Date: Mercredi le 2 février 2011 Heure: 9h00 à 12h00 Durée: 3 heures Lieu: salle de conférence du 3e étage (T3-61), bloc T du Centre de recherche du CHUL-CHUQ PHS 7013 - Génomique humaine Responsable du cours: professeure Francine Durocher Section: Séquençage de nouvelle génération Responsable de la section: professeur Jacques Corbeil Séquençage de nouvelle génération Étudiant au doctorat -- Directeur: professeur Jacques Corbeil -- Codirecteur: professeur François Laviolette S.B. n'est pas Auxiliaire d'enseignement à l'Université Laval Faculté de médecine, Université Laval Préparation et présentation du cours: Sébastien Boisvert
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Séquençage de nouvelle génération - boisvert.info · ... Séquençage de nouvelle génération Responsable de la ... for the Advancement of Science. ... 70% du marché de l'analyse
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Date: Mercredi le 2 février 2011Heure: 9h00 à 12h00Durée: 3 heuresLieu: salle de conférence du 3e étage (T3-61),bloc T du Centre de recherche du CHUL-CHUQ
PHS 7013 - Génomique humaineResponsable du cours: professeure Francine Durocher
Section: Séquençage de nouvelle générationResponsable de la section: professeur Jacques Corbeil
Séquençage de nouvelle génération
Étudiant au doctorat -- Directeur: professeur Jacques Corbeil -- Codirecteur: professeur François LavioletteS.B. n'est pas Auxiliaire d'enseignement à l'Université Laval
Faculté de médecine, Université Laval
Préparation et présentation du cours: Sébastien Boisvert
La structure de l'ADN
Watson JD, Crick FH.Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid.Nature. 1953 Apr 25;171(4356):737-8. http://www.nature.com/nature/dna50/archive.html
Plusieurs cibles sont détectées ou quantifiées ou décodées en parallèle
Jian-Bing Fan, Mark S. Chee & Kevin L. GundersonHighly parallel genomic assaysNature Reviews Genetics 7, 632-644 (August 2006) | doi:10.1038/nrg190http://www.nature.com/nrg/journal/v7/n8/full/nrg1901.html
Quantifier l'expression des ARNs messagers en séquençant l'ADN complémentaire
Idées générales
• Pour séquencer un polymère, on doit détecter le monomère à chaque position
• L'ADN a 4 monomères
• La méthode intuitive: détecter le monomère à chaque position itérativement
exemple: ATTCGGGACTAGGGCAT
• La méthode par compression: détecter le “déroulement de la séquence”
exemple: 1A 2T 1C 3G 1A 1C 1T 1A 3G 1C 1A 1T
TerminateurQuatre réactions de séquençage – unepour chaque base
deoxynucléotides and dideoxynucléotides (terminateurs)
Fin aléatoire de la polymérisation
Pour chaque base (A,T, C et G), nous avons toutes les sous-chaînes finissant par celle-ci,triées par longueur (sur gel)
L'analyse pénible est faite manuellement
Sanger F, Nicklen S, Coulson AR.DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 Dec;74(12):5463-7.http://www.pnas.org/content/74/12/5463.abstract
Pas de terminaison aléatoire, Séquençage par synthèse
Détection lors de l'incorporation des nucléotides
Problème majeur avec les homopolymères (AAAA versus AAAAA, 4A vs 5A)
Ronaghi M, Uhlén M, Nyrén P.A sequencing method based on real-time pyrophosphate.Science. 1998 Jul 17;281(5375):363, 365http://www.sciencemag.org/content/281/5375/363.long
Tout comme la technologie d'Affymetrix, les nouvelles technologies de séquençage utilisent des matrices d'échantillons
En général, les nouvelles technologies de séquençage filment les réactions qui se déroulent en parallèle
Les images sont analysées par ordinateur et on obtient beaucoup de données génétiques
Version parallèle
Basée sur une technologie à flux sur cellule
Developpée by 454, acheté by Roche
Margulies M et al.Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors.Nature. 2005 Sep 15;437(7057):376-80.http://www.nature.com/nature/journal/v437/n7057/abs/nature03959.html
Stephen M. Rumble, Phil Lacroute, Adrian V. Dalca, Marc Fiume, Arend Sidow, Michael BrudnoSHRiMP: Accurate Mapping of Short Color-space ReadsPLoS Comput Biol 5(5): e1000386. doi:10.1371/journal.pcbi.1000386http://www.ploscompbiol.org/article/info:doi/10.1371/journal.pcbi.1000386
L'espace de couleursLa technologie SOLiD génère des lectures colorées
Exemple: vert veut dire A si le nucléotide précédent était un C
Bentley DR, et al.Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.Nature. 2008 Nov 6;456(7218):53-9.http://www.nature.com/nature/journal/v456/n7218/abs/nature07517.html
Bentley DR, et al.Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.Nature. 2008 Nov 6;456(7218):53-9.http://www.nature.com/nature/journal/v456/n7218/abs/nature07517.html
Séquences en pairesFabrication des librairies en paires
Harris TD et al.Single-molecule DNA sequencing of a viral genome.Science. 2008 Apr 4;320(5872):106-9.http://www.sciencemag.org/content/320/5872/106.short
Le décodage est fait pendant que la polymérase fait son travail
Developpée par Pacific Biosciences
Eid J et al.Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules.Science. 2009 Jan 2;323(5910):133-8.http://www.sciencemag.org/content/323/5910/133.abstract
Daniel Branton et al.The potential and challenges of nanopore sequencingNature Biotechnology 26, 1146 - 1153 (2008) doi:10.1038/nbt.1495http://www.nature.com/nbt/journal/v26/n10/full/nbt.1495.html
Paul Flicek & Ewan BirneySense from sequence reads: methods for alignment and assembly.Nature Methods 6, S6 - S12 (2009) http://www.nature.com/nmeth/journal/v6/n11s/abs/nmeth.1376.html
•Assemblage avec référence•Assemblage sans référence
Surtout avec une référence: la séquence du génome humain
Avec ou sans enrichissement
La réaction en chaîne de la polymérase (PCR) est une méthode d'enrichissement !
Sarah B. Ng et al.Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomesNature 461, 272-276 (10 September 2009) | doi:10.1038/nature08250http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7261/full/nature08250.html
The 1000 Genomes Project ConsortiumA map of human genome variation from population-scale sequencingNature 467, 1061–1073 (28 October 2010) doi:10.1038/nature09534 http://www.nature.com/nature/journal/v467/n7319/full/nature09534.html
Cole Trapnell & Steven L SalzbergHow to map billions of short reads onto genomesNature Biotechnology 27, 455 - 457 (2009) doi:10.1038/nbt0509-455http://www.nature.com/nbt/journal/v27/n5/abs/nbt0509-455.html
Assemblageavec une référence
Chaque lecture est placée à la bonne place sur le génome humain en utilisant une sorte de table des matières
Paul Flicek & Ewan BirneySense from sequence reads: methods for alignment and assembly.Nature Methods 6, S6 - S12 (2009) http://www.nature.com/nmeth/journal/v6/n11s/abs/nmeth.1376.html
On trouve des chevauchements petits entre les lectures d'ADN et on construit un consensus
Ewan BirneyAssemblies: the good, the bad, the uglyNature Methods 8, 59–60 (2011) doi:10.1038/nmeth0111-59http://www.nature.com/nmeth/journal/v8/n1/abs/nmeth0111-59.html
Erreurs d'assemblage
“The low cost of short-read sequencing has motivated the development of de novo assemblies from only short-read data; impressively, assemblies for large mammalian genomes are now available. However, this is still a developing field, and these de novo assemblies have many artifacts, as do all de novo assemblies.
Zhong Wang, Mark Gerstein & Michael SnyderRNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomicsNature Reviews Genetics 10, 57-63 (January 2009) | doi:10.1038/nrg2484http://www.nature.com/nrg/journal/v10/n1/abs/nrg2484.html
Quantifier l'expression des gènes en utilisant le séquençage à haut débit
Peter J. Turnbaugh, Ruth E. Ley, Micah Hamady, Claire M. Fraser-Liggett, Rob Knight & Jeffrey I. GordonThe Human Microbiome ProjectNature 449, 804-810 (18 October 2007) | doi:10.1038/nature06244http://www.nature.com/nature/journal/v449/n7164/full/nature06244.html
Junjie Qin et al.A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencingNature 464, 59-65 (4 March 2010) | doi:10.1038/nature08821http://www.nature.com/nature/journal/v464/n7285/full/nature08821.html