SÚPRAVA NA DETEKCIU POVRCHOVÉHO ANTIGÉNU VÍRUSU … · alebo plazme. Tento test je určený na diagnostické použitie a na skríning krvi darcov. 2. ZHRNUTIE A VYSVETLENIE TESTU

[SK] 1

Monolisa™ HBs Ag ULTRA 1 platnička - 96 72346 5 platničiek - 480 72348 SÚPRAVA NA DETEKCIU POVRCHOVÉHO ANTIGÉNU VÍRUSU HEPATITÍDY B V ĽUDSKOM SÉRE ALEBO PLAZME ENZÝMOVOU IMUNOLOGICKOU TECHNIKOU

883661- 2013/11

[SK] 2

OBSAH

1. PLÁNOVANÉ POUŽITIE ........................................................................... 3

2. ZHRNUTIE A VYSVETLENIE TESTU ......................................................... 3

3. PRINCÍPY POSTUPU ............................................................................... 3

4. REAGENCIE ............................................................................................ 4

5. VAROVANIA A PREVENTÍVNE OPATRENIA ............................................. 5

6. VZORKY .................................................................................................. 6

7. POSTUP .................................................................................................. 7

8. OBMEDZENIA TESTU ............................................................................ 1 0

9. FUNKČNÉ CHARAKTERISTIKY .............................................................. 1 0

10. BIBLIOGRAFICKÉ ODKAZY .................................................................... 1 2

[SK] 3

1. PLÁNOVANÉ POUŽITIE Test Monolisa™ HBs Ag ULTRA je kvalitatívnou jednokrokovou enzýmovou imunologickou technikou „sendvičového“ typu pre detekciu povrchového antigénu vírusu hepatitídy B (HBs Ag) v ľudskom sére alebo plazme. Tento test je určený na diagnostické použitie a na skríning krvi darcov.

2. ZHRNUTIE A VYSVETLENIE TESTU Detekcia HBs Ag v sére alebo plazme poukazuje na infekciu zapríčinenú vírusom hepatitídy B. Je to prvý marker, ktorý sa objaví a môže sa pozorovať 2 alebo 3 týždne pred klinickými a biologickými príznakmi ochorenia. Doba jeho prítomnosti môže byť veľmi krátka (niekoľko dní) alebo veľmi dlhá (niekoľko rokov). HBs Ag pretrvávajúce viac ako 6 mesiacov v sére sa označuje ako „chronická hepatitída“. Vzhľadom na existenciu mnohých asymptomatických chronických prenášačov hepatitída B predstavuje významné nebezpečenstvo pri transfúzii a ochrana prenosu vychádza z detekcie HBs Ag pri každom darovaní krvi.

3. PRINCÍPY POSTUPU Test Monolisa™ HBs Ag ULTRA je kvalitatívnym jednokrokovým enzýmovým imunologickým testom, ktorý vychádza z princípu „sendvičového“ typu a používa monoklonálne protilátky a polyklonálne protilátky vybrané pre ich schopnosť viazať sa na rôzne podtypy HBs Ag, ktoré v súčasnosti WHO rozpoznáva, a na väčšinu rôznych HBV reťazcov. Pevná fáza testu Monolisa™ HBs Ag ULTRA je potiahnutá monoklonálnymi protilátkami. Konjugáty testu Monolisa™ HBs Ag ULTRA vychádzajú z použitia monoklonálnych protilátok z myší a polyklonálnych protilátok z kôz proti HBs Ag. Tieto protilátky sa viažu na peroxidázu. Postup testu obsahuje nasledujúce kroky reakcií:

1. Distribúcia kontrolných sér a vzoriek do jamiek na mikroplatničke. Túto distribúciu je možné kontrolovať vizuálne: medzi prázdnou jamkou a jamkou obsahujúcou vzorku je jasný rozdiel v sfarbení. Táto distribúcia sa môže kontrolovať aj automaticky čítaním pri 490/620-700 nm (voliteľné).

2. Distribúcia červeného konjugátu do jamiek. Túto distribúciu je tiež možné kontrolovať vizuálne. Po pridaní roztoku konjugátu sa farba jamky zmení na červenú. Túto distribúciu je možné kontrolovať aj automaticky pomocou čítania zo spektrofotometra pri 490/620-700 nm (voliteľné). V tomto kroku manipulácie je možné tiež kontrolovať usadenie vzorky automatickým čítaním pri 490/620-700 nm.

3. Po inkubácii pri 37 °C po dobu jeden a pol hodiny sa neviazaný konjugát odstráni premytím. 4. Distribúcia sfarbeného roztoku substrátu. Túto distribúcie je možné kontrolovať vizuálne:

medzi prázdnou jamkou a jamkou obsahujúcou ružový roztok substrátu je jasný rozdiel v sfarbení. Táto distribúcia sa môže kontrolovať aj automaticky čítaním pri 490 nm (voliteľné).

5. Po 30-minútovej inkubácii za prítomnosti substrátu v tme a pri izbovej teplote (18-30 °C) sa prítomnosť komplexného konjugátu ukáže zmenou farby.

6. Distribúcia zastavovacieho roztoku. Túto distribúciu je možné kontrolovať vizuálne. Roztok substrátu, ktorý bol na začiatku ružový, stratí svoje sfarbenie v jamkách s nereagujúcou vzorkou a sfarbí sa do modra a do žlta pri jamkách s pozitívnou vzorkou.

7. Čítanie optickej hustoty pri 450/620-700 nm a interpretácia výsledkov.

[SK] 4

4. REAGENCIE

4.1. Popis Identifikácia na

označení Popis Balenie / príprava

72346 72348

R1 Microplate

Mikroplatnička 12 pásikov v každej z 8 jamiek, potiahnuté monoklonálnymi anti-HBs protilátkami. Špecifické číslo ID = 51

1 doštička Pripravená na

použitie

5 doštičiek Pripravené na

použitie

R2 Concentrated

washing solution (20X)

Koncentrovaný premývací roztok (20X) Tris pufer NaCl pH 7,4 Stabilizačný prostriedok: Proclin™ 300 (0.04%)

1 ampulka 70 ml

Zriediť

1 ampulka 235 ml Zriediť

R3 Negative control

Negatívna kontrola Tris HCl pufer obsahujúci BSA (Bovine Serum Albumine - hovädzí sérový albumín) Stabilizačný prostriedok: ProClinTM 300 (0,1 %)

2 ampulky 2 x 2,5 ml

Pripravené na použitie

2 ampulky 2 x 2,5 ml

Pripravené na použitie

R4 Positive control

Pozitívna kontrola (ľudská) Tris HCl pufer obsahujúci BSA s pridaním zmesi purifikovaného HBs AG z ad a ay ľudských podtypov Stabilizačný prostriedok: ProClinTM 300 (0,1 %)

1 ampulka 2,5 ml

Pripravená na použitie

1 ampulka

2,5 ml Pripravená na

použitie

R6 Conjugate diluent

Riedidlo konjugátu Tris HCl pufer s pH 7,4 obsahujúci BSA, Tween® 20, hovädzie imunoglobulíny a myšacie imunoglobulíny s kontrolnou reagenciou pridanou do vzorky Stabilizačné prostriedky: ProClin™ 300 (0,1%), Ciprofloxacine (10 µg/ml)

1 ampulka 8 ml

Rekonštituovať

2 ampulky 2 x 18 ml

Rekonštituovať

R7 Conjugate

Konjugát Myšacie monoklonálne anti-HBs protilátky a kozie polyklonálne anti-HBs protilátky viazané na peroxidázu. Lyofilizované.

1 ampulka q.s. ad

8 ml Rekonštituovať

2 ampulky q.s. ad

2 x 18 ml Rekonštituovať

R8 Substrate buffer

Pufrovací substrát Kyselina citrátová a roztok octanu sodného pH 4,0, obsahujúci H2O2 (0,015%) and DMSO (4 %)

1 ampulka 60 ml

Rekonštituovať

2 ampulky 2 x 60 ml

Rekonštituovať

R9 Chromogen: TMB solution

(11X)

Chromogén: TMB roztok Roztok obsahujúci tetrametylbenzidín (TMB)

1 ampulka 5 ml

Zriediť

2 ampulky 2 x 5 ml Zriediť

R10 Stopping solution Zastavovací roztok Roztok kyseliny sírovej (H2SO4 1N)

1 ampulka 28 ml

Pripravená na použitie

3 ampulky 3 x 28 ml

Pripravené na použitie

4.2. Podmienky skladovania a manipulácie Táto súprava by mala byť skladovaná pri teplote +2-8 °C.Každá položka tejto súpravy skladovaná pri teplote +2-8 °C môže byť použitá až do dátumu exspirácie uvedeného na obale (pokiaľ nie je indikované inak).

[SK] 5

Po otvorení a pri absencii kontaminácie môžu byť reagencie R2, R3, R4, R6, R7, R8, R9 a R10 uchovávané pri teplote 2-8 °C použité až do dátumu exspirácie uvedeného na etikete.

Identifikácia Uchovávanie

R1 Po otvorení vzduchotesne uzatvoreného vrecúška môžu byť pásiky s mikrojamkami uchovávané pri teplote +2-8 °C používané 1 mesiac, ak sú v starostlivo uzatvorenom pôvodnom vrecúšku.

R2 Rozriedený premývací roztok môže byť 2 týždne skladovaný pri teplote +2-30 °C. Koncentrovaný premývací roztok (R2) môže byť uchovávaný pri teplote +2-30 °C.

R6 + R7 Po rekonštitúcii reagencie uchovávané pri teplote +2-8°C po dobu 1 mesiaca a pri 18-30°C po dobu 8 hodín.

R8 + R9 Po rekonštitúcii môžu byť reagencie uložené v tme používané 6 hodín pri teplote miestnosti (18-30 °C).

5. VAROVANIA A PREVENTÍVNE OPATRENIA Určené na diagnostické použitie in vitro. Na profesionálne používanie v zdravotníckej starostlivosti.

5.1. Zdravotné a bezpečnostné opatrenia • S touto testovacou súpravou by mal pracovať len kvalifikovaný personál vyškolený v

laboratórnych postupoch a oboznámený s potenciálnymi rizikami. Noste vhodný ochranný odev, rukavice, ochranu očí/tváre a so súpravou manipulujte v súlade so zásadami správnej laboratórnej praxe.

• Testovacia súprava obsahuje komponenty ľudskej krvi. Reagencia R4, pozitívna kontrola,

obsahuje purifikovaný HBs Ag z podtypov ad a ay pripravených z ľudskej plazmy negatívnej na anti HIV-1/anti HIV-2 a anti-HCV protilátky a inaktivované teplom. Žiadna známa testovacia metóda nedokáže ponúknuť kompletné uistenie o tom, že sú prítomné infekčné agensy. Preto by sa malo so všetkými derivátmi ľudskej krvi, reagenciami a ľudskými vzorkami zaobchádzať tak, ako keby prenášali infekčnú chorobu, na základe odporúčaných univerzálnych bezpečnostných opatrení pre krvné patogény stanovených miestnymi, regionálnymi a národnými nariadeniami.

• Biologické rozliatia: Rozliaty materiál z ľudského zdroja by sa mal považovať za potenciálne

infekčný. Rozliaty materiál, ktorý neobsahuje kyselinu, by sa mal ihneď dekontaminovať, vrátane oblasti rozliatia, materiálov a všetkých kontaminovaných povrchov alebo zariadení s vhodným chemickým dezinfekčným činidlom, ktoré je účinné na potenciálne bioriziká spojené s príslušnými vzorkami (bežné riedenie 1:10 s bielidlom z domácnosti, 70-80 % etanolom alebo izopropanolom, jodoforom [ako je 0,5 % Wescodyne™ Plus, atď.) a dosucha zotrieť. Rozliaty materiál, ktorý obsahuje kyselinu, by sa mal vhodne absorbovať (zotrieť) alebo neutralizovať, oblasť by sa mala opláchnuť vodou a utrieť dosucha; materiály použité na absorpciu rozliateho materiálu si môžu vyžadovať likvidáciu ako biologicky nebezpečný odpad. Potom by sa mala celá oblasť dekontaminovať niektorým chemickým dezinfekčným činidlom.

POZNÁMKA: Nedávajte do autoklávu roztoky obsahujúce bielidlo!

• Zlikvidujte všetky vzorky a materiály použité na vykonávanie testu, pretože môžu obsahovať

infekčné látky. Laboratórny, chemický alebo biologicky nebezpečný odpad musí byť manipulovaný a zlikvidovaný v súlade so všetkými lokálnymi, regionálnymi a národnými nariadeniami.

• Odporúčania, týkajúce sa nebezpečenstva a opatrení vzťahujúcich sa na niektoré chemické

komponenty v tejto testovacej súprave, nájdete na piktograme (piktogramoch) na nálepkách a v informáciách poskytnutých na konci pokynov na používanie. Karta bezpečnostných údajov je dostupná na www.bio-rad.com.

[SK] 6

5.2. Opatrenia vzťahujúce sa na postup 5.2.1. Príprava

Spoľahlivosť výsledkov závisí od správnej implementácie nasledujúcich zásad správnej laboratórnej praxe:

• Nepoužívajte exspirované reagencie. • Nezmiešavajte alebo nezdružujte reagencie z rôznych šarží v rámci vykonávania testu. • Pred použitím počkajte 30 minút, aby sa reagencie stabilizovali pri izbovej teplote (18-30

°C) a jednu hodinu pri rozriedenom premývacom pufri R2. • Názov testu a tiež špecifické identifikačné číslo testu sú napísané v rámčeku každej

mikroplatničky. Toto špecifické identifikačné číslo je tiež uvedené na každom pásiku. Monolisa™ HBs Ag ULTRA: Špecifické číslo ID = 51

Pred používaním si overte špecifické identifikačné číslo. Ak identifikačné číslo chýba, alebo je iné, ako je uvedené číslo odpovedajúce testu, pásik by nemal byť použitý. POZNÁMKA: Pre premývací roztok (R2, identifikácia etikety: 20X zelená farba), pufrovací peroxidázový substrát (R8, identifikácia etikety: TMB pufer, modrá farba), chromogén (R9, identifikácia etikety: TMB 11X, purpurová farba) a zastavovací roztok (R10, identifikácia etikety: 1N červená farba), je možné použiť iné šarže ako sú obsiahnuté v súprave, za predpokladu, že je v rámci daného testu použitá tá istá šarža. Tieto reagencie môžu byť použité s niektorými inými výrobkami našej spoločnosti. Podrobnejšie informácie môžete získať od nášho technického servisu.

• Opatrne rekonštituujte reagencie, aby ste sa vyhli akejkoľvek kontaminácii. • Používajte sklené výrobky, ktoré sú dôkladne umyté a opláchnuté deionizovanou vodou,

alebo radšej používajte jednorazový materiál. • Nedovoľte, aby mikroplatnička vyschla v čase medzi ukončením premývania a distribúciou

reagencií. • Enzýmová reakcia je veľmi citlivá na kovové ióny. Kvôli tomu nedovoľte, aby sa dostal žiadny kovový prvok do kontaktu s rôznymi roztokmi konjugátu alebo substrátu.

• Vyvíjací roztok (pufrovací substrát + chromogén) musí mať ružové sfarbenie. Zmena tohto sfarbenia v priebehu niekoľkých minút po rekonštitúcii indikuje, že reagencia nemôže byť použitá a musí byť vymenená. Príprava vyvíjacieho roztoku môže byť vykonaná v čistej jednorazovej plastovej miske alebo sklenej nádobe, ktorá bola najskôr umytá s 1N HCl, dôkladne opláchnutá destilovanou vodou a vysušená. Táto reagencia musí byť uchovávaná v tme.

• Nikdy nepoužívajte tú istú nádobu na distribúciu konjugátu a vyvíjacieho roztoku.

5.2.2. Spracovávanie • Nemeňte postup testu. • Nikdy nevykonávajte test za prítomnosti reakčných výparov (kyselina, alkália, aldehydové

výpary) alebo prachu, ktoré môžu zmeniť enzymatickú aktivitu konjugátu. • Pre každú vzorku použite novú pipetovaciu špičku. • Dobré premytie je kritický krok v tomto postupe: rešpektujte odporúčaný počet

premývacích cyklov a zaistite, aby sa všetky jamky celkom zaplnili a potom celkom vyprázdnili. Nesprávne premývanie môže viesť k nepresným výsledkom.

• Starostlivo dodržujte popísané postupy premývania, aby ste získali maximálnu výkonnosť testu. Pri niektorých nástrojoch môže byť potrebné optimalizovať postup premývania (zvýšenie počtu cyklov kroku premývania a/alebo množstva premývacieho pufra pre každý cyklus), aby ste dosiahli prijateľnú úroveň pozadia OD pre negatívnu vzorku.

• Ohľadom adaptácií a špeciálnych postupov kontaktujte našu spoločnosť.

6. VZORKY Odoberte vzorku krvi podľa aktuálnych praktík. Test by mal byť vykonaný na neriedenom sére alebo plazme (odobrané na EDTA, heparíne, citráte sodnom alebo ACD). Oddeľte sérum alebo plazmu zo zrazeniny alebo červených krviniek tak rýchlo, ako je to možné, aby ste sa vyhli akejkoľvek hemolýze. Extenzívna hemolýza môže ovplyvniť výkon testu. Vzorky obsahujúce zhluky musia byť pred testovaním vyčistené centrifugáciou. Suspendované fibrínové čiastočky alebo zhluky môžu dať falošné pozitívne výsledky. Vzorky sa uchovávajú pri teplote +2-8 °C, ak je test vykonaný do 7 dní, alebo môžu byť niekoľko mesiacov hlboko zmrazené pri teplote -20 °C. Neopakujte viac ako 3 cykly zmrazenia/rozmrazenia.

[SK] 7

Vzorky obsahujúce do 90 g/l albumínu, 100 mg/l bilirubínu, lipemické vzorky obsahujúce do 36 g/l ekvivalentu triglyceridu a hemolyzované vzorky obsahujúce do 1 g/l hemoglobínu neovplyvňujú výsledky. Neodporúča sa však použitie kontaminovaného hyperlipemického alebo hyperhemolyzovaného séra alebo plazmy. Ohrievanie vzoriek sa neodporúča. Ak majú byť vzorky prepravované, musia byť zabalené v súlade s platnými nariadeniami týkajúcimi sa prepravy etiologických činidiel a uprednostňuje sa ich preprava v zmrazenom stave.

7. POSTUP

7.1. Požadovaný materiál, ktorý sa nedodáva

• Destilovaná voda. • Chlórnan sodný (bieliaci prostriedok pre domácnosti) a bikarbonát sodný. • Absorpčný papier. • Jednorazové rukavice. • Ochranné okuliare. • Jednorazové skúmavky. • Automatické alebo poloautomatické, nastaviteľné alebo vopred nastavené pipety alebo

multipipety na meranie a dávkovanie 50 µl, 100 µl, 1000 µl a 10 ml. • Odmerné valce s objemom 100 ml 1000 ml. • Automatický, poloautomatický alebo manuálny systém premývania mikroplatničiek (*). • Vodný kúpeľ alebo ekvivalentný inkubátor na mikroplatničky, termostaticky nastavený na 37

°C ± 1 °C (*). • Nádoba na nebezpečný biologický odpad. • Čítačka mikroplatničiek vybavená filtrami 450 nm, 490 nm a 620-700 nm (*). (*) Získajte od nás podrobnejšie informácie o vybavení odporúčanom naším technickým oddelením.

7.2. Príprava reagencií 7.2.1. Reagencie pripravené na používanie

Reagencia 1 (R1): Mikrodoštička Každý rámčekový držiak obsahujúci 12 pásikov je zabalený v utesnenom fóliovom vrecúšku. Odstrihnite vrecúško s použitím nožníc alebo skalpela 0,5 až 1 cm nad uzáverom. Otvorte vrecúško a vyberte rámček. Vložte nepoužité pásiky naspäť do vrecúška. Vrecúško opatrne uzavrite a znovu ho skladujte pri teplote +2-8 °C. Reagencia 3 (R3): Negatívna kontrola Reagencia 4 (R4): Pozitívna kontrola Reagencia 10 (R10): Zastavovací roztok

7.2.2. Reagencie na rekonštitúciu Reagencia 2 (R2): Koncentrovaný umývací roztok (20X) Rozrieďte v pomere 1:20 v destilovanej vode, aby ste získali premývací roztok pripravený na použitie. Pre jednu platničku s 12 pásikmi pripravte 800 ml roztoku. Reagencia 6 (R6) + Reagencia 7 (R7): Pracovný roztok konjugátu Na pracovnom stole jemne poklepte na ampulku lyofilizovaného konjugátu (R7), aby ste odstránili z gumového viečka akúkoľvek substanciu. Opatrne odstráňte viečko a nalejte obsah ampulky riediaceho roztoku konjugátu (R6) do ampulky lyofilizovaného konjugátu (R7). Nasaďte viečko a nechajte postáť 10 minút pri občasnom jemnom potrasení a prevrátení, aby ste uľahčili rozpustenie. Reagencia 8 (R8) + Reagencia 9 (R9): Enzýmový vyvíjací roztok Rozrieďte chromogén (R9) v pufrovacom substráte (R8) v pomere 1:11 (napr. 1 ml reagencie R9 + 10 ml reagencie R8); 10 ml je potrebné a dostatočné množstvo pre 12 pásikov. Homogenizujte.

[SK] 8

7.3. Postup testu Dôsledne dodržiavajte postup. Používajte negatívne a pozitívne kontrolné séra pre každom teste, aby sa potvrdila kvalita testu. Dodržiavajte nasledujúce zásady správnej laboratórnej praxe:

1) Starostlivo pripravte plán distribúcie a identifikácie vzoriek. 2) Pripravte riedený premývací roztok R2 (pozrite si kap. 7.2). 3) Pripravte pracovný roztok konjugátu R6+R7 (pozrite si kap. 7.2). 4) Vyberte z ochranného obalu podporný rámček a potrebný počet pásikov (R1). Vložte

nepoužité pásiky naspäť do ich obalu. Zatvorte obal a uchovávajte ho pri teplote +2-8 °C. 5) Naplňte jamky v nasledujúcom poradí (odporúčané poradie distribúcie):

• 100 µl negatívna kontrola (R3) do jamiek A1, B1, C1 a D1 • 100 µl pozitívna kontrola (R4) do jamky E1 • 100 µl prvej neznámej vzorky v jamke F1, ak sa táto jamka nepoužíva ako kontrolná

jamka pre potvrdenie vzorky a usadeniny konjugátu (voliteľné) • 100 µl neznámej vzorky v jamkách G1, H1 atď. V závislosti od použitého systému je možné modifikovať polohu kontrol alebo poradie distribúcie.

POZNÁMKA: V tomto kroku manipulácie je možné distribúciu vzoriek a kontrol kontrolovať vizuálne, medzi prázdnou jamkou a jamkou obsahujúcou vzorku je rozdiel v zafarbení (pozrite si kap. 7.7).

6) Rýchlo dávkujte 50 µl roztoku konjugátu (R6 + R7) do všetkých jamiek; roztok konjugátu musí byť pred použitím potrasený. Homogenizujte reakčnú zmes.

POZNÁMKA: V tomto kroku manipulácie je možné distribúciu vzoriek ako aj distribúciu konjugátu kontrolovať vizuálne. V tomto kroku manipulácie môže byť vizuálne kontrolovaná distribúcia roztoku konjugátu (R6+R7), ktorý je červený. (Pozrite si kap. 7.7.)

7) Keď je to možné, zakryte doštičku novou adhezívnou fóliou. 8) Inkubujte mikroplatničku 1 hodinu a 30 minút (± 5 min.) pri teplote 37 °C ± 1 °C. 9) Ak je to potrebné, odstráňte adhezívnu fóliu. Odsajte obsahy jamiek do zásobníka tekutého

odpadu a pridajte do každej jamky minimálne 370 µl premývacieho roztoku. Znovu odsajte a opakujte premývanie minimálne 4-krát. Zvyškové množstvo musí byť menej ako 10 µl (ak je to potrebné, vysušte pásiky tak, že ich prevrátite na odsávací papier). Ak máte automatickú premývačku, postupujte podľa rovnakého prevádzkového cyklu.

10) Pripravte vyvíjací roztok (reagencia R8 + R9). 11) Rýchlo dávkujte do každej jamky 100 µl pripraveného vyvíjacieho roztoku (R8+R9), čerstvo

pripraveného pred použitím. Umožnite vývoj reakcie v tme po dobu 30 minút (± 5 min.) pri izbovej teplote (18-30 °C). Počas tejto inkubácie nepoužívajte adhezívnu kryciu fóliu.

POZNÁMKA: V tomto kroku manipulácie môže byť vizuálne kontrolovaná distribúcia vyvíjacieho roztoku, ktorý je ružový. Medzi prázdnou jamkou a jamkou obsahujúcou ružový roztok substrátu je jasný rozdiel. (Pozrite si kap. 7.7.)

12) Pridajte 100 µl zastavovacieho roztoku (R10) s použitím rovnakej sekvencie a rýchlosti distribúcie ako pre roztok substrátu. Homogenizujte reakčnú zmes.

POZNÁMKA: V tejto etape manipulácie môže byť distribúcia bezfarebného zastavovacieho roztoku vizuálne kontrolovaná. Ružová farba substrátu (pre negatívne vzorky) alebo modrá farba (pre pozitívne vzorky) sa stráca z jamiek, ktoré sa po pridaní zastavovacieho roztoku stávajú bezfarebné (pre negatívne vzorky) alebo žlté (pre pozitívne vzorky).

13) Opatrne utrite spodok každej dplatničky. Po pridaní zastavovacieho roztoku počkajte

najmenej 4 minúty pred odčítaním a do 30 minút od zastavovacej reakcie odčítajte optickú hustotu (OD) pri 450/620-700 nm s použitím čítačky platničiek.

14) Skontrolujte, či sa zhodujú spektrofotometrické a vizuálne výsledky a či bol dodržaný plán distribúcie platničky a vzorky a plán identifikácie.

7.4. Kontrola akosti V každej sérii testu použite negatívnu kontrolu (R3) a pozitívnu kontrolu (R4) na potvrdenie platnosti testu. (Pozrite si kap. 7.5.)

[SK] 9

7.5. Kritériá potvrdenia testu Platnosť tohto testu je potvrdená pri rešpektovaní nasledujúcich podmienok:

1) Pre negatívnu kontrolu R3: OD R3 ≤ 0,080 Ak jedna z jednotlivých hodnôt negatívne kontroly R3 sa líši o viac ako 40 % od strednej hodnoty (OD R3), neberte danú hodnotu do úvahy a znovu uskutočnite výpočet so zvyšnými tromi hodnotami negatívnej kontroly. Týmto spôsobom je možné eliminovať len jednu hodnotu.

V prípade veľmi nízkeho pozadia pre negatívnu kontrolu R3 (priemerná hodnota negatívnej kontroly je menej ako 0,010 OD) nepoužite tieto kritériá odmietnutia pre negatívnu kontrolu R3.

Test sa musí znovu uskutočniť, ak sú všetky kontrolné hodnoty mimo týchto noriem.

2) Pre pozitívnu kontrolu R4:

OD R4 ≥ 1,000

7.6. Výpočet/Interpretácia výsledkov Vylúčenie sa stanovuje negatívnou kontrolou R3: Vypočítajte strednú hodnotu nameranej absorbancie pre negatívnu kontrolu R3. Vypočítajte hodnotu vylúčenia: stredná OD R3 + 0,050. Prítomnosť alebo neprítomnosť HBs Ag sa stanovuje porovnaním registrovanej absorbancie s vypočítanou hodnotou vylúčenia pre každú vzorku. Pre každú vzorku je vypočítaný nasledujúci pomer: Pomer = OD vzorky / hodnota CO Vzorky s nižšou optickou hustotou ako je hodnota vylúčenia (pomer < 1) sú považované testom Monolisa™ HBs Ag ULTRA za negatívne. Hodnoty tesne pod hodnotou vylúčenia (CO-10 % < O.D < CO, pomer medzi 0,9 a 1) by však mali byť opatrne interpretované. Keď to dovolí systém a laboratórne postupy, odporúča sa opakované testovanie duplikátu odpovedajúcich vzoriek. Vzorky s optickou hustotou väčšou alebo rovnou hodnote vylúčenia (pomer ≥ 1) sú považované testom Monolisa™ HBs Ag ULTRA za počiatočne pozitívne. Pred konečnou interpretáciou by mali byť opakovane testované na duplikáte. Ak je po opakovanom testovaní hodnota pomeru najmenej jedného z 2 duplikátov rovnaká alebo väčšia ako 1, počiatočný výsledok je opakovateľný a vzorka je vyhlásená testom Monolisa™ HBs Ag ULTRA za pozitívnu. Ak sú hodnoty pomeru 2 duplikátov nižšie ako 1, počiatočný výsledok nie je opakovateľný a vzorka je vyhlásená za negatívnu. Vzorky, ktoré boli dvakrát testované s Monolisa™ HBs Ag ULTRA a boli zistené ako negatívne, ale s jednou hodnotou blízkou hodnote vylúčenia (pomer medzi 0,9 and 1), by mali byť interpretované opatrne. Odporúča sa opakované testovanie pacienta inou metódou alebo testovanie ďalšej vzorky. V prípade veľmi nízkej optickej hustoty pre testované vzorky (negatívne OD) a keď je skontrolovaná prítomnosť reagencie jamkách vzorky, výsledky môžu byť interpretované ako negatívne. Odporúča sa potvrdiť pozitívne vzorky s dodržaním aktuálnych národných odporúčaní a algoritmov. Neopakovateľné reakcie sú často zapríčinené: • Neadekvátnym premývaním mikroplatničky • Kontamináciou negatívnych vzoriek sérom alebo plazmou s vysokou koncentráciou HBs Ag • Kontamináciou roztoku substrátu oxidačnými činidlami (bielidlo, kovové ióny atď.) • Kontamináciou zastavovacieho roztoku

[SK] 10

7.7. Spektrofotometrická verifikácia pipetovania vzorky a konjugátu (voliteľná možnosť)

1) Verifikácia pipetovania vzorky a konjugátu a) Verifikácia pipetovania vzorky

Prítomnosť vzorky v jamke je možné verifikovať pred dávkovaním konjugátu automatickým čítaním pri 490/620-700 nm: jamka so vzorkou musí mať optickú hustotu v rozsahu od 0,050 do 0,900. Medzi prázdnou jamkou a jamkou obsahujúcou slabožltý roztok substrátu je jasný rozdiel.

b) Verifikácia pipetovania konjugátu Po verifikácii prítomnosti vzorky automatickým čítaním tak, ako je to popísané vyššie, sa môže skontrolovať pridanie konjugátu automatickým čítaním pri 490/620-700 nm: jamka s konjugátom musí mať optickú hustotu vyššiu ako 1,100. Farba jamiek obsahujúcich vzorky je slabožltá a zmení sa na červenú po pridaní konjugátu.

c) Súčasná verifikácia prítomnosti vzorky a konjugátu v jamkách. (Len spektrofotometrická verifikácia)

Keď sa prítomnosť vzoriek nepotvrdila automatickým čítaním tak, ako je to popísané vyššie, súčasná verifikácia prítomnosti vzorky a konjugátu v jamkách sa môže uskutočniť automatickým čítaním pri 490/620-700 nm, ak máte jamku obsahujúcu len konjugát. Delta ich optickej hustoty musí byť vyššia ako 0,35 na 490/620-700 nm. [DO (vzorka + konjugát) – DO len konjugát] ≥ 0,35

2) Verifikácia pipetovania vyvíjacieho roztoku Prítomnosť ružového vyvíjacieho roztoku v jamke môže byť verifikovaná automatickým čítaním pri 490 nm. Jamka s vyvíjacím roztokom musí mať optickú hustotu väčšiu ako 0,100 (nižšia OD indikuje zlé dávkovanie vyvíjacieho roztoku).

8. OBMEDZENIA TESTU Negatívny výsledok označuje, že testovaná vzorka neobsahuje detekovateľný HBs Ag s testom Monolisa™ HBs Ag ULTRA. Keďže veľmi nízky titer HBs Ag nie je možné detegovať, takýto výsledok nevylučuje možnosť vystavenia infekcii vírusom hepatitídy B. V závislosti od použitého nástroja (premývačka, čítačka, automatický procesor) je možné pozorovať miernu variabilitu. Okrem toho niekoľko autorov popísalo v odbornej literatúre prípady vírusovej hepatitídy B (akútnej alebo chronickej), kde DNA vírusu je detekovateľná v neprítomnosti povrchového antigénu (HBs Ag negatívni pacienti). Tieto abnormálne profily, aj keď sú zriedkavé, sú dôsledkom možných genetických mutácií, buď na génovej úrovni S alebo pre-S (zabraňujú rozpoznaniu Ag niektorými imunologickými reagenciami) alebo, zvyčajne na génovej úrovni X a pol, čo vyvoláva slabú vírusovú replikáciu. V týchto veľmi špecifických prípadoch sa pre konečnú diagnostiku infekcie odporúča testovanie dodatočných markerov (špecifická HBs Ag protilátka alebo ak je to možné, zosilnená DNA vírusu). Na overenie špecifickosti reakcie by mal byť každý pozitívny výsledok (v súlade s kritériami interpretácie testu Monolisa™ HBs Ag ULTRA) potvrdený neutralizačnou metódou HBs Ag (napr. potvrdenie Monolisa™ HBs Ag ULTRA, číslo kódu 72408) Kolorimetrická metóda pre verifikáciu vzorky, usadeniny konjugátu a vyvíjacieho roztoku umožňuje verifikáciu presnosti dávkovaného objemu vzoriek a konjugátu. Tento spôsob ukazuje len prítomnosť vzorky, konjugátu a vyvíjacieho roztoku v jamkách. Početnosť nesprávnych odpovedí pri tejto metóde je tesne prepojená s presnosťou používaného systému (variačný koeficient viac ako 10 % pre dávkovanie a čítanie výrazne zníži kvalitu tejto verifikácie). V prípade veľmi slabej účinnosti premývania po inkubácii konjugátu môže automatická verifikácia pipetovania vyvíjacieho roztoku (čítaním OD jamiek pri 490 nm) poskytnúť nesprávne výsledky s OD väčšou ako 0,100 pri prítomnosti vyvíjacieho roztoku. Nikdy nebolo pozorované pri hodnotení 939 testovaných vzoriek.

9. FUNKČNÉ CHARAKTERISTIKY

9.1. Presné meranie Presnosť merania testu Monolisa™ HBs Ag ULTRA bola stanovená analýzou 4 vzoriek: 1 negatívna vzorka, 2 HBs Ag pozitívne vzorky (vzorky 2 a 3) a 1 vysoko HBs Ag pozitívna vzorka.

[SK] 11

Opakovateľnosť testu bola hodnotená testovaním týchto 4 vzoriek 30-krát v tom istom behu. Dlhodobá presnosť bola hodnotená testovaním týchto 4 vzoriek v duplikáte počas 20 dní na 2 nezávislých behoch každý deň. Boli počítané stredné hodnoty pomeru, štandardné odchýlky (SD) a koeficienty odchýlky (CV).

9.1.1. Opakovateľnosť

n = 30 Vzorka 1 Vzorka 2 Vzorka 3 Vzorka 4

Stredné pomery 0,38 3,17 8,92 14,63

Štandardná odchýlka (SD) 0,04 0,12 0,34 0,91

Pomery CV (%) 10,6 % 3,8 % 3,8 % 6,2 %

9.1.2. Prostredná presnosť

n = 80 Vzorka 1 Vzorka 2 Vzorka 3 Vzorka 4

Stredné pomery 0,48 3,06 8,02 13,85

Štandardná odchýlka (SD) 0,087 0,251 0,751 1,471

Pomery CV (%) 18,1 % 8,2 % 9,4 % 10,6 %

9.2. Klinický výkon Výkonnosť Monolisa™ HBs Ag ULTRA bola stanovená testovacími vzorkami od náhodných darcov krvi, od klinických pacientov s akútnou alebo chronickou infekciou hepatitídy B alebo s ochoreniami nesúvisiacimi s infekciou hepatitídy B a z komerčných vzoriek a panelov sérokonverzie. Navyše bola testovaná analytická citlivosť použitím francúzskych SFTS panelov a 2. medzinárodnej normy WHO (00/588).

9.2.1. Diagnostická špecifickosť Špecifickosť na celkovom počte 9894 náhodne vybraných darcov krvi z 3 rôznych pracovísk bola zistená ako 99,94% (9887/9893) s intervalom spoľahlivosti pri 95 % [99,87-99,98%]. Jedna reaktívna vzorka bola potvrdená ako pozitívna pre hepatitídu B, povrchový antigén bol odvodený z výpočtu špecifickosti. Štúdia špecifickosti sa uskutočnila v klinickom laboratóriu (hepatologické stredisko). Pri 205 testovaných klinických vzorkách boli 2 vzorky zistené ako opakovane reaktívne, čo viedlo k špecifickosti 99,02 % s intervalom dôveryhodnosti 95 % [99,52 %-99,88 %].

9.2.2. Diagnostická citlivosť Štúdie citlivosti sa uskutočnili na 428 pozitívnych vzorkách od ďalších pacientov s chronickou alebo akútnou HBV infekciou, čo preukázalo 100 % citlivosť, Testoval sa panel 15 rekombinantných proteínov napodobňujúcich hlavné mutácie na sekvenciách aminokyselín HBs antigénu. všetky sa detegovali pomocou Monolisa™ HBs Ag ULTRA. Celkovo 60 dobre dokumentovaných komerčných panelov sérokonverzie (293 vzoriek) HBV bolo tiež študovaných a porovnaných s komerčne dostupnými testami EIA. Monolisa™ HBs Ag ULTRA ukazuje rovnaké výsledky pre komerčný EIA test pre 29 panelov, je citlivejší s jednou vzorkou skôr pre 28 panelov, s 2 vzorkami skôr pre 2 panely a s 5 vzorkami skôr pre 1 panel. Nasledujúce podtypy z SFTS 2001 panela: adw2, adw4, adr, ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayw5 a ayr sa zistili ako pozitívne s pomerom viac ako 5 pomocou testu Monolisa™ HBs Ag ULTRA. Bolo testovaných ďalších 25 čerstvých pozitívnych vzoriek (do 1 dňa od odobratia krvi) a boli zistené ako pozitívne.

9.3. Analytická citlivosť Analytická citlivosť testu sa odhadla na menej ako 0,060 ng/ml počas hodnotenia pomocou francúzskeho SFTS 2001 panelu pre HBs antigén a zistila sa ako 0,025 IU/ml CI95 [0,019-0,037 IU/ml] pomocou 2. medzinárodnej normy WHO (00/588).

[SK] 12

9.4. Štúdia analytickej špecifickosti/krížovej reaktivity Pomocou Monolisa™ HBs Ag ULTRA bolo testovaných 289 pacientov s rôznymi patológiami alebo stavom nesúvisiacim s hepatitídou B (tehotné ženy, reumatický faktor, anti-jadrové protilátky, anti-myšie protilátky alebo iné vírusové alebo bakteriálne infekcie). 11 vzoriek sa potvrdilo ako opakovane reaktívnych, boli kontrolované dostupným komerčným EIA testom a neutralizačným testom. Pomocou testu Monolisa™ HBs Ag ULTRA sa potvrdilo 10 z 11 opakovaných pozitívnych vzoriek, tieto sa potvrdili ako pozitívne pomocou komerčného HBs Ag testu. Jedna vzorka bola neinterpretovateľná pomocou neutralizačného testu, táto sa stiahla z konečného výpočtu; 2 vzorky neboli neutralizované; jedna bola z HSV IgG vzorky a jedna z myelómovej vzorky; vzorka sa potvrdila ako pozitívna aj pomocou komerčného EIA testu, vykonaná pre konečnú špecifickosť 99,28 % (276/278). Ďalších 9 pozitívnych z HSV IgG vzoriek a myelómových vzoriek sa potvrdili ako negatívne pomocou Monolisa™ HBs Ag ULTRA.

9.5. Štúdia hákového efektu Výskum potenciálneho hákového efektu sa uskutočnil na základe testovania 5 veľmi vysoko pozitívnych vzoriek (komerčné panely) riedených z 1 na 1/100 000 000 a s jedným negatívnym sérom prepichnutým vysokou koncentráciou HBs Ag ad/ay, aby sa získala konečná koncentrácia 11,57 mg/ml. Niektoré veľmi vysoko pozitívne vzorky môžu vykazovať viac zvýšený pomer po zriedení, ale, dokonca aj čisté, zostávajú jasne pozitívne.

10. BIBLIOGRAFICKÉ ODKAZY • COUROUCE A.M., LEE H., DROUET J., CANAVAGGIO M. and SOULIER J.P. (1983)

Monoclonal antibodies to HBs Ag : a study of their specificities for eight different HBs subtypes. Developments in Biological Standardization, 54, 527-534.

• COUROUCE A.M., PLANCON A. and SOULIER J.P. (1983) Distribution of HBs Ag subtypes in the world. Vox Sang. 44, 197-211.

• DAVID G.S., PRESENT W., MARTINIS J., WANG R., BATHOLOMEW R., DESMOND W. and SEVIER E.D., (1981) Monoclonal antibodies in the detection of hepatitis infection. Medical Laboratory Sciences, 38, 341-.348.

• DROUET J., COUROUCE A.M., KALIL J., LEE H., and FELLOUS M. (1981) Monoclonal antibodies to HBs Ag produced by murine hybridomas. In viral hepatitis, edited by Szmuness W. Alter H.J., Maynard J.E. The Franklin Institute Press, 706.

• FIELDS H.A., DAVID C.L., BRADLEY D.W. and MAYNARD J.E. (1983) Experimental conditions affecting the sensitivity of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of hepatitis B surface antigen (HBs Ag) - Bulletin of the World Health Organization, 61, 1, 135-142.

• LEE H.H., COUROUCE A.M., PERE M., CANAVAGGIO M., DROUET J. and SOULIER J.P. (1983) Monoclonal antibodies to HBs Ag; a study of their specificities against HBs Ag subtypes and their utilization in ELISA. International Association of Biological Standardization. International Symposium on Monoclonal Antibodies : Paris, France.

• SOULIER J.P., COUROUCE A.M., LEE H. DROUET J., MULLER A. and CANAVAGGIO M. (1983) Monoclonal antibodies against HBs antigen. Bulletin Biotest (vol. 4, 353-358).

• WANDS J.P., CARLSON R.L., SCHOEMAKER H., ISSELBACHER K.J. and ZURAWSKI V.R. (1981) Immunodiagnosis of hepatitis B with high-affinity IgM monoclonal antibodies. Proc. Nat. Acad. Sci., 78, 2, 1214-1218.

• M. CANAVAGGIO, A.M. COUROUCE, M. PERE, H. LEE Spécificité d'anticorps monoclonaux dirigés contre le déterminant a de l'Ag HBs (1985). Nouvelle Revue Française d'Immunohématologie (Springer International), 27, 2, 134.

• J. DROUET, G. CHARRIER, A.M. COUROUCE, M. PERE, J.F. DELAGNEAU, J. ROISIN (1985) Nouveaux réactifs de dépistage de l'Ag HBs et de dosage de l'anticorps anti-HBs. Nouvelle Revue Française d'Immunohématologie (Springer International), 27, 2, 134.

[SK] 13

[SK] 14

[SK] 15

[SK] 16

[SK] 17

Bio-Rad 3, Boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel.: +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax: +33 (0) 1 47 41 91 33 2013/11

www.bio-rad.com 883661