SLOŽENÍ MÉDIÍ SLOŽENÍ MÉDIÍ Teplota Světlo Vlhkost Složení plynné fáze Slo ž ení médií Aseptická kultivace Ošetření mateřských rostlin Typ explantátu Koncentrace živin v médiu [mmol/l] Živina Knop Hoagland a Snyder Murashige a Skoog Gamborg Shenk a Hildebran dt NO 3 - 10,94 15,00 39,40 24,72 24,72 NH 4 + - - 20,61 2,02 2,06 celkový N 10,94 15,00 60,01 26,74 27,32 PO 4 3- 1,84 1,00 1,24 1,08 2,6 SO 4 2- 1,01 2,00 1,50 2,03 1,62 Cl - - - 5,98 2,04 2,72 K + 4,30 6,00 20,04 24,72 24,72 Na + - - - 1,08 - Mg 2+ 1,01 2,00 1,50 1,01 1,62 Ca 2+ 4,23 5,00 2,99 1,02 1,35 Hydroponická média Média pro kultivaci in vitro
Živina. Knop. Hoagland a Snyder. Murashige a Skoog. Gamborg. Shenk a Hildebrandt. Koncentrace živin v médiu [ mmol/l ]. NO 3 -. 10,94. 15,00. 39,40. 24,72. 24,72. Hydroponická média. Média pro kultivaci in vitro. NH 4 +. -. -. 20,61. 2,02. 2,06. celkový N. 10,94. 15,00. - PowerPoint PPT Presentation
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
SLOŽENÍ MÉDIÍSLOŽENÍ MÉDIÍ
Teplota Světlo Vlhkost Složení plynné fáze Složení médií Aseptická kultivace Ošetření mateřských rostlin Typ
explantátu
Koncentrace živin v médiu [mmol/l]
Živina
Knop
Hoagland a Snyder
Murashige a Skoog
Gamborg
Shenk a
Hildebrandt
NO3- 10,94 15,00 39,40 24,72 24,72
NH4+ - - 20,61 2,02 2,06
celkový N 10,94 15,00 60,01 26,74 27,32
PO43- 1,84 1,00 1,24 1,08 2,6
SO42- 1,01 2,00 1,50 2,03 1,62
Cl- - - 5,98 2,04 2,72
K+ 4,30 6,00 20,04 24,72 24,72
Na+ - - - 1,08 -
Mg2+ 1,01 2,00 1,50 1,01 1,62
Ca2+ 4,23 5,00 2,99 1,02 1,35
Hydroponická média Média pro kultivaci in vitro
SLOŽENÍ MÉDIÍ pro kultivaci rostlin SLOŽENÍ MÉDIÍ pro kultivaci rostlin in vitroin vitro
a) Makroprvky
b) Mikroprvky Nezbytné
Prospěšné až nezbytné
c) Vitaminy
d) Aminokyseliny
e) Sacharidy
f) Doplňky
g) Pufry
h) Růstové regulátory
i) Zpevňující složky
SLOŽENÍ MÉDIÍ
a)a) Makroprvky – N, P, K, Ca, Mg, S Makroprvky – N, P, K, Ca, Mg, S
Důležitá jak koncentrace, tak vzájemná vyváženost.
N N – nejprve jako zdroj N používány NONO33-- ; přidání redukované formy NHNH44
++
může být prospěšné
NO3- NH4
+
energie
SLOŽENÍ MÉDIÍ
Proč ne jen NH4+ ??????
• toxicita při vyšších koncentracích
(kompenzovat přídavkem kyselin Krebsova cyklu)
• příjem vede k poklesu pH potřeba pufrovat média
2- oxoglutarát
Cyklus kyseliny
citrónové
glutamát
glutamin
glutamát (2)
NHNH4+
pHpH
Příjem NONO33-- při pHpH, ……………. příjem NHNH44
++ při pH
NO3-
OH-
NH4+
H+
NO3- OH-
NH4+
H+
pHpH
V médiu NONO33-- + NHNH44
++ (počáteční pH média 5,4 -5,8)
nejdříve příjem NHNH44++ pH následuje příjem NONO33
-- pH
SLOŽENÍ MÉDIÍ
SLOŽENÍ MÉDIÍ
b) Mikroprvky – Fe, Mn, Zn, B, Cu, Co, Mo b) Mikroprvky – Fe, Mn, Zn, B, Cu, Co, Mo
Jsou součástí metabolicky a fyziologicky důležitých proteinů
Chelatony - EDTA
c) Vitaminyc) Vitaminy
Rostliny jsou schopny vitaminy syntetizovat, rostlinné explantáty často nejsou soběstačné
d) Aminokyselinyd) Aminokyseliny
Okamžitě dostupný zdroj N; rychlejší příjem;
organické a anorganické zdroje N nejsou zaměnitelné !!!
Hydrolyzát kaseinuHydrolyzát kaseinu – směs aminokyselin a peptidů
Samostatně : glycin glycin, pro některé kultury k.k. glutamová, glutamin, k.glutamová, glutamin, k. asparagováasparagová, asparaginasparagin, … ostatní výjimečně
sorbitol, rafinózasorbitol, rafinóza.. Požadavky se mohou velmi lišit v závislosti na rostlinném druhu i typu kultury a jejím vývoji
Využitelnost sacharidu závisí na schopnosti
kultury :
transportovat daný sacharid (z buňky do buňky x vodivými pletivy)
rozkládat daný sacharid vně buněk (sacharóza glukóza + fruktóza, rafinóza ? fruktóza + melibióza nebo sacharóza + galaktóza) přijímat daný sacharid (pasivní transport X aktivní transport)
utilizovat daný sacharid (např. manitol, sorbitol, RFO)
! Výběr vhodného sacharidu často na základě empirického přístupu
Př:Př: Listové disky Capsicum annum tvorba výhonů - glukóza
Př:Př: kultury izolovaných kořenů pšenice (a dalších jednoděložných) – glukóza
Přítomnost sacharidu v médiu snižuje osmotický potenciál média osmotický stres (morfogenní signál)Př: Somatická embryogeneze jehličnanů – pozitivní vliv vysokých koncentrací sacharózy lze nahradit osmotickým stresem vyvolaným manitolem
SLOŽENÍ MÉDIÍ
Přítomnost sacharidu v buňkách osmotické přizpůsobení (zachování transpotru vody při osmotickém stresu)
osmoprotekce (ochrana membrán a makromolekul při nedostatku vody)
OsmoprotektantOsmoprotektant
Signální molekulaSignální molekula
přímé působení sacharidu
signál generován transportérem ? - rozhoduje míra transportu přes membránu
sacharózové transportéry ( X jiné systémy vázané na membráně) hexózové transportéry hexokinázový systém – rozhoduje „rychlost“ fosforylace
?
apoplastická invertáza
invertáza x SuSy
obsah sacharidů se promítá do hladiny sacharidu se signálním potenciálem (trehalóza-6-P) nebo jiné signální molekuly (SnRK1)
přímé působení sacharidu
signál generován transportérem ? - rozhoduje míra transportu přes membránu
sacharózové transportéry ( X jiné systémy vázané na membráně) hexózové transportéry hexokinázový systém – rozhoduje „rychlost“ fosforylace
?
apoplastická invertáza
invertáza x SuSy
Cukr může indukovat změny hladin fytohormonů (auxinů a cytokininů)
h) Růstové regulátoryh) Růstové regulátory
Funkce nikoli nutriční, ale regulační
Účinné ve velmi nízkých koncentracích.
Ovlivňují současně velký počet rozdílných procesů.
Nejdůležitější in vitro : auxiny, cytokininy, kys. abscisová, gibereliny
pH ovlivňuje příjem látek z média (živin i hormonů)
pH ovlivňuje gelační schopnosti agaru (pod pH 5 nedostatečná gelace)
SLOŽENÍ MÉDIÍ
auxinauxin
cytokinicytokininn
Tvorba kořenů na řízcích
Embryogeneze
Tvorba adventivních kořenů v kalusu
Tvorba adventivních výhonů
Proliferace úžlabních výhonů
Iniciace kalusu
Auxin cytokininový modelAuxin cytokininový model - tabák, Skoog a Miller, 1957
Rozhoduje:
endogenní hladina růstových regulátorů, která je výsledkem interakce endogenních hladin fytohormonů a exogenní aplikace růstových regulátorů. volba vhodného fytohormonu a nebo růstového regulátoru s obdobným účinkem
HabituaceHabituace
=tkáňová kultura po opakovaných =tkáňová kultura po opakovaných pasážích pasážích
ztrácí závislost na exogenním ztrácí závislost na exogenním cytokininu cytokininu cytokinincytokinin
ASEPTICKÁ KULTIVACE Detekce Detekce kontaminacekontaminace • viditelný růst
• latentní kontaminace zpomalený růst, špatné zakořeňování, náhlý úhyn rostlin po mnoha subkultivacích kontaminace napadá pletiva, snižuje pH, vyčerpává živiny, produkuje fytotoxické látky detekce – přeočkování na různé půdy
- někdy lze detekovat jen sérologicky nebo e- mikroskopií
• většina kontaminací nepřečká běžné sterilizační postupy
• ale !! Někdy velká odolnost: rod Bacillus : 5 min ponoření do EtOH, opálení lihovým
kahanem, ale i 1 týden v EtOH, i 20 min při 110 °C, výjimečně 20 min při 120 °C. Použití antibiotikPoužití antibiotik
• nemají nahradit pečlivost aseptické práce !
• některá antibiotika podporují růst
• častěji – fytotoxicita - antibiotika, která interferují se syntézou DNA, RNA
působí i na eukaryota; výhodné pokud specificky působí na mikroorganismy • nejlépe znát citlivost kontaminujícího mikroorganismu
• antibiotika působí na aktivně rostoucí organismy
• rezistence
TYP EXPLANTÁTUTYP EXPLANTÁTU
GenotyGenotypp:
Dvouděložné
Jednoděložné
Nahosemenné
Nejlépe reagují: Solanaceae, Begoniaceae,
Crassulaceae, Brassicaceae
Stáří:Stáří: a) stáří jedince
„skutečné stáří“--- počet dní od vyklíčení rostliny
„fyziologické stáří“----fáze růstu a vývoje rostliny
c) u již založené kultury in vitro rozhoduje subkultivační interval
b) relativní stáří pletiva
(hodnocení velmi obtížné např.: Vzrostný vrchol z 50 let staré rostliny v juvenilním stavu je „ mladý“. U dřevin nejlepší výsledky s výhony u báze kmene)
Většinou nejvhodnější explantát z nově založených orgánů Méně často - z plně vyvinutých orgánů
V některých případech jen změna postupu morfogeneze:
explantát z mladých listů nejprve koření
z dospělých listů nejprve tvoří pupeny
Teplota Světlo Vlhkost Složení plynné fáze Složení médií Aseptická kultivace Typ explantátu Ošetření mateřských rostlin
Velikost explantátuVelikost explantátu třeba zvolit optimální
!! vhodné umístění vzhledem k médiu, zachovaná polarita včetně směru transportu látek
-- příliš malý explantát velké hynutí, ---- malé zásoby živin, hormonů,
poměr poraněná : neporaněná část povrchu, produkce etylénu -- příliš velký explantát špatná manipulace, horší styk s médiem, malý
množitelský efekt
Polarita explantátuPolarita explantátu
OŠETŘENÍ MATEŘSKÝCH ROSTLINOŠETŘENÍ MATEŘSKÝCH ROSTLIN
• Dormance: většinou aktivně rostoucí, ne vždy ! Př:Př: tvorba náhradních pupenů na kořen. řízcích dřevin --- jen z dormantních rostlin
• Stav rostlin: zdravé, aktivně rostoucí, bez stresu, dostatek živin
• Termín odběru: změny v teplotě, fotoperiodě, osvětlení hladiny cukrů, proteinů, R.R
• Působení teploty: teplota při kultivaci mateřské rostliny ovlivňuje chování explantátu Př:Př: % vytvořených pupenů slivoně je úměrné době udržování mat.r. při
4°C
• Působení světla: promítá se do hladin zásobních látek, R.R. změny v chování explantátu
• Působení R.R: ovlivňuje jak růst, tak morfogenezi
Př:Př: rajče, ošetření chlormequatem (inhibice syntézy giberelinů) zvýšení tvorby pupenů na listových explantátech
Teplota Světlo Vlhkost Složení plynné fáze Složení médií Aseptická kultivace Typ explantátu Ošetření mateřských rostlin