1 2007 2007 2007 2007 Ecole d’été Peyresq 2009 Anne-Sophie Montcuquet 23 Juillet 2009 © CEA 2009. All rights reserved Any reproduction in whole or in part on any medium or use of the information contained herein is prohibited without the prior written consent of CEA Spectroscopie de fluorescence en milieu diffusant pour l’étude de structures profondes Montcuquet Anne-Sophie Ecole d’été Peyresq 2009 – 23 Juillet 2009 Directeur de thèse: J. Mars Responsable CEA: J. M. Dinten Encadrant CEA: L. Hervé
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Ecole d’été Peyresq 2009 Anne-Sophie Montcuquet 23 Juillet 2009
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Spectroscopie de fluorescence en milieu
diffusant pour l’étude de structures profondes
Montcuquet Anne-Sophie
Ecole d’été Peyresq 2009 – 23 Juillet 2009
Directeur de thèse: J. MarsResponsable CEA: J. M. Dinten
Encadrant CEA: L. Hervé
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Ecole d’été Peyresq 2009 Anne-Sophie Montcuquet 23 Juillet 2009
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Plan de présentation
1. Introduction
1. Contexte
2. Problématique
2. Séparation de sources de fluorescence par FMN
1. 1D
2. 2D et multiplexage
3. Régularisation
4. Conclusion et perspectives
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Ecole d’été Peyresq 2009 Anne-Sophie Montcuquet 23 Juillet 2009
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Plan de présentation
1. Introduction
1. Contexte
2. Problématique
2. Séparation de sources de fluorescence par FMN
1. 1D
2. 2D et multiplexage
3. Régularisation
4. Conclusion et perspectives
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Contexte
tumeur
source laser� Exploration des tissus par de lalumière visible: proche infra rouge
� Limite l’absorption des tissus
� Localisation de marqueursfluorescents
�Applications:� Etude de mécanismes biologiques
� Outil Diagnostic (détection de tumeurs)
o Petit animal (corps entier)o Homme (cerveaux, sein, prostate)
marqueurs fluorescents
En profondeur?
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Problématique
tumeur
source laser
Fluorescence spécifique
���� Signal utile
���� Signal parasite
autofluorescence
���� Analyse spectrale des signaux de fluorescence
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Dispositif expérimental
laser « rouge »
spectromètre
caméra CCD
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Plan de présentation
1. Introduction
1. Contexte
2. Problématique
2. Séparation de sources de fluorescence par FMN
1. 1D
2. 2D et multiplexage
3. Régularisation
4. Conclusion et perspectives
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Problématique
Développer un algorithme de séparation de spectres adapté à nos données spectrales
longueur d ′onde (nm)
posi
tion
le lo
ng d
e la
fen
te
Image de départ
750 800 850 900 950
20
40
60
80
100
120
140
160
180
2000
100
200
300
400
500
600
700
800
Souris avec capillaire d’ICG sous-cutané
Autofluorescence
Fluorescence spécifique
Pos
ition
le lo
ng d
e la
lign
e X
d
7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 1 0 0 00
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
lo n g u e u r d 'o n d e ( n m )
inte
nsité
7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 1 0 0 00
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
lo n g u e u r d 'o n d e ( n m )
inte
nsité
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Problématique
700 750 800 850 900 950 10000
100
200
300
400
500
600
700
800
longueur d'onde (nm)
inte
nsité
Chevauchement de spectres- Variation des spectres in vivo
- Proportion autofluorescence / fluorescence spécifique inconnue
���� Déconvolution aveugle
longueur d′onde (nm)
posi
tion
le lo
ng d
e la
fen
teImage de départ
750 800 850 900 950
20
40
60
80
100
120
140
160
180
2000
100
200
300
400
500
600
700
800
Pos
ition
le lo
ng d
e la
lign
e X
d
Autofluorescence
Fluorescence spécifique
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Plan de présentation
1. Introduction
1. Contexte
2. Problématique
2. Séparation de sources de fluorescence par FMN
1. 1D
2. 2D et multiplexage
3. Régularisation
4. Conclusion et perspectives
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Séparation de sources
Etant donnée une matrice non-négative , trouver les
matrices non-négatives et telles que :
λNxdNX ×∈RPxdNA ×∈R λNPS ×∈R
ASX ≈
Fonction de coût à minimiser :
∑∑ ∑= = =
−=Nxd
xdi
N
i
P
pippxdiixdi
FMN saxQ1 1 1
,.
,, ))²((
λ
λλλ Attache aux données
Factorisation en Matrices non Négatives (FMN). Enoncé du problème:
p p
Nombre de sources fluorescentes recherchées
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Factorisation en Matrices non Négatives (FMN)
. Vulgarisation:
Chaque ligne de la matrice X est alors une combinaison linéaire des spectres s1 et s2 :
≈
=λ
λ
λ
λ
N
N
NxdNxdNNxdNxd
N
ss
ss
aa
aa
xx
xx
X,221
,111
2,1,
1211
,1,
,111
L
LMM
L
MOM
L
Deux sources de fluorescence recherchées
P=2
P=2
...
...
...
... ... ...
...
...
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Factorisation en Matrices non Négatives (FMN)
. Algorithme:
1) matrices initiales A et S qui respectent les contraintes de positivité
etikSSA
XSaa
nTnnik
nTn
ikn
ik)(
)()()()(
)()()1( =+
kjSAA
XAss
nnnT
kj
nTn
kjn
kj)(
)()()1()1(
)1(
)()1(
++
++ =
2) minimisation de la fonction QFMN en deux étapes itératives :
. pour S fixée, la matrice A est mise à jour *
. Pour A fixée, la matrice S est mise à jour *
700 750 800 850 900 950 10000
20
40
60
80
100
longueur d'onde (nm)
inte
nsité
700 750 800 850 900 950 10000
20
40
60
80
100
longueur d'onde (nm)
inte
nsité
On fixe les p lignes de la matrice S initiale
*D.D. Lee and H.S. Seung. Algorithms for non-negative matrix factorization. Advancesin neural information processing systems, 13 :556–562, 2001.
700 750 800 850 900 950 10000
20
40
60
80
100
longueur d'onde (nm)
inte
nsité
700 750 800 850 900 950 10000
20
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100
longueur d'onde (nm)
inte
nsité
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Résultats
Factorisation en Matrices non Négatives (FMN)Deux lignes de la matrice S
700 750 800 850 900 950 10000
20
40
60
80
100
longueur d'onde (nm)
inte
nsité
(no
rmal
isée
)
spectre de fluorescencespécifique (ICG) obtenu après FMNspectre d'autofluroescenceobtenu après FMNspectre initial de fluorescencespécifique (ICG)spectre initial d'autofluorescence
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Résultats
longueur d ′onde (nm)
posi
tion
le lo
ng d
e la
fen
te
Image de départ
750 800 850 900 950
20
40
60
80
100
120
140
160
180
2000
100
200
300
400
500
600
700
800
longueur d′onde (nm)
posi
tion
le lo
ng d
e la
fen
te
1ere source détectée
750 800 850 900 950
20
40
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80
100
120
140
160
180
2000
100
200
300
400
500
longueur d′onde (nm)
posi
tion
le lo
ng d
e la
fen
te
2e source détectée
750 800 850 900 950
20
40
60
80
100
120
140
160
180
2000
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Fluorescence spécifique
Autofluorescence
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Plan de présentation
1. Introduction
1. Contexte
2. Problématique
2. Séparation de sources de fluorescence par FMN
1. 1D
2. 2D et multiplexage
3. Régularisation
4. Conclusion et perspectives
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Multiplexage
. plusieurs marqueurs fluorescents
longueur d′onde (nm)
posi
tion
le lo
ng d
e la
fen
te
Image de départ
750 800 850 900 950
50
100
150
2000
1000
2000
3000
4000
nICG
Alexa 750
Autofluorescence
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longueur d′onde (nm)
posi
tion
le lo
ng d
e la
lign
e X
d
Résultat 1ère source détectée
750 800 850 900 950
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
longueur d′onde (nm)
posi
tion
le lo
ng d
e la
lign
e X
d
Résultat 2e source détectée
750 800 850 900 950
20
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60
80
100
120
140
160
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2000
500
1000
1500
2000
2500
3000
longueur d′onde (nm)
posi
tion
le lo
ng d
e la
lign
e X
d
Résultat 3e source détectée
750 800 850 900 950
20
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100
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160
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2000
50
100
150
200
250
300
350
400
450
longueur d′onde (nm)
posi
tion
le lo
ng d
e la
lign
e X
d
Image de départ
750 800 850 900 950
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1000
1500
2000
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3000
3500
4000
Alexa 750
nICGAutofluorescence
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Passage en 2D
Montage:
Fantôme:
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Résultats
nICG Alexa 750
Vue de dessus du fantôme
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Plan de présentation
1. Introduction
1. Contexte
2. Problématique
2. Séparation de sources de fluorescence par FMN
1. 1D
2. 2D et multiplexage
3. Régularisation
4. Conclusion et perspectives
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Régularisation
)²(2
1)²(
2
1)( 0∑∑ ∑ −+−=
a
aai a
aiai hhhWvhF α
Nouvelle fonction F à minimiser:
Limitation de la distance modèle-résultat:
s sAx s s s0
etikSSA
XSaa
nTnnik
nTn
ikn
ik)(
)()()()(
)()()1( =+
kjSAA
XAss
nnnT
kj
nTn
kjn
kj)(
)()()1()1(
)1(
)()1(
++
++ =
Nouvelle loi de mise à jour pour S?
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Pondérations différentesDistance à l’origine
700 750 800 850 900 950 10000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
700 750 800 850 900 950 10000
10
20
30
40
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60
70
80
90
100
700 750 800 850 900 950 10000
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90
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1. Contexte
2. Problématique
2. Séparation de sources de fluorescence par FMN
1. 1D
2. 2D et multiplexage
3. Régularisation
4. Conclusion et perspectives
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Conclusion
. Méthode FMN
. Adaptée aux données spectrales manipulées
. Plus robuste que d’autres méthodes de séparation de sources
. Perspectives
. Evolution du banc
. Reconstruction 3D
. Application?
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