Spectroscopie infrarouge impulsionnelle appliquée au transfert de ligands dans les hémoprotéines Thèse Présentée par Thomas Polack préparée au Laboratoire d’Optique et Biosciences Directrice de thèse Antigoni Alexandrou
Mar 18, 2016
Spectroscopie infrarouge impulsionnelle appliquée au transfert de ligands dans les
hémoprotéines
Thèse Présentée parThomas Polack
préparée auLaboratoire d’Optique et Biosciences
Directrice de thèseAntigoni Alexandrou
• Transfert de ligands dans les hémoprotéines• Différentes approches expérimentales
• Expériences pompe-sonde spectralement intégrées• Résultats expérimentaux• Analyse et Interprétation
• Détection du champ émis • Mise en oeuvre• Expérience
• Conclusions et Perspectives
Plan de la présentation
• Transfert de ligands dans les hémoprotéines• Approches expérimentales
• Expériences pompe-sonde spectralement intégrées
• Résultats expérimentaux• Analyse et Interprétation
• Détection du champ émis • Mise en oeuvre• Expérience
• Conclusions et Perspectives
Plan de la présentation
F. Schotte, M. Lim, T. A. Jackson, A. V. Smirnov, J. Soman, J. S. Olson, G. N. Phillips Jr., M. Wulff, P. Anfinrud, Science 300, 1944 (2003).
Transfert de ligands
• Transport, stockage, catalyse enzymatique, détection de ligands
• Liaison du ligand à l’hème→ fonction de la protéine
• Dynamique du transfert du ligandsite de liaison ↔ extérieur
• Sonder le transfert :• rayons X• absorption transitoire visible
→ transitions électroniques de l’hème• absorption transitoire infrarouge
→ vibration du ligand
400 600 800 1000 1200
0
50
100
150
200
500 550 6000
5
10
15
Coef
ficie
nt d
'exct
ictio
n (m
M-1 c
m-1)
longueur d'onde (nm)
Sans CO
Avec CO
Motivations
• Compréhension du processus de transfert entre la poche de l’hème et l’extérieur de la protéine
→ Premières étapes du transfert
• Accès aux caractéristiques vibrationnelles du ligand aux temps courts
• Détection du champ émis : intervention de mouvements concertés dans le processus de transfert
Olson et al.Biochemistry(1994)
Elber et al.Biophys. J.(1998)
CO lié à l’hème
CO au docking-site
TransfertCO
Côté proximal
Côté distal
B1
Myoglobine : de l’hème au docking-site
Dissociation déclenchée par une impulsion pompe visibledans la bande de Soret à 400 nm.
CO lié à l’hème
CO sur le docking-site
Anfinrud et al., Nat. Struct. Biol. (1997)
Anfinrud et al. J. Chem. Phys.(1995)
┴
║
Δα
B1 B2
Caractéristiques infrarouges du transfert
Δα
Ligand CO
• Vibration en dehors du continuum des autres modesvibrationnels de la protéine• Forte absorption
Modification de la vibration
• 1945 → 2130 cm-1 • Diminution force d’oscillateurd’un facteur 30• Changement d’orientation
• Temps de déphasage ~1ps
Effets de polarisation perturbée• T2 ~1ps• Délai pompe-sonde négatif• Polarisation perturbée par la pompe• Oscillations spectrales
• Dynamique aux temps courts
• Transmission différentielleintégrées spectralementintégrées spectralement → signal faible
• Détection du champ émis
M. Joffre et al.Opt. Lett. 1988.
Domaine temporel
Domaine spectral
Polarisation P
Polarisation perturbéepar la pompe
P
• Transfert de ligands dans les hémoprotéines• Approches expérimentales
• Expériences pompe-sonde spectralement intégrées
• Résultats expérimentaux• Analyse et Interprétation
• Détection du champ émis • Mise en oeuvre• Expérience
• Conclusions et Perspectives
Plan de la présentation
Montage expérimental
Signal
Idler
RegACoherent
MiraCoherent
200 kHz, 150 fs4 µJ
Regen. Amp.
Oscillator
RegACoherent
MiraCoherent
200 kHz, 150 fs4 µJ
Regen. Amp.
Oscillator
RegACoherent
VitesseCoherent
100 kHz, 150 fs
OPA
1.2-2.4 µm 100 nJ
6 µJ
Amplificateur Régénératif
80 MHz, 100 fs800 nm, 5 nJ
Oscillateur
BBO BBO
Verdi 10 W
Translation-Rotationde l’échantillon
Pompe400 nm200 fs250 nJ
AgGaS2
BBO
Délai pompe-sonde
/2
DétecteurHgCdTe
IR
Interféromètre
Différence de fréquence
3-18 µm, 250 fs, 40 pJ
= 100 cm-1
• Transfert de ligands dans les hémoprotéines• Approches expérimentales
• Expériences pompe-sonde spectralement intégrées
• Résultats expérimentaux• Analyse et Interprétation
• Détection du champ émis • Mise en oeuvre• Expérience
• Conclusions et Perspectives
Plan de la présentation
• Intégration spectrale• Faible signal
-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4
Délai pompe-sonde (ps)
T/T x 105
Premiers résultats expérimentaux
Nécessité d’améliorer du rapport signal à bruit
Montage expérimental
Signal
Idler
RegACoherent
MiraCoherent
200 kHz, 150 fs4 µJ
Regen. Amp.
Oscillator
RegACoherent
MiraCoherent
200 kHz, 150 fs4 µJ
Regen. Amp.
Oscillator
RegACoherent
VitesseCoherent
100 kHz, 150 fs
OPA
1.2-2.4 µm 100 nJ
6 µJ
Amplificateur Régénératif
80 MHz, 100 fs800 nm, 5 nJ
Oscillateur
BBO BBO
Verdi 10 W
Translation-Rotationde l’échantillon
Pompe400 nm200 fs250 nJ
AgGaS2
BBO
Délai pompe-sonde
/2
DétecteurHgCdTe
IR
Interféromètre
AgGaS2
DétecteurHgCdTe
IR
Détection différentielle infrarouge• Hacheur mécanique haute fréquence• Intensité de référence
Echantillon
Faisceau pompe 50 kHz
Intensité sonde transmise
Intensité de référence
Laser (100 kHz)
Détectionsynchrone
• Transfert de ligands dans les hémoprotéines• Approches expérimentales
• Expériences pompe-sonde spectralement intégrées
• Résultats expérimentaux• Analyse et Interprétation
• Détection du champ émis • Mise en oeuvre• Expérience
• Conclusions
Plan de la présentation
nombre d’onde ( cm-1)
1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300
CO sur ledocking site
CO liéà l’hème
12
3
1945 2130 cm-1 Nombre d’onde
Inte
nsité
(uni
tés
arbi
traire
s)Sondes Infrarouges et absorption du ligand
Sonde = 100 cm-1
x 10-4
Délai pompe-sonde (fs)-1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 2000
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
┴
║
║
Fréquence initiale1945 cm-1
Fréquence finale2120 cm-1
Fréquence intermédiaire
2060 cm-1
-ΔT/T
Aucun signal observé dansdeoxymyoglobine
1945 2130
12
3
Transmission différentielle dans MbCO
Pompe 400 nmSonde IR
Absorption différentielle
Angle MagiquePompe 400 nmSonde IR
Fréquence initiale
Fréquence finale
-4
• Transfert de ligands dans les hémoprotéines• Approches expérimentales
• Expériences pompe-sonde spectralement intégrées
• Résultats expérimentaux• Analyse et Interprétation
• Détection du champ émis • Mise en oeuvre• Expérience
• Conclusions
Plan de la présentation
Modèle Phénoménologique :
• Polarisation induitelinéairement par la sonde• Modèle à 2 niveaux équations de Bloch• Variation
• fréquence• force d’oscillateur• temps de déphasage• orientation
Simulations
1900 2000 2100 2200Nombre d’onde (cm-1)
)())'()'(*(')()()( )''('')''('' ttteedtittt tdttdtit
baab
EP
Changement instantané de force d’oscillateur
→ Changement abrupt de la force d’oscillateur n’est pas compatible avec l’expérience
Fréquence initiale
Fréquence finale
-4ExpérienceSimulation
Changement progressif de force d’oscillateur
→ Temps caractéristique de la diminution de la force d’oscillateur : 400 fs
Fréquence initiale
Fréquence finale
-4
ExpérienceSimulation
Changement de fréquence vibrationnelle progressif
→ Moins bon accord avec les expériences
Fréquence initiale
Fréquence finale
-4
ExpérienceSimulation
Effet d’un élargissement spectral
→ Influence faible pour un élargissement inférieur à la largeur du spectre de sonde
Fréquence initiale
Fréquence finale
-4Avec élargissementSans élargissement
0 700 1400
Sonde à la fréquence finale
Sonde à la fréquence initiale
Tran
smis
sion
diff
éren
tielle
-T/
T (a
. u.)
Délai pompe-sonde (fs)
2145 cm-1
1945 cm-1
Expériences intégrées spectralement• Changement de fréquence quasi-instantané• Diminution progressive de la force d’oscillateur• Faible influence de l’élargissement spectral
• Nouvelle observation• Compatible avec les résultats
de Anfinrud et al• Indicateur de la distance Hème-CO• Nécessité de calculs de force d’oscillateur
→ Utilisation de la force d’absorption comme sonde du transfert
• Transfert de ligands dans les hémoprotéines• Approches expérimentales
• Expériences pompe-sonde intégrées spectralement
• Résultats expérimentaux• Analyse et Interprétation
• Détection du champ émis • Mise en oeuvre• Expérience
• Conclusions
Plan de la présentation
ET = EI + ER t
EIncident
ERayonné
Champ émis ER
Transmission |ET |2
ETransmis
Champ transmis et Champ rayonné
Expériences de détection du champ émis
Eexcitation
EPOMPE
Eréférence
Nécessité d’un contrôle de la phase refexc
• Transfert de ligands dans les hémoprotéines• Approches expérimentales
• Expériences pompe-sonde spectralement intégrées
• Résultats expérimentaux• Analyse et Interprétation
• Détection du champ émis • Mise en oeuvre• Expérience
• Conclusions
Plan de la présentation
Montage expérimental
Signal
Idler
RegACoherent
MiraCoherent
200 kHz, 150 fs4 µJ
Regen. Amp.
Oscillator
RegACoherent
MiraCoherent
200 kHz, 150 fs4 µJ
Regen. Amp.
Oscillator
RegACoherent
VitesseCoherent
100 kHz, 150 fs
OPA
1.2-2.4 µm 100 nJ
6 µJ
Amplificateur Régénératif
80 MHz, 100 fs800 nm, 5 nJ
Oscillateur
BBO BBO
Verdi 10 W
Translation-Rotationde l’échantillon
Pompe400 nm200 fs250 nJ
AgGaS2
BBO
Délai pompe-sonde
/2
DétecteurHgCdTe
IR
Interféromètre
Montage expérimental
AgGaS2
DétecteurHgCdTe
échantillon
AgGaS2
• Deux générations IR• Phase relative difficile à stabiliser
Modification de la configuration expérimentale
HeNe
PZT
Microcontrôleur
Montage expérimental
AgGaS2
DétecteurHgCdTe
échantillon
• Impulsion de référence engendrée dans le même cristal• Interferomètre asservi → Impulsions vérouillées en phase• Impulsion de référence engendrée dans le même cristal• Impulsion de référence engendrée dans le même cristal• Interferomètre asservi → Impulsions vérrouillées en phase• Détection synchrone à la somme de fréquence fpompe + fexcitation
Détection synchrone
fpompe
fexcitation
Deux approches possiblesDétection homodyne référencée
Détection homodyne auto-référencée→ facilité de mise en oeuvre
)'(' tdtexcitation
• Transfert de ligands dans les hémoprotéines• Approches expérimentales
• Expériences pompe-sonde spectralement intégrées
• Résultats expérimentaux• Analyse et Interprétation
• Détection du champ émis • Mise en oeuvre• Expérience
• Conclusions et Perspectives
Plan de la présentation
-1000 -500 0 500 1000
-60
-30
0
Délai (fs)
GaAs =0 /2
Expérience de détection du champ émis
-1000 -500 0 500 1000
-0.50-0.45-0.40-0.35-0.30-0.25-0.20-0.15-0.10-0.050.000.050.100.150.20
Délai (fs)
Imag -Real -Imag Real
pompe
référenceexcitation
t
pompe
référenceexcitation
t
500 fs
Expériences de détection du champ émis
• Changement avec la phase• Contribution pompe-sondeImpulsion excitatrice
• Transfert de ligands dans les hémoprotéines• Approches expérimentales
• Expériences pompe-sonde spectralement intégrées
• Résultats expérimentaux• Analyse et Interprétation
• Détection du champ émis • Mise en oeuvre• Expérience
• Conclusions et Perspectives
Plan de la présentation
Conclusions• Expériences pompe-sonde spectralement intégrées
• Mesure l’absorption intégrée et le décalage en fréquence • Expérience adaptée aux grands changements de fréquence > 100 cm-1 (myoglobine)
• Mise en évidence d’une décroissance non-instantanée de la force d’oscillateur, c’est une nouvelle observation• Utilisation de cette force d’oscillateur comme sonde du transfert
• Expériences de détection du champ émis• Démonstration expérimentale• Expérience adaptée aux faibles changements de fréquence et transfert cohérent
• Etude du transfert de ligand dans diverses hémoprotéines à l’aide des méthodes développées• Expérience de détection du champ émis dans la cytochrome c oxydase
Perspectives
Ursula Liebl and Gérard Lipowski and Michel Négrerie and Jean-Christophe Lambry and Jean-Louis Martin and Marten H. Vos, Nature 401 (1999)Fe=cm-1 → Cu=2062 cm-1