SPIM - mafija.fmf.uni-lj.simafija.fmf.uni-lj.si/seminar/files/2011_2012/SPIM_-_mikroskopija_z_ravninsko... · ravnina je iz modre svetlobe in je pravokotna na os detekcije. Na presečišču

Oddelek za fiziko

SPIM:

mikroskopija z ravninsko osvetlitvijo

Seminar

Maruša Vitek

Mentor: doc. dr. Primož Ziherl

marec 2012

POVZETEK

Mikroskopija z ravninsko osvetlitvijo je metoda, pri kateri vzorec osvetljujemo pravokotno na os

detekcije s tanko svetlobno plastjo. Vzorec nato po korakih premikamo skozi to plast in slikamo

zaporedne plasti. Bledenje vzorca je pri tem zelo majhno, metoda pa omogoča zelo hitro zajemanje in

dobro prostorsko ločljivost. Je zelo pomembna na področju razvojne biologije, saj z njo lahko slikamo

velike žive vzorce na različnih prostorskih in časovnih skalah.

1

Kazalo vsebine 1. Uvod ................................................................................................................................................ 1

2. SPIM ................................................................................................................................................ 3

2.1. Osvetlitvena ravnina ................................................................................................................ 4

2.2. Detekcija .................................................................................................................................. 4

2.3. Priprava vzorca ........................................................................................................................ 5

2.4. Obdelava podatkov .................................................................................................................. 5

3. Izboljšave metode SPIM.................................................................................................................. 6

3.1. mSPIM..................................................................................................................................... 6

3.2. SPIM-SI ................................................................................................................................... 7

3.3. DSLM ...................................................................................................................................... 8

3.4. DSLM-SI ................................................................................................................................. 9

4. Uporaba ......................................................................................................................................... 10

4.1. Opto-genetska kontrola srčnega delovanja ............................................................................ 11

4.2. Laserska mikrokirurgija......................................................................................................... 12

5. Zaključek ....................................................................................................................................... 13

Literatura ............................................................................................................................................... 14

1. Uvod

Razvojna biologija je področje, ki raziskuje rast in razvoj organizmov. Preučuje rast in

diferenciacijo celic ter razvoj tkiv, organov in celotne anatomije. Za opazovanje celotnega

poteka razvoja moramo slediti številnim procesom na zelo različnih prostorskih in časovnih

skalah. Prostorska skala se razteza od nekaj za procese znotraj celice do nekaj mm za

procese na ravni zarodka, časovna skala pa se razteza od nekaj sekund do nekaj dni.1 Poleg

široke prostorske in časovne skale je izziv za opazovanje še dejstvo, da imamo opravka s

precej velikim tridimenzionalnim, v idealnem primeru živim vzorcem, ki veliko svetlobe

siplje ali absorbira.

V raziskavah življenjskih procesov potrebujemo neinvazivne metode, ki vzorca ne uničijo. Le

tako lahko opazujemo nespremenjene procese in njihov prispevek k celotnemu razvoju

organizma.1 Za opazovanje in slikanje velikih tridimenzionalnih vzorcev je bilo razvitih že

precej neinvazivnih tehnik: slikanje z magnetno resonanco, optična koherenčna tomografija,

različne metode optične fluorescenčne mikroskopije. Pri magnetni resonanci in optični

koherenčni tomografiji težko dobimo želene kontraste, ki bi omogočali učinkovito

opazovanje, zato so metode fluorescenčne mikroskopije za področje razvojne biologije

(embriologije) pripravnejše.1

V primeru fluorescenčne mikroskopije morajo vzorci vsebovati

fluorofore. To so fluorescenčna barvila, ki se s kovalentno vezjo vežejo na makromolekule.

2

Najosnovnejši fluorescenčni mikroskop je epifluorescenčni mikroskop2 (slika 1). Osvetlitev

vzorca poteka skozi objektiv s svetlobo krajših valovnih dolžin (vir je npr. živosrebrna

svetilka). Ta svetloba vzbudi molekule v višje stanje, od koder z vibracijskimi prehodi najprej

preidejo v malo nižje stanje, nato pa se vrnejo v osnovno stanje in pri tem izsevajo foton, ki

ga zaznamo.3 Ta foton ima večjo valovno dolžino kot jo je imel vzbuditveni foton. Slabost

tega mikroskopa je, da z njim lahko opazujemo le celoten vzorec naenkrat, saj nimamo

nobenega mehanizma za optično ločevanje delov vzorca.

Veliko primernejši za opazovanje tridimenzionalnih bioloških vzorcev je konfokalni

mikroskop (slika 1). Tu vzorec osvetljujemo z vzbujevalno lasersko svetlobo. Pri detekciji se

z luknjico pred zaslonom omejimo le na svetlobo, izsevano iz goriščne ravnine objektiva. S

tem lahko slikamo posamezne plasti vzorca in jih sestavimo v tridimenzionalno sliko.3 Pri tem

načinu optičnega ločevanja delov vzorca veliko svetlobe zavržemo. Vzorec zaradi

izpostavljenosti svetlobi bledi, saj se fluorofori pri določeni količini vpadle svetlobe uničijo.

Nepotrebnemu osvetljevanju vzorca se izognemo z uporabo dvofotonske mikroskopije. Ta

deluje na principu frekvenčnega podvajanja, ki spada med nelinearne optične pojave. Na

vzorec svetimo praviloma z infrardečim laserjem. Ko na molekulo hkrati vpadeta dva fotona,

jo vzbudita v višje stanje od koder se nato z izsevanjem fotona polovične valovne dolžine

vrne v osnovno stanje. Verjetnost za absorpcijo je sorazmerna s kvadratom intenzitete vpadne

svetlobe. Do fluorescence zato pride le v majhnem volumskem elementu v okolici grla

laserskega snopa.6 Penetracijska globina dvofotonskega mikroskopa je precej velika, do 700

Slika 1: Epifluorescenčni mikroskop4 (levo) in konfokalni mikroskop

5 (desno). Pri epifluorescenčnem

mikroskopu svetlobo skozi objektiv usmerimo na vzorec, kjer povzroči fluorescenco. Fluorescentna svetloba

gre skozi dikroično zrcalo, saj ima drugačno valovno dolžino kot osvetlitvena svetloba. Skozi okular nato

potuje do detektorja. Pri konfokalnem mikroskopu svetloba preko dikroičnega zrcala in objektiva pade na

vzorec in povzroči fluorescenco. Fluorescentna svetloba s celotnega vzorca (črna, rdeča, zelena črta) na poti

proti detektorju preide skozi dikroično zrcalo. Skozi zaslonko do detektorja pride le svetloba, ki prihaja iz

goriščne ravnine objektiva (črna črta), ostalo svetlobo (rdeča, zelena črta) zavržemo.

3

, ločljivost pa je manjša kot pri konfokalnem mikroskopu. Za dvofotonsko mikroskopijo

potrebujemo laserske sunke z zelo veliko močjo, kar lahko povzroči gretje, bledenje in tudi

poškodbe vzorca.7

Prelom v raziskavah velikih živih bioloških vzorcev je prinesla fluorescenčna metoda

mikroskopije z ravninsko osvetlitvijo, ki jo označujemo s kratico SPIM (ang. selective plane

illumination microscopy). Tu je bledenje vzorca zelo majhno, zelo malo je tudi poškodb

vzorca, obenem pa je mogoče podatke zajemati z veliko hitrostjo. SPIM so razvili leta 2004,1

temu pa je sledil še razvoj podobnih metod, ki so SPIM izboljšale in nadgradile.

2. SPIM

SPIM je metoda, pri kateri ločeno opazujemo in slikamo posamezne ravnine vzorca. Optično

ločevanje ravnin vzorca poteka na sledeč način: vzorec od strani osvetlimo s tanko svetlobno

plastjo, ki sovpada z goriščno ravnino mikroskopa, torej je pravokotna na os detekcije. Vpadla

svetloba v vzorcu povzroči fluorescenco. S kamero detektiramo izsevano fluorescentno

svetlobo. Položaj vzorca lahko spreminjamo z napravo za mikropozicioniranje. Lahko ga

sučemo okrog navpične osi in ga premikamo vzdolž treh prostorskih osi. S tem je omogočeno

opazovanje poljubne navpične ravnine vzorca.1 Če posnamemo slike vseh ravnin v eni smeri

(ali v več smereh), lahko sestavimo tridimenzionalno sliko vzorca (slika 2).

Slika 2: Mikroskopija z ravninsko osvetlitvijo. Zgoraj levo je skica komore mikroskopa SPIM.1 Osvetlitvena

ravnina je iz modre svetlobe in je pravokotna na os detekcije. Na presečišču osvetlitvene ravnine in osi detekcije

je vzorec v valju agaroze. Spodaj je prikazan set podatkov, ki jih posnamemo: zaporedje dvodimenzionalnih slik,

ki jih lahko združimo v 3D sliko. Desno in povsem spodaj je tlorisni shematski prikaz delovanja sistema SPIM.1

Kolimiran laserski snop vpade na cilindrično lečo, ki ga v eni dimenziji fokusira. Nastala svetlobna ravnina

sovpada z goriščno ravnino mikroskopa. Osvetlitev v ravnini vzorca povzroči fluorescenco, ki jo zaznamo s

kamero.

4

2.1. Osvetlitvena ravnina

Svetlobno ravnino za osvetlitev vzorca dobimo tako, da kolimiran laserski snop pošljemo

skozi cilindrično lečo, ki snop v vodoravni smeri fokusira. V navpični smeri snop ostane

kolimiran. Laserski snop sestavlja svetloba iz modro-zelenega dela spektra z valovnimi

dolžinami 488 nm in 514 nm, ki prihaja iz argonskega ionskega laserja, ter svetloba, ki prihaja

iz dveh He-Ne laserjev in ima valovni dolžini 543 nm in 633 nm.8 Debelina osvetljene plasti

je tipično med 3 in 10 . Omejena je s pogojem, da mora biti plast približno enako

debela na celotnem vidnem polju objektiva (lahko variira do ).1 Objektiv z desetkratno

povečavo in numerično aperturo 0.30 ima na primer vidno polje veliko 660 . Da bo na

celotnem vidnem polju debelina osvetljene plasti variirala za manj kot , mora biti grlo

plasti široko vsaj .1

2.2. Detekcija

Za detekcijo se uporabljajo CCD kamere. Hitrost zajemanja je plasti na sekundo, pri

čemer je slika ene plasti velika pikslov. Vzorec se da vzdolž osi detekcije

premikati po korakih velikih od .1

Zaradi osvetlitve fluorofori v vzorcu izsevajo fluorescentno svetlobo v polni prostorski kot.

Detektiramo le svetlobo, ki se izseva v smeri detektorja. Prečna ločljivost metode je omejena

ali z numerično aperturo objektiva ali z velikostjo pikslov kamere.1 Načeloma je prečna

ločljivost tem večja, čim večja je numerična apertura (NA). Ta je definirana kot

(1)

kjer je lomni količnik medija, pa polovica kota maksimalnega stožca, iz katerega lahko

sistem sprejme svetlobo ali jo vanj odda.

Hkrati se z večanjem vidnega prostorskega kota manjša delovna razdalja objektiva. Za

opazovanje debelih vzorcev zato leče z visokimi NA niso primerne. Za SPIM so najboljše

imerzijske leče, ki imajo višjo NA, saj je lomni količnik medija (vode) večji od lomnega

količnika zraka, hkrati pa imajo dovolj veliko delovno razdaljo (1 – 3 mm).1 Pri manjših

povečavah se uporabljajo tudi leče, ki delujejo na stiku z zrakom.

Pri kakršnem koli sistemu zajemanja podatkov, ki temelji na fluorescenci, sta velik problem

sipanje in absorpcija. Pri velikih vzorcih, za opazovanje katerih je bila razvita metoda SPIM,

se kvaliteta slike slabša z naraščanjem optične poti svetlobe v vzorcu. Za deli vzorca, ki

močno absorbirajo ali sipajo, nastanejo sence in slika je na strani izvora svetlobe veliko

svetlejša kot na nasprotni strani. Tema dvema problemoma se lahko delno izognemo z

opazovanjem z več zornih kotov. Večinoma se vzorec posname s zornih kotov, za vsak

kot se posname plasti.1 Slikanje celotnega vzorca torej traja nekaj minut, kar

omejuje časovno ločljivost mikroskopa.

5

2.3. Priprava vzorca

Vzorec mora biti pravilno pripravljen. Tipični vzorci za opazovanje z metodo SPIM so

zarodki rib medake (Oryzias latipes) in cebrice (Danio rerio) ter zarodki in odrasli osebki

vinske mušice (Drosophila melanogaster). Vzorci so gensko spremenjeni, da vsebujejo

fluorofore, potrebne za fluorescenco. Zarodek gensko spremenijo tako, da vanj še v

enoceličnem stanju vbrizgajo genetski material, ki se vgradi v celični DNA.1 Ta novi del

DNA poskrbi, da v celici začne pri procesu ekspresije proteinov nastajati zeleni fluorescentni

protein (GFP – ang. green fluorescent protein). Ekspresija GFP poteka v somatskem in

gladkem mišičevju, v srcu in v ganglijih.1

Za opazovanje je zarodke potrebno vzeti iz membrane, ki jih ločuje od okolice.1 Za nekatere

eksperimente se zarodku odvzame še rumenjak. Zarodek (z rumenjakom ali brez) nato

potopimo v agarozo in ga s tem fiksiramo.1 Valj agaroze z vzorcem postavimo v komoro, ki

jo v večini primerov zapolnjuje voda. Imerzijski objektiv je za metodo SPIM kot že omenjeno

primernejši. Na zgornji strani je valj agaroze vpet v napravo za mikropozicioniranje, s katerim

ga lahko premikamo in sučemo. Tako posnamemo dvodimenzionalne slike vzorca, ki jih

moramo nato še obdelati in ustrezno sestaviti v tridimenzionalno sliko.

2.4. Obdelava podatkov

Procesiranje podatkov poteka v treh korakih. V prvem koraku najprej odrežemo področja, ki

nas ne zanimajo (npr. dele slike, na katerih ni vzorca ampak le ozadje). S tem zmanjšamo čas

obdelave podatkov.1 Nato podatke uredimo. Pri zajemanju podatkov gre naenkrat na CCD

kamero signal iz končno debele plasti. Posamezna plast je v splošnem tanjša od dimenzije

površine svetlobne ravnine, s katere fluorescentna svetloba vpade na en piksel, za obdelavo pa

moramo podatke urediti v tridimenzionalno mrežo. Zaželeno je, da so volumski elementi,

voksli, kubične oblike. Zato po potrebi združimo podatke iz posnetkov več zaporednih plasti

in tako ustvarimo kubično mrežo. Zbirke posnetkov plasti pod posameznimi zornimi koti nato

še zasučemo, tako da imajo vse enako orientacijo.9

V drugem koraku poravnamo posnetke iz različnih zornih kotov, tako da se vidne strukture

prekrijejo. Natančno prekrivanje dobimo z navzkrižno korelacijo z uporabo FFT.9

V tretjem koraku tako obdelane slike vzorca združimo v eno samo tridimenzionalno

optimalno sliko z visoko ločljivostjo.1 Še izboljšano ločljivost dosežemo, če v algoritem

rekonstrukcije slike vključimo dekonvolucijo (slika 3).10

Če imamo zelo veliko podatkov,

procesiranje lahko poenostavimo s tem, da posebej obravnavamo posamezne dele slike.1

Dobimo 3D slike delov vzorca, ki jih nato sestavimo v celotno sliko.

6

3. Izboljšave metode SPIM

Po letu 2004, v katerem je bila metoda SPIM prvič predstavljena,1 se je mikroskopija z

ravninsko osvetlitvijo razcvetela. Postala je eno glavnih orodij razvojne biologije, saj je

primerna za opazovanje zelo različnih vzorcev: tankih, debelih, prozornih, neprozornih,

različno sipajočih, in sicer na zelo različnih časovnih in prostorskih skalah. Za različne tipe

vzorcev in za različne namene opazovanja pa je bilo mogoče metodo še izboljšati.

Največji problem pri metodi SPIM povzročata absorpcija in sipanje, saj imamo opravka z

velikimi vzorci s specifično strukturo. Določeni deli vzorca svetlobo zelo močno absorbirajo.

Ko se tak del vzorca znajde v osvetlitveni ravnini, za njim nastane senca, saj vpije svetlobo, ki

pride do njega. Prav tako določeni deli vzorca močno sipajo svetlobo. Ko svetloba pride do

takega dela, se siplje v vse smeri. V goriščni ravnini objektiva za takšnim delom vzorca tako

spet nastane senca, zaradi sipane svetlobe pa postanejo osvetljeni tudi bližnji deli vzorca, ki

sicer niso v goriščni ravnini. Ta svetloba, ki ni v gorišču objektiva, prispeva le k ozadju slike

in le-to zamegli. Problemu senc se izognemo z uporabo metode mSPIM, za redukcijo ozadja

zaradi svetlobe izven fokusa pa so razvili metodo SPIM-SI.

3.1. mSPIM

Mikroskopijo z večsmerno ravninsko osvetlitvijo mSPIM (ang. multidirectional SPIM) so

razvili, da bi se znebili senc, ki nastanejo za deli vzorca, ki močno absorbirajo in sipajo (slika

4). 11

Ta metoda izniči še en efekt, ki nastane zaradi absorpcije in sipanja v vzorcu, in sicer da

Slika 3: Rekonstrukcija slike votlih skupkov Madin-Darby canine ledvičnih celic (MDCK). Levi sliki sta

posneti z metodo SPIM, desni sliki pa s konfokalnim mikroskopom. Zgoraj sta sliki, ki ju dobimo le s klasično

rekonstrukcijo, spodnji pa sta rekonstruirani z algoritmom, ki vsebuje dekonvolucijo. Slika z metodo SPIM je že

v zgornjem primeru bistveno razločnejša, po dekonvoluciji pa pridejo prednosti te metode še bolj do izraza.

Skala je 10

7

se vzdolž vzorca intenziteta svetlobe zmanjšuje in je s tem vzorec na bolj oddaljeni strani

slabše osvetljen.

Pojava senc in zmanjševanja intenzitete svetlobe vzdolž osvetlitvene ravnine se sicer lahko

znebimo s konstrukcijo 3D slike iz dvodimenzionalnih posnetkov z več zornih kotov, ki smo

jih dobili z metodo SPIM. Z metodo mSPIM se ju znebimo že med samim slikanjem.11

Vzorec osvetljujemo z dveh nasprotnih strani hkrati, s čimer je z obeh strani enako osvetljen.

Poleg tega osvetlitveno ravnino zanihamo v goriščni ravnini objektiva okrog osi detekcije, in

sicer za kot 10° s frekvenco 1 kHz, s čimer se znebimo senc (slika 4).11

3.2. SPIM-SI

Mikroskopija s strukturirano ravninsko osvetlitvijo SPIM-SI (ang. SPIM with structured

illumination) je izboljšava osnovne metode. Z njo lahko ločimo fluorescentno svetlobo, ki se

je izsevala iz goriščne ravnine od tiste, ki se je izsevala iz bližnjih delov vzorca, ki so bili

osvetljeni s sipano svetlobo.12

Svetloba iz delov vzorca, ki niso v goriščni ravnini, zamegli

sliko tanke plasti, zato se je želimo znebiti. SPIM-SI deluje tako, da pred cilindrično lečo, ki

povzroči fokusiranje kolimiranega snopa v vodoravni smeri, postavimo mrežico, ki povzroči

modulacijo svetlobne ravnine v navpični smeri (slika 5). Perioda mrežice je 10-150 rež na

mm, zato uklon nima pomembne vloge. Mrežico lahko v navpični smeri premikamo. Vsako

plast vzorca posnamemo trikrat, pri različnih položajih mrežice. Vsakič jo premaknemo za

tretjino periode mrežice v navpični smeri, torej je fazni zamik med poljubnima dvema

postavitvama mrežice . Za vsako plast torej dobimo tri slike

Slika 4: Delovanje metode mSPIM.11

Na shemi (b) vidimo, da pri navadni metodi SPIM za deli vzorca, ki

absorbirajo, nastanejo sence. Shema (c) ilustrira, da sence pri metodi mSPIM izginejo, saj vzorec osvetljujemo z

obeh strani in svetlobno ravnino nihamo okoli osi detekcije za ~10°. Desna slika prikazuje zgoraj sliko glave 35

ur starega zarodka cebrice. Na sliki, posneti s SPIM mikroskopom, so opazne proge, ki pri mSPIM zbledijo.

Spodaj desno je 10 ur star zarodek cebrice, kjer je opazno zmanjševanje svetlobne intenzitete vzdolž vzorca. Pri

združitvi slik z osvetlitvami iz nasprotnih smeri dobimo razločno sliko (e). Skala na vseh petih slikah je m.

8

. Fluorescentna svetloba, ki izhaja iz goriščne ravnine, je vsa prostorsko

modulirana, prispevki, ki ne prihajajo iz goriščne ravnine, pa so posledica sipanja in niso

prostorsko modulirani.12

Ti prispevki so na vseh treh slikah iste plasti enaki.

Sliko plasti iz treh slik z različnim zamikom izračunamo kot

‖ ⁄

⁄ ‖

√ ⁄ [( ) ( )

( ) ]

(2)

Tako se znebimo prispevkov, ki nastanejo zaradi sipane svetlobe brez spremembe ločljivosti.

Dobimo sliko z majhnim ozadjem in velikimi kontrasti (slika 5).

Čas snemanja treh slik ene plasti je med 0.3 in 1 s, se pravi da za celoten vzorec, ki ga

posnamemo razdeljenega na denimo 150 plasti, porabimo od 45 do 150 s.12

3.3. DSLM

Tretja priredba metode SPIM je metoda DSLM, mikroskopija z digitalnim laserskim

skeniranjem13

(ang. digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy). Za razliko od

metode SPIM tu nimamo osvetlitvene ravnine, ampak približno debel osvetlitveni

žarek, ki ga premikamo v navpični smeri in s tem skeniramo vzorec (slika 6). Kamera

integrira signal, ki ga dobiva, medtem ko laserski žarek skenira eno plast.13

Tako dobimo

dvodimenzionalno sliko ene plasti. Vzorec nato enako kot pri metodi SPIM po korakih

Slika 5: Metoda SPIM-SI.12

Shema A prikazuje tlorisni pogled, ki je enak kot pri metodi SPIM. Razliko

prikazuje shema B. Povsem na levi je mrežica, ki povzroča strukturo osvetlitvene ravnine. To mrežico

premikamo za tretjino periode mrežice v navpični smeri. Za vsako osvetljeno plast vzorca posnamemo tri slike

pri različnih pozicijah mrežice, ustrezni osvetlitveni vzorci so prikazani desno zgoraj. Spodaj sta sliki rilčka

vinske mušice. Slika C je posneta z navadno metodo SPIM, slika D pa z metodo SPIM-SI. Na njej so kontrasti

bistveno boljši.

9

premikamo, da posnamemo vse zaporedne plasti. Laserski žarek je vzdolž vzorca povsod

enako debel. Ker skeniramo s konstantno hitrostjo, je cela plast vzorca, ki jo osvetljujemo,

enako osvetljena. Z uporabo fokusiranega laserskega žarka se močno izboljša izkoristek

osvetlitve, saj se za osvetljevanje porabi kar 95% svetlobe, ki pride iz laserja.13

Pri metodi

SPIM se pri oblikovanju svetlobne ravnine izgubi velik del svetlobe. Izkoristek osvetljevanja

je le 3%.13

Zaradi razlike v izkoristkih pri enakem laserskem izvoru in enakem času

osvetljevanja vzorca dobimo pri metodi DSLM 30-krat več fluorescentne svetlobe kot pri

metodi SPIM. To omogoča bistveno hitrejše zajemanje podatkov z metodo DSLM, eno plast

vzorca posnamemo v manj kot 1 ms, celoten vzorec torej slikamo v nekaj sekundah.13

3.4. DSLM-SI

Tudi pri metodi DSLM se da prispevek zaradi sipanja zmanjšati s strukturiranim

osvetljevanjem (DSLM-SI).14

Tu je prehod v strukturirano osvetlitev precej preprostejši kot

pri metodi SPIM, strukturiranost osvetlitve namreč dosežemo z modulacijo intenzitete

laserskega žarka med skeniranjem. Struktura osvetlitve je sinusna, frekvenco in fazo pa lahko

hitro spreminjamo.14

Tudi tu sliko ene plasti posnamemo trikrat, pri fazah in

nato končno sliko sestavimo po enačbi (2). Pri tem se prispevki zaradi sipanja spet odštejejo,

ostane pa nam slika z boljšim kontrastom.

Pri zarodku ribe medake se kontrast z uporabo metode DSLM-SI v povprečju poveča za 80%,

pri zarodku vinske mušice, pri katerem je efekt sipanja zelo močan, pa kar za 260%.14

V primerjavi z metodo SPIM-SI ima DSLM-SI tri pomembne prednosti. Prva je, da je

modulacija laserskega žarka lahko zelo hitra, kar omogoča hitro zajemanje slik s fazno

zamaknjenimi strukturami osvetlitve. Druga prednost je izjemna stabilnost in kvaliteta

osvetlitvenega vzorca v nasprotju z vzorcem, ki ga pri metodi SPIM-SI tvorimo z mrežico. Ta

lahko rahlo drsi in spreminja lego, zato je manj primerna za dlje trajajoče slikanje vzorca.

Tretja prednost metode DSLM-SI pa je možnost hitrega prilagajanja frekvence in faze

osvetlitvenega vzorca, kar omogoča spreminjanje strukture osvetlitve v skladu s

spreminjanjem sipalnih lastnosti opazovanega vzorca.14

Slika 6: Metoda DSLM: z vrtenjem zrcala povzročimo navpično premikanje laserskega snopa skozi vzorec -

skeniranje.13

10

4. Uporaba

Uporabnost mikroskopije z ravninsko osvetlitvijo je izjemna predvsem v razvojni biologiji.

Tako pomembna je, ker ima veliko penetracijsko globino, veliko hitrost zajemanja in ker

povzroča zelo majhno bledenje vzorca. Poleg tega je uporabna na zelo različnih časovnih in

prostorskih skalah.

Je edina metoda, ki omogoča opazovanje živih vzorcev s tako visoko ločljivostjo ( ).

Zelo pomembno je, da je nedestruktivna, saj to omogoča opazovanje življenjskih procesov in

razvoja.

Z metodo DSLM so na primer posneli zgodnji embrionalni razvoj ribe cebrice iz dveh

pravokotnih smeri. Posnetke iz obeh zornih kotov so združili in dobili zaporedje slik. Dobili

so t.i. digitalni zarodek, bazo podatkov, ki vsebuje pozicije, velikosti in intenzitete

fluorescenčne svetlobe izsevane iz 92% celičnih jeder celotnega zarodka vse od prve delitve

celice do vzpostavitve bitja srca (slika 7).

Slika 7: Zgodnji razvoj ribe cebrice. Slika A prikazuje stanje zarodka ob označenih časih v različnih razvojnih

fazah. Slike B, C in D prikazujejo v polju A označene dele. Slika E prikazuje delitev blastomere. Skala na sliki

A je m, na sliki B in E m ter m na slikah C in D. 13

11

Nekaj primerov klasične uporabe metode SPIM v razvojni biologiji je bilo predstavljenih že v

prejšnjih poglavjih. Metoda SPIM se sicer uporablja tudi v celični biologiji, na primer v

raziskovanju dinamičnih lastnosti mikrotubulov.15

To so cevasti polimeri, ki so pomemben del

celičnega skeleta. Pomembno vlogo igrajo pri delitvi celice.

V razvojni biologiji je v zadnjem času postalo pomembno, da lahko vzorec ne le slikamo,

ampak z njim tudi manipuliramo. Fotomanipulacija je mogoča tudi z metodo SPIM. Poteka

tako, da osvetlimo določen del opazovanega vzorca in s tem spremenimo njegovo delovanje.

Tu bomo predstavili še dve zanimivi možni uporabi metode SPIM in sicer za dve različni

obliki fotomanipulacije.

4.1. Opto-genetska kontrola srčnega delovanja

Pred kratkim je bil objavljen članek, ki opisuje uporabo metode SPIM za fotomanipulacijo

srca zarodka ribe cebrice.16

Organizem je bil gensko spremenjen, tako da sta v procesu

ekspresije proteinov v celicah, ki v srcu povzročajo krčenje (srčni ritmovnik), nastajala tudi

proteina halorodopsin (NpHR) in kanalski rodopsin-2 (ChR2).16

To sta proteina, ki v celični

membrani delujeta kot ionski črpalki. Ko nanju vpade svetloba določene valovne dolžine (570

nm za NpHR in 480 nm za ChR2), se odpre pora, skozi katero v celico pridejo ioni.

Mikroskopu SPIM je bila preko dikroičnega zrcala priključena še ena veja (slika 8). Naloga te

veje je bilo generiranje svetlobnega vzorca, ki je nato skozi detekcijski objektiv svetil na

opazovani vzorec in povzročil osvetlitev določenih delov. V osvetljenih delih sta bila

aktivirana zgoraj omenjena proteina. Ko so bile osvetljene celice, ki povzročajo krčenje srca,

je to v njih povzročilo neravnovesje, zaradi česar je bilo delovanje srca moteno. Takoj po

koncu osvetljevanja je srce spet začelo biti z začetnim ritmom.16

Slika 8: Shema naprave za fotomanipulacijo vzorca (A). Na klasičen SPIM mikroskop je dodana veja, ki

omogoča osvetljevanje vzorca skozi objektiv in s tem foto-manipulacijo. Na sliki B je srce 3 dni starega zarodka

cebrice. Atrij in ventrikel sta označena z A in V. Desno je prikazan presek skozi oranžno označeno ravnino srca

v odvisnosti od časa. Vidimo utripe srca do trenutka, ko so celo srce osvetlili in je prenehalo biti. Po koncu

osvetljevanja se je vzpostavil normalni srčni ritem.

12

Z uporabo osvetlitvenega vzorca v SPIM mikroskopu so zelo natančno locirali srčni

ritmovnik in povzročili tahikardijo, bradikardijo in srčni zastoj. Povzročili so tudi obratno

krčenje srca: najprej se je krčil ventrikel in šele nato atrij (slika 9). Pretok krvi skozi srce se

sicer ni obrnil, ampak se je ustavil, saj se ventrikel med raztezanjem ni napolnil s krvjo. Po

prenehanju osvetljevanja se je vzpostavil normalni srčni ritem.16

4.2. Laserska mikrokirurgija

Drugi primer fotomanipulacije s SPIM mikroskopijo je laserska mikrokirurgija (slika 10). Na

mikroskop SPIM je preko dikroičnega zrcala priključen Nd:YAG laser, ki deluje v UV

področju. Laser deluje v pulznem načinu, frekvenca sunkov je 1 kHz, trajanje posameznega

sunka pa 470 ps. S takim fokusiranim snopom lahko izvajamo ablacijo.17

Vzorec lahko s

SPIM mikroskopom hkrati opazujemo in sproti določamo potek ablacije.

Slika 10: Laserska mikrokirurgija s SPIM. Levo je slika delovanja na submikronski skali. Z laserjem so rezali,

kjer je označeno, in prerezali mikrotubule. Kvadratki na mreži so veliki m. Na desni sliki je prikazano

rezanje na večji skali. Na sliki vidimo repno plavut odrasle cebrice, ki jo po korakih režemo, kot je označeno.

Skala je m.17

Slika 9: Na levi sliki je prikazan nespremenjen srčni utrip: atrij se skrči in porine kri v ventrikel, nato se ta skrči

in potisne kri v obtok. Na desni sliki so z osvetlitvijo označenega dela srca dosegli obratno krčenje. Skala na

sliki je 20 m. 16

13

Tako lasersko rezanje lahko poteka na različnih prostorskih skalah od submikronske do

milimetrske. Slika 10 prikazuje rezanje mikrotubula na submikronski skali in rezanje repne

plavuti ribe cebrice.17

S to metodo so opazovali tudi odziv imunskega sistema zarodka vinske mušice. Zarodek so

poškodovali s stotimi UV sunki, nato pa z metodo SPIM opazovali gibanje hemocitov.

Hemociti so celice, ki igrajo pomembno vlogo v imunskem sistemu nevretenčarjev. V tem

eksperimentu so hemociti vsebovali zeleni fluorescentni protein. Takoj po poškodbi so se

hemociti iz celega zarodka usmerili tja (slika 11).17

5. Zaključek

Mikroskopija z ravninsko osvetlitvijo vzorca je nova metoda, pomembna predvsem v razvojni

biologiji. Omogoča slikanje celotnih živih vzorcev, velikih do nekaj milimetrov, ter

spreminjanje njihovega delovanja in razvoja. Tako veliki vzorci so lahko zelo neprozorni.

Problemu absorpcije in sipanja se lahko v majhnem obsegu izognemo že s konstrukcijo slike

iz posnetkov vzorca z več zornih kotov, v večjem obsegu pa se tovrstnim problemom

izognemo z uporabo izboljšanih metod mSPIM in SPIM-SI. Metoda SPIM za slikanje

celotnega vzorca, razdeljenega na okoli 200 plasti, z nekaj zornih kotov potrebuje nekaj

minut. Če želimo opazovati spremembe vzorca na manjši časovni skali, moramo uporabiti

mikroskopijo z digitalnim laserskim skeniranjem (DSLM), ki lahko sliko celotnega vzorca

zajame že v nekaj sekundah. SPIM mikroskop se uporablja tudi za optično manipulacijo

vzorcev.

Zaradi uspešnosti metode SPIM v razvojni biologiji se je njena uporaba začela širiti tudi na

druga področja, najprej v sorodno celično biologijo. V fiziki razvijajo visoko ločljivo metodo,

osnovano na metodi SPIM, za optično sledenje nanodelcem.18

SPIM je metoda z visoko

ločljivostjo, hitrim zajemanjem, veliko penetracijsko globino ter odličnim razmerjem med

signalom in šumom. Slabost metode pa je, da z njo lahko opazujemo samo vzorce, ki

vsebujejo fluorofore. To v veliki večini pomeni, da morajo biti vzorci gensko spremenjeni. S

spremembo genskega zapisa vzorcev ti niso več povsem enaki vzorcem enakih organizmov,

Slika 11: Imunski odziv zarodka vinske mušice. Na modro označenem mestu so vzorec poškodovali s 100 UV

sunki. Rdeče pike na sliki a prikazujejo lokacije hemocitov ob času 0. Slika b prikazuje, kako so se ti hemociti v

29 min po poškodbi premikali proti njej. Skala je m.17

14

ki niso bili gensko spremenjeni. Lansko leto je bil objavljen članek, ki predstavlja

nizkokoherenčno mikroskopijo z ravninsko osvetlitvijo za slikanje bioloških vzorcev brez

fluorescence.19

V to smer bo verjetno tekel tudi nadaljnji razvoj, saj je končni cilj dobiti

metodo, s katero bi lahko z visoko prostorsko in časovno ločljivostjo opazovali žive

nespremenjene vzorce ter njihov razvoj in obnašanje.

Literatura

1. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J. in Stelzer, E. H. K. Science 305, 1007-

1009 (2004).

2. Dosegljivo na http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence_microscope (2012).

3. Kokalj, M., Izboljšanje ločljivosti pri fluorescenčni mikroskopiji, Seminar (2011).

4. Dosegljivo na http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence_microscope (2012).

5. Dosegljivo na http://www.uni-muenster.de/Physik.PI/DeCola/trcm.html (2012).

6. Mur, J., Dvofotonski procesi, Seminar (2011).

7. Huisken, J. in Stainier, D. Y. R. Development 136, 1963-1975 (2009).

8. Greger, K., Swoger, J. in Stelzer, E. H. K. Rev. Sci. Instrum. 78, 023705 (2007).

9. Swoger, J., Verveer, P., Greger, K., Huisken, J. in Stelzer, E. H. K. Opt. Express 15, 8029-

8042 (2007).

10. Verveer, P. J., Swoger, J., Pampaloni, F.,Greger, K., Marcello, M., Stelter, E. H. K. Nat.

Methods 4, 311-313 (2007).

11. Huisken, J. in Stainier, D. Y. R. Opt. Lett. 32, 2608-2610 (2007).

12. Breuningen, T., Greger, K. in Stelzer, E. H. K. Opt. Lett. 32, 1938-1940 (2007).

13. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J. in Stelzer, E. H. K. Science 322, 1065-1069

(2008).

14. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Santella, A., Khairy, K., Bao, Z., Wittbrodt, J.,Stelzer, E. H.

K. Nat. Methods 7, 637-642 (2010).

15. Keller, P. J., Pampaloni, F. in Stelzer, E. H. K. Nat. Methods 4, 843-846 (2007).

16. Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y. R., Baier, H. in Huisken, J. Science 330, 971-974 (2010).

17. Engelbrecht, C. J., Greger, K., Reynaud, E. G., Kržič, U., Colombelli, J., Stelzer, E. H. K.

Opt. Express 15, 6420-6430 (2007).

18. Fedosov, I. V., Nefedov, I. S., Khlebtsov, B. N. in Tuchin, V. V., predstavljeno na The

European Conference on Lasers and Electro-Optics (CLEO/Europe), München, 2011.

19. Xu, Z. in Holy, T. E. Proc. of SPIE 8129, 812908-2 (2011).