Seminario molecular 2013

Juliana Ceballos GiraldoJuan Felipe Giraldo Aristizabal

Tercer semestreUniversidad Pontificia Bolivariana

Introduction

• Congenital is any characteristic present at the moment of birth that was acquired inside the womb. It might be the result of genetic, physical, chemical or infectious factors.

• Neutrophil Defect Syndrome characterized by a severe defect in neutrophils, bone marrow fibrosis, nephromegaly and life-threatening infections.

Introduction

• VPS45 mutation is a mutation that causes Thr224Asn or Glu238Lys modification depending on the ethnicity.

• The mutation of the VPS45 gen causes a defect in the neutrophils that is expressed before the birth what makes this a congenital condition, affecting the innate immunity.

Objective

• The study was performed in 7 kids that had similar symptoms : neutropenia, neutrophil dysfunction, bone marrow fibrosis and renal extramedullary haematopoiesis, in order to describe the mechanism of this new disease.

• The mutation of the VSP45 gen causes multiple defects that affects not only the neutrophil cells but also the fibroblasts.

Materiales y Métodos

Pacientes:

Estudio realizado en 7 niños. 4 familias palestinas y 1 marroquí. Presencia de síntomas anteriormente mencionados. Los padres firmaron consentimiento informado.

Materiales y Métodos

Polimorfismo de nucleótido simple (SNP):

La genotipicación de los SNP se realizó en ADN genómico con el uso del HumanOmniExpress DNA Analysis Bead-Chip.

Los SNPs fueron analizados mediante el uso del software GenomeStudio.

Materiales y Métodos

Secuenciación:

Se utilizó un método de hibridación en solución de captura de exones.

Las variantes del VPS45 fueron examinados por medio de secuenciación didesoxi, con cebadores que cubren el exón 7 y su región intrónica de acompañamiento.

Materiales y Métodos

Estudios celulares

Fibroblastos cultivados de biopsias del antebrazo de niños afectados.

Comparación con fibroblastos de adultos normales.

Materiales y Métodos

Transfección:

Transfección de los fibroblastos de los pacientes y de control con un vector pCMV6 con un plásmido Myc-DDK.

Su eficiencia fue de un 70%

Materiales y Métodos

Función neutrófila:

En neutrófilos aislados de sangre heparinizada se probó la producción de superoxido y H2O2.

También se realizó un análisis de las subunidades de la NADPH-oxidasa y la quimiotaxis.

Materiales y Métodos

Citometría:

Muestras de sangre periférica de pacientes y controles.

Fueron incubadas con anticuerpos anti-CD45 PerCP y anti-CD29 FTC.

Los linfocitos, granulocitos y monocitos fueron separados.

La expresión de ambos marcadores fue medida con citometría de flujo.

Materiales y Métodos

Estudios en el pez cebra:

Se microinyectó morfolinos de genes específicos en los sacos vitelinos de los embriones de pez cebra de la raza Ekkwill.

Los embriones se incubaron a 28°C en medio de embrión E3 por 24 horas post-fertilización.

Se realizó hibridación in situ con ribosondas y tinción con Negro Sudán B.

Fundamentos

Secuenciación:

Se utilizan desoxirribonucleótidos para terminar las cadenas y detener la elongación.

Como "molde" se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN que se va a secuenciar.

 Como "cebador" para iniciar la síntesis, se necesita un corto oligonucleótido complementario del extremo de la cadena.

Fundamentos

Desoxinucleótidos de las cuatro bases: dAMP, dTMP, dGMP, dCMP. 

Didesoxinucleótidos de una base en cada una de las cuatro reacciones de secuenciación. Al añadir la ADN-polimerasa, comienza la polimerización en el cebador, pero cesa el incorporarse un didesoxinucleótido. 

En el estudio se utilizó para examinar las variaciones del gen VPS45 que causan los defectos.

Fundamentos

Transfección:

Consiste en la introducción de material genético externo en células eucariotas mediante plásmidos, vectores víricos u otras herramientas para la transferencia.

Fosfato de Calcio, una solución salina tamponada con HEPES y que contiene iones fosfato se combina con una solución de cloruro de calcio que contiene el DNA a transfectar.

Fundamentos

Se forma un precipitado, quedando el DNA en su superficie.

Esta suspensión se añade a las células que se quieren transfectar.

En el estudio se utiliza para ingresar a los cultivos de fibroblastos el ADN complementario mediante los vectores pCMV6.

Fundamentos

Citometría:

Se analiza La dispersión y difracción de la luz que ocurre cuando se la hace pasar por una suspensión de células.

Se analiza el tamaño y la complejidad de estas.

Fundamentos

Las células se pueden poner en presencia de anticuerpos monoclonales marcados con moléculas fluorescentes, se pueden evaluar que células poseen los antígenos complementarios a los anticuerpos monoclonales usados.

En el estudio se utiliza para ver la expresión de los marcadores en la superficie celular en respuesta a los anticuerpos añadidos a las muestras de sangre.

Resultados

Los padres de las cinco familias fueron clínicamente sanosExámenes realizados en padres y hermanos, dieron resultados normales.

Figura 1

Resultados

En el estudio, algunos pacientes presentaron hematopoyesis extramedular.

Figura 1

Resultados

Hipercelularidad.Distorsión del tejido hematopoyético .Prominente fibrosis reticular.Fibrosis en todas las biopsias.

Figura 1

Resultados

Menor proporción de gránulos en los neutrófilos.

Mayor presencia de mitocondrias.

Aparato de Golgi y retículo endoplasmático más desarrollados.Figura 1

Resultados

Resultados

Expresión reducida de VPS45 en sangre y en fibroblastos de pacientes.

reducción de rabenosyn-5 y la sintaxina-16 (STX16)

Figura 2

Motilidad celular reducida en pacientes.

Fibroblastos recubiertos con fibronectina.

Figura 2

Resultados

Resultados

análisis de citometría de flujo para CD45 y β1 integrina La sangre del paciente tiene muchas menos células que son positivas para la integrina β1. Figura 2

Resultados

Presencia de apoptosis aumentada en fibroblastos de los pacientes

Figura 2

Resultados

Los niveles de las proteínas se restauran luego de la trasfección con un plásmido no mutado.

Figura 3

Resultados

Los fibroblastos transfectados tuvieron una motilidad mayor.

Figura 3

Resultados

La transfección con el vector de VPS45 no mutado reduce la apoptosis en un 50%.

Figura 3

Resultados

Figura 4

Conclusions

Progress in laboratory techniques and methods are

of great help in understanding molecular biology’s field and its importance in medicine, is of vital importance in explaining the mechanism by which certain diseases occur, in this case of congenital defect neutrophil syndrome associated with mutations in VPS45.

Conclusions

The use of these techniques are very useful in the clinic, as knowing exactly what is efective or mutated in patients with congenital defects in neutrophils, could eventually be given a better treatment.

Conclusions

The importance of understanding the molecular level of the diseases that have been around us troughout our lives is evident. The ability to achieve that specific level, will in the future recognize new methods of diagnosis and more effective treatments.

Conclusions

It's amazing to understand that the body is

completely perfect and that a minimum burst of normal functions, causes imbalance. For example neutrophil defects associated with VPS45 mutations cause a new immunodeficiency syndrome that involves deterioration in the function of neutrophils.

Discussion

Author Theory Yes or no

Malech HL One component of this system, the neutrophil, plays a particulary prominent role in the defense against bacterial and fungal infections.

Yes

Zucker- Franklin D Congenital neutropenia: and intrisic cell defect demonstrated by electron microscopy of soft agar colonies.

Yes

Discussion

Author Theory Yes or No

Kinchen JM One critical component of the endocytic pathway in neutrophils involves vacuolar sorting (VPS)

Yes

Rahajeng J Common and distinc roles for the binding partners Rabenosyn-5 and VPS45 in the regulation of endocytic trafficking in mammalian cells.

Yes

Mapa

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GRACIAS