Spectrométrie de masse - ESIbadiaa/CHM3102_MS1.pdf · 2004. 11. 28. · Notions de base – mesure de masse Une molécule est representée par sa distribution atomique (formule empirique).

1CHM 3102

Spectrométrie de masse

Qui etaient les lauréats du prix Nobel de 2002 en chimie?

"for his development of nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining

the three-dimensional structure of biological macromolecules in solution“

Kurt Wüthrich

1/2 of the prize

Switzerland

"for the development of methods for identification and structure analyses

of biological macromolecules“

John B. Fenn

1/4 of the prize

USA

"for their development of soft desorptionionisation methods for mass

spectrometric analyses of biological macromolecules“

Koichi Tanaka

1/4 of the prize

Japan

Importance de la spectrométrie de masse dans l’analyse de biomolécules


2CHM 3102

A quoi sert la spectrométrie de masse dans la vie de tous les jours?

Détection et identification de stéroides anabolisants chezles athlètesHaleine des patients anesthésies lors de chirurgieComposition d’espèces moléculaires dans l’espaceMiel dénaturé avec du sirop de maïsLocalisation d’huile à partir de précurseurs présents dansles rochesProcédés de fermentation dans l’industrie biotechnologiqueDioxines dans les poissons contaminésModification génétique dû à un stress environnementalComposition élémentaire de matériaux semi-conducteursExplosifs dans les aéroportsÉtudes pharmacocinétiques sur les nouveaux composéspharmaceutiques


3CHM 3102

Composantes d’un spectromètre de masse

Introduction de l’échantillon

Chromato. (GC, HPLC)Injection directe

Electrophorèse capillaire

Ionisation

Neb. Electro. (ESI)Des. Laser (MALDI)Bomb. Atomes rap.

Ion. Chim.Impact elect.

Analyseur

QuadrupoleTrappe ion.

Temps d’envolRes. Ion. Cyclo. Secteurs (B, E)

Détection

Mult. ElectronDynode de conv.

Réseau mult. elect.(MCP)

e-

Sous vide


4CHM 3102

Technologie du vide

Gamme de pression (Pa)

Gamme de pression (mbar)

Gamme de pression (mtorr)

Vide Débit de gaz

105 -102 1 bar - 1 mbarr 750 torr - 750 mtorr Vide primaire Débitvisqueux

102 -10-1 100 -10-3 750-0.75 Vide intermédiaire

Débit de Knudsen

10-1 -10-5 10-3 -10-7 0.75 – 7.5 .10-5 Vide élevé Débitmoléculaire

< 10-5 < 10-7 < 7.5 .10-5 Ultravide Débitmoléculaire

Vide en deux étapes:

• Pompes rotatives: 4-16 m3/h, assure le vide primaire nécessaire à l’opération de pompes moléculaires (backing pumps).

• Ultravide obtenue à partir de pompes turbomoléculaires (200-500 L/s), pompes àdiffusion (600-2000L/s), pompes cryogéniques.


5CHM 3102

Notions de base – mesure de masseSpectre de masse nebulisation electrostatiqueen mode + et – d’un pesticide

L’espece ionisée correspond à la moléculeavec un proton supplémentaire ou un proton en moins.Dans la littérature, la masse moléculairepeut être exprimée de différente façon:

Masse moyenne: 219.67Masse nominale: 219Masse précise: 219.0563

Formule empirique: C11H10N3Cl1

220.06

222.06

218.04

220.05

Pourquoi on observe plus d’une espèce ionique (ie m/z 221.06 et 222.06)?


6CHM 3102

Notions de base – mesure de masse

Une molécule est representée par sa distribution atomique(formule empirique).Chaque atome a une distribution d’isotope naturel. Par exemple le carbone et le chlore:

36.9659u :Cl34.9689u, :Cl

13.0034u :C12.0000u, :C3717

3517

136

126

% 1.08 :C%, 100 :C 136126

22.9984u :Na18.9984u, :F 2311199

Chaque isotope a une abondance naturelle qui lui estpropre. Par exemple le carbone

Les atomes monoisotopiques tels ceux du fluor ou dusodium sont identifiéscomme A et les atomes multi-isotopiques (carbone, chlore, hydrogène, etc…) A+1, A+2, etc…


7CHM 3102


Par définition l’atome A du carbone a une masse de 12.00000uL’unité de masse u, est définit comme étant 1/12 de la masse du nuclide 12C et correspond à:

1u: 1.66055 x 10-27 kg

Certains atomes ont une masse légèrement supérieure(excédent) à la masse nominale alors que d’autres sontlégèrement inférieures (déficit). Par exemple:

Comment se traduit cette subtilité pour les masses moléculaires élevées?

15.9949u :O1.0078u, :H 16811


8CHM 3102


y = 0.0002x + 7E-15

y = 0.0007x + 2E-14

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

Masse (Da)

Exce

dent

(Da)

Poly-Asp

Poly-Leu

Gamme de masse excedentairepour peptides

Poly-aspatate et poly-leucine représentent les polypeptides ayant respectivement le contenude proton le plus faible et le plus elevé parmi les acides aminés. La poly-cystéine (plus faiblecontenue de proton/masse) n’a pas été considerée car le frequence de l’acide aminé Cys par protéine n’est pas elevée.


9CHM 3102

Notions de base – abondance

Chaque isotope naturel a une abondance relative caractéristique.Quel serait la variation du rapport isotopique avec l’augmentation du nombre d’atome de carbone?

C60 C90 C120

12C monoisotopique 12C monoisotopique

12C monoisotopique

Comment varie la progression du rapport isotopique avec la masse moléculaire?


10CHM 3102


Si un élément A possède deux isotopes naturels dont l’un(A’) est plus abondant que l’autre (A’’). Le rapport de leurabondance est donné par:

Par exemple si on a un total de 1000 molécules de CH4, il y aura 11 molécules contenant 13C plutôt que 12C; alors que le reste (989) aura la composition 12CH4. Leur rapport relatifd’intensité sera 989/11. De façon plus générale, la probabilité de n’avoir que des isotopes 12C pour unemolécule possédant Z atomes de carbones est:

)'A'-/(100'A' où: A’ est l’abondance naturelle(%) du constituant mineur

Z

⎥⎦⎤

⎢⎣⎡=

100'A'-100

P


11CHM 3102


De la même façon, pour les éléments C H N O S, la probabilité PM que tous les atomes ne contiennent aucunisotope lourd est donné par:

où: 13C, 2H, 17O, 18O, 15N, 33S et 34S sont les abondances relatives des différents isotopes lourds des éléments considerés.

a, b, c, d, e représentent le nombre d’atome pour le carbone, l’hydrogène, l’oxygène, l’azote et le soufre

edcba

⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡•⎥

⎦

⎤⎢⎣

⎡•⎥

⎦

⎤⎢⎣

⎡•⎥

⎦

⎤⎢⎣

⎡•⎥

⎦

⎤⎢⎣

⎡=

100SS-100-

100N100-

100OO-100-

100H100-

100C100-

P3433151817213

M


12CHM 3102


De la même façon, la probabilité d’avoir un atome 13C pour une molécule contenant Z atomes est donné par:

Z

⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡•⎥

⎦

⎤⎢⎣

⎡•=+

100C100-

C100-C

z P13

13

13

1M

Donc le rapport d’intensité M+1/M correspondantuniquement à une molécule ne contenant que des atomes de carbone est:

⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡•=+

C100-C

z PP

13

13

M

1M


13CHM 3102


En tenant compte de chacunes des combinaisons d’isotopesM+1 de chacune des atomes C, H, N, O et S, on obtient le rapport d’intensité relative suivant:

( )EeDdCcBbAaM

M•+•+•+•+••=

+100

1

où: a: # atome de carbone

A: 13C/(100-13C): 0.011

b: # atome d’hydrogène

B: 2H/(100-2H): 1.15 x 10-4

c: # atome d’oxygène

C: 17O/(100-17O): 3.80 x 10-4

d: # atome d’azote

D: 15N/(100-15N): 3.70 x 10-3

e: # atome de soufre

E: 33S/(100-33S): 7.89 x 10-3


14CHM 3102


Aussi la probabilité d’avoir exactement A atomes 13C (PM+A) sur un total de z atomes est décrit par la relation:

Z-A13

13

13

AM 100100

100C

)!!(!

P ⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡ −•⎥

⎦

⎤⎢⎣

⎡−

•−

=+

CCZAZ

AZ

A13

13

13

100100

C100-C

)!!(!

⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡ −•⎥

⎦

⎤⎢⎣

⎡•

−=

CZAA

AZ

A13

100100

)!!(!

⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡ −•

−=+

CZAA

AP

P

M

AM


15CHM 3102

Notions de base – abondanceSymbole #atomique Masse nom. Comp. isoto. Masse isoto. Mass moy.

H 1 12

1000.0115

1.0078252.014101

1.00795

Na 11 23 100 22.989769 22.989769

P 15 31 100 30.973762 30.973762

C 6 1213

1001.08

12.00000013.003355

12.0108

N 7 1415

1000.369

14.00307015.000109

14.00675

O 8 161718

1000.0380.205

15.99491516.99913217.999116

15.9994

S 16 32333436

1000.84.520.02

31.97207132.97145933.96786735.967081

32.067

Cl 17 3537

10031.96

34.96885336.965903

35.4528

Br 35 7981

10097.28

78.91833880.916291

79.904


16CHM 3102


Quelle variation de rapport isotopique peux t’on prévoir pour un peptide moyen?

y = 0 . 0 5 5 6 x - 9 E -1 4

y = 0 . 0 0 0 2 x 1 . 6 9 0 7

y = 2 E -0 7 x 2 . 4 5 1

0

2 0

4 0

6 08 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0

M a ss (D a )

% o

f mon

oiso

topi

c 12

C M + 1 / MM + 2 / MM + 3 / M

Formule empirique pour l’acide aminé “averagine”: (C4.95H7.8N1.47O1.35S0.039)


17CHM 3102

Notions de base – abondanceDes-Arg Bradykinine

Angiotensine I

904.46

1296.69

1758.93

2465.20

ACTH clip (18-39)

Renin substrate

• Variation du rapport isotopique avec la masse• Variation de l’excédent de masse moyen de 0.0005Da/Da


18CHM 3102

Notions de base – résolution

50 %

5 %

∆M

MM

R∆

=

10 %

R: 500 1u 1u1u

50 51 500 501 1000 1001 m/z


19CHM 3102

Notions de base – résolution

Comment la distribution isotopique varie avec la résolution duspectromètre de masse?


20CHM 3102

Notions de base – résolutionRésolution et son impact sur l’identification d’espèce ionique

C20H9+

C19H7N+

C19H7N+ C20H9+ C13H19N3O2+C13H19N3O2+

Instrument de grande résolutionR> 10,000

Instrument de faible résolutionR: 1000

249 249.0580 249.0700 249.1479

Analyseurs de masse de plus grande résolution (> 10,000) sont les appareils à secteurs, temps d’envol, résonance cyclotronique ionique


21CHM 3102

Techniques d’ionisation - Désorption laser avec matrice

Impulsion laser de 4 ns (λ 337 nm , N2)

± 30 kV

To MS

Échantillon + matrice m/z1500010000

[M+H]+

Caractéristiques:

Analytes: Biomolecules jusqu’à - 500 kDaSensibilité: 10-100 pg (-10-100 fmoles)Précision: Avec TOF ± 0.02% (ext.), ± 0.005% (int.)Résolution: Avec TOF 15,000 (


22CHM 3102


Laser

UV/visible regions λ

Excimer gaz rares: ArF 193 nmKrF 248 nmXeCl 307 nmXeF 351 nm

Azote 337 nm

Infrarouge

Er:YAG fondamentale 2.94 µmCO2 9.6 nm, 10.6 µm

Plus communs

Laser Science Inc. VSL-337ND nitrogen laser. Specifications : 250µJ/impulsion, 3 ns temps d’impulsion. Duree de vie ~ 2-4 ans.


23CHM 3102


OH

COOH

OH

HO

CH=CCN

COOH

N=N OH

COOH

N

OH

COOH

N

NN

CH 3

S

H

H

OH O OH

N

CH=CH COOH

H CH 3 O

HO

O CH 3

CH=C H

COOH

OH

HO

HO

C CH 3

O

Matrices pour laser à l’azote

• 2,5-dihydroxy benzoic acid (DHB) 1, 2, 3, 4, 5

• α-cyano-4-hydroxycinnaminic acid (CHCA) 1, 2

• 3-hydroxypiconilic acid (HPA) 4

• HABA 2

• 6-aza-2-thiothymine (non acide) 1, 4

• Dithranol (non acide) 5

• Trans-indoleacrylic acid 5

• Sinnapinic acid 2

• 2’,4’,6’-trihydroxyacetophenone 2, 3

(non acide)

(1: peptides, 2: protéines, 3: oligosaccharides, 4: acides nucléiques, 5: polymères)


24CHM 3102


A. Evaporation

• Désaler l’échantillon (Zip tip). Utiliser au besoin des billes échangeuse d’ions pour réduire la formation d’adduits alcalins.

• Préparer solution ~ 10 µM de l’échantillon dans une solution aqueuse d’acétonitrile.• Préparer une solution de 0.1 M solution de matrice (DHB ou CHCA) in 1:1 Acétonitrile:eau.• Mélanger la solution de matrice et l’echantillon 1:1 (v:v).• Appliquer 0.5 µL de l’echantillon/matrice sur la plaque et sécher.

S.L. Cohen, B.T. Chait, Anal. Chem. 68, 31-37 (1996)

B. Couche mince

• Dissoudre la matrice dans l’acétone avec 1-2% eau et appliquer sur la plaque. • Rinser la plaque légerement avec l’eau pour enlever les sels. • Appliquer l’échantillon.

O. Volm, P. Roepstorff, M. Mann, Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994)

C. Sandwich

• Préparer une couche mince comme decrit en B.• Appliquer analyte/matrice sur la couche mince celle-ci formant de cristaux de germination.

F. Xiang, R.C. Beavis, Rapid Commun. Mass Spectrom. 8, 199-204 (1994)

Préparation de l’échantillon


25CHM 3102


Impulsion laser

± 30 kV

Analyte + matrice

Un faisceau moléculairesupersonique occasionne la sublimation de l’analyte/matrice

Modèle de desorption avec matrice

La matrice absorbe la radiation dans la gamme d’émission du laser.L’énergie absorbée occasionne la dissociation de la matrice. La zone irradiée s’etend sur une zone de 300 µm x 600 µm, 25 Å profondeur, et déplèteenviron 4.5 x 10-10 cm3 de solide.La dissociation rapide de la matrice libère des molécules neutres et des analytes en phase gazeuse et produit une région de plus haute pression dans le voisinage de la surface irradiée. Cette haute pression se traduit par une expansion supersonique amenant avec elle les analytes desorbés.


26CHM 3102


Modèle d’ionisation avec matrice

La matrice joue un rôle important dans l’ionisation en plus du processus de désorption.

La photoionisation de la matrice est suivie par une multitude de réactionsimpliquant à la fois des transferts radicalaires et de protons.

Les molécules de matrice ne doivent pas former de radicaux ou espèces protonéesstables afin de favoriser l’ionisation de l’analyte.

H. Ehring, M. Karas, F. Hillenkamp, Org. Mass Spectrom., 27, 472-480 (1992).

CH3 O

HO

O CH3

CH=C H

COOH

Moins acide lorsde l’excitation

Plus acide lorsde l’excitation

Réaction photochimique:

H-DHB* + P (H+P)+ + DHB

H-DHB* H+ + DHB- P + H+ (P-H)+


27CHM 3102


Distribution de velocité de l’acide sinnapinique

Distribution de velocité de l’acidesinnapinique calculée selon le déplacement du temps d’envol

Distribution d’intensité de l’acidesinnapinique selon le délai après

l’impulsion laser

Inte

nsi

te(u

nite

arb.)

200

400

600

800

Velocite (m/sec) Delai (µsec)

10 20In

tensi

te(u

nite

arb.)

L’impulsion laser occasionne une large distribution d’énergie cinétique des analytesCette distribution est plus étroite suite a un délai après l’impulsion bien quel’intensité diminue.


28CHM 3102


Influence du délai sur la résolution

Extraction region

Acceleration region

UeSourceplate

UaIntermediate

grid

UfFinalgrid

Ue

Ua

Uf

18 kV, constant

20 kV, pulse

ground, constant

16 kV

Delay Time

Pulsing scheme PerSeptive

0

0

da d0

Adapte de R. Cotter, Anal. Chem. 445A, 1999


29CHM 3102

Techniques d’ionisation – Nébulisation électrostatique (ESI)

ESI voltage (5 kV)

Air

Echantillon/phase mobile

Nébulisation desgouttelettes

Evaporation du solvant

⇑ Champ électrique

Ejection des ions

↓

↓ ↓

↓ ↓

↓

↓ ↓

↓ ↓

Caractéristiques:

Analytes: Biomolécules jusqu’à - 500 kDaSensibilité: 1-10 pg (-1-10 fmoles pour 1000 Da)Précision: ± 0.02% (ext.), ± 0.005% (int.)Résolution: Avec TOF 15,000, >100,000 avec FTMSHybride: Couplage en ligne avec EC, CLHP, infusion


30CHM 3102


m/z

Apparition d’ions multiplement chargés ie [M-nH]n- ou [M+nH]n+Espacement entre deux série d’ion multiplement chargés correspond a l’ajout ou l’abstraction d’un proton de la molécule.Comment peux t’on determiner la masse moléculaire?

+ H

10+

9+

8+

7+

6+

1000 1500

Caractéristiques du spectre de masse ESI

Protéine de 10,000 Da

1001.0

1112.1

1251.0

1429.6

1667.7

1221 //1

]1[/

][/ zmzmet

znHM

zmetznHM

zm <+

++=

+=


31CHM 3102


Ions multiplement chargés et charge

M: 1000.5 Da

1 m/z

0.5 m/z

0.33 m/z

Simplement chargé1001.5

501.3 Doublement chargé

Triplement chargé334.5

m/z


32CHM 3102


Aspect mécanistique

Production de gouttelettes chargées à partir de l’analytedissout en solution

Evaporation du solvant, diminution de la taille des gouttelettes, desintégration de celles-ci donnant lieu à des micro-gouttelettes plus chargées.

Production d’ions en phase gazeuse.

Phénomènes secondaires tels oxidation de l’analyte.


33CHM 3102


Gouttelettes chargées. La solution à l’extrémité du nébuliseurélectrostatique est soumis à une tension électrique elevée. Lorsque le capillaire de diametre rc est situé à une distance d de la contre-électrode (MS), le champ électrique est donné par:

Ec = 2 Vc/rc ln(4d/rc)

Anal. Chem. 65, 972A (1993)

+-

- ++

++++

+++

+

++++

+++

+

+

++

+

++

++

+

+

++

++

++

+

+

++

++

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Reduction

Oxydation

High-voltagepower supply

e-

e-

Taylor cone


34CHM 3102


L’évaporation du solvant et la collision avec les moléculesenvironnantes a pression atmospherique occasionne uneréduction de la taille des gouttelettes. Une explosion Coulombique (fission) survient lorsque la micro-goutteletteatteint la limite de Rayleigh ou l’ampleur du champ électrostatique est plus grand que la tension de surface maintenant l’integrité de la gouttelette.

Q2 = 64 π2 ε0 γ R3

ou Q correspond a la charge, ε0 la constante de permittivité, γla tension de surface, R le rayon de la gouttelette. Pour unesolution aqueuse ou R=1.5 µm nous obtiendrons une charge Q de 10-14 C (ou 50,000 ions simplement chargés).


35CHM 3102


Ionisation de l’analyte. La diminution de la gouttelette suite aux fissions successives peut donner lieu a un résidu ioniquedésolvaté de ~ 1nm (single ion in droplet theory, SIDT, proposépar Dole et al., J. Phys. Chem.49, 2240 (1968)). Un autremécanisme assume une évaporation ionique successive (émission) a partir de micro-gouttelettes de plus en plus chargées (Iribarne and Thomson, J. Phys. Chem., 64, 2287 (1976)). Ces gouttelettes compétitionnent avec les phénomènesde fission lorsque celles-ci atteignent un diametre de 8 nm comprenant ~ N=70 charges élsmentaires. Dans ces conditions, les micro-gouttelettes ne donnent pas lieu à une fission maisémettent des ions directement. Lorsque N décroit, l’émission peutêtre maintenue suite à la diminution du diamètre de la gouttelette. Ce modèle peut survenir même en présenced’analytes formant des paires d’ions.


36CHM 3102


Taille de l’émetteur, débit et efficacité d’émission. Les progrèsrécents dans la fabrication d’émetteurs de petits diamètres et la disponibilité de pompes CLHP à faible débit ont permis d’obtenirdes gains importants de sensibilité (Dale, D.C., Smith, R.D., Rapid Commun. Mass Spectrom., 7, 1017, (1993), Emmett, M.R., Caprioli, R.M., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 5, 605, (1994), Andren, P.E., Emmett, M.R., Caprioli, R.M., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 5, 867, (1994) and Wilm, M.S., Mann, M., Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc., 136, 167, (1994)]. Dans ces conditions un cône de Taylor est obtenu pour des debits de 25-100 nL/min avec une émetteur de


37CHM 3102


1/ 3

r e =

ρ

4π 2 γ tanπ

2− α

⎛ ⎝

⎞ ⎠

U aU t

⎛

⎝ ⎜

⎞

⎠ ⎟

2

− 1⎡

⎣

⎢

⎢

⎤

⎦

⎥

⎥

⎛

⎝

⎜

⎜ ⎜

⎞

⎠

⎟ ⎟ ⎟

xdVdt

⎛ ⎝

⎞ ⎠

2 / 3

où γ est la tension de surface du liquide, α l’angle de cone liquide, ρ sadensité, Ut et Ua le seuil du voltage d’émission et le voltage appliqué, et dV/dt le débit. Pour un capillaire de dimension donné, le diamètre estproportionnel au débit (DV/dt)2/3 . Pour une solution aqueuse dont le débit est de 25 nL/min, re est 88 nm. L’efficacité d’ionisation/ transmission à ce débit est d’environ 8 x 10-4. Cette réduction de la taillede l’émitteur permet des gains significatifs de sensibilité et ce pour des diamètre de < 5 µm et des gouttelettes de < 200 nm, ce qui permetégalement la réduction du voltage appliqué.


38CHM 3102


Comparaison de la sensibilité et du débit en LC-MS

Diamètre (mm) Débit (µL/min) Qté inj. (pmol) Facteur de conc. Rel.

4.6 500-1000 102-105 1

2.1 100-400 50-104 5

1.0 40-100 5-103 20

0.32 1-10 0.5-500 200

0.075 0.05-0.5 0.001-1 3700


39CHM 3102


Comparaison de la sensibilité et du débit en LC-MS


40CHM 3102



41CHM 3102



42CHM 3102


Résolution accrue pour l’analyse de protéines en mode ESI.MALDI permet par contre une mesure de masse avec une plus grande sensibilitépour l’analyse de glycoprotéines, ce qui n’est pas possible avec ESI car la protonation de l’analyte ne permet pas d’obtenir des m/z dans la gammeaccessible du MS.


43CHM 3102


Analyse de peptides et protéines par ESI

Smith et al. Anal. Chem., 62, 882 (1990)


44CHM 3102


Analyse LC-MS de digestat trypsique de lectin (PNA)


45CHM 3102


Spectre de masse d’oligonucléotide dT10 en présenced’imidazole et piperidine (échange H/Na)

GreigM., Griffey. R.H., Rapid Commun. Mass Spectrom., 9, 97 (1995)

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Spectrométrie de masse - ESIbadiaa/CHM3102_MS1.pdf · 2004. 11. 28. · Notions de base – mesure de masse Une molécule est representée par sa distribution atomique (formule empirique).

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