MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO SECRETARIA DE EDUCAÇÃO PROFISSIONAL E TECNOLÓGICA INSTITUTO FEDERAL GOIANO CAMPUS URUTAÍ Curso Superior de Bacharelado em Agronomia Acadêmico: Adriano Martins Barbosa Professor: Milton Luíz da Paz Lima Manejo de solos orgânicos visando redução da colonização interna de plantas de tomate por Salmonella enterica serovarTyphimurium GU, G., CEVALLOS-CEVALLOS, J. M., VALLAD, G. E., AND VAN BRUGGEN, A. H.C. Organically managed soils reduce internal colonization of tomato plants by Salmonella enterica serovar Typhimurium. Phytopathology 103:381-388. 2013.
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Seminários em Fitopatologia II - Aluno Adriano Martins Barbosa
Gu, G., Cevallos-Cevallos, J. M., Vallad, G. E., and van Bruggen, A. H. C. 2013. Organically managed soils reduce internal colonization of tomato plants by Salmonella enterica serovar Typhimurium. Phytopathology 103:381-388.
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
SECRETARIA DE EDUCAÇÃO PROFISSIONAL E TECNOLÓGICA
INSTITUTO FEDERAL GOIANO CAMPUS URUTAÍ
Curso Superior de Bacharelado em Agronomia
Acadêmico: Adriano Martins Barbosa
Professor: Milton Luíz da Paz Lima
Manejo de solos orgânicos visando redução da
colonização interna de plantas de tomate por
Salmonella enterica serovarTyphimurium
GU, G., CEVALLOS-CEVALLOS, J. M., VALLAD, G. E., AND VAN BRUGGEN, A. H.C. Organically managed soils reduceinternal colonization of tomato plants by Salmonella enterica serovar Typhimurium. Phytopathology 103:381-388.2013.
INTRODUÇÃO
• Frutas e legumes frescos cada vez mais reconhecidos como
veículos para a transmissão de patógenos entéricos humano
(salmonelose);
• Contaminação desde campos de produção até durante o
processamento;
• Salmonella enterica pode contaminar brotos, folhas, frutos
e sementes de uma gama de espécies de plantas;
• Produção vegetal orgânica tem sido sugerido com maior
risco de contaminação com patógenos entéricos do que em
produção convencional;
• Uso de esterco compostado ou resíduos de jardim para manter a
fertilidade do solo: possível via de contaminação.
• Mudanças na qualidade do solo afetam a fisiologia vegetal e,
possivelmente, a resistência à colonização por microrganismos;
• Plantas podem explorar consórcios microbianos do solo para se
protegerem contra infeccções;
• Indicações a respeito da correlação negativa entre populações de
enteropatogenos e diversidade microbiana em adubo, solo e
plantas.
INTRODUÇÃO
OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi investigar a colonizaçãointerna e transmissão por sementes de S. enterica ser.Typhimurium em plantas de tomate, e a avaliação do efeitodo tipo de manejo do solo em comunidades bacterianasendofíticas, persistência interna e translocação deSalmonella spp. nas plantas.
MATERIAL E MÉTODOS
Cepas bacterianas e preparação da planta
• Culturas bacterianas armazenadas em meio de Luria-Bertani (LB)
contendo 25% de glicerol a -80 °C;
• Sementes de tomate (Solanum lycopersicum 'Florida Lanai'),
desinfectadas, semeadas em mistura de envasamento;
• Mudas transplantadas em vasos, e água aplicada em um intervalo de 2
dias;
• Fertilização semanal com 8 g de Kow® para solo orgânico e 150 ml
de solução Hoagland® para o solo convencional;
• Temperatura oscilou entre 23 e 33 °C, com temperatura média de 28
°C.
Configuração experimental
• Experimento principal de duas fases, realizado duas vezes (1º em 2009
e experimento 2º em 2010);
• 126 plantas de tomate divididas em sete blocos e em cada bloco, nove
plantas cultivadas em solo e os outros nove em solo orgânico;
• Seis das nove plantas inoculadas aleatoriamente com S. enterica ser.
Typhimurium MAE110 ou MAE119, e as outras três plantas por bloco
mergulhadas em SDW;
• Cada ano, 84 plantas de tomate cultivadas em solo convencional ou
orgânicos (42 plantas cada), inoculados duas a quatro vezes, antes de
frutificação com cepas de S. entérica ser. Typhimurium, e 42 plantas
cultivadas no mesmos solos foram tratados com SDW como controle.
MATERIAL E MÉTODOS
• Segunda fase: extraiu-se sementes a partir de frutos contaminados e
não contaminados na primeira geração e semeadas em substrato
(experimento 1, com 135 sementes) ou convencional do solo
(Experimento 2, com 130 sementes);
• Detectar a possível contaminação da segunda geração plantas;
• Experimento adicional realizado para confirmar o efeito do manejo do
solo na sobrevivência interna de Salmonella spp. em folhas de tomate.
• 16 mudas de tomate plantadas aleatoriamente em quatro vasos com
solos convencional e orgânico, inoculados com Salmonella MAE110 (4
plantas por tratamento) e 4 vasos com SDW como controle.
MATERIAIS E MÉTODOS
Coleta do solo e análise
• Experimentos 1, 2 e 3: solos convencionais e orgânicos coletados a
partir de locais de manejo intensivo em diversas culturas;
• Vegetais cultivados organicamente por 5 anos e esterco de galinha
compostado foi aplicado 4 meses antes colheita;
• Nas fazendas convencionais, as culturas foram cultivadas com
fertilizantes, fungicidas, inseticidas e aplicação do herbicida;
• Duas sub-amostras (500 g) das amostras de solo coletadas foram
enviadas para análises laboratoriais.
MATERIAIS E MÉTODOS
Inoculação foliar das plantas de tomateiro com S. enterica
Typhimurium
• Imersão três folhas em cada um dos dois ramos, por planta, em 15 ml de
suspensão de Salmonella sp. (109 UFC/ml) com 0,025% de Silwet L-77
por 30 s.
• As plantas de controle inoculados com a mesma quantidade de SDW
com 0,025% de Silwet L-77;
• Plantas de tomate inoculadas nas semanas 5 e 10 no experimento 1 e nas
semanas 5, 8, 9 e 10 no experimento 2;
• Experimento 3: três folhas em cada um dos quatro ramos, por planta,
mergulhados em suspensão de Salmonella sp. (109 UFC/ml) com 0,025%
de Silwet L-77 durante 30 s, oito semanas após a semeadura da semente.
MATERIAIS E MÉTODOS
Amostragem de folhas e procedimento de teste
• Folhas inoculadas e não inoculadas amostradas 14 dias após a
inoculação no experimento 1;
• Experimento 2: 3 horas e 1, 3, 5, 7, 14, 21 e 30 dias após as
inoculações;
• Experimento 3: 1, 3, 5, 7, 14, 21 e 30 dias após a inoculação das quatro
plantas de cada tratamento. Mesmos número de folhas para as plantas do
controle;
• Retirados discos de 12 mm com um furador de cortiça estéril a partir
do meio de cada folha inoculada;
• Números de colônias de S. enterica ser. Typhimurium em cada placa de
Petri foi determinada pela contagem de UFC verde fluorescente usando
uma lâmpada UV.
MATERIAIS E MÉTODOS
Observações microscópicas
•Amostras observadas em microscópio de varredura a laser;
•Ao todo, 40 cortes de tecido foram examinados por amostra:
total 40 × 3 × 8 = 960 seções para folhas inoculadas e 960 seções
para folhas não inoculadas;
• Trinta seções por amostra de tronco foram examinados: total
30 × 8 = 240 seções;
• Cortes de tecido foram analisados com um comprimento de
onda de excitação de 488 nm e um filtro de emissão BA505-525
(GFP).
MATERIAIS E MÉTODOS
Extração de DNA, reação em cadeia da polimerase e
desnaturação eletroforese em gel gradiente
• DNA extraído a partir de 0,1 g de tecidos desinfectados das plantas,
usando um kit de isolamento de DNA PowerPlant®;
• Amostras submetidas a 16S rDNA polimerase reação em cadeia
(PCR) utilizando primers 799F e1492R;
• Produtos de PCR foram submetidos a eletroforese num gel de
agarose a 1%;
• Após a eletroforese, os géis foram corados durante 30 min com
SYBR GOLD® gel de ácido nucleico;
• As bandas foram visualizadas por Molecular Imager Gel Doc XR
System®.
MATERIAIS E MÉTODOS
Amostragem de frutas e procedimento de teste
• Frutos de tomate foram colhidos, desinfestados, cortado verticalmente
em metades e colocado por 1 min em LB agar contendo canamicina a
50 μg/ml.
• Quantidade de colônias foi determinada por contagem de UFC verde
fluorescente utilizando uma lâmpada de UV.
Extração das sementes e detecção
• Retirada da sementes por escavação da polpa do fruto de tomate.
• Sementes desinfestadas e secas, moídas e incubadas em caldo LB
(canamicina 50 μg/mL) a 37 °C durante 24 h.
• Salmonella sp. foi confirmada sob a luz UV.
MATERIAIS E MÉTODOS
Medição do peso seco das plantas
• Após a colheita, todos os frutos de tomate da primeira fase do
experimento 2, foram mensurados os pesos da parte aérea seca.
Segunda geração de amostras de tecido de plantas e a
detecção
• Experimento 1: 61 sementes de frutos contaminados e 74 sementes de
sem inoculação foram plantadas em substrato; Experimento 2: 100
sementes contaminadas e 30 sementes sem inoculação foram plantadas m
solo convencional;
• Mudas foram transplantadas novamente em substrato e cresceu para a
maturidade;
• Fruitos foram verificados se havia presença de Salmonella spp. como
descrito nos testes anteriores.
MATERIAIS E MÉTODOS
Análises estatísticas
• Taxa estimada dos parâmetros foram submetidos à análise de variância
(ANOVA) incluindo o termo de interação;
• Como não houve interação significativa, o efeitos do tipo de manejo
do solo na sobrevivência de Salmonella spp. nas folhas inoculadas
foram avaliados por meio de análise multivariada de variância
(MANOVA);
• ANOVA, MANOVA e testes t foram realizados utilizando programa
de comparação de médias SAS;
• Os testes χ2 e Q' foram realizados em Microsoft Excel.
MATERIAIS E MÉTODOS
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Testes de interação
• Não houve efeito significativo de interação entre morfotipo
Salmonella e manejo do solo na diminuição das taxas de Salmonella
Typhimurium em folhas inoculadas;
• Não houve efeito significativo da interação entre morfotipo
Salmonella e tipo de manejo do solo sobre o número de plantas com
e sem inoculação das folhas, número de frutos e de plantas com
frutas com presença da bacteria;
• Os valores de P para os testes do Q‘ que determinam essas
interações foram de 0,72, 0,67, e 0,64, respectivamente.
Tabela 1. Salmonella enterica ser. Typhimurium (dados da combinação de cepas
MAE110 e MAE119) em contaminação em plantas de tomate nos dois experimentos
principais.
w - Plantas com folhas adjacentes não inoculadas contaminadas internamente para folíolos inoculados, conforme determinado após
enriquecimento de Salmonella spp. em suspensão de folhas. Contaminação dos frutos foi alta o suficiente para que o enriquecimento
não fosse necessário.
x - Nove de nove frutas em uma planta.
y - Número igual de solos orgânicos e convencionais.
z - Cinco de seis frutas em uma planta e duas de sete frutas na outra planta.
Experimento, tratamento
Número de plantas
internamente contaminadas/
total de plantas (w)
Número de plantas com fruta
contaminada/ total de plantas
Número de frutas
contaminadas/ total de plantas
1
Plantas inoculadas em solo
convencional... 1/42 9/270(x)
Plantas inoculadas em solo
orgânico... 0/42 0/270
Controle - Plantas controle em
solo orgânico ou convencional
(y)
... 0/42 0/270
2
Plantas inoculadas em solo
convencional5/42 2/42 7/250(z)
Plantas inoculadas em solo
orgânico3/42 0/42 0/250
Controle - Plantas controle em
solo orgânico ou convencional0/42 0/42 0/250
Fig. 1. Tendências de sobrevivência de Salmonella enterica Typhimurium em folhas de tomate inoculadas. Silwet L-77 foi usado
0,025% de suspensão de inoculo, um tanto mais baixa que a concentração utilizada pelos agricultores em aplicações de pesticidas
(≈0.10%). A. Diminuição da S. enterica Typhimurium na primeira fase do experimento 2 (dados de cepas MAE MAE 110 e 119 foram
aglomeradas); B. Diminuição da S. enterica Typhimurium tensão MAE 110 no experimento 3. Porg e Pcon - curva de regressão prevista
com base no modelo de decaimento exponencial com assíntota para a sobrevivência de Salmonella spp. em plantas de tomate cultivadas
em solos orgânicos e convencionais, respectivamente.
Sobrevivência de S. enterica ser. Typhimurium em plantas de
tomate
Tabela 2 - Estimativas dos parâmetros para o declínio exponencial da concentração de
Salmonella enterica ser. Typhimurium em folhas de tomate depois de um período de 30
dias(y).
y - A = assíntota e R = taxa de declínio. Letras indicam diferenças significativas (P = 0,05) entre tratamentos dentro de cada uma dos
experimentos.
Z - número do experimento e tipo de manejo do solo.
Experimento, solo (z) A (log [CFU/g]) R (dia–1)
2
Solo convencional 3.826 +- 0.129 a 0.039 +- 0.023 a
Solo orgânico 2.071 +- 1.715 b 0.168 +- 0.059 b
3
Solo convencional 3.877 +- 0.229 a 0.044 +- 0.043 a
Solo orgânico 0.027 +- 1.012 b 0.219 +- 0.059 b
Tabela 3 - Impacto do manejo convencional e orgânico de fazenda na taxa de declínio de Salmonella
enterica Typhimurium em folhas de tomate, as propriedades do solo e diversidade e riqueza de
comunidades bacterianas endofíticas em experimentos 2 e 3, e os coeficientes de correlação entre as
taxas de declínio de Salmonella spp. e as propriedades solo e comunidade bacteriana (v).
v - Propriedades do solo: NH3, nitrogênio; NOx, os óxidos de nitrogênio; P, fósforo; K, potássio; Ca, cálcio; Mg, magnésio; e OM, a
matéria orgânica do solo (%). Coeficiente significativo de correlação (α <0,05) entre os níveis de nutrientes, teor de matéria orgânica ou
diversidade bacteriana ea taxa de declínio de Salmonella spp. são mostradas em negrito.
w - C1 a C3, solos provenientes de diferentes fazendas convencionais; O1 a O3, solos coletados em diferentes fazendas orgânicas.
x - Taxa de declínio de Salmonella spp. (log [UFC / g] / dia) foi medida através do ajuste dos dados observados (como na Figura 1) a um
modelo de decaimento exponencial com assíntota. y - Diversidade da comunidade bacteriana endofítica antes da inoculação.
z - Riqueza da comunidade bacteriana endofítica antes da inoculação.
Propriedades da amostra de solo e correlação com
persistência interna de S. enterica ser. Typhimurium em folhas
de tomate
Tabela 3 - Impacto do manejo convencional e orgânico de fazenda na taxa de declínio de Salmonella
enterica ser. Typhimurium em folhas de tomate, as propriedades do solo e diversidade e riqueza de
comunidades bacterianas endofíticas em experimentos 2 e 3, e os coeficientes de correlação entre as
taxas de declínio de Salmonella spp. e as propriedades solo e comunidade bacteriana (v).
v - Propriedades do solo: NH3, nitrogênio; NOx, os óxidos de nitrogênio; P, fósforo; K, potássio; Ca, cálcio; Mg, magnésio; e OM, a
matéria orgânica do solo (%). Coeficiente significativo de correlação (α <0,05) entre os níveis de nutrientes, teor de matéria orgânica ou
diversidade bacteriana ea taxa de declínio de Salmonella spp. são mostradas em negrito.
w - C1 a C3, solos provenientes de diferentes fazendas convencionais; O1 a O3, solos coletados em diferentes fazendas orgânicas.
x - Taxa de declínio de Salmonella spp. (log [UFC / g] / dia) foi medida através do ajuste dos dados observados (como na Figura 1) a um
modelo de decaimento exponencial com assíntota. y - Diversidade da comunidade bacteriana endofítica antes da inoculação.
z - Riqueza da comunidade bacteriana endofítica antes da inoculação.
Comunidades bacterianas endofíticas em plantas de tomate
cultivadas em solos convencionais e orgânicas
Figura 2. Fruto de tomate e sementes contaminadas com Salmonella enterica Typhimurium. A, Fruto contaminado cortado; B,
Colónias de Salmonella recuperado a partit do fruto mostrado em A em placas de Luria-Bertani com canamicina; C e D,
Contaminação internadas sementes de tomate quando germinadas em ágar rico em carbono com ≈1,000 ppm C (55).
Contaminação do fruto e da semente de plantas de tomate
cultivadas em solo convencional
CONCLUSÕES
• S. enterica Typhimurium pode atingir não apenas frutos de
tomate, mas também sementes via inoculação da folha, embora
a possibilidade seja baixa;
•A colonização interna de Salmonella spp. em folhas de
tomate foi afetada pelo tipo de manejo do solo;
• Células de Salmonella foram encontradas nas células do
floema no caule de plantas cultivadas convencionalmente mas
não naquelas cultivadas organicamente;
• Ca é conhecido por resultar em paredes celulares mais
resistentes e melhor função da membrana;
1. Abbasi P. A., Al-Dahmani J., Sahin F., Hoitink H. A. J., and Miller, S.
A. 2002. Effect of compost amendments on disease severity and yield of
tomato in conventional and organic production systems. Plant Dis.. 86:156
161
Alali, W. Q., Thakur, S., Berghaus, R. D., Martin, M. P., and Gebreyes, W.
2. A. 2010. Prevalence and distribution of Salmonella in organic and