This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
SILMÄLÄÄKKEIDEN FORMULOINTI
JA TEOLLINEN VALMISTAMINEN
KOKEELLINEN OSA:
RAMAN-SPEKTROSKO-PIAN HYÖDYNTÄMINEN
JAUHESEOKSEN LÄÄKEAINEPITOISUUDEN
MÄÄRITTÄMISESSÄ
Ville Kangas Pro gradu -tutkielma Proviisorin koulutusohjelma Itä-Suomen yliopisto, farmasian laitos Maaliskuu 2014
ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, terveystieteiden tiedekunta Farmasian laitos Proviisorin koulutusohjelma Farmasian teknologia KANGAS VILLE T: SILMÄVALMISTEIDEN TEOLLINEN FORMULOINTI JA VALMISTAMINEN Pro gradu -tutkielma, 108 s. ohjaajat: Professori, FaT Jarkko Ketolainen, Lehtori, dosentti Tapio Nurmi Maaliskuu 2014
Avainsanat: Silmälääke, formulointi, aseptiikka, valmistaminen, teknologia
Tiivistelmä
Silmälääkintä vaatii lääkevalmisteelta useanlaisia ominaisuuksia. Silmän pinta on lääkkeellä helposti saavutettavissa, mutta yleensä vain alle viisi prosenttia lääkeaineesta pääsee imeytymään silmän sisempiin osiin, jossa sen vaikutuskohta sijaitsee. Tätä ongelmaa pyritään ratkaisemaan yleensä parantamalla lääkevalmisteen kykyä pysyä silmässä. Erilaiset ainesosat, kuten imeytymisen parantajat, viskositeetin kohottajat, biokiinnitysaineet, faasin muuttajat ja suspension muodostajat, lisäävät lääkeaineen vaikutusaikaa silmässä. Perinteisten valmisteiden rinnalle on tullut myös pitempivaikutteisia ratkaisuja, kuten silmäluomitaskuun laitettavia implantti- ja sienivalmisteita, sekä teknologisempia annostelujärjestelmiä, kuten iontoforeesi. Kaikissa järjestelmissä on omat heikkoutensa, ja silmän herkkyyden takia valmisteiden muokkaaminen optimaalisiksi on hankalaa. Parhaimmillaankin silmävalmisteet ovat eri optimitilojen kompromisseja, joissa lääkeaineen imeytyminen, valmistettavuus, siedettävyys ja käyttäjän hoitomyöntyvyys yhdessä saavuttavat korkeimman tasonsa.
Silmävalmisteiden tuotanto on puhtaudeltaan parenteraalisen lääkinnän tasolla, ja valmistusolosuhteiden täytyy täyttää niille asetetut korkeat vaatimukset. Nykyaikaisten lääkeaineiden formulaatiot voivat olla monimutkaisia, mikä aiheuttaa tuotannolle omat vaikeutensa. Sterilointi ei useinkaan onnistu lopputuotteelle, jolloin joudutaan menemään täysin aseptiseen valmistukseen, jossa tasaisen korkean laadun saavuttaminen vaatii tarkkaa tuotantosuunnittelua ja toimivan ympäristön. Jokainen lisätty työvaihe aseptisessa valmistuksessa on riski tuotteen kontaminoitumiseen. Tätä varten on kehitetty erilaisia tekniikoita, kuten isolaattori, HEPA-ilmansuodatus, blow-fill-seal -teknologia, sterilization in place ja sterilointitunneli –järjestelmät. Näillä pystytään yhdistämään eri tuotantovaiheita samaan ympäristöön, jolloin tuotannon turvallisuus ja tehokkuus saadaan maksimoitua.
UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of health science School of Pharmacy Master of Science in Pharmacy program Pharmaceutical Technology KANGAS VILLE T: FORMULATION AND INDUSTRIAL MANUFACTURING OF OPTHALMIC PRODUCTS Master’s thesis, 108 pp, Supervisors: Professor, PhD. Jarkko Ketolainen, Lecturer, Adjunct Professor Tapio Nurmi March 2014
Drug administration into the eye calls for several different properties of a pharmaceutical preparation. It is relatively easy for a drug to reach the surface of the eye but usually only less than five percent of an active drug ingredient is absorbed into the inner parts of the eye, that is, into the action site. Usually formulators try to solve this problem by increasing the dwelling time of the product on the surface of the eye. Different kinds of excipients are available, such as: permeation enhancers, bioadhesive agents, phase modifiers, suspending and thickening agents. It has been developed also new kind of treatments in parallel with conventional drugs like topically administered implants and gelatin products and also more technological solutions like iontophoresis. Every system has its own downsides and because eye is so vulnerable, product optimizations are difficult to be made. Even at the best case eye medicines are compromises of different optimal modes, where the permeability of an active pharmaceutical ingredient, producibility, tolerability and users comfort for medicine are combined.
The manufacture of the eye preparations needs to be as pure as drug manufacture for parenteral applications and the facilities need to fulfill the high specifications. New drug formulations can be so complicated that that may cause problems for manufacture. Some products cannot be sterilized after manufacture, but they need to be prepared in an aseptic way. In such aseptic manufacture, spesific production planning and good facilities are needed to achieve the high and consistent quality. Every additional production step in the aseptic manufacture is a risk of contamination. To avoid the contamination risk, several techniques are developed, such as isolator, HEPA air filtration, blow-fill-seal technology, sterilization-in-place and sterilization tunnel which helps to increase manufacturing safety and efficiency.
Esipuhe
Olen tehnyt opinnäytetyöni Itä-Suomen yliopiston farmasian teknologian ja
biofarmasian osastolla. Ohjaajina opinnäytetyössä toimivat FaT Jarkko Ketolainen,
Lehtori Tapio Nurmi, FaT, dos. Ossi Korhonen ja DI Tuomas Ervasti. Haluan kiittää
heitä hyvästä ohjauksesta ja tuesta opinnäytetyöni aikana.
Haluan kiittää myös perhettäni ja ystäviäni, erityisesti Jutta ja Matti Suvantoa sekä
Katri ja Ilari Kososta tuesta ja avusta opinnäytetyössä. Lisäksi kiitokset myös
ystävilleni korppikotkille yöllisestä puhelusta opinnäytetyön teonaikana sekä Suvi
Kohottavat nesteen rakennetta pienentäen partikkelien laskeutumisnopeutta sekä helpottaen aineen uudelleen sekoitettavuutta. Kohottavat lääkkeen säilyvyyttä ja vaikutusaikaa silmässä sekä vähentävät emulsion vaahtoavuutta
heikkous on, että valmisteessa poloksameerikonsentraation täytyy olla yli 25 %
(w/w), mikä vähentää sen siedettävyyttä silmässä (Wilson ym. 2001).
20
Faasitransitio, joka perustuu komponentin pH:n vaihtumiseen, tehdään esimerkiksi
käyttäen selluloosa-asetaatti-ftalaattia (Wilson ym. 2001). Tällä aineella on hyvin
pieni viskositeetti pH:ssa viisi, mutta se muodostaa hyvin nopeasti geelin pH:n
noustessa kyynelnesteen tasolle 7,4:ään. Carpopol 934 -polymeereillä on
samantyyppinen ominaisuus: pH:ssa 4,4 sen aiheuttama viskositeetti on 25 cps ja
pH:ssa 7,4 vastaavasti 9000 cps (Nayak ym. 2012).
Ionivahvuuteen perustuvissa faasitransitioissa käytetään usein Gellan gum -
polysakkaridia. Valmisteessa nestemäisenä oleva Gellan gum muuttuu annostelun
jälkeen kyynelnesteen vaikutuksesta kirkkaaksi geeliksi (Mazuel ym.1989, Wilson
ym. 2001). Geeliytymiseen vaikuttaa erityisesti kyynelnesteessä olevat yksi- ja
kaksiarvoiset kationit. Ionivahvuuteen perustuvan faasitransition etuna on erityisesti
helpompi varastointi, koska siinä tuotteen säilyttäminen ei vaadi yhtä tarkkaa
lämpötilaseurantaa, kuten esimerkiksi lämpötilaan perustuvan transition tuotteissa.
2.3. Formulaatiotyypit silmälääkinnässä
2.3.1 Perinteiset formulaatiot
Perinteiset annostelumuodot silmälääkevalmisteissa ovat liuokset, suspensiot, geelit
ja voiteet (Ali ja Lehmussaari 2006) (Kuva 4, taulukko 2). Niitä on kritisoitu paljon
muun muassa huonosta hyötyosuudesta, mutta ne ovat edelleen käytetyimpiä
annostelumuotoja silmälääkinnässä. Perinteisten annostelumuotojen rinnalle on
kehitetty uusia innovatiivisempia lääkemuotoja, kuten silmälamellit,
aihiolääkevalmisteet sekä mikro- ja nanopartikkelit, joiden käyttöiät voivat vaihdella
tunneista vuosiin. Näiden lisäksi on erilaisia silmän sisään annosteltavia
lääkemuotoja, mutta tässä katsauksessa keskitymme silmän ulkopuolelle
annosteltaviin valmisteisiin, jotka eivät tarvitse kirurgista toimenpidettä annosteluun.
21
Kuva 4. Silmävalmisteiden käyttöaika (Amo ja Urtti 2008)
Taulukko 2 Formulaatiokomponentit, joita käytetään yleisesti moniannossilmätippa-valmisteissa. (Y) Komponentti sisältyy, (O) Komponentti voidaan lisätä, ( ) Kompo-nenttia ei käytetä
Komponentti Liuos Suspensio Geeli Voide Lamelli
Lääkeaine Y Y Y Y Y
Lääkekuljetin O O O O O
Vesi Y Y Y O
Puskurointiaine Y Y Y
Toonisuuden säätäjä O O O
Säilytysaine Y Y Y Y
Viskositeetin säätäjä O O
Liuotin O O
Suolat O O O O
Luonnollinen kiinnitysaine O O O O
Suspensionmuodostaja Y
Faasinvaihtaja Y
Imeytymisen parantaja O O O O
Kytketyt polymeerit Y
Vaha/öljy/vaseliini Y
Lähde: Lang 1995
22
2.3.1.1 Liuokset
Vesipohjaiset liuosvalmisteet ovat edelleen yleisin silmälääkemuoto (Ali ja
Lehmussaari 2006, Gibson 2009). Suurin osa lääkeaineista on vesiliukoisia, mutta
tilanteissa, jossa lääkeaine ei itse ole vesiliukoinen, yritetään lääkeaineesta muokata
vesiliukoinen suola tai tehdä rasvapohjainen valmiste. Liuosmaisen valmisteen etuja
ovat pääsääntöisesti yksinkertaisempi valmistaminen teollisessa mittakaavassa sekä
helpompi annosteltavuus. Liuoksien heikkoutena taas on nopea poistuminen
imeytymisalueelta, jolloin lääkkeen hävikki on suurempi. Liuoksissa voidaan käyttää
muun muassa lääkekuljettimia, puskurointiaineita, toonisuuden säätäjiä,
säilytysaineita, viskositeetin säätäjiä, liuottimia, biokiinnitysaineita ja imeytymisen
kuten Yhdysvaltojen Farmakopean (United States Pharmacopeia, USP 36)
mukaiseen injektioihin käytettävään veteen. Liuos suodatetaan tämän jälkeen
steriloivan membraanin tai suodattimen läpi. Nestemäiset valmisteet voidaan usein
steriloida myös säteilytyksellä.
3.1.4 Pakkauksen sterilointi ja puhdistus
Aseptisen valmisteen pakkauksen täytyy olla puhdistettu, steriili ja pyrogeeniton
ennen kuin valmiste voidaan annostella siihen (Agalloco ja Akers 2008, Reed 2009).
Osassa järjestelmistä pakkauksen nämä toimenpiteet on liitetty osaksi
valmistuslinjastoa, jolloin säästytään ylimääräisiltä kuljetuksilta ja varastoinneilta.
Suuren mittakaavan järjestelmissä lasisten pakkausten depyrogenointi ja sterilointi
suoritetaan lämmön avulla jatkuvatoimisessa sterilointitunnelissa. Pakkaus kulkee
sterilointitunnelissa, jonka keskivaiheilla ilman lämpötila nousee 350 ˚C:een ja laskee
siitä asteittain normilämpötilaan ennen kuin pakkaukset saavuttavat linjaston
täyttöaseman (Reed 2009). Lasipakkaus katsotaan steriloiduksi, kun se saavuttaa
180–200 ˚C lämpötilan. Osa pakkausten valmistajista voi toimittaa pakkaukset
valmiiksi käsiteltyinä, jolloin ne voidaan täyttää heti (Agalloco ja Akers 2008). Vastuu
pakkausten steriiliydestä on silloin niiden tuottajalla, kunhan lääkkeen valmistaja
täyttää ne soveltuvassa puhdastilassa.
Muovisten pakkausten sterilointiin voidaan käyttää kaasumaisia etyleenioksidi- ja
vetyperoksidi-käsittelyjä, tai pakkaukset voidaan altistaa ionisoivalle säteilylle
(Agalloco ja Akers 2008). Elektonisäde- ja kaasusterilointiin tarvittavat laitteistot
voidaan asentaa valmistuslinjaston yhteyteen, mutta gammasädesteriloinnit on
suoritettava alihankkijoilla toiminnon terveyshaittojen takia.
37
3.1.5 Blow-Fill-Seal -laitteisto (BFS)
Blow-Fill-Seal (BFS) on automatisoitu laitteisto, joka valmistaa tuotteen pakkauksen
juuri ennen sen täyttöä ja sulkee sen heti täytön jälkeen (kuva 9). BFS-laitteistoilla
valmistetaan yleensä 1–1000 ml:n nestemäisiä pullo- tai pipettivalmisteita (Reed
2002). BFS-laitteisto kehitettiin alun perin 1930-luvulla Euroopassa, mutta vasta
1970-luvulla se otettiin farmaseuttiseen käyttöön (Reed 2002, Löfgren ym. 2003).
Kuva 9. BFS-laitteisto (Reed 2002).
BFS-laitteiston pääosat ovat polymeerin varastointi- ja syöttöjärjestelmä,
kuumennettava ruuvipuristin, jossa on putkisuutin, putken katkaisuterä, steriili
täyttökammio, muotin puolikkaat pakkauksen muodostamiseen ja sulkemiseen sekä
tarkastuslaitteet esimerkiksi vuodon havaitsemiseen.
BFS-laitteisto on vain osa aseptisesta valmistusprosessista, ja se tarvitsee
ympärilleen perinteiset aseptisen valmistusprosessin välineet, joiden avulla täytettävä
neste valmistetaan (kuva 10). BFS-laitteistot käsittelevät normaalisti vain kahta
raakamateriaalia, täytettävää tuotetta ja polymeeriä, josta pakkaus valmistetaan
(Reed 2002). Molemmille materiaaleille on omat linjastonsa, jotka mahdollistavat
erittäin suurten eräkokojen valmistamisen kerralla. Laitteisto voi valmistaa
esimerkiksi 500 000 yksikön eriä, ja sen täyttöaika voi olla 120 tuntia.
38
Kuva 10. BFS-laitteiston yhteenliittäminen valmistusprosessiin (Haettu internetistä 16.12.2013 http://www.rommelag.com)
BFS-laitteistossa polymeerirakeet syötetään ruuvipuristimeen, jossa ne
kuumennetaan 160–170 ˚C tasaiseksi massaksi ja johdetaan suuttimen läpi ontoksi
polymeeriputkeksi (Reed ym. 2002). Putken rakennetta estetään romahtamasta
tukemalla sitä steriilillä ilmavirralla (Kuva 11 a). Kun putki on saavuttanut sopivan
pituuden, alempi muotti painautuu polymeeriputken ympärille ja sulkee sen alaosan
(Kuva 11 b). Samaan aikaan putken yläosa leikataan auki sähköllä kuumennetulla
terällä. Alamuotti siirtyy tämän jälkeen täyttöasemalle, jossa putki imetään ja/tai
puhalletaan kiinni muotin kylmennettyihin seinämiin. Näin saadaan muodostettua
putkesta pakkauksen alaosa. Tämän jälkeen täyttöneula annostelee oikean määrän
nestettä pakkaukseen (Kuva 11 c). Täytön jälkeen neula nostetaan pois, ja muotin
ylempi osa puristaa putken kiinni muodostaen pakkaukselle yläosan ja samalla
sulkien sen (Kuva 11 d). Tällä tavoin on saatu yhdistettyä pakkauksen muodostus,
täyttö ja sulkeminen yhteen laitteeseen, ja koko prosessin tekemiseen menee 10–15
sekuntia.
39
Kuva 11 Blow-Fill-Seal -laitteiston toimintaperiaate: a) kuumennetun polymeeriputken syöttömuoteille, b) muottien sulkeminen ja polymeeriputken katkaisu molemmista päistä ja alapään sulkeminen, c) polymmeriputken täyttö ja muotoilu muotin mukaan, d) pakkauksen yläosan sulkeminen, e) pakkauksen vapauttaminen muoteista (Reed ym. 2002).
Ilmavirtauksia käytetään hyödyksi myös BFS-laitteistossa, jotta laitteiston
ulkopuolella olevat partikkelit eivät kulkeudu täyttöalueelle, jossa tuote on
haavoittuvimmillaan (Reed 2002, FDA 2004). Laitteiston toimintakierrossa on yleensä
kolme kohtaa, jossa pakkaus on altis kontaminaatiolle: kun putki katkaistaan
kuumalla terällä, kun pakkausta siirretään täyttöasemalle ja juuri kun täyttöneula
otettu pois pakkauksesta. Katkaistaessa polymeeriputki kuumalla terällä syntyy
näkyvää savua ja siten partikkeleita, jotka poistetaan steriilillä ilmavirralla. Katkaisuun
on kehitetty uusi systeemi, KleenKut™, joka toimii yleisimmin BFS-laitteistossa
Lääkevalmisteiden suunnittelu on nykypäivänä kokonaisvaltaista, ja jokaisen
formulaation aineosa täytyy miettiä aineen toiminnasta tuotannon kautta aina
asiakkaan annosteluun saakka.
43
KOKEELLINEN OSA: RAMAN-SPEKTROSKO-
PIAN HYÖDYNTÄMINEN JAUHESEOKSEN
LÄÄKEAINEPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMISESSÄ
44
ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, terveystieteiden tiedekunta Farmasian laitos Proviisorin koulutusohjelma Farmasian teknologia KANGAS VILLE T: Raman-spektroskopian hyödyntäminen jauheseoksen lääkeainepitoisuuden määrittämisessä Pro gradu -tutkielma, 108 s., 3 liitettä (5 s.) ohjaajat: Tutkija, diplomi-insinööri Tuomas Ervasti ja Lehtori, FaT, dosentti Ossi Korhonen Maaliskuu 2014
Tabletit ovat edelleen käytetyin lääkemuoto sairauksien hoidossa. Niiden valmistuksessa pyritään entistä enemmän jatkuvatoimisiin prosesseihin, joiden yksi suurimmista haasteista on luotettava ja tasalaatuinen lääkkeen valmistus. Sitä varten valmistuslaitteisto vaatii rinnalleen reaaliaikaisen laadunvalvontajärjestelmän, joka kykenee riittävän nopeasti ja tarkasti analysoimaan tuotetta, ja jonka tuottaman datan avulla voidaan tehdä muutoksia valmistusasetuksiin. Raman-spektroskopia on yksi lupaavista järjestelmistä reaaliaikaiseen laadunvalvontaan, koska se kykenee mittaamaan näytteet nopeasti valmistuksen aikana, sen on osoitettu kykenevän erittäin tarkkoihin pitoisuusmittauksiin ja se soveltuu käytettäväksi niin nesteiden, kiinteiden kuin kaasumaistenkin näytteiden kanssa.
Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää PhAT-anturilla varustetun Raman-spektrometrin soveltuvuutta jauhemaisten näytteiden lääkeainepitoisuuksien määrittämiseen sekä paikallaan että liikkeessä olevilla näytteillä. Tutkimukseen valittiin yleisesti lääkevalmistuksessa tunnettuja lääke- ja apuaineita, joista tehtiin seoksia eri pitoisuuksilla. Seokset mitattiin Raman-spektrometrillä paikallaan yhden ja kuuden sekunnin mittausajoilla sekä liikkeessä yhden sekunnin mittausajalla. Kaikki Raman-spektrometrillä mitatut lääkeaineseossarjat esikäsiteltiin SIMCA–P 12 ohjelmalla ja niistä muodostettiin ennustusmalleja, joiden kykyä ennustaa näytteiden pitoisuuksia tutkittiin käyttämällä tunnettuja koenäytteitä. Asetyylisalisyylihapon ja dikalsiumfosfaatin seoksille määritettiin lääkeainepitoisuudet myös kemiallisesti, jotta Raman-spektrometrin antamien tulosten paikkansapitävyyttä voitiin arvioida.
Soveltuvimmat esikäsittelyt antoivat sarjoista muodostetuille malleille ennustustehoiksi arvoja välillä 0,8–4 (RMSEP). Liikkeessä tehdyissä mittauksissa osassa sarjoista Raman-spektrometri pystyi erottelemaan viiden prosentin pitoisuuserot toisistaan, jota voidaan pitää vähimmäisvaatimuksena lääkkeenvalmistuksen analyysilaitteistolle.
Tutkimus osoitti järjestelmän sisältävän potentiaalia reaaliaikaiseen jauheseoksen pitoisuusmittaukseen. Etenkin liikkeessä olevien seosmittausten toistettavuutta ja tarkkuutta pitää kuitenkin tutkia vielä lisää erilaisilla näytteen liikkumisnopeuksilla.
Tutkimuksen aikana luotiin myös Raman-kirjasto, joka auttaa tuntemattomien Raman-spektrien tunnistamista. Saadut spektrit osoittautuivat suurimmalta osin vertailukelpoisiksi kirjallisuudesta saatuihin referensseihin.
45
UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Health Science School of Pharmacy Master of Science in Pharmacy program Pharmaceutical Technology KANGAS VILLE T: Utilization of Raman spectroscopy to determining the drug concentration of the powder mixture Master’s Thesis, 108 pp, 3 appendixies (5 pp.) Supervisors: Researcher, Master of Science Tuomas Ervasti and Lecturer, PhD, Adjunct Professor Ossi Korhonen March 2014
Keywords: Raman spectroscopy, drug concentration, Raman spectroscopy library
Summary Tablets are still the most commonly used form of medicines in treatment of diseases. The aim of medical manufacturers is to move from large batch processes to smaller continuous processes. In such processes one of the biggest challenges is to establish a reliable process for manufacturing uniform products. Manufacturing equipment requires a parallel real-time quality control system, which can quickly and accurately analyze the product and, with its analyzed data can be used to make necessary adjusts to the manufacturing equipment. Raman spectrometry is one of the most promising systems for that type of quality control, since it is capable of measuring samples rapidly during manufacturing process, it has shown to be very precise measuring concentrations and it is suitable to be used for liquid, solid or gaseous samples.
The aim of this study was to find out suitability of Raman spectrometer with PhAT probe for measuring drug concentrations for both stationary and mobile powdered drug mixture samples. All drugs and pharmaceutical excipients chosen to the study are commonly known in pharmaceutical manufacturing, and mixtures of various concentrations were used. Stationary mixtures were measured with Raman spectrometer with one and six second measurement times and mobile mixtures were measured with one second measurement time. All series were preprocessed with SIMCA-P 12 software and probability models were constructed for each series. Prediction efficiencies of the constructed models were measured on known exhibits. For acetylsalicylic acid and dicalciumphosphate drug mixtures were also tested in chemical assays to enable evaluation of results given by the Raman spectrometer.
The Raman spectrometer gave RMSEP values from 0.8 to 4 for the most suitable preprocessed models. For some of the series measured from mobile samples Raman spectrometry was able to distinguish five percent differences in drug concentration. This difference can be considered as minimum accuracy for analytical devices in pharmaceutical manufacturing.
Raman spectroscopy demonstrated good potential for real time concentration monitoring in the study. Further studies are needed to ensure the accuracy and repeatability of measurements with different sample speeds.
46
During the study a Raman spectroscopic library was created to aid the identification of unknown Raman spectrum. Most of the obtained spectra turned out to be comparable with the spectra from literature.
47
5 JOHDANTO
Tabletit ovat tämän hetken käytetyin lääkemuoto. Tabletti on stabiili lääkemuoto, joka
on teollisuudelle yksinkertainen ja edullinen valmistaa sekä asiakkaan helppo
käyttää. Perinteinen tablettivalmistus pohjautuu suuriin tuotantoeriin, joiden
laadunvarmistus tapahtuu valmistuksen jälkeen tuotteelle määritetyillä testeillä. Vasta
hyväksyttyjen testien jälkeen tuote on valmis vapautettavaksi jakeluun.
Lääketeollisuudessa tavoitteena olisi kuitenkin siirtyä eräpohjaisesta valmistuksesta
kohti jatkuvatoimista lääkkeenvalmistusta, jossa pyritään saavuttamaan pienemmät
valmistuslaitteistot, vähentämään tuotantokatkojen ja epäkelvon lopputuotteen
määrää sekä saamaan kattavampi reaaliaikainen laadunvarmistus.
Jatkuvatoimisen lääkkeenvalmistuksen tärkeimpiä kulmakiviä on saada laitteisto
tuottamaan tasalaatuista lopputuotetta. Tähän tarvitaan reaaliaikaista
analytiikkalaitteistoa, joka pystytään liittämään osaksi valmistuslaitteiston toimintaa
(De Beer ym. 2011). Yhden tai useamman analytiikkalaitteiston avulla pyritään
tarkkailemaan valmisteen kriittisiä ominaisuuksia reaaliajassa koko tuotantoketjun
ajan. Kriittisten ominaisuuksien määrityksellä pyritään seuraamaan eri prosesseja ja
niissä tapahtuvia muutoksia. Pyrkimyksenä on rakentaa valmistusjärjestelmä, jossa
analytiikkalaitteistojen datan perusteella voidaan valmistuslaitteistojen toimintaa
muuttaa siten, että lopputuote pysyy jatkuvasti sille määritettyjen parametrien sisällä.
Raman-spektroskopia on yksi lupaavista mittaustekniikoista, joita tutkitaan
reaaliaikaiseen analytiikkaan.
Raman-spektroskopia perustuu molekyyleihin kohdistettujen fotonien energian
epäelastiseen siroamiseen (Raman ja Krishnan 1928). Raman-spektroskopiaa
pyritään soveltamaan nykypäivänä pelkästään farmasian alalla moniin eri
valmistusprosesseihin, kuten sekoitus, rakeistus, kuivaus, päällystys, kylmäkuivaus
ja ekstruusio (Vergote ym. 2004, Wiksström ym. 2005, Aaltonen ym. 2007, De Beer
ym. 2007, Kogerman ym. 2008, Saerens ym. 2010, Wirges ym. 2013). Raman-
spektroskopia on kohteeseen kajoamaton mittausmenetelmä, jolla pystytään
mittaamaan niin kiinteitä, nestemäisiä kuin kaasumaisiakin näytteitä. Laitteistolla
voidaan mitata myös lasin läpi, jolloin näyte voidaan sijoittaa esimerkiksi
lasiampulliin, ja muun muassa hygroskooppisten näytteiden mittaaminen on
48
mahdollista. Raman-spektroskopiaa voidaan soveltaa erilaisten prosessien tarkkailun
lisäksi esimerkiksi eri yhdisteiden tunnistamiseen valmiiden spektrikirjastojen avulla
(Bugay ja Brush 2010).
Tutkimuksessa pyrittiin selvittämään Raman-spektroskopian soveltuvuutta
jauheseoksien lääkeainepitoisuuksien tarkkailuun niin paikallaan kuin liikkeessä
olevista näytteistä. Liikkuvilla näytteillä pyrittiin tutkimuksessa mallintamaan
käytettiin erilaisia esikäsittelytekniikoita parantamaan datan perusteella tehtäviä
ennustuksia. Saatujen tulosten avulla arvioitiin Raman-spektroskopian soveltuvuutta
jauheiden pitoisuuden tarkkailuun. Tutkimukseen valitut aineet ovat yleisesti
lääkkeenvalmistuksessa käytettyjä materiaaleja. Pitoisuustutkimuksen yhteydessä
luotiin myös Raman-spektrikirjasto tukemaan Itä-Suomen yliopistolle valmistuneen
jatkuvatoimisen linjaston mittaustekniikoiden tutkimusta (liitetaulukko 1).
Spektrikirjaston oikeellisuutta pyrittiin varmistamaan vertaamalla tuloksia muihin
tehtyihin tutkimuksiin.
6 MATERIAALIT JA MENETELMÄT
6.1 Raman-spektroskopia
Raman-sironnaksi kutsuttua ilmiötä tutkitaan altistamalla näyte monokromaattiselle
säteilylle ja mittaamalla säteilyssä tapahtuvaa aaltolukumuutosta (Ferraro ym. 2002,
Gurtu ja Khera 2009). Säteilyn energia absorboituu näytteen molekyyleihin ja saa ne
värähtelemään. Värähtelytilan purkautuessa molekyylistä lähtevä säteily sisältää
Rayleight-säteilyksi kutsuttavan alkuperäisen taajuuden lisäksi myös matalampia
taajuuksia, joita kutsutaan Stokesin säteilyksi, ja korkeampia taajuuksia, joita
kutsutaan anti-Stokesin säteilyksi.
Raman-säteilyssä molekyylit virittyvät niin kutsutulle virtuaalitasolle, joka on
huomattavasti varsinaista elektronin virittymistilaa alhaisempi (Kuva 12) (Ferraro ym.
2002). Raman-sironta on hyvin heikkoa Rayleight-sirontaan verrattuna, sillä
49
normaalisti alle yksi sadastatuhannesta näytteeseen tulevasta fotonista aiheuttaa
Raman-sirontaa.
Kuva 12: Eri säteilyjen aiheuttamia muutoksia kaksiatomisessa molekyylissä (IR= infrapuna, R=Rayleigh, S=Stokes, A=anti-Stokes) (Ferraro ym. 2002)
Kaikki molekyylissä tapahtuva värähtely ei aiheuta Raman-sirontaa. Molekyylin
värähtely on Raman-aktiivista, jos polarisoituvan molekyylin koko, muoto tai asento
muuttuu värähtelyn aikana (kuvat 13 ja 14) (Ferraro ym 2002, Gurtu ja Khera 2009).
Raman-aktiivisessa säteilyssä värähtely tapahtuu symmetrisesti molekyylin
symmetriakeskuksen nähden, kuten kuvassa 2 värähtely V1. Värähtelyt V2 ja V3 ovat
infrapuna(IR)-aktiivisia, mutta eivät Raman-aktiivisia, koska V3-värähtely ei ole
symmetristä ja V2-värähtelyssä polaroituneiden molekyylien koko, muoto sekä asento
säilyvät muuttumattomina.
50
Raman-spektristä kullekin aineelle ominaisen tekevät niiden erilaiset
molekyylirakenteet (Ferraro ym. 2002, De Beer ym. 2011). Molekyylin värähtely
koostuu monista yksinkertaisista värähtelytiloista, joista kukin värähtelee sille
ominaisella taajuudella. Raman-spektri koostuu näiden värähtelytiloista purkautuvien
säteilyjen ja alkuperäisen säteilyn erotuksista. Kuvaan 15 on koottuna joitakin
taajuuksia, joilla ilmenee tiettyjä molekyylirakenteita. Raman-säteilyn voimakkuus, eli
intensiteetti, riippuu perustilassa olevien molekyylien määrän lisäksi värähtelevästä
sidoksesta ja värähtelytyypistä. Kovalenttiset sidokset tuottavat enemmän Raman-
säteilyä, kun taas ionisidokset tuottavat enemmän IR-säteilyä. Kovalenttisten mono-,
di- ja tri-sidosten vaikutukset Raman-spektrin intensiteettiin ovat suhteessa noin
sidoksen kerrannainen, eli esimerkiksi kolmoissidos aiheuttaa kolminkertaisen
intensiteetin yksinkertaiseen sidokseen nähden. Värähtelytyypeistä molekyyliä
venyttävä värähtely tuottaa yleensä suuremman intensiteetin kuin molekyyliä
taivuttava (Ferraro ym. 2002).
Kuva 13. CO2-molekyylissä vallitsevan polarisaation muutokset eri normaali-värähtelyissä määrittävät niiden Raman-aktiivisuuden (Ferraro ym. 2002).
Kuva 14. H2O-molekyylissä vallitsevan polarisaation muutokset eri normaali-värähtelyissä. (Ferraro ym. 2002).
51
Kuva 15. Esimerkkejä Raman-spektriä muodostavien ryhmien rakenteiden ilmenemisaaltolukualueista x-akselilla (Schwartz 2005).
6.2 Spektrien esikäsittely
Tässä tutkimuksessa mittauksissa saaduille Raman-spektreille suoritettiin erilaisia
esikäsittelyitä. Esikäsittelyt ovat erilaisia tilastollisia menetelmiä, joilla pyritään
poistamaan tutkimusdatassa esiintyviä poikkeamia, kuten mittausten olosuhteissa
tapahtuvia muutoksia tai virheitä (Gemperline ym. 2006). Näin datasta saadaan
poistettua tutkittavan muutoksen kannalta merkityksetöntä tietoa, ja todelliset
muutokset mittauksissa näkyvät selvemmin, jolloin johtopäätösten ja oikeiden
tulkintojen tekeminen on helpompaa (Naes ym. 2002, Rinnan ym. 2009).
Spektroskopiassa käytetyimmät esikäsittelytekniikat voidaan jakaa kolmeen
ryhmään: spektrin derivointi, spektriä tasoittavat esikäsittelyt ja sirontaa korjaavat
esikäsittelyt (Ferraro ym. 2002, Gemperline ym. 2006, Rinnan ym. 2009).
52
6.2.1 Spektrin derivointi
Derivointi on yksinkertainen ja usein käytetty esikäsittely spektroskopiassa. Sillä
pystytään vähentämään datan pohjatason vaihtelun lisäksi myös yhteis- ja
kerrannaisvaikutuksia (Naes ym 2002. Gemberline ym. 2006, Rinnan ym. 2009).
Derivoinnin vaikutukset havaitaan, kun tarkastellaan kahta Gaussin käyrää, joista
toiseen on lisätty kohonnut pohjataso ja toiseen sen lisäksi myös kerrannaisvaikutus
(kuva 16). Ensimmäisen asteen derivaatta on alkuperäisen spektrin jokaisen pisteen
kulmakerroin ja sillä saadaan poistettua spektriltä pohjataso. Alkuperäinen spektri
sijoittuu siten, että sen minimit ja maksimit ovat derivoidussa spektrissä x-akselin
leikkauskohdissa ja alkuperäisen spektrin suurimmat kulmakertoimet ovat
ensimmäisen asteen derivaatan maksimit ja minimit. Toinen derivaatta, joka mittaa
alkuperäisen spektrin jokaisen pisteen kaarevuutta, pystyy poistamaan
alkuperäisestä spektristä pohjatason lisäksi myös taustan kaltevuutta tai
kaareutuvuutta, joka usein johtuu fluoresenssista tai muista poikkeamista. Toisen
asteen derivoinnilla saadun spektrin rakenne on myös helpommin luettava, kuin
ensimmäisen derivoinnilla saatava. Toisen asteen derivaatalla saatavassa spektrissä
alkuperäisen spektrin positiivisella puolella ilmenevät piikit terävöityvät ja säilyttävät
maksimi kohtansa x-akselilla suhteen, vaihtaen suuntansa y-akselin suhteen
negatiiviselle puolelle (Ferraro ym. 2002, Naes ym. 2002). Piikkien terävöityminen
helpottaa eri piikkien erottamista toisistaan.
53
Kuva 16. Derivoinnin vaikutukset Gaussin käyrään, jolla on kohonnut pohjataso (vihreä) ja Gaussin käyrään, jolla on kohonnut pohjataso sekä kerrannaisvaikutus (punainen) (Rinnan ym. 2009).
Ensimmäisen asteen derivaatta saadaan kahden peräkkäisen mittauspisteen
funktioiden avulla, joista muodostetaan erotusosamäärä (kaava 1). Kaavassa 1 on
ensimmäinen mittauspiste kohdassa i ja h on mittauspisteiden välinen erotus.
Kaavassa 2 on ensimmäisen asteen derivaatta pisteessä i. Toisen asteen
derivaatta saadaan kahden peräkkäisen pisteen perusteella ensimmäisen
asteen derivaatan spektristä (kaava 3) (Rinnan ym. 2009, Etälukio 2013).
(1)
(2)
(3)
Derivoinnin heikkous on, että se hävittää datan signaalia ja huonontaa siten signaali-
kohina -suhdetta. Mitä suuremman asteen derivaatta, sitä enemmän se laskee
signaali-kohina -suhdetta (Rinnan ym. 2009 ja Gemberline ym. 2006)
54
6.2.2 Spektrin normalisointi
Normalisoinnin tarkoituksena on saada vertailtavien spektrien intensiteetit samaan
mittakaavaan ja helpottaa siten erityisesti tuntemattomien näytteiden vertailua
referenssispektreihin (Kramer 1998, Ferraro ym 2002). Normalisoinnit voidaan jakaa
karkeasti kahteen kategoriaan, globaaleihin ja paikallisiin (Listgarten ja Emili 2005).
Globaaleissa tavoissa spektrien yhteisen tekijän normalisointiin käytetään koko
spektriä, kun taas paikallisissa tavoissa siihen käytetään vain osaa spektristä.
Verrattaessa yhdisteitä, joissa on yhteinen komponentti mukana, on normalisointi
helppo suorittaa paikallisella periaatteella yhteisen piikin keskikohdan mukaan.
Tällöin normalisointi suoritetaan jakamalla kunkin spektrin yhteinen taajuus kaikkien
spektrien keskimääräisellä intensiteetillä, jolloin piikin intensiteetin vaihteluksi tulee
1,0, ja loppuosat spektreistä asettuvat sen mukaan helpommin vertailtaviksi.
Jos vertailtavilla spektreillä ei ole yhteistä rakennetta, voidaan normalisointi tehdä
spektrin alle jäävälle pinta-alalle (Ferraro ym. 2002, Meko 2013). Menetelmällä
saadaan spektrien pinta-alaksi yksi (kaava 4). Kaavassa 4 on spektrin
intensiteetti yksittäisellä taajuudella. Menetelmä mahdollistaa eri spektrien suhteiden
vertailun ja auttaa tunnistamaan tuntemattomia spektrejä. Pinta-alapohjainen
normalisointi toimii heikosti erilaisten taustojen omaavien spektrien vertailussa:
voimakkaan ja pienen taustan vertaaminen tällä normalisoinnilla voi vääristää muun
spektrin mittasuhteita siten, että spektrien tunnistaminen vaikeutuu.
√∑ (4)
6.2.3 Spektrin tasoitus
Raman-laitteisto voi kärsiä joillakin näytteillä esimerkiksi vähäisestä sironnan
määrästä, joka aiheuttaa signaali-kohina -suhteen (SNR) huonontumista spektrissä
(Ferraro ym. 2002, Gemberline ym 2006). SNR:n huononemista voidaan vähentää
erilaisilla spektrin tasoitusmenetelmillä, jotka tasoittavat spektrin taustalla olevaa
kohinaa. Spektrin tasoittamisessa on otettava huomioon, ettei tasoituksesta tehdä
liian voimakasta, sillä se voi hävittää myös tärkeää tietoa spektristä. Tasoituksella
55
voidaan kuitenkin hävittää kohinaa niin paljon, että datan tulkinta voi onnistua ilman
suurempia esikäsittelyitä. Yleensä tasoitusta käytetään kuitenkin derivoinnin
yhteydessä, jossa SNR huononee huomattavasti.
Savitzky-Golay (SG) -käsittelyssä valitaan käsittelyyn käytettävien havaintopisteiden
määrä ja polynomin aste (Ferraro ym. 2002 ja Rinnan ym. 2009). Polynomin avulla
spektrin jokaiselle havaintopisteelle muodostetaan keskiarvo (kuva 17). Esimerkiksi
laskettaessa seitsemän pisteen mallilla, jossa on kolmijakoinen painotus, niin itse
mitattavan pisteen lisäksi otetaan huomioon kolme edeltävää pistettä ja kolme
seuraavaa havaintopistettä (Ferraro ym. 2002). Kolmijakoisessa painotuksessa
pisteet painotetaan siten, että keskipiste on painoarvoltaan 1,0, sen viereiset pisteet
0,75, niistä seuraavat pisteet 0,50 ja kauimmaiset pisteet 0,25. Tulos jaetaan sitten
summalla 4,0, josta saadaan painotetun mittauspisteen arvo. Savitzky-Golay -
menetelmässä nämä yksinkertaiset painotukset on korvattu epälineaarisilla painoilla,
jotka tietokone hakee valittujen asetusten perusteella muistista ja laskee tasoituksen.
Polynomin järjestysasteella voidaan vaikuttaa siihen, kuinka monimutkaisia käyriä
tasoituksella voidaan sovittaa (Ferraro ym. 2002 ja Microsoft excel-help 6.11.2013).
Esimerkiksi toisen asteen polynomilla laskettuna käyrä voi sisältää yhden huipun tai
pohjan, kun taas kolmannen asteen polynomilla se voi sisältää kaksi huippua tai
pohjaa.
56
Kuva 17. Käsittelemättömän spektrin tasoittaminen Savitzky-Golay -käsittelyllä. Kuvassa siniset käsittelemättömän datan havaintopisteet tasoitetaan seitsemän pisteen, toisen asteen polynomifunktion avulla punaiseksi viivaksi, josta kuvassa on vielä laskettu ensimmäisen asteen derivaatta (Rinnan ym. 2009).
6.2.4 Sirontaa korjaavat esikäsittelyt
6.2.4.1 Standard Normal Variate (SNV)
SNV on käytetyimpiä esikäsittelyitä Raman-spektroskopian yhteydessä (Rinnan ym.
2009 ja Ferraro ym. 2002). Sen avulla voidaan korjata spektrin taustojen eroja (kuva
18). Toisin kuin derivoinnissa, SNV-korjauksessa säilytetään spektrin alkuperäinen
ulkoasu, jolloin signaali-kohina -suhde pysyy parempana. Käsittely ei siis poista
spektreistä taustaa, vaan pyrkii parantamaan spektrien keskinäistä korreloivuutta.
SNV-käsittelyssä jokaisesta spektristä vähennetään näytteiden keskiarvo, jolla
yksittäisten spektrien vaihtelua saadaan vähennettyä (Ferraro ym. 2002, Naes ym.
2002, Gemberline ym. 2006). Esikäsittelyn jälkeen spektri on keskittynyt y-akselilla
nollaan ja sen intensiteetin vaihtelu on muuttunut alkuperäisestä. SNV käsittelee
spektriä kaavan 5 mukaisesti, missä Xkorjattu on SNV-korjauksen jälkeinen
intensiteetti, Xorg on alkuperäinen intensiteetti samassa kohdassa spektriä, a0 on
keskiarvo korjattavista spektreistä ja n on spektrien lukumäärä.
57
Kuva 18. SNV-käsittelyn vaikutukset spektrien pohjatasoon. (a) 20 mikrokiteisen selluloosajauhenäytteen NIR-spektriä. (b) samat näytteet SNV-esikäsiteltyinä (Gemberline ym. 2006).
√∑
(5)
6.2.4.2 Multiplicative Scatter Correction (MSC)
MSC-käsittely on periaatteeltaan läheinen SNV-käsittelylle (Gemberline ym. 2006,
Rinnan ym. 2009). Molemmilla käsittelyillä pyritään poistamaan pohjatason vaihtelua
ja partikkelikoon vaihtelun aiheuttamia siroamiseroja. MSC- ja SNV-käsittelyt eroavat
siinä, että MSC:ssä spektristä ei vähennetä keskiarvoa, vaan jokaiselle spektrille
tehdään lineaarinen regressio erillisen referenssispektrin avulla. Referenssispektrinä
käytetään yleensä, kuten tässäkin tutkimuksessa, mittausjoukon keskimääräistä
spektriä (kaava 6) tai vaihtoehtoisesti erillistä kalibrointispektriä (Naes ym. 2002,
Rinnan ym. 2009, SIMCA-P 12.0.1 User Guide). Spektrit saadaan näin
käyttäytymään lineaarisemmin keskimääräisen spektrin suhteen.
∑
(6)
(7)
58
(8)
Kaavoissa 6, 7 ja 8 Xik on yksi mitatuista spektreistä ja mk on joukon keskimääräinen
spektri, jota käytetään referenssispektrinä. Edelleen Xik korjattu on korjattu spektri ja ai
ja bi ovat skalaariparametreja, jotka kuvaavat kyseisen näytteen kerrannais- (b) ja
summautumisvaikutuksia (a) ja ne ovat kullekin näytteelle erilaiset. Parametrit
saadaan kuvan 19 tyyppisestä regressiokuvaajasta. eik kuvaa muita spektrissä
esiintyviä muutoksia, jotka eivät selity a:n tai b:n perusteella. MSC-käsittely ei ole
yhtä herkkä häiriöpitoiselle spektrille kuin SNV, koska MSC-käsittely sisältää
pienimmän neliösummasovituksen (Naes ym. 2002, Rinnan ym. 2009).
Kuva 19. Skalaariparametrit saadaan piirrettäessä näytespektri referenssin suhteen, jolloin ne saadaan pienimmän neliösumman regression avulla piirretyn suoran leikkauspisteestä ja kulmakertoimesta (Rinnan ym. 2009).
59
6.2.4.3 Row center (Row)
Row center -käsittelyä ei voida pitää sirontaa korjaavana käsittelynä, vaikka se
keskittääkin näytteiden vaihtelua. Row center -käsittelyssä jokaisesta pitoisuudesta
vähennetään kaikkien pitoisuuksien keskiarvo (SIMCA-P 12.0.1 User Guide).
6.3 Raman-spektrometri ja PhAT anturi
Raman-spektrometrin tärkeimmät osat ovat säteilylähde, jollaisena toimii yleensä
jatkuva-aaltoinen (CW) laser, säteilyn näytteeseen kuljettava ja sieltä keräävä
järjestelmä, aallonpituuden valitsin sekä tunnistin ja ohjausyksikkö, eli tietokone ja
käyttöohjelmisto (Ferraro ym. 2002). Kuva 20 antaa yhdenlaisen läpileikkauksen
laitteistoon.
Tutkimuksessa käytettiin Raman-spektrometriä (Kaiser Optical systems, RXN1-785,
Michigan, Yhdysvallat) ja valokuitukaapelilla varustettua PhAT-anturia. Laitteiston
säteilylähteenä toimiva laser asetettiin 200 mW teholle ja tuottamaan 785 nm
aallonpituudella olevaa säteilyä (kuva 21 ja 22). PhAT-anturi eroaa perinteisestä
anturista suuremman mittausalan takia (Kaiser Optical systems, haettu internetistä
21.2.2013). Normaalin Raman-spektrometrin lasersäteen koko on 2–500 µm, kun
taas mittauksissa käytetyssä PhAT-anturissa mittausalue on vakiona 6 mm (kuva
21). PhAT-anturin oikea mittausetäisyys 6 mm:n lasersäteelle on 25 cm, joka on
sama kuin anturin suojaputken pituus. Suurempi mittausalue antaa näytteestä
keskimääräisemmän kuvan, joka tasoittaa eri mittausten välisiä eroja varsinkin
liikkuvassa näytteessä. Säteen koko lisää tulosten toistettavuutta, mutta ei anna yhtä
tarkkaa kuvaa vaihtelusta (Kim ym. 2006). Lisäksi PhAT-anturin suurempi
mittausalue vähentää laserin aiheuttamaa paikallista lämmöntuottoa näytteeseen ja
täten näytteessä tapahtuvia mahdollisia muutoksia. Tämä on tärkeää erityisesti
mitattaessa aineita, jotka ovat lämmölle herkkiä.
60
Kuva 20. Raman-spektrometrin tärkeimmät osat (Ferraro ym. 2002).
61
6.4 Seokset ja niiden valmistus
Tutkimukseen valittiin kolme lääkeainetta: asetyylisalisyylihappo (ASA) (Sigma-
aldrich, Steinheim, Saksa), parasetamoli (PARA) (Sigma-aldrich, Steinheim, Saksa)
ja ibuprofeeni (IBU) (BASF, Ludwigshafen, Saksa) sekä kolme apuainetta
S/PH Langacher Greifensee, Sveitsi) ja sekoittamalla ne geometrisessä sarjassa.
Kuva 21. PhAT-anturin lasersäteen halkaisijaksi on asetettu 6 mm ja mittausetäisyys on säädetty 25 cm:iin. Vertailuksi FT-Ramanin mikroanturin halkaisijaltaan 2–5 µm (Haettu internetistä 21.3.2013 ja muokattu www.kosi.com)
Kuva 22. Raman-spektrometri kuituoptisella PhAT-mittapäällä ja ohjausyksikkö (Haettu inter-netistä 12.2.2013 www.kosi.com)
tunnusomaiset piikit ja kuva spektristä. Spektrit arvotettiin tunnistettavuuden mukaan
silmämääräisesti kolmeen luokkaan: huono, tyydyttävä ja hyvä. Arvotukseen vaikutti
pohjatason korkeus, piikkien korkeus pohjatasoon nähden, piikkien muoto sekä
piikkien lukumäärä.
y = 0,0056x - 0,0988 R² = 0,9995
y = 0,0244x + 0,0242 R² = 0,9997
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 100 200 300 400 500 600
Ab
so
rban
ssi
Laskennallinen pitoisuus mg/l
Asetyylisalisyylihappo
Salisyylihappo
68
7 TULOKSET
7.1 Lääkeainepitoisuuden kemialliset määritykset
Taulukossa 4 nähdään asetyylisalisyylihapon laskennalliset pitoisuudet sekä
asetyylisalisyylihappoa ja dikalsiumfosfaattia sisältävien näyteseoksien
spektrifotometrillä määritetyt pitoisuudet. Kuvissa 27 ja 28 on esitetty tulokset sekä
24 tuntia lämmitetyssä ja sekoituksessa olleille näytteille että neljä ja kahdeksan
tuntia pelkässä sekoituksessa olleille näytteille. Taulukossa 5 on esitetty
asetyylisalisyylihapon ja salisyylihapon laskennalliset ja mitatut pitoisuudet neljän ja
kahdeksan tunnin liuotuksen jälkeen. Laskennalliset pitoisuudet ylittyvät, kun
näyteseoksia on lämmitetty ja sekoitettu 24 tuntia. Pitoisuusylitykset olivat
suurimmassa osassa liuoksia 50–100 mg/l eli ne arvioitiin 2–6 % teoreettisia
pitoisuuksia vahvemmiksi. Ero korostuu, kun otetaan huomioon myös ASA:sta SA:ksi
muuttunut lääkeainemäärä. Uusituilla lyhemmillä mittauksilla näytteiden pitoisuudet
jäivät selvästi alle laskennallisten pitoisuuksien sekä neljän että kahdeksan tunnin
liuotuksilla (taulukko 5).
Taulukko 4. Asetyylisalisyylihappoa ja dikalsiumfosfaattia sisältävien seosnäytteiden teoreettiset ja kemiallisella analyysillä määritetyt pitoisuudet. Näytteitä liuotettiin 24 tuntia lämmityksessä ja sekoituksessa
Kuva 27. Asetyylisalisyylihapposeoksien kemiallisella analyysillä määritetyt pitoisuudet verrattuna laskennallisiin pitoisuuksiin.
Kuva 28. Salisyylihapon pitoisuus seosnäytteissä eri sekoitusolosuhteissa
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
Pito
isuu
s (
mg/l)
Teoreettinen pitoisuus (mg/l)
Näytteet ilmanlämmitystä 4-5hliuotuksen jälkeen
Näytteet ilmanlämmitystä 8hliuotuksen jälkeen
Teoreettinenpitoisuus
24h Lämmitetytnäytteet
0
50
100
150
200
250
300
350
0 10 20 30 40 50
Sa
lisyylih
ap
on
pito
isu
us (
mg
/l)
Asetyylisalisyylihapon pitoisuus (%)
24 tunnialämmityksessä
4-5 tuntia ilmanlämmitystä
8 tuntia ilmanlämmitystä
70
Taulukko 5. Asetyylisalisyylihappoa ja dikalsiumfosfaattia sisältävien seosten lääkeainepitoisuudet laskennallisesti ja kemiallisen analyysin avulla määritettynä. Näytteitä sekoitettiin liuotuksen aikana ilman lämmitystä neljä ja kahdeksan tuntia.
Kuvassa 29 on eri sekoituskäytännöillä tehtyjen spektrofotometrimittausten
pyyhkäisyspektrit tutkitulta aallonpituusalueelta. Pyyhkäisyspektrit osoittavat, että 24
tunnin sekoituksen aikana matalia pitoisuuksia asetyylisalisyylihappoa sisältävät
näytteet hajoavat salisyylihapoksi ja peittävät asetyylisalisyylihapon aallonpituuden
alleen. Ainoastaan vahvimmalla 1000,2 mg/l pitoisuudella sekoitettujen ASA-
näytteiden spektrit vaikuttavat luotettavilta. 100,2 mg/l pitoisuuden 24 tunnin
sekoituksen kohdalla täytyy jo miettiä, kuinka paljon SA:n piikki vaikuttaa ASA:n
tulokseen.
71
Kuva 29. Liuotettavan ASA:n määrän ja hydrolysoitumisen vaikutukset spektrofotometrin spektriin eri sekoitusajoilla, kun liuotustilavuus pysyy samana. Kunkin näytteen laimennettu ASA pitoisuus oli spektrofotometrimittauksissa noin 100 mg/l.
Taulukko 10. Parasetamolin ja laktoosin esikäsittelyn vaikutukset yhden ja kuuden sekunnin mittauksissa. dydx: ensimmäisen asteen derivaatta esikäsittely, SNV: standardi normaali variaatti esikäsittely, MSC: multiplikatiivinen sirontakorjaus esikäsittely, SG: Savitzky-Golay esikäsittely
Parasetamoli ja laktoosi 5–95 %
malli ennuste ennuste (q2≥0,93)
Yhden sekunnin sarjat RMSEE RMSEE RMSEP Vaikuttavat aaltoluvut Komp. määrä
mallissa
Mallista poistetut pisteet
Ennustuspisteet q2-
summa
Ilman käsittelyä 8,67 10,50 5,91 391;651;797;858;1168;1237;1324;1370;1609;1648 2 100 5,15,30,45,80,85 0,964
* Käsittelyssä enemmän komponentteja kuin q2≥0,93 määritys ohjaisi
87
7.4 Spektrimuutokset siirryttäessä puhdasaineesta
seokseen
Suurimmat erot yksittäisten spektrien välillä syntyvät, kun siirrytään puhdasaineesta
seoksiin. Erityisesti spektrin pohjataso saattaa laskea tai nousta huomattavasti tässä
siirtymässä (kuva 32). Ibuprofeenin ja laktoosin tapauksessa seoksissa korostuu
laktoosin aiheuttama pohjatason nouseminen. Siirryttäessä puhtaasta laktoosista
seokseen, jossa on 95 % laktoosia ja 5 % ibuprofeenia, laskee pohjan intensiteetti
1000–1500 yksikköä käsittelemättömällä datalla. Puhtaan ibuprofeenin pohjataso on
matalalla ja siirryttäessä seokseen, jossa on 95 % ibuprofeenia ja 5 % laktoosia, se
ei nouse yhtä paljon, kuin se laski siirryttäessä puhtaasta laktoosista seokseen. 95 %
ibuprofeeniseoksen piikit ovat kuitenkin vastaavia puhdasaineen piikkejä
korkeammat (kuva 32).
Esikäsittelyillä, kuten MSC (kuva 33 ja 35), saadaan pohjatasoja yhtenäistettyä, ja
erot on helpompi havaita. Silmämääräisesti spektrejä tutkittaessa siirtymä puhtaasta
laktoosista seokseen on helpompi havaita kuin siirtyminen puhtaasta ibuprofeenista
seokseen. Tämä johtuu laktoosin pienien pitoisuuksien vähäisestä piikkien
muodostuksesta. Selkeimmin ibuprofeenin osuuden aiheuttamat muutokset piikkeihin
ovat havaittavissa aallonpituuksilla 1185 ja 1210 MSC-käsitellyssä datassa (kuva
33). Muissa kohdissa spektriä puhdasaineet ja niitä lähinnä olevien seosten spektrit
muistuttavat liian paljon toisiaan eron havaitsemiseksi pelkällä spektrin visuaalisella
tulkinnalla. MSC-käsittely saa ibuprofeenin puhdasainespektrin piikit 1185 ja 1210
aaltoluvuilla seoksia korkeammiksi. Laktoosin aiheuttama fluoresenssi haittaa myös
pienten laktoosimäärien havaitsemista. Pitoisuushavainnointeja ei voi kuitenkaan
tehdä luotettavasti yksittäisen piikin perusteella. Tietokonepohjaisesti tutkittaessa,
kaikki pitoisuudet huomioon otettaessa ja vertailtaessa koko spektrin alaa
käsittelemätön data antoikin selkeästi paremman ennustettavuuden ibuprofeenin ja
laktoosin seoksille (taulukko 7). Ibuprofeenin ja mannitolin seoksissa, joissa
kumpikaan ei aiheuta puhdasaineina korkeaa pohjatasoa, piikit tulevat selvemmin
esiin spektristä (kuva 34 ja 35). Tälläkin seoksella mannitolin pienet määrät on
vaikeampi havaita kuin ibuprofeenin. Suurimman osalla aaltolukualueesta 100 % ja
90 % ibuprofeenin spektrit kulkivat päällekkäin ja seokset aiheuttavat suuremmat
piikit kuin puhdasaineet (kuva 34). Tietokonepohjaisissa pitoisuusmäärityksissä
88
tehdyissä tutkimuksissa MSC-käsittely antoi vähemmillä komponenteilla saman
ennustettavuuden kuin käsittelemätön data (taulukko 8).
Kuva 32. Ibuprofeenin ja laktoosin puhdasaineiden sekä 5 %, 50 % ja 95 % ibuprofeenia sisältävien seoksien käsittelemättömät spektrit yhden sekunnin kuvausajalla. Spektristä on otettu tarkasteluun 850–1250 aaltolukualueella cm-1.
Kuva 33. Ibuprofeenin ja laktoosin seokset 0 %, 5 %, 50 %, 95 % ja 100 % ibuprofeenin osuudella. Spektrit MSC-käsitelty aaltolukualueella 860–1240.
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
12000
13000
14000
15000
850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250
Inte
nsiteett
i
Aaltoluku (cm-1)
550951000
89
Kuva 34. Ibuprofeenin ja mannitolin puhdasaineiden ja seoksien spektrit 10 %, 50 % ja 90 % ibuprofeenin osuudella. Spektrit aaltolukualueella 800–1050.
Kuva 12. Ibuprofeenin ja mannitolin puhdasaineiden ja 10 %, 50 % ja 90 % ibuprofeenia sisältävät MSC-käsitellyt spektrit.
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
800 850 900 950 1000 1050
Inte
nsiteett
i
Aaltoluku (cm-1)
10
50
90
100
0
90
7.5 Raman-spektrikirjasto
Spektrikirjastoon kerättiin 41 eri ainetta (liitetaulukko 1). Mittaukset tehtiin pääasiassa
yhden ja kuuden sekunnin mittausajoilla. Mitatuista aineista 21:llä oli matala
pohjataso, ja 20 aineista fluoresoi, joista 12 voimakkaasti. Spektreistä 23 oli
silmämääräisesti helposti tunnistettavia ja ne saivat arvon hyvä, kymmenen oli
tyydyttävästi tunnistettavissa ja kahdeksan huonosti. Eniten referenssispektrejä löytyi
parasetamolille (6), asetyylisalisyylihapolle (4), salisyylihapolle (4) ja propranololille
(4). Yhteensä 26 aineelle löytyi jonkinlainen referenssispektri aikaisemmin
julkaistuista tutkimuksista. Suurin osa tässä työssä tutkituista spektreistä oli
muodoltaan samanlaisia tai melkein samanlaisia kuin muissa tutkimuksissa
esiintyneet spektrit. Joissain tapauksissa referenssispektrien tulkintoja hankaloittivat
artikkelien erilaiset spektrien asettelut. Artikkelien säteilylähteiden tehot vaihtelivat
0,6 ja 1000 mW:n välillä ja käytetyt aallonpituudet 514 ja 1064 nm:n välillä.
Artikkelien Raman-järjestelmät perustuivat myös eri Raman-tekniikoihin, mikä saattoi
vaikuttaa spektrien muotoon ja tulkittavuuteen.
Artikkeleissa esiintyneet parasetamolin spektrit olivat hyvin lähellä tutkimuksen
mittaustuloksia. Piikkien intensiteetti vaihteli jonkin verran, mutta ne olivat hyvin
tunnistettavissa. Samoin asetyylisalisyylihapon spektrit olivat hyvin tai melko hyvin
tunnistettavissa samanlaisiksi tämän tutkimuksen mittauksen kanssa. Nikotiiniamidin
kohdalla löytyi sekä tämän tutkimuksen spektriä tukeva artikkeli, että sen spektristä
osittain eroavia artikkeleita (Kumar ym. 2010, Ramanlingman ym. 2010, Rajesh ym.
2012). Kaikki sulfaniiliamidit olivat joko hyvin hankalia tai mahdottomia tunnistaa
referenssiartikkelin perusteella (Sutherland ym. 1990). Spektrien tulkintaa
hankaloittivat artikkelin erilaiset spektrin mittakaava-asettelut ja omassa
tutkimuksessa esiintynyt voimakas sulfametasiinin fluoresointi. Mikrokiteisen
selluloosan tulkintaa haittasi voimakas fluoresenssi ja erilainen asettelu kuin
artikkeleissa (Widjaja ja Seah 2008, Maltas ym. 2013). Propranololin osalta
hankaloittava tekijä oli sen eri isomeerit. Artikkeleissa oli käytetty
peilikuvaisomeereistä potentimpaa propranolin S-muotoa, jonka spektri eroaa
raseemisen seoksen spektristä piikkien intensiteetin osalta sekä ylimääräisellä piikillä
aaltoluvulla 200 (kuva 36). Kuvasta on hyvä huomata kuitenkin, että isomeerit ja
raseeminen seos on mitattu eri Raman-tekniikoilla. Verrattaessa tutkimuksen spektriä
91
raseemiseen referenssispektriin oli tunnistettavuus parempi. Tutkimuksessa oli
mukana kahden eri valmistajan parasetamolia. Mittaukset antoivat niille hyvin
samanlaiset spektrit, mutta pohjataso mittauksissa oli jostain syystä erilainen (kuva
26).
Kuva 13. Propranololin isomeerien ja raseemisen seoksen Raman-spektrit (Bodoki ym. 2012)
Kuva 14. Kahden eri valmistajan syntetisoiman parasetamolin Raman-spektri.
Carbopoli 974P NF CC76NAB668 1,6 osittain Tyydyttävä Noveon 492,828,10821318,1452,1659
(pyöreät matalat piikit korkea pohja)
Hydroksietyyliselluloosa 282553988 1,6 on Huono Fluka Ei tunnuspiikkejä
Ibuprofeeni IB1M485 1,6 ei Hyvä BASF corp X 636,745,833,1180,1206,1607
Kalsiumfosfaatti-dihydraatti pHEur B10941A 1,6,12 ei Tyydyttävä Emcopress
premium
389,415,587,896,983,1087,1127
Kalsiumsilikaatti 1344-95-2 1,6,30 osittain Tyydyttävä Huber 966,1350,1411
Klooripropamidi 031H0722 1,6 ei Hyvä Sigma 259,625,754,911,1084,1159,1587
Klotrimatsoli BCBB5668 1,6 ei Hyvä Sigma 266,317,446,620,659,1001,1033,1079,1156,1585
111
Kofeiini (vedetön) 81612 1,6 ei Hyvä Cheminent X 482,554,642,740,1327
Laktoosi Pharmatose 90M pH.Eur 10407255 1,3,6 osittain Hyvä DFE Pharma X 356,361,382,475,850,875,1085,1119,1140,1260,
Magnesiumkloridi 8xH2O 12341983420
5143 1,6 osittain Huono Fluka
572,1000,1583(Ei selkeitä vahvoja piikkejä)
Magnesiumstearaatti pH Eur 15883 1,2,3,4,
6,1AdVp osittain Hyvä
X 1062,1129,1295,1436,1456
Maissitärkkelys 129K0076V 1,6 Osittain Tyydyttävä Sigma-
Aldrich
477,865,937,1049,1079,1125,1335,1457
Mannitoli D (-) K262 1,6 ei Hyvä Prolabo X 475,875,1036,1132
Mefenaamihappo 055K1555 1,6 on Huono Sigma X 621,772,807,1037,1159,1243,1332(ei selkeitä
tunnistepiikkejä)
Methocel® MC 2864831289 1,6 on Huono Fluka 937,1095,1358,1446(ei selkeitä tunnistepiikkejä)
Mikrokiteinen selluloosa 50M pH.Eur 5S8571 1,3,6 on Huono EMCOCEL X 1091 (ei kunnollisia piikkejä)
Mikrokiteinen selluloosa 90M pH.Eur 9S1191 1,3,6 on Huono EMCOCEL X 1092 (ei kunnollisia piikkejä) isoin piikki
Mikrokiteinen selluloosa PH101
pH.Eur 60935C 1,3,6Vp on Huono Avicel
X 1092 (ei kunnollisia piikkejä)
Nikotiiniamidi 1380397 1,6 ei Hyvä Fluka X 385,785,1041,1596
Nitrofurantoiini 067K0737 1,6 on Hyvä Sigma X 1017,1169,1247,1348,1378,1492,1609
112
Parasetamoli 1005402-
2002 1,3,6 ei Hyvä Oriola
X 390,651,797,857,1168,1237,1324,1370,1609,1647
Polyetyleeniglykoli 044K0092 1,6 ei Hyvä Sigma X 277,361,533,843,(858),1061,(1124),1140,1231,1279,147
9
Polyvinyylipyrrolidoni BCBb7859 1,6 ei Hyvä Fluka 752,850,933,1018,1226,1424,1670
Propranololi HCL 95.334 1,6 ei Hyvä S.I.M.S X 488,736,760,1385,1443,1578
Pyratsiinikarboksamidi 068K1129 1,6 ei Hyvä Sigma 413,806,1024,1052,1453,1524,1577
Salisyyliamidi S51885-358 1,6 ei Hyvä Sigma-
Aldrich
X 562,746,1039,1125,1143,1166,1246,1432,1622
Salisyylihappo 097K3401 1,6 ei Hyvä Sigma-
Aldrich
X 451,566,772,1030,1153,1247,1323,1634
Sukroosi 40K0201 1,6 Osittain Hyvä Sigma X 401,524,548,639,849,920,1037,1124,1237,1461
Sulfadiatsiini 027k2064 1,3,6 ei Hyvä Sigma X 285,544,633,824,847,993,1097,1149,1598
Sulfameratsiini 068K1130 1,6 ei Hyvä Sigma X 546,633,819,838,998,1093,1151,1594
Sulfametasiini 118K0898 1,3,6 on Tyydyttävä Sigma X 577,635,823,840,996,1088,1142,1593
Sulfametoksatsoli 048K0124 1,6 on Tyydyttävä Sigma 291,544,687,830,924,1092,1142,1156,1507,1592
Sulfaniiliamidi 126K001 1,3,6 on Tyydyttävä Sigma X 296,561,633,819,840,897,1090,1134,1155,1593
113
Teofylliini vedetön 057K0691 1,6 ei Hyvä Sigma X 445,502,554,666,926,968,1248,1285,1314,1425,1663,17
04
Tiosalisyylihappo 106K3671 1,6 on Huono Sigma 801,1043,1121,1307,1562,1585(1043 piikki kunnollinen)
Tolbutamidi 058K1071 1,6 ei Hyvä Sigma 290,634,796,811,881,1093,1147,1159,1599
Trikalsiumfosfaatti 605044 1,6 ei Tyydyttävä Prolabo X 426,586,961 (ainoastaan 961 voimakas piikki.)
TriNatriumfosfaatti-dodekahydraatti A326478133 1,6 on Tyydyttävä Merck X 408,544,939,1000
*R: Aineelle löytyy kirjallisuudesta verrattava Ramanspektri
Liitetaulukko 3. Asetyylisalisyylihapon standardiliuosten valmistus kantaliuoksesta, suluissa laimennokseen käytetty pitoisuus ja lisätyn tislatun veden määrä.
Liitetaulukko 4. Salisyylihapon standardiliuosten valmistus kantaliuoksesta, suluissa laimennokseen käytetty pitoisuus ja lisätyn tislatun veden määrä.
Standardi SA 0 SA 1 SA 2 SA 3 SA 4 SA 5
Pitoisuus 5,038 mg/l l
37,785 mg/l
50,38 mg/l
75,57 mg/l
100,76 mg/l
151,14 mg/l
Laimennosohje 1ml
(50,38mg/l) + 9ml
5ml (151,14mg/l)
+ 15ml
1ml (1007,6mg/l)
+ 19ml
5ml (151,14mg/l)
+ 5ml
1ml (1007,6mg/l)
+ 9ml
3ml (1007,6mg/l)
+17 ml
Liitetaulukko 4. Kantaliuoksen valmistaminen asetyylisalisyylihapon ja dikalsiumfosfaatin seoksista ja laimentaminen edelleen spektrofotometrillä mitattaviksi näytteiksi