Spettroscopia Infrarossa: Microscopia, SPR-FT · abC bM I I A log T log 0 10 =− = 10 = = ... 2.37 K2Cr2O7, H2SO4 conc. Alta 14 * Amorphous material transmitting infrared

The world leader in serving science

Caratterizzazione Fisico–Chimica e morfologica dei Materiali:

Spettroscopia Infrarossa: Microscopia, SPR-FT

Siena 23 Novembre 2008

Massimiliano Rocchia, PhDProduct SpecialistMolecular SpectroscopyThermo Fisher ScientificStrada Rivoltana20090 Rodano- Mi-ItalyWeb: http://www.thermo.come-mail: [email protected]

http://www.thermo.com/

mailto:[email protected]

2

SPR (Surface Plasmon Resonance spectroscopy)

Spettroscopia infrarossa• Introduzione e basi teoriche

Tecniche di Campionamento Macro• Trasmissione• Riflessione (Speculare – Diffusa)• Riflessione totale attenuata

Strumetazione infrarossa• Strumenti dispersivi e strumenti FT

Interpretazione Spettrale

Microscopia Infrarossa

Sommario

3

Spettroscopia

La Spettroscopiaè una scienza che studia l’interazione di due entità diverse, ma

nello stesso tempo simili tra loro

MATERIA RADIAZIONEELETTROMAGNETICA

4

Radiazione Elettromagnetica

Radiazione o Onda Elettromagnetica è costituita da due campi oscillanti perpendicolari tra loro, un campo elettrico ed uno magnetico, che si propagano nel vuoto:

5

Proprietà della radiazione elettromagnetica

La radiazione o onda elettromagnetica è descritta da:

Lunghezza d’onda Lunghezza d’onda

Ampiezza

Distanza tra due massimi.

(HZ) Numero di oscillazioni complete nell’unità di tempo

(cm-1) Numero di onde nell’unità di lunghezza – L’inverso della lunghezza d’onda e proporzionale alla frequenza

Lunghezza d’Onda λ

Frequenza ν

Numero d’Onda ν

(nm) Tempo necessario a compiere un’oscillazione completa o a percorrere uno distanza pari a λ

Velocità: dipende dal mezzo in cui si propaga la radiazione.Velocità nel vuoto c ≅ 3.108 m/s.

In un altro mezzo:vmedia = c/n

dove n è l’indice di rifrazione del mezzo

Periodo T

6

Spettro Elettromagnetico

7

Natura corpuscolare: Fotoni

Una radiazione elettromagnetica che interagisce con la materia deve essere vista nella sua natura corpuscolare e quindi come flusso di particelle aventi energie discrete, chiamate FOTONI.

L’energia di un fotone è direttamente proporzionale alla frequenza dell’onda, secondo l'equazione:

E = h X ν = hc/ λ = hcνdove h è la costante di Planck; h = 6.63*10-34 Joule*s

Il carattere corpuscolare della radiazione consente di studiare gli scambi di energia della luce con la materia

8

Interazione Radiazione Elettromagnetica - Materia

Postulati di Bohr:

• La materia (sistemi atomici) esiste in stati stabili

• L’assorbimento o l’emissione di energia elettromagnetica avviene quando passa da uno stato di energia ad un altro

• Il processo di assorbimento o emissione corrisponde ad un fotone di

energia hν = E2-E1 differenza di energia tra due strati

Gli stati energetici della materia possono essere modificati solo da quei fotoni che hanno un energia corrispondente alla differenza tra due stati

9

Interazione Radiazione Elettromagnetica - Materia

E0 E1 E2 E3

Fotone di enegia hνtale che Ex-Ex-1= hν

Nucleo

Fotone di enegia hν1 tale che Ex-Ex-1≠ hν1

10

Condizioni per l’assorbimento in infrarosso

νλ

hhcE ==ΔCondizione di risonanza

L’energia dei fotoni deve essere uguale all’energia necessaria a far

passare la molecola dallo stato vibrazionale n=0 a quello n=1

1

Il momento dipolaredi una molecola deve

cambiare a seguito della transizione vibrazionale

2

11

Condizioni per l’assorbimento in infrarosso

Cl H

N NNessun segnale IR attivo

Momento dipolareL’intensità dell’assorbimento infrarosso dipende dall’efficacia con cui l’energia del fotone viene trasferita alla molecolaQuesto dipende dal cambiamento del momento di dipolo indotto dalla vibrazione

12

Regione infrarossa dello spettro elettromagnetico

La regione infrarossa dello spettro elettromagnetico si

occupa delle vibro-rotazioni degli atomi costituenti le

molecole:

• Organici ed inorganici• Solidi, liquidi e gas

• Campionamento micro&macro• Analisi quantitative&qualitative

Scissoring

(forbice)

Rocking

(dondolo)

Twisting

(torsione)Wagging

(agitare)

Stretching

asimmetrico

Stretching

simmetrico

13

Regione infrarossa dello Spettro Elettromagnetico

UV Visibile NEAR MID

vibrazioni di overtonevibrazioni di combinazione

vibrazioni fondamentalivibrazioni di fingerprint

vibrazioni di scheletro

FAR

Nella regione infrarossa si utilizzano i numeri d’onda (cm-1) in quanto si ha la necessità di utilizzare la frequenza (grandezza proporzionale all’energia) l’unità di misura in HZ non viene utilizzata

14

Sommario



15

Spettrofotometri IR Dispersivi

Grating

Detector

IR Source

Reference

Sample

Chopper

Slits

16

Strumentazione IR Trasformata di Fourier

Detector

Sorgente IR

Specchio fisso

x 0 -x

Beamsplitter

Laser diodeHe-Ne laser

Campione

Specchio mobile

17

Funzionamento Interferometro Michelson

Differenza di fase = 0

Specchio Fisso

Beamsplitter

x 0 -x

Specchio Mobile

Differenza dicammino ottico:

SF = SMZERO PATH

DIFFERENCE

Detector IR

18


Differenza di fase = 1/4λ

Specchio Fisso

Beamsplitter

Specchio Mobile

Differenza di camminoottico: SF = SM - 1/8λ

Detector IR

x 0 -x

19


Differenza di fase = 1/2λ

Specchio Fisso

Beamsplitter

Specchio Mobile

Differenza di camminoottico: SF = SM - 1/4λ

x 0 -x

Detector IR

20

Dal dominio del tempo a quello delle frequenze: FTV

olta

ggio

Differenza di cammino ottico (ritardo)

λInterferogramma di una sola frequenza

λ/4

λ/2

21

Dal dominio del tempo a quello delle frequenze: FTV

olta

ggio

Differenza di cammino ottico (ritardo)

FT

Voltaggio

FT

FT

Frequenza

22

Dal dominio del tempo a quello delle frequenze: FT

FT

Interferogrammaregione infrarossa

Spettro infrarosso

23

Strumentazione IR Trasformata di Fourier

Rapporto I/Io x 100

Interferogrammadel bianco

Curva I

FFT

Interferogrammadel campione

Curva Io

FFT

Signature: Not signed

0.4 0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2.0

2.1

2.2

Abso

rban

ce

5000 6000 7000 8000 9000 10000 Wavenumbers (cm-1)

24

Vantaggi spettrofotometri FT

Vantaggio JacquinotL’energia che arriva al rivelatore è molto elevata

(assenza di fenditure, monocromatori, filtri)Come conseguenza il rapporto segnale/rumore è migliore

Vantaggio ConnesLa presenza del laser He-Ne permette di avere

un riferimento interno, ad ogni scansione, per la scaladelle frequenze dell’interferogramma

Precisione 0.01cm-1

25

Vantaggi spettrofotometri FT

Vantaggio FelgettAcquisizione di uno spettro estremamente rapida

Possibilità di effettuare più scansioni

(il tempo di una scansione completa è pari al tempo che un sistema dispersivo impiega a registrare una porzione di spettro

uguale alla banda passante)

Possibilità di mediare le scansioni migliorando il rapportosegnale/rumore

26

Sommario




27

Polystyrene measured as a film

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

%T

500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Wavenumbers (cm-1)

Metodi di Analisi: Trasmissione

A: assorbanza

T: trasmittanza

I0, I: potenze radianti

a: assorbanza specifica

b: cammino ottico

C: concentrazione

ε: assorbanza specifica molare

M: molarità

I0 I

T= I /I0

A=log(Io/I )

bMabCIIlogTlogA 0

1010 ε===−=

Legge di Lambert-Beer

cam

pion

e

Polystyrene measured as a film

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

Abs

orba

nce

500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Wavenumbers (cm-1)

Film di polistirene

A %T

28

Metodi di Analisi: Riflessione Speculare

Dipende dall’indice di rifrazione (n) e dal coefficiente di estinzionemolare (k)

Si può correggere tramite la trasformata di Kramers-Kronig chetiene in considerazione i parametri sopra citati e permette di avere

uno spettro simile a quelli di trasmittanza

Sostanza che assorbe

(e riflette)

Riflessione assorbimentoRAS

Riflessione speculare

Sostanza che assorbe e

riflette

Metallo che riflette

θi θrθi=θr

Es: polimeri accoppiati con alluminio, vernici...

29

Metodi di Analisi: Riflessione Speculare

0.2

0.4

0.6

0.8

Log(

1/R

)

Polimetil Metacrilato Riflettanza Speculare KK

Polimetil Metacrilato Riflettanza Speculare

4

6

8

10

1000 1500 2000 2500 3000 3500

30

Metodi di Analisi: Riflessione Diffusa

SDDD

D• Per polveri o solidi che provochinoriflessione della radiazione in tutte le

direzioni (scattering)• Preparazione minima del campione• Elevata sensibilità (fino alle ppm)

• Adatta a campioni di vario tipo

Occorre eliminare la componente speculare in quanto altera le misure non essendo assrobita dal campione.

Lo spettro di riflessione diffusa può essere manipolato con la funzione di Kubelka Munk per ottenere spettri simili a quelli in

trasmittanza

31

Metodi di Analisi: Riflessione Diffusa

sK

RRRf =

−=

∞

∞∞ 2

)1()(

Kubelka Munk

Csa

RRRf 302.2

2)1()( =

−=

∞

∞∞

R∞ Riflettanza diffusa di un campione spessore infinito rispetto ad

un bianco non assorbente

K Coefficiente di assorbimento

s Coefficiente di scatteringPer basse concentrazioni

K = 2.302 a Ca assobanza specifica

C concetrazione

32

Metodi di Analisi: Riflessione Totale Attenuata (ATR)

Angolo criticoSorgente

nn11

nn22 n2n1>

θ

Indice dirifrazione

33

Metodi di Analisi: Riflessione Totale Attenuata

Campione in contatto con un cristallo ad elevato indice di rifrazione

Misura Superficiale

A seconda della dimensione del cristallo possono essere:Singola RiflessioneMultipla Riflessione

34


L’intensità dell’onda evanescente diminuisceesponenzialmente allontanandosi dalla superficie

Iev = Io exp [-z/dp]

z distanza dall’interfaccia (normale alla superficie)Io Intensità a z = 0,

dp distanza alla quale l’intensità dell’onda evanescente diminuisce di un valore rispetto al suo valore originario

dove n1 e n2 sono rispettivamente gli indici di rifrazione del cristallo e del solido/liquido da analizzare

θ angolo di riflessione

21

221

221

0

)(2 nsennd p

−=

θπ

λ

35


Parametri che influiscono sugli spettri in Riflessione totale attenuata

Indice di rifrazione del cristallo e del campione

Numero di riflessioni

Angolo di incidenza

Contatto tra cristallo e campione (Pressione)

36

Riflessione Totale Attenuata: Indice di rifrazione

ZnSe (45o) Esano RI = 2.4

Ge (45o) Esano RI = 4.0Si (45o) Esano RI = 3.4

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Ass

orba

nza

2700 2800 2900 3000 3100 3200 Numeri d’onda (cm-1)

37

Riflessione Totale Attenuata: Angolo di riflessioneA

bsor

banc

e

Ge 35° PP/PMMA/PEGe 40° PP/PMMA/PEGe 45° PP/PMMA/PEGe 50° PP/PMMA/PE

0.000

0.002

0.004

0.006

0.008

0.010

0.012

0.014

0.016

0.018

0.0200.022

2800 2900 3000 3100 Numeri d’onda (cm-1)

Ass

orba

nza

38

Riflessione Totale Attenuata: Numero di riflessioni

Esano 12 riflessioni

Esano 10 riflessioni

Esano 1 riflessione

0.1

0.2

0.3

0.4

Ass

orba

nza

1340 1360 1380 1400

Numeri d’onda (cm-1)

39

Riflessione Totale Attenuata: Pressione

Alta pressione di contattoMedia pressione di contattoBassa pressione di contattoNessuna pressione di contatto

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

Ass

orba

nza

2700 2800 2900 3000 3100 Numeri d’onda (cm-1)

Film di Polietilene

40

Riflessione Totale Attenuata: Cristalli

Range n Sensibile a: Durezza Range Ph

ZnSe 17000-650 2.4 Acidi e basiforti, agenti

complessanti(EDTA)

Bassa 5-9

Ge 5500-600 4 Acqua regia Media 1-14

Silicio 8300-660 3.4 HF e HNO3 Media 4-12

Amtir* 11000-700 2.5 Prolungataesposizione asoluzioni alcaline

Bassa 1-7

Diamante 4500-2500e 1667-33

2.37 K2Cr2O7,H2SO4 conc.

Alta <1;>14

* Amorphous material transmitting infrared radiation

41

Sommario





42

Interpretazione Spettrale: Medio infarosso

Polistirene

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%Tr

ansm

ittan

ce

800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2000 2500 3000 3500 Wavenumbers (cm-1)

ZONA GRUPPI FUNZIONALI

ZONA IMPRONTA DIGITALE

43


HCO

Finger Print

44


http://www.cem.msu.edu/~reusch/VirtualText/Spectrpy/InfraRed/infrared.htm

45


Posizione IntensitàForma

Informazioni che un segnale infrarosso fornisce

46


Gruppi funzionali Frequenze(cm-1) Intensità Assegnazione Frequenze

(cm-1) Intensità Assegnazione

Alcani 2850-3000 str CH3, CH2 e CH2 o 3 segnali

1350-14701370-1390720-725

medmedwk

CH2 e CH3

deformazioneCH3 deformationCH2 rocking

Alcheni 3020-31001630-1680

1900-2000

medvar

str

=C-H & =CH2 (stretto) C=C (simmetrico intensitàridotta)

C=C asymmetric stretch

880-995780-850675-730

strmedmed

=C-H & =CH2

(out-of-plane bending)cis-RCH=CHR

Alchini 33002100-2250

strvar

C-H (stretto)C≡C (simmetrico intensitàridotta)

600-700 str C-H deformation

Areni 30301600 & 1500

varmed-wk

C-H (possibilità di molti segnali)C=C (in ring) (2 segnali)(3 se coniugato)

690-900 str-med C-H bending e modi di anello

Alcoli e Fenoli 3580-36503200-3550

970-1250

varstr

str

O-H (free), (stretto)O-H (H-bonded), solitamentelargoC-O

1330-1430

650-770

med

var-wk

O-H bending (in-plane)O-H bend (out-of-plane


47


Ammine 3400-3500 (Dil. Sol.)

3300-3400 (Dil. Sol.)1000-1250

wk

wkmed

N-H (ammine primarie), 2 segnaliN-H (ammine secondarie)C-N

1550-1650660-900

med-strvar

NH2 scissoring (ammine primarie)NH2 e N-H wagging(shift per legameidrogeno)

Aldeidi e Chetoni 2690-2840(2 segnali)1720-17401710-1720

1690 1675 1745 1780

medstrstr

strstrstrstr

C-H (aldeide C-H)C=O (aldeide satura) C=O (chetone saturo)

Aril chetoneα, β-insaturociclopentanoneciclobutanone

1350-13601400-1450 1100

strstrmed

α-CH3 bendingα-CH2 bendingC-C-C bending

Acidi carbossilicie derivati

2500-3300 (acidi) su C-H1705-1720 (acidi)1210-1320 (acidi)

1785-1815 (acil) 1750 & 1820 (anidridi)

1040-1100 1735-1750 (esteri)

1000-1300 1630-1695(amidi)

strstrmed-str

strstrstrstrstrstr

O-H (molto largo)C=O (legame idrogeno) O-C (a volte 2 segnali)

C=OC=O (2 segnali)

O-CC=O

O-C (2 segnali)C=O (amide primaria)

1395-1440

1590-1650

1500-1560

med

med

med

C-O-H bending

N-H (amide primaria) N-H (amide secondaria)


48

Sommario




Interpretazione SpettraleMicroscopia Infrarossa

49

Cosa è Possibile Analizzare?

Microscopia ottica con analisi Infrarossa

Particelle solide

Fibre

Superfici

Laminati

Film multistrato

Inclusioni

Difetti

Impurezze

50

CAMPIONE

SUPPORTOSUPPORTO

1 - TRASMISSIONE2 - RIFLESSIONE

3 - RIFLESSIONE ATR

MICRO CRISTALLO ATR

Tipi di Misure in Microscopia IR

51

TRASMISSIONE:Particelle appiattiteFibre appiattiteLaminati e sezioni multistratoInclusioni asportate da manufattiImpurezze prelevate da prodottiRisoluzione spaziale > 8-10 μm

%T

RIFLESSIONE:Particelle appiattiteSuperfici riflettentiInclusioni asportateImpurezze prelevateRis Sp > 10 μm

%R

MICRO ATR:Particelle tal qualiFibre tal qualiSuperfici tal qualiInclusioni tal qualiImpurezze tal qualiRis Sp > 10 μm

Micro ATR

Tipi di Misure in Microscopia IR

52

Mascheramento del Campione

Quando il raggio Infrarosso è di dimensioni più grandi dell’area di interesse (*):

• Lo spettro che si ottiene include informazioni dalla zona diinteresse analitico ma anche da quelle adiacenti

• Questo effetto indesiderato è detto “contaminazione spettrale”e può pregiudicare la qualità dell’analisi fino alla scorrettainterpretazione

Esempio:

(*) Nel punto di fuoco ottimale del microscopio FT-IR il raggio IR viene focalizzato a circa 150 micron di diametro. Per analizzare campioni di dimensioni più piccole (il 90% dei casi) ed evitare “contaminazione spettrale, occorre mascherare.

Film polimerico di Polipropilene

Inclusione (?)

53


Analisi dell'inclusione SENZA APERTURE

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

%T

500 1000 1500 2000 2000 3000 4000 Wavenumbers (cm-1)

???

54


Analisi dell'inclusione CON APERTURE: Polistirene HQI 99%

10

20

30

40

50

60

70

80

90

%T

500 1000 1500 2000 2000 3000 4000 Wavenumbers (cm-1)

Film estruso di polipropilene

10

20

30

40

50

60

70

80

90

%T

500 1000 1500 2000 2000 3000 4000 Wavenumbers (cm-1)

Apertura

Polipropilene

Polistirene

55

Apertura

Lo spettro IR viene espresso in Numeri d’Onda• Il campo spettrale IR, espresso in Numeri d’Onda

è compreso tra 4000 e 400 cm-1

• Espresso in Lunghezza d’Onda (l’IR è nell’ordine dei Micron) il campo spettrale risulta essere compreso tra 2,5 e 25 micron

In microscopia FT-IR, un’apertura di dimensioni molto piccole rappresenta un limite fisico:

• Quando le sue dimensioni raggiungono valori prossimi alle lunghezze d’onda della radiazione incidente

• Le lunghezze d’onda superiori alle dimensioni dell’apertura nonpossono attraversarla e quindi non sono rilevate

56

Apertura

Wavenumbers (cm-1)

apertura 20 x 20 micron50

100

%T

50

100

%T

50

100

%T

50

100

%T

1000 1500 2000 2000 3000

10μm7μm

apertura 15 x 15 micron



57

Modificazione superficiale con risoluzione micrometrica Analisi puntuale

4 3 2 1

Immagine da microscopio ottico

Immagine da microscopio elettronico

Materiale Silicio poroso terminato con idrogenoLa microscopia FTIR mi permette di ottenere informazioni sulle modificazioni chimiche successive al trattamento subito dal materiale (bombardamento con elettroni) con risoluzione micrometrica

Finestra 100X100 micron

58

Microscopia infrarossa Mapping ed Immagini chimiche

Mappa 1,1 X 1,2 mm2 (cornice rossa)

• Finestra di Campionamento100X100 μm2

• Step 50 μmFinalità della misura:

• Verificare il numero dicomponenti della vernice e l’omogeneità degli stessi sullasuperficie

Capacità di abbinare l’Informazione chimica (spettri infrarossi) e l’informazione spaziale (distribuzione componenti)

59

Dalla mappatura si risale ai costituenti della vernice che sono stati identificati come:

• Polifenilensolfuro PPS• Politetrafluoroetilene PTFE


60


nF

FF

F

S

n

Mappa di correlazione spettrale ottenuta sulla base dello spettro del PTFE Rosso nella mappa correlazione ottima rapporto pari a 1

Blu nella mappa correlazione molto bassa

rapporto pari a 0

1

0

61


Sovrapposizione dell’immagine chimica con l’immagine otticaGarantisce l’individuazione immediata della distribuzione dei singoli componenti

62


40 2030 15 10μm

Corrosione di un bronzoMappa in ATR

5350 data points

Universita’ di BolognaTecnologie per la Conservazione dei Beni CulturaliProf. Rocco [email protected]

Informazione chimica (spettri infrarossi) eInformazione spaziale (mapping)

63


Bronze (no absorption) correlationChemical image

Azurite 950 cm-1 region chemigramChemical image

Malachite 1040 cm-1 region chemigramChemical image

Cellulose correlationChemical image

Embedding resin correlationChemical image

Abso

rban

ce (

Abs

)

0.00

0.05

0.10

3800 3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

Position (micrometers)=12 µm ;331 µm

Abso

rban

ce (

Abs

)

0.00

0.05

0.10

3800 3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

Position (micrometers)=12 µm ;331 µm

64

Compressa farmaceutica

ORIGINAL SPECTRUM

0.8

1.0

1.2

1.4

Abs

KRAMERS KRONIG CORRECTED

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Abs

Acetylsalicylic acid; Aspirin

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Abs

1000 1500 2000 2000 2500 3000 3500 4000 Wavenumbers (cm-1)

* Position (micrometers)=-16228 µm ;977 µm

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

Abs

Caffeine

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Abs

1000 1500 2000 2000 2500 3000 3500 4000 Wavenumbers (cm-1)

* Position (micrometers)=-13356 µm ;-1551 µm

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2.0

2.1

2.2

Abso

rban

ce

1000 1500 2000 2000 2500 3000 3500 4000 Wavenumbers (cm-1)

Spectrum from map and Caffeine KK corrected and Acetylsalicylic acid

Excipient


65


28 spettri ad ognistep tavolino

14 elementi

• Due di 14 elementi• 28 elementi totali

Ingrandimentoobiettivo

Dimensionepixel

(microns)

15x 20

32x 9

Detector Imaging

66

Sommario





Microscopia Infrarossa

SPR (Surface Plasmon Resonance spectroscopy)

glassprism

p-polarized

incident b

eam

reflected beam

SPR

67

Angolo SPR(+bassa %R)

450Å lamina di oro

Luce polarizzata p

Angolo critico

Come funziona la tecnica SPR

(riflessione interna)

Condizione 3 Raggiungere l’angolo SPR Angolo a cui l’energia della radiazioneincidente polarizzata p viene assorbita dagli elettroni liberi del metallo(oro) e si genera un minimo nello spettro di riflessione

Condizione 1 Luce polarizzata p incidente sulla superficie

Condizione 2 Condizione di riflessione totale interna

L’angolo SPR dipende da:1 - Proprietà del film 2 - Lunghezza d’onda della luce incidente3 - Metallo utilizzato4 - Indice di rifrazione ad entrambi i lati del film metallico

68

Dipolo immagine nei metalli

Carica positiva vicino alla superficie:Attrae gli elettroni liberi verso la superficie

Risultato parziale carica negativa verso la superficie del metallo

Fuori dalla superficie si crea un campo elettricoprodotto dalla ridistribuzione delle cariche.

.

69


All’interfaccia il campo elettrico risultante ènullo

Il dipolo immagine cancella il dipolo reale

Dipolo parallelo alla superficie:

Dipolo reale

Dipolo immagine

70


μeffective=2μ0

μ0

μimage

Il dipolo immagine è orientato nella stessadirezione del dipolo reale

Momento di dipolo totale doppioIl metalllo amplifica il momento di dipolo

Dipolo Reale

DipoloImmagine

Dipolo perpendicolare alla superficie:

71

Come può essere sfruttata la tecnica SPR Monitoraggioangolo SPR

ΔΘ

0%

20%

40%

60%

80%

100%

50 51 52 53 54 55 56 57 58Angolo di incidenza

Rifl

ettiv

ità

Solo oro

+5 nm Coating

Lunghezza d’ondacirca 12500 cm-1

Shift dell’angolo di minima riflessione

Elevata precisione nella misura dell’angolo di incidenzaNecessità di misurare angoli inferiori a 0.001 grado per monitoraredeposizioni di monolayer

72

Come può essere sfruttata la tecnica SPR Monitoraggiominimo di riflettività mediante FTIR

Il monitoraggio della lunghezza d’onda del minimo di riflettività presentaalcuni vantaggi rispetto all’angolo Uno shift di alcuni numeri d’ondaequivale ad una variazione dell’angolo di 0.001 gradoLa tecnica FTIR garantisce una precisione migliore di 0.5cm-1 e quindisensibilità elevatissime FT-SPR permette sensibilità minori di 1 Å

73

Come può essere sfruttata la tecnica SPR Monitoraggiominimo di riflettività mediante FTIR

Variazione angolo vs variazione lunghezza d’onda

74

Applicazioni della tecnica SPR

Probe immobilizzato Analita Dimostrata

DNA DNA

RNA

Proteina

Proteina

Proteina

DNA

DNA

Peptide

Proteina

75

NIR Beam from FT-IR

polarizer

lens

lens

InGaAsdetector

lens

mirror

prism

gold coat glass slide

aperture

Samplein / out

Strumentazione SPR

76

FT-SPR Deposizione di multistrati di biopolimeri

Deposizione di 2 biopolimeri Acido Poli-glutammico (MW 70.500) e Poli-lisina (MW 48.100) 2 soluzioni 10mg/ml in 100mM di soluzione buffer a pH 8Il chip d’oro è stato preparato utilizzando un SAM terminato con un tioloin testa ed una funzionalità carbossilica in coda (soluzione 1mM per 2h)La deposizione dei bipolimeri è avvenuta per cicli successiviDescrizione di un singolo ciclo:

• Riempimento cella con acido poliglutammico• Incubazione 10 minuti• Risciacquo con soluzione buffer• RIempimento cella con polilisina• Incubazione 10 minuti• Risciacquo con soluzione buffer

SPR

77

FT-SPR Multistrati di biopolimeri

SAM

Au

pLys

pGlu

pLys

pGlu

pLys

pGlu

pLys

pGlu

pLys

pGlu

1: t = 21.690 min.2: t = 25.778 min.3: t = 29.989 min.4. t = at 31.697 min.5. t = 36.822 min.6: t = 38.834 min.7: t = 45.179 min.8: t = 49.999 min.9: t = 54.515 min.

10: t = 58.178 min.11: t = 60.009 min

Total Δt = 60.009 – 21.690 = 38.319 min

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

% R

iflet

tanz

are

lativ

a(P

/S)

7000 8000 9000 10000 11000 Numeri d’onda (cm-1)

123 4

56

78

9

1011

78

Analisi in dinamica del binding Biotina T7-Streptavidina

TTTTTTT

TTTTTTT

Biotin-T7 bound to Streptavidin on SPRchip™Au

O OO ON O OO ON

S S

Streptavidin

Maleimide

T7

Biotin

Linker

TTTTTTT

TTTTTTT

SA-Maleimide probe covalently linked toSPRchip™

Au

O OO ON O OO ON

S S

Streptavidin

Maleimide

Linker

T7

Biotin

Biotin-T7 Analyte

mw = 2400

Multilayer binding structure showingBiotin-T7 bound to streptavidin on SPR chip.

79

Monitoraggio in real time del binding

Interazione con Biotina 7T (oligonucleotide biotinilato) 500nM

Buffer Biotina T7 Buffer

Biotina T7

Buffer

Tempo (sec)

80

Monitoraggio in real time del binding

Interazione con Biotina 7T (oligonucleotide biotinilato) 500nM – Streptavidina giàsaturata con biotina (non con oligonucleotide)

Tempo (sec)

81

Ibridizzazione DNA

Probe: 5’-HS-YYY GTG TTA GCC TCA AGT G-3’Analita non complememtare: 5’-AGA CTC TGA CTC AGT G-3’Analita complementare: 5’-CAC TTG AGG CTA ACA C-3’

Shift di 34.5 cm-1 corrispondente ad un assorbimento di un DNA con MW di 5300

82

Wegner GJ, Lee HJ, Corn RM, 2002. Anal. Chem. 74:5161-8

FLAG ancorato sulla superficie

83

Legame tra anticorpo-FLAG e il probe FLAG

0

5

10

15

20

25

30

35

40

9000 9200 9400 9600 9800

Wavenumber (cm-1)

SPR In

tens

ity

0 nM10 nM25 nM50 nM75 nM100 nM

Nexus™ 870

Concentrazione di anticorpo crescente

84

Shift del picco a ricoprimenti crescenti di anticorpo

Nexus™ 870

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 50 100 150 200 250 300

Anti-FLAG Ab Concentration (nM)

Rel

ativ

e su

rfac

e co

vera

ge

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-100 50 100 150 200 250 300

Raw data peak shifts

SPR

Pea

k Sh

ift c

m-1 Concentration (nM)

Langmuir di adsorbimento possibilità di determinarel’affinità dell’anticorpo

Spettroscopia Infrarossa: Microscopia, SPR-FT · abC bM I I A log T log 0 10 =− = 10 = = ... 2.37 K2Cr2O7, H2SO4 conc. Alta 14 * Amorphous material transmitting infrared

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