Steroidogenesis and differentiation in the pejerrey Odontesthes bonariensis. Ph. D. Thesis Martín. Blasco

Esteroidogénesis y diferenciación sexual en el pejerrey

Lic. Martín BlascoDirector: Dr. Gustavo Somoza1

Co-Directora: Dra. Denise Vizziano2

1. IIB-INTECH2. Dpto. Oceanología. UdelaR.URUGUAY

1

2

Composición de la tesis

Síntesis de andrógenos en órganos del pejerrey

Perfiles de expresión de marcadores

Cuantificaciónde andrógenos

Introducción. Determinación sexual y diferenciación gonadal

Devlin & Nagahama, 20023

Determinación sexual Diferenciación gonadal

4

Introducción. Mecanismos de determinación sexual

GSD GSD ESDXXXY

ZWZZ

Temperatura

pH

Strüssmann et al. 1997, Ito 2005

Introducción. TSD en el pejerrey bonaerense

5

Odontesthes bonariensis

17 C

29 C

TFM (29 C)

TFH (17 C)

semanas post-eclosión

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

EST Diferenciación

Gonadalec

losi

ón

TFMix (25 C)

Introducción. Determinación sexual y diferenciación gonadal

6

7

Introducción. Diferenciación morfológica en el pejerrey

Determinación Primeros signos de diferenciación

8

Introducción. Marcadores tempranos de la diferenciación

sox9

nr5a1 sf-1

nr0b1 dax1 dmrt1

amh

foxlfst

cyp19a1a

Introducción. Sensibilidad a los esteroides

9 Adaptado de Piferrer, 2002

Introducción. Hipótesis los esteroides como mediadores de la dif.

Estrógenos

Inh. Arom

Andrógenos

10

Estrógenos

¿Andrógenos?

Determinación sexual Diferenciación gonadal

Yamamoto, T-O ,1969

11

Introducción. Biosíntesis de esteroides sexuales en peces

Estudiar el rol de los andrógenos 11-oxigenados en el proceso de determinación-diferenciación sexual del pejerrey

Objetivo general

-Análisis de la androgénesis testicular y de otros órganos.

-Caracterización de enzimas clave para la síntesis de andrógenos.

-Expresión temprana de las enzimas de la androgénesis.

-Análisis cuantitativo de los andrógenos.

12

Objetivos particulares

La producción de esteroides es muy difícil de estudiar en los estadíos tempranos

Biología molecular para el estudio de la capacidad androgénica.

¿Qué andrógenos son importantes?

¿Qué enzimas están involucradas?

Elección de genes.

Desarrollo de la estrategia de estudio

13

14

Capítulo I. Introducción. Estudio de la esteroidogénesis

Espermatogénesis

Caracteres sexualessecundarios

T. indif.

Extracción

T. juv.

Etc.

HPLC

Identificación definitiva

DPMs/mgDPMs/pico

Fraccionamiento

15

Capítulo I. Materiales y métodos. “Bioquímica clásica”

TLCIncubación

Muestras

Resolución

Cap. I. Resultados. Testículos analizados

16

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

I II III IV-A IV-B IV-C

Experimento

IGS%

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

I II III IV-A IV-B IV-C

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

I II III IV-A IV-B IV-C

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

I II III IV-A IV-B IV-C

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

I II III IV-A IV-B IV-C

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

I II III IV-A IV-B IV-C

Juveniles Adultos

Indiferenciado

Diferenciación

mpe

Semana 5 (TFM)Incubado con A4

17

Cap. I. Resultados. Síntesis de 11-KT en la gónada indiferenciada (TFM)

11-KT

18

Cap. I. Resultados. Esteroidogénesis en testículos de juveniles

Meses 6,5 Incubados con 17P

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

I II III IV-A IV-B IV-C

19

Cap. I. Resultados. Esteroidogénesis en testículos maduros (17P)

Incubados con 17P

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

I II III IV-A IV-B IV-C

Cap. I. Resultados. Identificación de 11-KT, 11β-OHA4 y 11-KA4

20

Incubados con A4 ó 17P

Cap. I. Resultados. Esteroidogénesis en ovarios (P.V.)

21

Cap. I. Resultados. Esteroidogénesis en riñón

Riñón

11β-OHA4

22

Cap. I. Discusión y conclusiones.

23

Semana 5 TFM 11-KT

11-KTJuveniles

¿Hígado?

¿Sangre?

11-KT11β-OHA4Adultos

24

Cap. I. Discusión y conclusiones.

A4 11β-OHA4 11-KA4

11-KT

Cap. I. Discusión y conclusiones. Androgénesis en otros órganos

25

Riñón

11β-OHA4

HígadoSNC

Ovario

1. Enzimas clave en la síntesis de andrógenos (P450-scc y P450-11b)2. Estudio de la expresión en tejidos3. Expresión temprana durante el TSD y la diferenciación a TFM y TFH

Potencial androgénico durante el desarrollo gonadal

26

¿Andrógenos?

27

Capítulo II. Patrones de expresión génica

Testículos

Caracterización de las secuencias de cyp11a1

y cyp11b1Oligos qPCR

Tejidos

Sitios de expresión

t= 1, 2, ..9 spe

TFH TFM

Perfiles de expresión

Capítulo II. Troncos y gónadas pre- y post-diferenciación

28

(A) Región de unión a esteroide (Tsujita et al, 1993).

(B) Región de unión a adrenodoxina (Wada et al, 1992).

(C) Región de coordinación del grupo hemo.

Cap. II. Resultados. Secuencia y características de la cyp11a1

29

(A)Sitio de unión a esteroides

(B) Unión a oxígeno (C) Región de Ozol

(D) Sitio aromático, (E) Sitio de unión al hemo

Cap. II. Resultados. Secuencia y características de la cyp11b1

30

Cap. II. Resultados. P450-scc y P450-11b por ClustalW

31

Cap. II. Resultados. Sitios de expresión de cyp11a1 y cyp11b1

32

Cap. II. Resultados . Expresión de cyp11a1 y cyp11b1 en troncos (1-8)

33

Cap. II. Resultados . Expresión de cyp11a, 11b1, 19a1a en gónadas

34

35

Cap. II. Resultados . Marcadores de la diferenciación gonadal

Cap. II. Discusión y conclusiones

36

sox9

nr5a1

dmrt1

amh

cyp11b1

11-KT

cyp19a1a

nr5a1

cyp19a1a

37

¿ESTEROIDES?RIAsEIAs •Trazadores (radiactivos o enzimáticos)

•Disponibilidad comercial (síntesis a medida)

Capítulo III. Introducción. Determinación cuantitativa de esteroides

LC + fraccionador + extracción + RIA(3 días)

+ RIA(EIA)

Bioquímica clásica Métodos directos

•Anticuerpos específicos

•Necesidad de conjugación (haptenos)

•Reactividad cruzada

38

HPLC-ESI-MS

Capítulo III. Estrategia

Carassius auratus

Esteroides de interés medidos por RIA en un modelo conocido

Cap. III. Materiales y métodos. Iones moleculares y linealidad

LC-MS

Estándares de esteroides 11β-OHT

11-KT

11-KA4

11β-OHA4

T

A41 ppm

0,2-50 ppb

287

573595

0

20

40

60

80

100

120

101 276 347 406 472 597 684 789

A4

m/z, amu

% R

elat

ivo

y = 1550x R² = 0.9993

0.00

2000.00

4000.00

6000.00

8000.00

10000.00

12000.00

0 10 20 30

11-KT

11β-OHA4

T

SCAN

ENFOCADO

39

Evaporación

Cap. III. Materiales y métodos. Determinaciones en plasma

Centrifugación 30 min x 350 rcf

Extracción por punción del pedúnculo caudal

Extracto en fase móvil (CH3CN:H2O)

Histología gonadal

[HE:E]

Extracción orgánica [Partición-Congelación]

LC-MS40

Cap. III. Resultados. Espectros de masa en modo SCAN

305

327 631

0

20

40

60

80

100

120

101 150 210 305 438 607 681 773 868

11β-OHT

m/z, amu

% R

elat

ivo

303

605

0

20

40

60

80

100

120

100 166 237 305 378 439 503 586 686

11β-OHA4

m/z, amu

% R

elat

ivo

301

323 623

0

20

40

60

80

100

120

100 185 301 427 549 714 835

11-KA4

m/z, amu

% R

elat

ivo

287

573595

0

20

40

60

80

100

120

101 276 347 406 472 597 684 789

A4

m/z, amu

% R

elat

ivo

303

605627

0

20

40

60

80

100

120

101 157 232 304 350 400 630

11-KT

m/z, amu

% R

elat

ivo

289

577 599

0

20

40

60

80

100

120

100 134 180 224 301 353 455 741

T

m/z, amu%

Rel

ativ

o

41

Cap. III. Resultados. Resolución, LD, LQ en modo enfocado (SIM)

42

LD

LQ

43

Cap. III. Resultados . Concentraciones séricas en goldfish

Código de muestraPT

(g) Sexo EstadioPG

(g)

IGS

%

T

(ng/mL)

11-KT

(ng/mL)

11β-OHA4

(ng/ml)

GF102_11/03/08 66,57 H Ma 4,76 7,15 3,74 < 0.3 < 0.5

GF106_11/03/08 59,35 H Ma 3,64 6,14 1,62 5,78 1,89

GF107_11/03/08 50,90 H Ma 3,02 5,92 1,22 3,07 < 0.5

GF205_22/04/08 113,94 H Ma 10,30 9,04 2,51 < 0.3 1,38

GF206_22/04/08 103,30 H Ma 12,10 11,71 3,58 < 0.3 0,50

GF103_11/03/08 61,08 M Ma 1,46 2,40 4,28 12,34 3,36

GF104_11/03/08 60,68 M Ma 0,85 1,40 4,94 14,54 6,63

GF105_11/03/08 60,48 M Ma 1,69 2,80 5,93 11,70 1,27

GF201_22/04/08 81,11 M Ma 3,28 4,04 5,92 13,60 1,47

GF202_22/04/08 65,44 M Ma 1,60 2,44 5,21 19,38 < 0,5

GF203_22/04/08 98,12 M Ma 1,85 1,88 5,38 12,57 0,87

GF204_22/04/08 68,05 M E 3,21 4,72 13,25 18,66 0,86

44

GC-MS Derivatización(2 días)LC-MS (1 día)

LC + fraccionador + extracción (acondicionamiento) + RIA(3 días)

+ RIA

Cap. III. Discusión. Comparación con otros métodos

EIA-RIA

•Anticuerpo•Reacción cruzada•Trazador

Cap. III. Conclusiones

45

Cuantificación simultánea de T, 11-KT y 11β-OHA4.

Los niveles de detección y cuantificación permiten estudiosfisiológicos.

Compatible con otros sistemas (por ej. MS/MS).

Estudio de bioquímica de esteroides (metabolómica).

46

Cap. III. Proyecciones

Relación gónada Circulación

Aplicación

Análisis de 11-KT/11β-OHA4 en otros vertebrados

Estudio de vias metabólicas completas

47

Cap. III. Proyecciones. Anticipo.

Macho espermiante

T

(ng/mL)

11-KT

(ng/mL)

11β-OHA4

(ng/ml)

3,8 2,4 4,7

Suero

48

Conclusiones generales

Identificación de los principales andrógenos testiculares.

Machos en diferenciación molecular

Herramientas para estudio de andrógenos (cuali-cuantitativo)

Dimorfismo en cyp11a1 y cyp11b1

A4 11β-OHA4 11-KA4

11-KT

11-KT

Desarrollo testicular temprano

49

¿?

¿?

¿?

¿?

¿Preguntas?