Seminario t.b final

María Alejandra Maya Roldan

Johan H. Muñoz Ríos

2015

INTRODUCTION

Pentose phosphate pathway

PPP

Glycolisis

ENZIME: RELATION

Ribulose 5 phosphate

Ribose 5 phosphate R5Pi

AHumans

BT. brucei

Atracttive drug tagger

ENZIME

Ribose 5 phosphate isomerase (Rpi) catalyzes the interconversion: ribulose 5 phosphate (Ru5P) ribose 5 phosphate (R5P).

Transformation from group aldose to ketose.

Transition to the non oxidative branch of the PPP

The reaction mechanism involves an initial opening of furanose ring of R5P, followed by the aldolase-ketose isomerization, via a cis-enediolate high energy intermediate.

Trypanosoma

Trypanosomatides protozoa.

Monophyletic group of unicellular protist parasites.

Different species infect vertebrates causing trypanosomiasis.

Trypanosoma

Transmitted by invertebrates such as biting insects, or penetrate the skin.

Complex life cycle.

Has a variety of different ways in the invertebrate host, and guests vertebrate cells take a form feature called trypomastigote

Trypanosoma brucei

Kingdom: Protist

Phylum: Euglenozoa

Class: Kinetoplastea

Order: Trypanosomatid

Genus: Trypanosome

Species: T. brucei

Trypanosoma brucei

Causes African trypanosomiasis (sleeping sickness)

Subspecies:

T. b. gambiense…chronic tripanosomiasis slow start.

T. b. rhodesiense,… tripanosomiasis quick start.T. b. brucei,… African (or nagana) animal

trypanosomiasis.

unusual features

• Only large mitochondria with mitochondrial DNA condensed structure, in association with the basal body of the flagellum, unusually constitutes the mechanism of cell cytoskeleton organization

• Unique and remarkable cover variant surface glycoprotein (VSG) in order to avoid the host immune system

Due to the large difference between these two hosts, the

cell undergoes complex changes to facilitate survival in the insect gut and blood of

mammals.

VECTOR

Trypanosoma brucei

OBJECTIVE

Investigate the importance

of RpiB in T. brucei bloodstream

form viability and infectivity.

MATERIALES Y MÉTODOS

Declaración éticaInvestgación

IBMC.INEB

Parlamento europeo

Acreditación de la dirección veterinaria

portuguesa

CULTIVO

Cultivo Conjunto de técnicas

Mantenimiento, supervivencia, diferenciación, crecimiento y

función.

Preservando sus propiedades

Fisiológicas

Químicas

Genéticas

Med

io d

e cu

ltivo

Sustrato

Nutrientes

Condiciones abiótica

Mantenimiento, supervivencia,

diferenciación, crecimiento y función.

T.Brucei Lister 247

Procíclica

F. Sangre

MEM- Pros

HMI-9

FELOMICINA

PCR

PC

R

Amplificación directa de un gen o fragmento de

DNA o indirecta de RNA

Enzimas

De 20-40 ciclos

Pasos: Desnaturalización, alineamiento y síntesis

Se obtuvieron los genes de R5Pi DNA genómico

Producto:

* Aislación

* Purificación

* Clonación

* Secuenciación

DNA Recombinante

Molécula de DNA artificial que proviene de la unión de DNA = origen.

Se emplea para la producción de proteínas.

Qué se necesita:

1. DNA donador

2. DNA receptor

3. Enzimas de restricción.

4. Ligasas

UNA VEZ OBTENIDO EL DNA RECOMBINANTESE INSERTA EN UNA BACTERIA PARA LA

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE

Ensayo enzimáticoEnsayo enzimático

Actividad, inhibición y cinética enzimática

Curva

La reacción de equilibrio

Rapidez de formación del producto o desaparición del sustrato

Hay 2 tipos

Continuos

Discontinuos

Km de R5P

Km de Ru5P

Mecanismo de inhibición del 4_PEH

InmunofluoresenciaIn

mun

oflu

ores

enci

a

Técnica inmunoquímica con marcador de

fluorocromo

Utiliza reacción Ag-Ac

Puede ser de 2 tipos:

Directa

Indirecta

Encontrar dónde se encontrabaLa R5Pi :

DAPI………DNA Aldolasa…..Glicosoma R5Pi………citoplasma

Permeabilización con Digitonina

Digitonina

Digitalis purpurea

Detergente

Ataca el colesterol

Permeabiliza las membranas

cells.

F. s

angr

e

Permeabilización

con Dig.

Acceder a contenidos

citoplasmáticos de las cells.

Sobrenadante se midió por W.B:

*Enolasa

*Aldolasa

*R5Pi

Transgénicos

También llamados OMG.Organismo vivo creado a partir de la

manipulación de sus genes.

MEJORAR CONDICIONES

TécnicaAislar

segmentos de DNA .

Introducir éste en el material

hereditario de otro.

Ejemplo

Creación

Cells con RNAi

Cells con complementación

funcional

T.brucei

T.cruze

Northern Blot

Reconocimiento de secuencias específicas de RNA

¿Cómo se realiza?

1.Aislar RNA

2.Electroforesis.

3.Fijación a medio sólido.

4. Hibridación.

5. Separación.

6. Autoradiográfia

RNA presente en la Forma sanguínea

Western Blot

Identificación de proteínas.

¿Cómo se hace?

1. Electroforesis (SDS/PAGE)

2. Transferencia al filtro con Ac.

3. Identificación de proteínas

Cuantificación proteínas

Parásitos en sangre

Proteína recombinante

RESULTS

Figura 1

Figura 2

Figura 2

Figura 3

Figura 4

DISCUSSIONAUTHOR CONCLUSION AGREE DISAGREE

Stern Al Et al

TbRpiB has the ability of using bothe R5P or Ru5P as subtrates, but with remarkable preference for Rub5P

.Jensen BC

Et alThe levels of TbRPIB mRNA in logarithic phase procyclic forms

compared to bloodstream forms are higher.

X.Colasante C

Et alMake a proteomic analysis that failed to

find TbRpiB enzime in purified glycosomes.

.Ong HB

Et al TbRpiB is not the fist protein reported

as dispensable under estandar laboratory culture condictions but crucial for parasities growth in tHe animal host.

.

.

CONCLUSIONS

Is very important Identify and know the metabolics pathways, its enzymes or obligatory steps to use as pharmacological targets.

To study the importance of an enzyme, we have to make a lot of techniques to identify its action, origin, cinetic profile, location, concentration and the mechanism of inhibition

In the study is corraborated use of RpiB as a drug target. Consider non only the possiblity of using it against African sleeping sickness, but tuberculosis, a real affliction of our enviroment.

The odds must be open to new investigations, searching for that drug target in multiple pathological agents.

para

BIBLIOGRAFÍA

Martinez Sanchez, Lina Maria. Biologia molecular.7.ed.Medellin: UPB. Fac.Medicina.

Castaño, María Eugenia. Cultivos celulares. Biogénesis, principios de la virología.