0.2 0.5 ± 0.2
RAM-C-4α 1.2 ± 0.04 0.8 ± 0.1 0.6 ± 0.1
RAM-C-5α 1.2 ± 0.1 0.8 ± 0.1 0.6 ± 0.1
RAM-2' 1.1 ± 0.3 0.9 ± 0.2 0.7 ± 0.2
RAM-3' 1.2 ± 0.2 0.9 ± 0.1 0.7 ± 0.1
RAM-5' 1.5 ± 0.1 1.3 ± 0.1 1.1 ± 0.1
Tabela III-4. Wartości indeksu kombinacji (CI) dla interakcji związek-promieniowanie przy różnych efektach: ED50,
ED75, ED90 wyznaczone dla komórek nowotworowych linii DU145. W tabeli przedstawiono dane uzyskane
na podstawie obliczeń w programie CalcuSyn wraz z odchyleniami standardowymi. Wartości obliczone
na podstawie danych z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Kolorem zielonym zaznaczono wartości
wskazujące na silny synergizm, kolorem czerwonym synergizm.
DU145 CI ED50 ED75 ED90
GENISTEINA 1.2 ± 0.5 0.9 ± 0.3 0.8 ± 0.3
G21 1.1 ± 0.2 0.9 ± 0.2 0.8 ± 0.3
RAM-3 1.0 ± 0.5 0.6 ± 0.1 0.4 ± 0.1
RAM-5 0.7 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.2 ± 0.0
RAM-C-4α 0.9 ± 0.2 0.7 ± 0.2 0.7 ± 0.3
RAM-C-5α 0.9 ± 0.2 0.6 ± 0.3 0.5 ± 0.3
RAM-2' 0.5 ± 0.1 0.3 ± 0.1 0.2 ± 0.0
RAM-3' 0.9 ± 0.3 0.3 ± 0.1 0.5 ± 0.1
RAM-5' 1.1 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.2 ± 0.1
Należy zauważyć, że w linii HCT116 (ale nie w DU145) zastosowanie kombinacji
testowanych związków z promieniowaniem jonizującym w większości przypadków powodowało
powstawanie antagonizmu przy ED50. Trzeba tutaj podkreślić, że, w przeciwieństwie to powyższej
tendencji, dwie pochodne, RAM-5 oraz G21, w niskich stężeniach nie działały antagonistycznie
w kombinacji z niskimi dawkami promieniowania, ale powodowały powstawanie efektów
addytywnych bądź słabo synergistycznych. Podkreślenia wymaga, że znaczący efekt synergistyczny
obserwowano także przy ED50 dla pochodnych RAM-2’ (CI = 0.5) i RAM-5 (CI = 0.7) w linii
DU145.
15
III.3. Hamowanie aktywności EGFR przez genisteinę i jej pochodne
Badania wstępne [47] wskazywały, że niektóre glikozydowe pochodne genisteiny mogą
hamować, w stopniu znacznie bardziej nasilonym niż genisteina, aktywność kinaz tyrozynowych,
w tym kinazy będącej przedmiotem badań niniejszej pracy doktorskiej, a mianowicie receptora
naskórkowego czynnika wzrostu, EGFR. Ponieważ najważniejszym mechanizmem aktywującym
tę kinazę, jest spowodowana jej oddziaływaniem z ligandem autofosforylacja [21], zatem kolejnym
etapem pracy doktorskiej było zbadanie czy i w jakim stopniu pochodne genisteiny mogą blokować
fosforylację EGFR.
Poziom fosforylacji EGFR badano z użyciem metody „western blot”. Otrzymane obrazy
poddano analizie densytometrycznej z zastosowaniem programu ImageJ (NIH, program pobrany
ze strony http://imagej.nih.gov/ij/, na podanej stronie internetowej znajduje się również opis
metodyki oraz zastosowania programu). Wartość intensywności sygnału odczytywano
z densytogramów, a wyniki z trzech niezależnych doświadczeń uśredniano. Wyniki analizy
przedstawione w postaci wykresów słupkowych znajdują się na rycinach III.3 i III.4.
Rycina III.3. Analiza poziomu fosforylacji EGFR w komórkach HCT116 poddanych ekspozycji przez 24 godziny
na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów
z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie
oraz odchylenia standardowe normalizowane do poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli
nietraktowanej (dla której poziom badanych form pEGFR = 100%). Ramkami zaznaczono najsilniejsze efekty
(spadek zawartości pEGFR o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną zaznaczono związek działający najwydajniej.
Rycina III.6. Analiza poziomu fosforylacji EGFR w komórkach DU145 poddanych ekspozycji
na genisteinę i jej pochodne przez 24 h, a następnie napromienionych (4 Gy). Przedstawiono wyniki analiz
densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów z „western blot”. Z przynajmniej trzech niezależnych
eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane
do poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form pEGFR
= 100%). Wszystkie stężenia podano w μM. Ramkami zaznaczono związki o najlepszym efekcie hamującym
aktywność EGFR (spadek zawartości Pegfr o przynajmniej połowę). Legenda: pEGFR-Tyr 1068, pEGFR-Tyr
1173.
III.5. Hamowanie aktywności ścieżek przekazu sygnału zależnych od EGFR przez genisteinę
i jej pochodne
Oddziaływanie EGFR z ligandem aktywuje kilka cytoplazmatycznych szlaków sygnałowych
stymulujących procesy związane z proliferacją komórek, różnicowaniem, potencjałem migracyjnym
i przeżyciem. Szlakami sygnałowymi aktywowanymi w wyniku fosforylacji EGFR są między innymi
ścieżki sygnałowe RAS-RAF-MAPK oraz PI3K-AKT [24, 48, 49]. Jak pokazują dane literaturowe
konstytutywna aktywność ścieżek RAS-RAF-MAPK oraz PI3K-AKT spowodowana mutacjami w
genach K-RAS oraz PI3KCA może być przyczyną niepowodzenia w leczeniu z zastosowaniem
inhibitorów EGFR [50, 51]. Pożądaną właściwością pochodnych genisteiny, w kontekście ich
potencjalnego zastosowania jako inhibitorów EGFR, byłaby ich zdolność do hamowania kinaz
znajdujących się poniżej w szlaku przekazywania sygnału, w tym kinaz AKT i ERK 1/2. Należy przy
tym zauważyć, że wspomniane szlaki przekazu sygnału stanowią skomplikowaną sieć oddziaływań
20
pomiędzy ich poszczególnymi elementami, a zahamowanie aktywności EGFR jest tylko jednym
z wielu możliwych czynników modulujących aktywność kinaz AKT czy ERK 1/2.
W celu określenia czy zahamowanie fosforylacji EGFR przez testowane pochodne zmniejsza
aktywność szlaków zależnych od EGFR, zbadano poziom fosforylacji kinaz AKT oraz ERK 1/2
w komórkach inkubowanych przez 24 godziny z analizowanymi związkami. Jak w poprzednich
doświadczeniach posłużono się metodą „western blot” oraz densytometrii w programie ImageJ.
Wyniki analizy przedstawione w postaci wykresów słupkowych znajdują się na rycinach III.7
dla pAKT oraz III.8 dla pERK 1/2.
Rycina III.7. Analiza poziomu fosforylacji AKT w komórkach HCT116 oraz DU145 poddanych ekspozycji przez
24 godziny na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz densytometrycznych wykonanych
na podstawie obrazów z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych eksperymentów. Poszczególne słupki
obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane do poziomu białek kontrolnych
w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form pAKT = 100%). Ramkami zaznaczono
związki o najskuteczniejszym działaniu (obniżające aktywność AKT o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną
zaznaczono związek najefektywniejszy. Wszystkie stężenia podano w μM.
W przypadku komórek HCT116 tylko pochodna RAM-5 w zdecydowany sposób obniżała
poziom fosforylowanej formy kinazy AKT. Inną pochodną, która hamowała aktywację AKT, jednak
znacznie słabiej niż RAM-5, był związek G21. Spośród innych związków, które obniżały zawartość
pEGFR (RAM-C4α oraz RAM-C5α), żaden nie powodował istotnych zmian w poziomie
fosforylowanej (aktywnej) formy AKT. Inne związki, które nie hamowały aktywacji EGFR,
21
nie powodowały także zmian w poziomie aktywnej formy kinazy AKT. Interesujące jest,
że w przypadku traktowania komórek HCT116 pochodną RAM-5’ dochodziło do pobudzenia
aktywności kinazy AKT.
W przypadku komórek DU145, również tylko pochodna RAM-5 w zdecydowany sposób
obniżała poziom fosforylowanej formy kinazy AKT. Spośród innych związków, które
we wcześniejszych badaniach hamowały fosforylację EGFR (RAM-3, RAM-C-4α oraz RAM-C-5α)
jedynie RAM-3 i RAM-C4α hamowały aktywację kinazy AKT. Można także zauważyć, że inaczej
niż w przypadku komórek HCT116, również pochodna G21, jakkolwiek w stosunkowo wysokim
stężeniu, znacznie obniżała zawartość pAKT.
Rycina III.8. Analiza poziomu fosforylacji kinazy ERK 1/2 w komórkach HCT116 oraz DU145 poddanych
ekspozycji przez 24 godziny na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz densytometrycznych
wykonanych na podstawie obrazów z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych eksperymentów.
Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane do poziomu białek
kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form pAKT = 100%). Ramkami
zaznaczono związki o najskuteczniejszym działaniu (obniżające aktywność ERK 1/2 o przynajmniej połowę).
Ramką czerwoną zaznaczono związek najefektywniejszy.
Jak wynika z danych zamieszczonych na rycinie III.8 badane pochodne zasadniczo
w podobny sposób hamują aktywność kinazy ERK 1/2 (pERK 1/2) i kinazy AKT (pAKT).
I w tym przypadku związkiem najwydajniej blokującym fosforylację ERK 1/2 okazała
22
się pochodna RAM-5. Pochodna RAM-5’, która niespodziewanie zwiększała poziom fosforylowanej
formy AKT w komórkach HCT116, nie wykazywała takiego efektu w stosunku do kinazy ERK 1/2.
Otrzymane dane wskazują także, że niektóre z pochodnych zwiększają aktywność kinazy ERK 1/2.
W przypadku komórek HCT116 obserwowałam wzrost zawartości pERK 1/2 po zastosowaniu
RAM-C-4α oraz RAM-5’, w przypadku DU145: RAM-C-4α, RAM-2’ oraz w mniejszym stopniu
RAM-5’. Związek RAM-5’ powodował również wzrost zawartości pAKT w linii HCT116.
III.6. Hamowanie aktywności topoizomerazy II przez genisteinę i jej pochodne
Genisteina, jako związek o działaniu plejotropowym oddziałuje z wieloma celami
molekularnymi. Do najważniejszych celów molekularnych w kontekście blokowania proliferacji
komórek nowotworowych należy, oprócz kinaz tyrozynowych, topoizomeraza II. Genisteina,
podobnie jak etopozyd, zaliczana jest do związków określanych jako „trucizny” topoizomerazy II.
Rycina III.9. Analiza zawartości niezwiązanej z DNA frakcji topoizomerazy II α oraz II β
w komórkach linii HCT116 poddanych ekspozycji na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz
densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych
eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane
do poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form
topoizmoerazy II = 100%). Związki referencyjne użyte w doświadczeniu to etopozyd, genisteina oraz G21.
Ramkami zaznaczono związki o najlepszym efekcie hamującym aktywność TOPO II (spadek zawartości niezwiązanej z DNA topoizomerazy II o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną zaznaczono związek działający
najwydajniej.
23
Rycina III.10. Analiza zawartości niezwiązanej z DNA frakcji topoizomerazy II α oraz II β
w komórkach linii DU145 poddanych ekspozycji na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz
densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych
eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane do
poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form
topoizomerazy = 100%). Związki referencyjne użyte w doświadczeniu to etopozyd, genisteina oraz G21. Ramkami
zaznaczono związki o najlepszym efekcie hamującym aktywność TOPO II (spadek zawartości niezwiązanej z DNA
topoizomerazy II o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną zaznaczono związek działający najwydajniej.
Genisteina podana komórkom przyłącza się do związanej kowalencyjnie z DNA
topoizomerazy II tworząc potrójny kompleks (ang. ternary complex). W ten sposób genisteina
blokuje etap łączenia przeciętych nici DNA (faza ligacji) prowadząc do powstania podwójnych
pęknięć w nici DNA, a to z kolei może prowadzić do śmierci komórek [52, 53].
We wcześniejszych badaniach wykazano, że pochodna G21 wykazuje właściwość inhibitora
TOPO II (Gogler-Pigłowska et al., 2012). Można było zatem oczekiwać, że także inne pochodne
badane w niniejszej pracy również mogą wykazywać właściwość trucizn topoizomerazy.
W celu określenia wpływu wprowadzonych do cząsteczki genisteiny modyfikacji
na jej zdolność do hamowania aktywności TOPO II zastosowano test „immunoband depletion”,
a otrzymane obrazy poddawano densytometrii. Wyniki opracowane jak poprzednio przedstawiono
24
na rycinach III.9 (komórki HCT116) oraz III.10 (komórki DU145). Jak wykazałam wpływ badanych
związków na aktywność TOPO II α i TOPO II β jest w komórkach HCT116 i DU145 podobny.
W obu liniach spośród związków referencyjnych najsilniejsze działanie hamujące aktywność
topoizomerazy II wykazał etopozyd, lek rutynowo stosowany w leczeniu przeciwnowotworowym.
Genisteina i G21 hamowały aktywność topoizomerazy II, jednak istotny efekt pojawiał się jedynie,
jeśli związki te były stosowane w najwyższych badanych stężeniach. Spośród testowanych
pochodnych genisteiny jedynie RAM-5 wykazywał silny efekt hamujący aktywność TOPO II, przy
czym silniejszy w odniesieniu do formy β. Stosunkowo niskie stężenia RAM-5 (5 μM), przy których
zahamowanie aktywności TOPOII jest znaczące wskazują, że pochodna ta może być rozważana jako
interesujący obiekt dalszych badań przedklinicznych. Inne badane pochodne genisteiny nie wpływały
na aktywność żadnej z form topoizomerazy II lub obserwowany efekt hamujący był nieznaczny.
III.7. Podsumowanie wyników badań
Pochodnymi najsłabiej działającymi na wybrane do badań cele molekularne była grupa
związków O-glikozydowych podstawionych grupą ramnalową przy węglu C-4’. W przypadku
związków tej serii obserwowano ponadto pogarszanie się właściwości cytotoksycznych wraz z
wydłużaniem łącznika węglowego w cząsteczce. Pochodne te nie hamowały aktywności ani EGFR,
ani zależnych od niego szlaków sygnałowych, jak również TOPO II. Mimo to w przypadku komórek
linii DU145 działały synergistyczne z promieniowaniem jonizującym. Efekt ten musiał zatem zależeć
od działania tych pochodnych na inne cele molekularne niż badane w niniejszej pracy doktorskiej.
Pochodne O-glikozydowe podstawione przy węglu C-7 modulowały aktywność EGFR
zarówno samodzielnie, jaki i w kombinacji z IR znacząco efektywniej w komórkach linii HCT116
niż w komórkach linii DU145. Z drugiej strony to w linii DU145 po zastosowaniu pochodnych
genisteiny osiągnięto efekty silnie synergistyczne, podczas gdy w linii HCT116 jedynie
synergistyczne. Efekt działania pochodnych C-glikozydowych (RAM-C-4α, RAM-C-5α) można
ocenić jako umiarkowany, jednak słabszy niż ich analogów O-glikozydowych (RAM-3, RAM-5).
Spośród pochodnych obniżających aktywność EGFR w obu liniach komórkowych (RAM-3, RAM-
5, RAM-C-4α, RAM-C-5α) jednie RAM-5 hamował także aktywność kinaz znajdujących się poniżej
w szlaku sygnałowym zależnym od EGFR, również w linii HCT116, w której szlaki sygnałowe AKT
oraz MAPK są konstytutywnie aktywne ze względu na występowanie mutacji w genach K-RAS oraz
PI3KCA. Najważniejsze wyniki badań prowadzonych w ramach niniejszej pracy doktorskiej zostały
podsumowane w tabelach IV-5 (komórki HCT116) oraz IV-6 (komórki DU145).
Szczególnie ważnym wynikiem niniejszej pracy jest informacja, że RAM-5 pozwala na
uzyskanie istotnego efektu synergistycznego w kombinacji z promieniowaniem jonizującym już w
stężeniu 5 μM, które jest możliwe do osiągnięcia w osoczu krwi, przy założeniu, że cząsteczka RAM-
5 jest stabilna i nie ulega degradacji podczas obiegu w układzie krążenia. Dane literaturowe pokazują,
że cytotoksyczność związków radiouczulających wobec komórek nowotworowych in vitro jest
zróżnicowana i ujawnia się w zakresie stężeń od nanomolarnych do mikromolarnych [54-59].
Stężenia efektywne RAM-5 mieszczą się w zakresie stężeń mikromolarnych, co pozwala
zaklasyfikować związek do kandydatów na leki o umiarkowanych właściwościach cytotoksycznych.
25
Tabela III-1. Tabela podsumowuje dane uzyskane ze wszystkich eksperymentów dla komórek HCT116. Dla efektu wywoływanego przez pochodne na białka
zastosowano następujący opis: - oznaczał stymulację, 0 brak efektu, + inhibicję aktywności białka bądź obniżanie jego poziomu (pożądany efekt), większa ilość
plusów bądź minusów określała arbitralnie siłę efektu. Dla białek badanych w kombinacji z promieniowaniem zastosowano odniesienie do komórek
napromienionych oraz komórek kontrolnych nietraktowanych*”. Efekty kombinacji opisano w następujący sposób: - antagonizm, 0 efekt addytywny, + słaby
synergizm, + + synergizm, + + + silny synergizm (wartości liczbowe CI podane w „Materiałach i Metodach”, podrozdział III.8, tabela III-4).
*( 0 / - oznacza, że związek nie obniżał poziomu białka w porównaniu do komórek napromienionych („0”) / poziom białka był większy niż w komórkach
nietraktowanych (brak efektu „-”))
+ / 0 oznacza, że związek obniżał poziom białka w porównaniu do komórek napromienionych (efekt „+”) / do poziomu białka odpowiadającego jego zawartości
Tabela III-2. Tabela podsumowuje dane uzyskane ze wszystkich eksperymentów dla komórek DU145. Dla efektu wywoływanego przez pochodne na białka
zastosowano następujący opis: - oznaczał stymulację, 0 brak efektu, + inhibicję aktywności białka bądź obniżanie jego poziomu (pożądany efekt), większa ilość
plusów bądź minusów określała arbitralnie siłę efektu. Dla białek badanych w kombinacji z promieniowaniem zastosowano odniesienie do komórek
napromienionych oraz komórek kontrolnych nietraktowanych*”. Efekty kombinacji opisano w następujący sposób: - antagonizm, 0 efekt addytywny, + słaby
synergizm, + + synergizm, + + + silny synergizm (wartości liczbowe CI podane w „Materiałach i Metodach”, podrozdział III.8, tabela III-4).
*( 0 / - oznacza, że związek nie obniżał poziomu białka w porównaniu do komórek napromienionych („0”) / poziom białka był większy niż w komórkach
nietraktowanych (brak efektu „-”))
+ / 0 oznacza, że związek obniżał poziom białka w porównaniu do komórek napromienionych (efekt „+”) / do poziomu białka odpowiadającego jego zawartości