Solid phase oligonucleotide synthesis

Solid Phase Oligonucleotide Synthesis

Kelompok 6Agus Setiawan

Desi PurwaningsihG Jeni Christi A

Rini NovitaTirta SetiawanPriatno Khanna

Solid-Phase synthesis secara luas digunakan dalam mensintesis peptida, sintesis oligosakarida, sintesis oligonukleotida, dan kombinasi senyawa kimia.

Prinsip Kerja : Solid-phase synthesis dilakukan dengan sebuah solid support (resin) yang dilakukan diantara filter, dalam kolom yang memungkinkan semua reagen dan pelarut bebas untuk lewat.

Oligonukleotida disintesis pada solid support dari ujung 3' dan monomer pertama pada ujung 3’ yang biasanya melekat pada CPG atau polystyrene. Monomer yang melekat pada ujung 5‘ dilindungi dengan kelompok asam labile dan trityl lipofilik dan monomer A, G, C dan mC dilindungi dengan kelompok basa labile proteksi pada bagian nucleobase.

Solid Phase Oligonucleotide Synthesis

Keuntungan

Reagen fasa larutan yang berlebih dapat digunakan untuk menggerakkan reaksi agar cepat selesai

Pengotor dan reagen yang berlebih dibuang dan tidak perlu pemurnian pada setiap langkah

Proses ini dapat menggunakan otomatisasi pada solid-phase synthesizers yang dikendalikan oleh komputer

MetodeFosforamidit

Tahapan

1.Detritylation2.Coupling3.Oxidation4.Capping

Detritylation

Pada tahap detritilasi, grup tritil melekat pada karbon 5' gula pentosa dari nukleotida penerima yang dihapus oleh asam trikloroasetat (TCA) melepaskan kelompok hidroksil reaktif.

Coupling

Pada tahap coupling, monomer phosphoramidite ditambahkan

dengan adanya aktivator seperti tetrazole, asam lemah yang

menyerang nukleosid fosforamidit coupling membentuk intermediet fosforamidit tetrazolil. Struktur ini kemudian bereaksi dengan gugus

hidroksil dari penerima dan membentuk ikatan 5 ‘ ke 3‘.

Oxidation

Tahapan oksidasi menstabilkan ikatan fosfat oleh oksidasi yodium

dengan adanya air dan piridin. Resultan fosfodiester secara efektif melindungi DNA backbone dengan

grup 2-sianoetil. Grup sianoetil mencegah reaksi yang tidak

diinginkan pada fosfor selama siklus sintesis berikutnya.

Capping

Tahap terakhir dari siklus sintesis adalah reaksi capping. Setiap gugus hidroksil 5’ yang tersisa diblok pada

tahap capping dalam proses irreversibel. Tahap ini mencegah oligonukleotida kehilangan basa.

Solid Support

1.Controlled-pore Glass (CPG)

2.Polystyrene (PS)

Controlled –pore Glass (CPG)

Controlled-pore glass is rigid and non-swelling with deep pores in which oligonucleotide synthesis takes place. Glass supports with 500 Å (50 nm) pores are mechanically robust and are used routinely in the synthesis of short oligonucleotides. However, synthesis yields fall off dramatically when oligonucleotides more than 40 bases in length are prepared on resins of 500 Å pore size. This is because the growing oligonucleotide blocks the pores and reduces diffusion of the reagents through the matrix. Although large-pore resins are more fragile, 1000 Å CPG resin has proved to be satisfactory for the synthesis of oligonucleotides up to 100 bases in length, and 2000 Å supports can be used for longer oligonucleotides.

Polystyrene (PS)

Highly cross-linked polystyrene beads have the advantage of good moisture exclusion properties and they allow very efficient oligonucleotide synthesis, particularly on small scale (e.g. 40 nmol).Solid supports for conventional oligonucleotide synthesis are typically manufactured with a loading of 20-30 μmol of nucleoside per gram of resin. Oligonucleotide synthesis at higher loadings becomes less efficinet owing to steric hindrance between adjacent DNA chains attached to the resin; however, polystyrene supports with loadings of up to 350 μmol / g are used in some applications, particularly for short oligonucleotides, and enable the synthesis of large quantities of oligonucleotides.

Animation

Cleavage From The Solid Support

Oligonucleotide Deprotection