-
STABILITYOFCOCAINEINPHOSPHATEBUFFERAND
INURINE*
Marianna KISZKA, Grzegorz BUSZEWICZ, Roman MDRO
ChairandDepartmentofForensicMedicine,MedicalAcademy,Lublin
ABSRTACT: The stability of cocaine and benzoylecgonine standard
solutions inphosphate buffer and cocaine solutions in three
different samples of urine was evalu-ated. The research indicated
that cocaine solution is significantly less stable
thanbenzoylecgonine solution. Both xenobiotics were isolated from
urine by means ofthree-step liquid-liquid extraction. Quantitative
analysis was performed using theHPLC method. The effect of time (up
to 90 days), temperature (+25C, +4C and20C), pH (in the range from
5 to 8) and, in the case of urine, sodium fluoride as well,was
tested. It turned out that sodium fluoride did not have a
noticeable influence onthe degradation process of cocaine and
benzoylecgonine. The stability of cocaine andbenzoylecgonine
increased with a decrease in samples storage temperature and a
de-crease in their pH. But only the freezing of samples, or their
acidifying down to pH = 5together with storage at +4C assured the
stability of the investigated cocaine
andbenzoylecgoninesolutionsfor90days.
KEY WORDS:
Cocaine;Benzoylecgonine;Stability;Autopsymaterial;Urine.
ZZagadnieNaukSdowych,z.XLIV,2000,
723Received9July2000;accepted10October2000
INTRODUCTION
The mean life-time of cocaine in the body amounts to merely 2090
min-utes [8, 10, 12, 14, 19, 20]. Only 1 to 14% of this xenobiotic
is excreted as theunchanged form with urine [8, 14]. The remaining
part of cocaine is con-verted mainly to benzoylecgonine and
ecgonine methyl ester, which com-prise over 80% of all cocaine
metabolites [1, 2, 4, 5]. The above-mentionedtransformations
consist mainly in enzymatic (to ecgonine methyl ester) orchemical
(to benzoylecgonine) hydrolysis of two ester bonds included in
thecocainemolecule[8,18].
* This article is based on a presentation given at the 11th
Meeting of the Polish Society ofForensic Medicine and Criminology,
d, 1998. The first author, dr Marianna Kiszka,received the
Professors Jan Markiewicz and Tadeusz Borkowski of the Institute of
ForensicResearchMemorialAward.
-
The enzymatic and chemical processes that lead to degradation of
cocainein the body of living persons are continued after death and
in biological ma-terial collected during autopsy and from living
persons. The hydrolysis of co-caine to benzoylecgonine depends
considerably on pH [9]. This is confirmedby our observations1,
indicating that in aqueous medium at pH between8.5 and 9 after 16
hours approximately 1/10 to over 1/3 of the initial amountof
cocaine is excreted to benzoylecgonine. One should keep in mind the
de-pendence of the cocaine degradation rate on pH, because gradual
pH changesof biological material take place with time in corpses as
well as in vitro [16].
There is no doubt that for diagnostic needs of fatal and other
cocaine poi-sonings it is important to find out exactly the
transformations which it un-dergoes in vitro. This knowledge is
essential to appropriately protect biologi-cal or standard
materials against degradation of cocaine and benzoylecgo-nine, to
avoid xenobiotics loss during toxicological analysis and correctly
in-terpret the results. Cocaine stability was tested in urine
because its pH var-ies and also because in the case of living
persons it is the only biological ma-terial which can be obtained
non-invasively and in sufficient amounts
fortoxicologicalinvestigations.
MATERIALSANDMETHODS
Standard solutions of cocaine and benzoylecgonine were prepared
usingthree phosphate buffers with different pH (5.0, 7.4 and 8.0).
Phosphatebuffer was applied because it is used as a mobile phase in
determination ofthese xenobiotics by means of the HPLC method.
Three samples of urinewere collected from three different corpses.
Each sample was divided into3 portions and their pH was adjusted to
5.0, 6.0 and 8.0 respectively,
withtheuseof0.1MHClsolutionand0.1MNaOHsolution.
In the next step of urine preparation for analysis, each of the
nine sam-ples was divided into 2 parts and sodium fluoride NaF (in
the amount
re-quiredtoreachaconcentrationof5mg/ml)wasaddedtooneofthem.
Next, each buffer and each of the eighteen urine samples were
dividedinto two parts. Cocaine was added to one part of each buffer
solution andbenzoylecgonine in the amount required to create a
concentration of 5 mg/mlwas added to the other one. In the case of
urine, cocaine (in the amount re-
8 M.Kiszka,G.Buszewicz,R.Mdro
1 Mdro R., Kiszka M., Buszewicz G., Fatal cocaine poisoning a
presentation at the 4th PolishScientific Conference Poisonings,
injuries, alcoholism and drug addiction in forensic
andmedicalpractice,Bielsko-Biaa,2728April,1995.
-
quired to obtain a concentration of 5 mg/ml) was added to one
half of the
eigh-teensamplesandtheotheronewasleftasthebackgroundcontrol.
The initial concentration of cocaine and benzoylecgonine, which
was as-sumed as 100%, was determined directly after preparation of
their solutionsin phosphate buffers and in urine. After
determination of initial xenobioticsconcentrations, their solutions
were divided and put into tubes which werestored at different
temperatures, +25C, +4C and 20C respectively. Thesamples were
collected for analysis after 1, 7, 14, 21, 30, 60 and 90 days inthe
case of cocaine and benzoylecgonine solutions in buffers and after
1, 7,30,60and90daysinthecaseofcocainesolutionsinurine.
Xenobiotics were isolated from urine by means of three-step
liquid-liquidextraction with the use of dichloromethane /
isopropanol mixture (3:1), 0.1
NHClandonceagaindichloromethane/isopropanolmixture(3:1)2.
Quantitative determinations were carried out by means of the
HPLCmethod using a liquid chromatograph manufactured by Gilson
equippedwith a spectrophotometric detector with fluent adjustment
of wavelength.Chromatographic separation was performed on a
Hypersil ODS (250 x4.0 mm, 5 mm) column. A mixture of 80% 0.025 M
phosphate buffer, pH = 3(with addition of 0.5% triethylamine) and
20% acetonitryle constituted themobile phase, in a two-pump system.
Before each use, the buffer andacetonitryle were filtered on Nylon
66 Membranes 0.45 mm x 47 mm pur-chased by Supelco and vented by
constant helium flow. The flow rate of theeluent amounted to 1 ml
per minute and the volume of the injected sample 10 ml. The
measurements were carried out at l = 233 nm. The detector signalwas
processed electronically using Gilson 715 HPLC System
ControllerSoftware. Concentrations of cocaine and benzoylecgonine
were determinedfrom the appropriate calibration curves using Gilson
715 HPLC System soft-ware. The internal standard method (with use
of lignocaine) was applied inthe case of urine investigations and
the external standard method was
usedinthecaseofbuffersolutionsanalysis3.
Diagrams of solution preparation and storage are shown in
Figures 1 and 2.132 samples of cocaine and benzoylecgonine
solutions in phosphate buff-
ersand558urinesampleswereanalysed.
Stabilityofcocaineinphosphatebuffer... 9
2 The procedure was shown in detail at the presentation: Kiszka
M., Buszewicz G, Mdro R.,Determination of cocaine and
benzoylecgonine in urine, 14th Szczecin Scientific
Symposium,Szczecin,2426September,1997.
3 The analytical procedures of cocaine and benzoylecgonine
determination were presented indetail at the presentation: Kiszka
M., Mdro R., Buszewicz G., Analytical problemsconnected with
cocaine determination in tissues, 11th Meeting of the Polish
Society ofForensicMedicineandCriminology,d,25September,1998.
-
10 M.Kiszka,G.Buszewicz,R.Mdro
Figure 1. A diagram of preparation and storage of cocaine and
benzoylecgonine inbuffersolutions.
-
Stabilityofcocaineinphosphatebuffer... 11
Figure2.Adiagramofpreparationandstorageofurinesamples.
-
RESULTSANDDISCUSSION
The results of the study were displayed in the form of stability
curves, i.e.,graphs of the relationship between the concentration
of cocaine or ben-zoylecgonine (expressed as percentages of initial
concentration), and thestorage time of samples at different pH and
temperature. Figure 3 concernscocaine and benzoylecgonine solutions
in phosphate buffers and Figure 4 cocaine in urine. Good and
moderate stability periods of cocaine in bufferand in urine
according to sample pH and storage temperature are shown inTable 1.
Stability was assumed to be good when cocaine loss was
smallerthan15%andmoderatewhenitwasbetween15and30%.
TABLE1. PERCENTAGES OF MEAN COCAINE LOSS (L) IN PHOSPHATE BUFFER
ANDURINE
Temperature 25C 4C
Days 1 7 30 60 90 1 7 30 60 90
Buffer
pH=5 2 4 5 7 14 0 1 2 3 8
pH=7.4 13 75 100 100 100 0 10 33 51 61
pH=8 45 86 100 100 100 5 34 53 70 86
Urine
pH=5 2 3 9 23 76 0 0 3 2 11
pH=6 1 6 66 100 100 1 1 4 10 33
pH=8 49 84 100 100 100 12 37 63 84 100
Stable(L
-
Stabilityofcocaineinphosphatebuffer... 13
Figure 3. The stability of cocaine (C) and benzoylecgonine (BE)
in standard
solutionsaccordingtostorageperiods(days),temperatureandpHofphosphatebuffers.
-
the buffer pH (up to 8) caused approximately 2 to 3 times
greater loss of co-caine.
Cocaine stability in standard solutions decreased greatly at
+25C. AtpH = 7.4, about 10% of the initial cocaine concentration
had alreadydecomposed within one day. The loss level averaged 75%
after 7 days and co-cainewastotallydecomposedafter3weeks.
14 M.Kiszka,G.Buszewicz,R.Mdro
Figure 4. The stability of cocaine (C) in urine (expressed in
per cents, calculated asthe mean value of 3 urine samples)
according to temperature and storage periods(days),pHofurineand NaF
addition.
-
On the other hand, the benzoylecgonine standard solutions were
muchmore stable. After 2 months of their storage at +25C only about
1/5 of theinitial xenobiotic
concentrationhaddecomposedbothatpH7.4and8.
Other authors [9, 13] have observed a similar influence of
temperatureand pH on cocaine hydrolysis in aqueous solutions. There
is a lack of data inthe available literature concerning
benzoylecgonine stability at different pH.However, in a study by
Isenschmid [13], longer stability of benzoylecgonine(the hydrolysis
product of cocaine) in alkaline buffers is seen (compared
tococaine). Similar trends were observed in (our) described
experiment. Co-caine decomposed to benzoylecgonine and over a
relatively long period oftime (about 60 days), especially in the
weakly alkaline solutions (pH = 7.4)the sum of the concentrations
of both substances was comparable to the ini-tial cocaine
concentration. However, buffer alkalinity decreased
benzoylec-goninestabilitythiswasparticularlyclearinsamplesstoredat+25C.
The freezing of urine samples similar to standard solutions
guaranteedthe stability of cocaine over 90 days, regardless of pH.
Dugan et al. [6] ascer-tained good stability of drugs in urine
samples frozen to 20C, but even inthese conditions, the cocaine
concentration decreased after one year by
37%onaverageandmaximally87%.
It turned out that the shapes of cocaine stability curves in
urine and inbuffers at identical or similar pHs were similar. But
it has to be noted that inroom temperature a change of the pH from
5 to 6, i.e. a small decrease of acid-ity caused a considerable
decrease of cocaine stability. Thus the acidity ofthe urine did not
stabilise cocaine as effectively as the acidity of the
buffer.Satisfactory cocaine stability was ascertained only in urine
samples atpH = 5 stored in a refrigerator at +4C under these
conditions cocaine didnot undergo significant degradation in the
space of 90 days. In the case ofurine samples stored at 25C,
acidity (pH = 5) ensured sufficient cocaine
sta-bilityonlyfor60days.
The alkalinity of urine was conducive to faster degradation of
cocaine. Insamples of pH = 8 stored at +4C after just 1 day,
cocaine loss averaged 12%and after 7 days 37%. When samples were
stored at +25C it averaged 49%and 84% respectively. Moreover, an
increase of benzoylecgonine concentra-tion, (as was the case in
acidic buffers and acidic urine), was observed simul-taneously.
The experimentally demonstrated increased speed of cocaine
degrada-tion in urine with increase of pH from acidic to alkaline
fully confirmed theresults of Baselts research [3]. He ascertained
an approximately two-folddecline of cocaine concentration in urine
at pH = 8 (after 3 weeks of storageat +4C), and no significant
changes in the cocaine level in urine at pH = 5stored at this
temperature. Our observations are also similar to the findingsof
Dugan et al. [7]. However, we found a definitely slower cocaine
hydrolysis
Stabilityofcocaineinphosphatebuffer... 15
-
at +25C in acidic urine. The observed cocaine loss was only
about 10% after30 days, while Dugan ascertained as much as a
10-fold decline of
cocaineconcentrationafter7daysofurinestorageinthesameconditions.
Because about 23% of cocaine was lost from urine at pH = 5
stored at+25C after 60 days, and as much as about 76% after 90
days, the view ofHippenstiel and Gerson [11] should be rejected.
These authors deliberate, onthe basis of Isenschmids investigation
[13], the usefulness of refrigerationof urine at this acidity. It
should be noted that Isenschmid performed deter-minations of
cocaine in buffers, where it is more stable than in urine.
More-over, the research was finished after 4 weeks, while urine
storage up to thebeginning of analysis and during the time analysis
is performed is very oftenmuchlonger.
The findings of this experiment that cocaine degradation in
urine at dif-ferent pH was intensified with increase in temperature
of sample storageare similar to the observations of Javaid et al.
[15] and Matsubara et al. [17].The statement that addition of NaF
as a preservative in the amount of5 mg/ml does not significantly
affect cocaine stability in urine at pH = 5, 6 and8 during storage
from 1 to 90 days at +4C and at +25C, was in full agreementwith the
observations of other authors [3, 17].
CONCLUSIONS
1. Cocaine is degradation to benzoylecgonine in standard
solutions aswellasinurinesamples.
2. Because benzoylecgonine is much more stable in biological
material,
itshouldbedeterminedinthecaseofsuspicionofcocainepoisoning.
3. Immediate freezing prevents the degradation of cocaine
contained instandardsolutionsandurinesamples.
4. When the investigated material can be stored only at +4C,
satisfac-tory cocaine stability for 90 days is ensured by
acidifying of urine sam-plestopH=5.
5. Storage of urine at pH = 5 and at +25C longer than 60 days
createsariskofsignificantdegradationofcocainepresentinthesample.
References:
1. A m b r e J . , F i s c h m a n M . , R u o T . I ., Urinary
excretion of ecgonine methylester, a major metabolite of cocaine in
humans, [in:] Cocaine: determination inhuman body fluids. Reprints
of selected articles from the Journal of AnalyticalToxicology,
Baselt R. C., Espe E. [ed.], Preston Publications, Niles
1988,pp.7981.
16 M.Kiszka,G.Buszewicz,R.Mdro
-
2. A m b r e J ., The urinary excretion of cocaine and
metabolites in humans: A ki-netic analysis of published date, [in:]
Cocaine: determination in human body flu-ids. Reprints of selected
articles from the Journal of Analytical Toxicology,Baselt R.C.,
Espe E.[ed.],PrestonPublications,Niles1988,pp.99103.
3. B a s e l t R . C ., Stability of cocaine in biological
fluids, Journal of Chromatogra-phy 1983,vol.268,pp.502505.
4. B o g u s z M . , S c h m i d t G ., Cocain-Missbrauch Neue
Bedrohung mit deralten Substanz, Zeitschrift fr Rechtsmedizin
1991,Bd.35,S.783793.
5. C l a r k e E . G . C ., Isolation and identification of
drugs in pharmaceutical,
bodyfluidsandpost-mortemmaterial,ThePharmaceuticalPress,London1986.
6. D u g a n S . , B o g e m a S . , S c h w a r t z R . W . [et
al.], Stability of drugs of abusein urine samples stored at 20C,
Journal of Analytical Toxicology 1994, vol. 18,pp.391396.
7. D u g a n S . H . , C o s t a n t i n o A . G . , B o g e m a
S . C . [et al.], A study of the sta-bility of cocaine,
benzoylecgonine, ecgonine methyl ester, creatinine, and
otherchemistriesinurine, JournalofAnalyticalToxicology
1996,vol.20,p.74.
8. F l e m i n g J . A . , B y c k R . , B a r a s h P . G .,
Pharmacology and therapeutic ap-plicationsofcocaine,
Anaesthesiology 1990,vol.73,pp.518531.
9. F l e t c h e r S . M . , H a n c o c k V . S ., Potential
errors in benzoylecgonine and co-caineanalysis,
JournalofChromatography 1981,vol.206,pp.193195.
10. G a w i n F . H . , E l l i n w o o d E . H ., Cocaine and
other stimulants. Actions,abuse, and treatment, New England Journal
of Medicine 1988, vol. 318,pp.11731182.
11. H i p p e n s t i e l M . J . , G e r s o n B .,
Optimization of storage conditions for co-caine and benzoylecgonine
in urine: a review, Journal of Analytical
Toxicology1994,vol.18,pp.104109.
12. I s e n s c h m i d D . S . , F i s c h m a n M . W . , F o
l t i n L . W . [et al.], Concentra-tion of cocaine and metabolites
in plasma of humans following intravenous ad-ministration and
smoking of cocaine, Journal of Analytical Toxicology
1992,vol.16,pp.311314.
13. I s e n s c h m i d D . S . , L e v i n e B . S . , C a p l
a n Y . H ., A comprehensive studyof the stability of cocaine and
metabolites, Journal of Analytical Toxicology
1989,vol.13,pp.250256.
14. I t e n P . X ., Fahren unter Drogen- oder
Medikamenteneinfluss. Forensische In-terpretation und Begutachtung,
Institut fr Rechtsmedizin Forensische
Toxiko-logieUniversitt,Zurich1994.
15. J a v a i d J . I . , D e k i r m e n i j a n H . , D a v i
s J . M . [et al.], Determination of co-caine in human urine,
plasma and red blood cell by gas-liquid
chromatography,JournalofChromatography 1978,vol.152,pp.105113.
16. M a r k i e w i c z J ., Swoisto sdowych bada
chemiczno-toksykologicznych,Zzagadniekryminalistyki
1971,z.VI,s.2229.
17. M a t s u b a r a K . , M a s e d a C . , F u k u i Y .,
Quantitation of cocaine, ben-zoylecgonine and ecgonine methyl ester
by GC-CI-SIM after Extrelut extraction,ForensicScienceInternational
1984,vol.26,pp.181192.
18. S t e w a r t D . J . , I n a b a T . , L u c a s s e n M .
[et al.], Cocaine metabolism: co-caine and norcocaine hydrolysis by
liver and serum esterases, Clinical Pharma-cologyandTherapeutics
1979,vol.25,pp.464468.
Stabilityofcocaineinphosphatebuffer... 17
-
19. W e i s s R . D . , G a w i n H . F ., Protracted
elimination of cocaine metabolites inlong-term, high-dose cocaine
abusers, American Journal of Medicine 1988,vol.85,pp.879880.
20. W i l k i n s o n P . , V a n D y k e C . , J a t l o w P .
[et al.], Intranasal and oral co-caine kinetics, Clinical
Pharmacology and Therapeutics 1980, vol. 27,pp.386394.
18 M.Kiszka,G.Buszewicz,R.Mdro
-
TRWAO KOKAINYWBUFORZEFOSFORANOWYM
IWMOCZU*
Marianna KISZKA, Grzegorz BUSZEWICZ, Roman MDRO
WSTP
redni czas ptrwania kokainy (C) w organizmie wynosi zaledwie
2090 min[8, 10, 12, 14, 19, 20]. Tylko 114% tego ksenobiotyku
wydalane jest w postaci nie-zmienionej z moczem [8, 14]. Pozostaa
cz C przechodzi w benzoiloekgonin (BE)i ester metylowy ekgoniny
(EME), ktre stanowi ponad 80% wszystkich metaboli-tw C [1, 2, 4,
5]. Powysze przemiany polegaj gwnie na hydrolizie enzymatycznej(do
EME) lub chemicznej (do BE) dwu wiza estrowych zawartych w
czsteczce C[8,18].
Procesy enzymatyczne i chemiczne, ktre zayciowo prowadz do
degradacji C,tocz si dalej w zwokach oraz w materiale biologicznym
pobieranym podczas sekcjii od osb ywych. Hydroliza C do BE zaley
przy tym w znacznym stopniu od pH [9],co potwierdzaj spostrzeenia
autorw1, z ktrych wynika, e w wodnym rodowiskuo pH = 8,59 ju po 16
godzinach rozkadowi do BE ulega w przyblieniu od 1/10 doponad 1/3
pocztkowej iloci C. Naley pamita o zalenoci tempa degradacji C
odtego czynnika, bowiem wraz z upywem czasu nastpuj stopniowe
zmiany pH mate-riaubiologicznegozarwnow zwokach,jaki in vitro
[16].
Nie ulega wic wtpliwoci, e dla potrzeb diagnostyki miertelnych
(i innych) za-tru C istotne znaczenie ma dokadne poznanie przemian,
jakim podlega ona in vitro.Wiedza ta jest niezbdna po to, by
odpowiednio zabezpieczy materia biologiczny(lub wzorcowy) przed
degradacj C i BE oraz po to, by unikn strat ksenobiotykwpodczas
analizy toksykologicznej i prawidowo zinterpretowa jej wyniki.
Natomiastrozpoczcie testowania trwaoci C w moczu byo podyktowane
tym, e jego pH wahasi oraz tym, e w przypadku osb ywych jest to
jedyny materia biologiczny, ktrymona uzyska w sposb nieinwazyjny i
w odpowiedniej iloci do bada toksykolo-gicznych.
* Niniejszy artyku opracowany zosta na podstawie referatu pt.
Trwao kokainy w materia-le biologicznym, ktry zosta uznany za
najlepsz prac przedstawion podczas XI Krajo-wego Zjazdu Polskiego
Towarzystwa Medycyny Sdowej i Kryminologii w odzi w 1998 roku,a jej
pierwszy autor (dr Marianna Kiszka) otrzymaa Nagrod Imienia
Profesorw InstytutuEkspertyz Sdowych Jana Markiewicza i Tadeusza
Borkowskiego.
1 Mdro R., Kiszka M., Buszewicz G., miertelne zatrucie kokain
referat wygoszony naIV Oglnopolskiej Konferencji Naukowej Zatrucia,
urazy, alkoholizm i narkomania w prak-tycesdowo-lekarskiej,
Bielsko-Biaa,2728 kwietnia 1995r.
-
MATERIAIMETODY
Roztwory wzorcowe C i BE wykonano z uyciem trzech buforw
fosforanowycho rnym pH (5,0; 7,4; 8,0), co podyktowane byo tym, e
wanie bufor fosforanowyjest stosowany (jako faza ruchoma) przy
oznaczaniu tych ksenobiotykw metodHPLC. Trzy prbki moczu pobrano z
trzech rnych zwok i kad z nich podzielonona trzy porcje, ktrych pH
zmodyfikowano do 5,0; 6,0 i 8,0 dodajc odpowiednie iloci0,1 M
roztworu HCl i0,1 M roztworu NaOH.
W kolejnym etapie przygotowywania moczu do bada kad z dziewiciu
prbekpodzielono na dwie czci i do jednej dodano fluorek sodu NaF (w
iloci potrzebnej douzyskania stenia 5 mg/ml). Nastpnie kady bufor i
kad z osiemnastu prbekmoczu podzielono na p. Do jednej poowy kadego
z buforw dodano C, a do drugiejBE w iloci odpowiedniej do uzyskania
stenia 5 mg/ml. Natomiast w przypadku mo-czu, do jednej poowy kadej
z osiemnastu prbek dodano C (rwnie w iloci odpowied-niej do
uzyskania stenia 5 mg/ml), a drug poow pozostawiono jako kontrol
ta.
Wyjciowe, przyjmowane nastpnie za 100%, stenie C i BE oznaczano
bezpo-rednio po przygotowaniu ich roztworw w buforach fosforanowych
i w moczu. Pooznaczeniu wyjciowych ste ksenobiotykw ich roztwory
rozdzielono do prob-wek, ktre przechowywano w rnej temperaturze
(+25C, +4C, 20C) i pobieranodo bada po 1, 7, 14, 21, 30, 60 i 90
dniach w przypadku roztworw C i BE w
buforachorazpo1,7,30,60i90dniachwprzypadkuroztworwCwmoczu.
Ksenobiotyki z moczu wyosobniano metod trjetapowej ekstrakcji
typuciecz-ciecz przy uyciu mieszaniny dichlorometan / izopropanol
(3:1), a nastpnie0,1 NHCl iponowniemieszanin dichlorometan /
izopropanol (3:1)2.
Analiz ilociow wykonywano metod HPLC przy uyciu chromatografu
cieczo-wego firmy Gilson z detektorem spektrofotometrycznym o
pynnej regulacji dugocifali. Rozdzia chromatograficzny
przeprowadzono na kolumnie Hypersil ODS (250 x4,0 mm, 5 mm). Faz
ruchom stanowia mieszanina: bufor fosforanowy 0,025 M,pH = 3 (z
dodatkiem 0,5% trietylaminy) acetonitryl w proporcjach 80:20 w
systemiedwch pomp. Przed kadym uyciem bufor oraz acetonitryl byy
filtrowane (Nylon 66Membranes, 0,45 mm x 47 mm firmy Supelco), a
nastpnie odpowietrzane przezcigy przepyw helu. Prdko przepywu
eluentu wynosia 1 ml/min., a objtowstrzykiwanej prbki 10 ml.
Pomiary wykonywano przy dugoci fali l = 233 nm.Sygna z detektora
przetwarzany by elektronicznie z zastosowaniem oprogramowa-nia
Gilson 715 HPLC System Controller Software. Stenia C i BE
wyznaczano me-tod standardu wewntrznego (ktry w trakcie badania
moczu stanowia lidokaina)lub standardu zewntrznego (w przypadku
analizy roztworw buforowych) z odpo-wiednich krzywych kalibracji
(oprogramowanie Gilson 715 HPLC System3). Schema-
20 M.Kiszka,G.Buszewicz,R.Mdro
2 Metoda przedstawiona zostaa szczegowo na XIV Szczeciskim
Sympozjum Naukowym,ktre odbyo si w dniach 2426 wrzenia 1997 r., w
referacie: Kiszka M., Buszewicz G,Mdro R.,Oznaczanie kokainy i
benzoiloekgoniny wmoczu.
3 Procedury analityczne zwizane z oznaczaniem C i BE
przedstawione zostay szczegowow trakcie XIKrajowego Zjazdu
Polskiego Towarzystwa Medycyny Sdowej i Kryminologii(d, 25 wrzenia
1998 r.) w referacie: Kiszka M., Mdro R., Buszewicz G.,
Problemyanalityczneanezoznaczeniemkokainywtkankach.
-
ty, zgodnie z ktrymi przygotowywano i przechowywano roztwory,
przedstawiaj ryci-ny 1 i 2.
Przebadano 132 prbki roztworw C i BE w buforach fosforanowych
oraz 558 pr-bekmoczu.
WYNIKIIDYSKUSJA
Wyniki bada przedstawiono w postaci krzywych trwaoci (C i BE w
buforachfosforanowych rycina 3 oraz C w moczu rycina 4), tj.
wykresw zalenoci ste Club BE (wyraonych w procentach pocztkowego
stenia) od czasu przechowywaniaprbek o rnym pH w rnej temperaturze.
Natomiast tabela I zawiera zestawienieokresw dobrej (ubytek C
poniej 15%) lub redniej (ubytek C w zakresie 1530%)stabilnoci C w
buforze i w moczu w zalenoci od pH prbek i temperatury, w jakiejbyy
przechowywane.
Z krzywych trwaoci, ktre przedstawia rycina 3, wynika
jednoznacznie, eprzez 90 dni przechowywania kwanych (bufor
fosforanowy pH = 5) roztworw wzor-cowych C i BE nie stwierdzono w
nich znaczcego ubytku obu ksenobiotykw nawetwwczas, gdy temperatura
prbek wynosia +25C. Roztwory C i BE okazay sitrwae (niezalenie od
ich pH) rwnie w temperaturze 20C. Natomiast rezultatyanalizy prbek
o pH = 7,4 i 8 przechowywanych w temperaturze +4C i +25C wy-kazay,
e wzrost temperatury oraz wzrost pH powodoway ubytek zarwno C, jaki
BE. W roztworach wzorcowych kokainy jej ubytkowi towarzyszyo przy
tym adek-watnenarastaniesteniaprodukturozpadu, tj. BE.
Wpyw pH na stabilno C by szczeglnie wyrany w trakcie
przechowywaniaroztworw w temperaturze +4oC. Przy pH = 7,4 po jednym
dniu nie obserwowano bo-wiem strat C, a po jednym tygodniu wynosiy
one zaledwie 10%, ale ju niewielkiwzrost pH
buforu(do8)powodowawprzyblieniu23-krotniewikszyubytekC.
Stabilno C w roztworach wzorcowych obniaa si najbardziej w
temperaturze+25C. W roztworze o pH = 7,4 ju po jednym dniu
rozkadowi ulegao bowiem okoo10% pocztkowego stenia C, po siedmiu
dniach poziom strat wynosi rednio
75%,apotrzechtygodniachdochodziodocakowitego rozkadu C.
Natomiast roztwory wzorcowe BE byy wielokrotnie bardziej
stabilne, o czymwiadczy fakt, e po 2 miesicach ich przechowywania w
temperaturze +25C tylkookoo 1/5 pocztkowego stenia ksenobiotyku
ulegao degradacji zarwno przypH =7,4,jaki pH =8.
Podobny wpyw temperatury i pH na hydroliz C w jej wodnych
roztworach byobserwowany przez innych autorw [9, 13]. W dostpnej
literaturze brakuje nato-miast danych na temat stabilnoci BE w
roztworach o rnym pH. W pracy Isen-schmida [13] widoczne jest
jednak dusze (w porwnaniu z C) utrzymywanie si BEbdcej produktem
hydrolizy substancji macierzystej w buforach alkalicznych.W
opisanym eksperymencie obserwowano podobne tendencje. C rozkadaa si
bo-wiem do BE, przy czym przez do dugi czas (ok. 60 dni), zwaszcza
w roztworachsabo alkalicznych (pH = 7,4), suma ste obu substancji
bya zbliona do wyjcio-wego stenia C. Zasadowy odczyn buforu
zmniejsza jednak trwao BE, co
byoszczeglniewyranewprbkachprzechowywanychwtemperaturze+25C.
Zamroenie prbek moczu, podobnie jak zamroenie prbek roztworw
wzorco-wych, gwarantowao trwao C przez 90 dni niezalenie od pH. Z
publikacji Dugana
Trwao kokainywbuforzefosforanowym... 21
-
i in. [6], ktrzy stwierdzali znaczn stabilno lekw w prbkach
moczu zamroonychdo 20C, wynika jednak, e nawet w tych warunkach po
roku nastpowao obnieniesteniaCrednioo37%,amaksymalnieo87%.
Okazao si, e krzywe trwaoci C w moczu miay ksztat do zbliony do
krzy-wych trwaoci C w buforach o identycznym lub zblionym pH.
Zwraca jednak uwagfakt, e w temperaturze pokojowej zmiana pH z 5 do
6 (tj. niewielkie obnienie od-czynu kwanego) powodowao znaczne
zmniejszenie stabilnoci C. Zatem kwany od-czyn nie stabilizowa C w
moczu tak skutecznie, jak kwany odczyn buforu. W penizadowalajc
trwao C stwierdzono bowiem tylko w prbkach moczu o pH = 5
prze-chowywanych w lodwce w temperaturze +4C, gdy wwczas nie ulegaa
onaznaczcemu rozkadowi przez 90 dni. Natomiast w przypadku prbek
moczu prze-chowywanych w temperaturze +25C odczyn pH = 5 zapewnia
wystarczajc sta-bilnoCtylkoprzez60dni.
Zasadowy odczyn moczu sprzyja szybkiej degradacji C. W prbkach o
pH = 8przechowywanych w temperaturze +4C ju po 1 dniu straty C
wynosiy rednio 12%,a po 7 dniach 37%, za w temperaturze +25C
odpowiednio 49% i 84%. Obserwowanoprzy tym (podobnie jak w buforach
i w moczu o odczynie kwanym) rwnoczesne na-rastaniestenia BE.
Wykazane eksperymentalnie przyspieszenie degradacji C w moczu w
miarzmiany pH od kwanego do zasadowego w peni potwierdza wyniki
bada Baselta[3], ktry stwierdzi okoo dwukrotne obnianie si stenia C
w moczu o pH = 8 (po3 tygodniach przechowywania w temperaturze +4C)
i brak istotnych zmian poziomuC w przechowywanym w tej temperaturze
moczu o pH = 5. Obserwacje autorw ni-niejszej publikacji s rwnie
zbiene z ustaleniami Dugana i in. [7]. Autorzy wyka-zali jednak
zdecydowanie wolniejsz hydroliz C w temperaturze +25C w moczuo
kwanym odczynie. Po 30 dniach zaobserwowane straty C wynosiy
zaledwie okoo10%, podczas gdy Dugan po 7 dniach przechowywania
moczu w tych samych
warun-kachstwierdziadziesiciokrotnyspadeksteniaC.
Ze wzgldu na to, e w moczu o pH = 5, ktry przechowywano w
temperaturze+25C, po 60 dniach degradacji ulegao okoo 23% C, a po
90 dniach nawet okoo 76%,odrzuci naley pogld Hippenstiela i Gersona
[11]. Autorzy ci na podstawie wyni-kw bada Isenschmida [13]
zastanawiaj si bowiem nad celowoci schadzaniamoczu o tym odczynie.
Tymczasem Isenschmid oznacza C w buforach, w ktrych jestona
bardziej stabilna ni w moczu, a ponadto dowiadczenie koczyo si po
upywieczterech tygodni, podczas gdy przechowywanie moczu do chwili
rozpoczcia
analizyiwtrakciejejwykonywanianiejednokrotnietrwaznacznieduej.
Ustalenia niniejszego eksperymentu, z ktrych wynika, e rozkad C
w moczuo rnym pH nasila si wraz ze wzrostem temperatury
przechowywania prbek, sw przyblieniu zgodne z obserwacjami Javaida
i in. [15] oraz Matsubary i in. [17].W peni zgodne z obserwacjami
innych autorw [3, 17] okazao si natomiast ustale-nie, e dodatek
substancji konserwujcej pod postaci NaF w iloci 5 mg/ml niewpywa w
uchwytny sposb na stabilno C w moczu o pH = 5, 6 i 8 podczas jego
prze-chowywania przez okres od 1 do 90 dni zarwno w temperaturze
+4C, jak i +25C.
22 M.Kiszka,G.Buszewicz,R.Mdro
-
WNIOSKI
1. W roztworach wzorcowych i w prbkach moczu kokaina rozkada si
do benzo-iloekgoniny.
2. Zdecydowanie wysza trwao benzoiloekgoniny w materiale
biologicznymstanowi wskazanie do jej oznaczania w przypadku
podejrzenia o zatrucie ko-kain.
3. Natychmiastowe zamroenie zapobiega rozkadowi kokainy zawartej
w roz-tworachwzorcowychiwprbkachmoczu.
4. W przypadku, gdy materia do bada mona przechowywa jedynie w
tempe-raturze +4C, zadowalajc stabilno kokainy zapewnia przez 90
dni zakwa-szenieprbekmoczudo pH =5.
5. Przechowywanie moczu o pH = 5 w temperaturze +25C duej ni 60
dni wiesizryzykiemznacznejdegradacjizawartejwnimkokainy.
Trwao kokainywbuforzefosforanowym... 23