Seminario de Histología 1UA de Histología, Embriología ......Algunas definiciones: Célula: es la mínima porción de materia que posee vida independiente. Tejido: es el conjunto

Seminario de Histología1UA de Histología, Embriología, Biología Celular y Genética

Técnicas Histológicas

Algunas definiciones:

Célula: es la mínima porción de materia que posee vida independiente.

Tejido: es el conjunto de las células y sus materiales extracelulares que contribuyen a cumplir una(s) función(es) común(es).

Órgano: es el conjunto de tejidos que comparten una forma y un grupo de funciones comunes y más o menos independientes.

Aparato: es el conjunto de órganos que contribuye a un grupo de funciones comunes.

Sistema: el es el conjunto de órganos que contribuye a un grupo de funciones comunes y se distribuye en todo el organismo.

Fibrae (fibra) Texturae (tejido) HISTOLOGÍA

Técnica Histológica

Técnica de rutina

Técnicas especiales

Como los tejidos animales contienen mucha agua, en cortes delgados, translúcidos, tienen poco contraste. Sólo se ven las estructuras que tienen color de por sí.

Hay que crear contraste donde no lo hay para poder distinguir estructuras.

Por eso se colorean los tejidos.

Pasos de la técnica histológica de rutina

1) Obtención de la muestra

2) Fijación

3) Inclusión:

a) Deshidratación

b) Aclaración

c) Inclusión propiamente dicha

4) Corte

5) Montaje preliminar

6) Coloración:

a) Aclaración

b) Rehidratación

c) Coloración propiamente dicha

7) Montaje final

a) Deshidratación

b) Aclaración

c) Montaje final propiamente dicho

Obtención de la muestra

Para observación mediata (post-mortem) = AUTOPSIA

Para observación inmediata (in vivo) = BIOPSIA

Puesto este órgano en un microscopio, ¿veríamos algo?... ¿lo atraviesa la luz?...

…entonces hay que seccionarlo en rebanadas delgadas, muy delgadas (5-10 milésimas de

milímetro)… para poder observarlo a trasluz con un microscopio…

Fijación

• Métodos de fijación• Físico: frío, calor

• Químico: paraformaldehído, formol, formalina, glutaraldehído.

• Inmersión

• Perfusión

Hay que indurar al órgano con sus tejidos, incluyéndolo en un material más duro que se pueda cortar más delgado

Inclusión

50% 70% 96% 100%

Post-fijación por inmersión

Deshidratación en concentraciones crecientes de ETANOL

Aclaración con XILOL

Etanol 100%XILOL

Inclusión

Distintos tipos de parafinas se funden (son líquidas) a 45º-58º…

…se sumerge la muestra de tejido en

parafina líquida…

…se incuba en estufa a 60º para que la parafina

impregne todo el tejido

Inclusión propiamente dicha

Moldes de inclusión

Taco de inclusión

Se obtiene un taco de inclusión, sólido, con el tejido incluido en parafina. El taco se talla y se pasa al…

Charles Sedgwick Minot (1852-1914)

Corte

¿Con qué se corta el taco de inclusión?...

…con un MICRÓTOMO

Corte

Micrótomo rotatorio tipo Minot

Taco

Platina

Taco

Cuchilla Tira de cortes Grosor: 5-10 μm

Montaje preliminar

Portaobjetos de vidrio Corte de tejido

Coloración

Aclaración (desparafinización) con XILOL

Rehidratación en concentraciones decrecientes de ETANOL

Coloración propiamente dicha HEMATOXILINA + virado + EOSINA

Deshidratación en concentraciones crecientes de ETANOL

Aclaración con XILOL

Montaje final propiamente dicho con Bálsamo de Canadá o similar

Montaje final

Corte sin colorear

Corte coloreado sólo con

EOSINA

Corte coloreado con

EOSINA y HEMATOXILINA

Acidofilia y Basofilia con H-E

Acidofilia y Basofilia con H-E

Técnica de rutina: HEHematoxilina Eosina

Colorante básico Colorante ácico

Azul metileno, azul toluidina,verde metilo, hematoxilina

Azul de anilina, naranja G, eosina, fucsina ácida

Tiñen componentes ácidos de la célula Tiñen componentes básicos de la célula

Permiten visualizar núcleos, polirribosomas.

Permiten visualizar componentes citoplasmáticos como organelas.

Los componentes celulares afines con este colorante se llaman BASOFILOS.

Los componentes celulares afines con este colorante se llaman ACIDOFILOS.

Resumiendo…

Pasos de la técnica histológica de rutina

1) Obtención de la muestra

2) Fijación

3) Inclusión:

a) Deshidratación

b) Aclaración

c) Inclusión propiamente dicha

4) Corte

5) Montaje preliminar

6) Coloración:

a) Aclaración

b) Rehidratación

c) Coloración propiamente dicha

7) Montaje final

a) Deshidratación

b) Aclaración

c) Montaje final propiamente dicho

CONCEPTOS

ORTOCROMASIA: es la capacidad que tienen los colorantes básicos o ácidos de mantener invariable su espectro de absorción electromagnética al formar uniones salinas o electrostáticas con los componentes celulares y extracelulares.

METACROMASIA: es la capacidad que tienen ciertos colorantes básicos o catiónicos derivados de las tiazinas de virar su espectro de absorción electromagnética al formar uniones salinas o electrostáticas con ciertos componentes celulares y extracelulares que son polímeros polianiónicos.

Colorantes metacromáticos: azul de metileno, azul de toluidina, violeta de metilo, azul de tionina, azur A

MetacromasiaEs una propiedad de los colorantes básicos derivados de las tiazinas (Azul de metileno; Azul de toluidina; Azur; Violeta de cresilo; Gallocianina)

Características del tejido: poseer polímeros polianiónicos (ej: heparina) que hacen “virar” el azul original del colorante a un púrpura-violáceo = metacromasia

Metacromasia (mastocitos; oreja de ratón)

H&E Azul de toluidina

Coloraciones tricrómicas:Tricrómico de Mallory (azul de anilina +

naranja G + fucsina ácida; todos ácidos; se desconoce el fundamento)

Frank Burr Mallory(1862-1941)

Cirrosis

Tricrómico de Mallory

Azul de Anilina + Naranja G + Fucsina ácida

Coloraciones tricrómicas:

Tricrómico de van Giesson (ácido pícrico + fucsina ácida + hematoxilina férrica de Weigert)

Tricrómico de Masson-Lillie (fucsina Ponceau + verde luz + hematoxilina de Mayer)

Tricrómico de Masson (fucsina Ponceau + azul de anilina + hematoxilina de Mayer)

Técnicas histoquímicas: Localización de polisacáridos Técnica de PAS (peryodic acid-Schiff)

1) El ácido peryódico (HIO4) oxida a los glúcidos (sobre grupos 1-2 glicol de las hexosas) y expone grupos aldehídos.

2) Los grupos aldehídos formados se ponen en evidencia por la unión del reactivo de Schiff (fucsina ácida decolorada por anhídrido sulfuroso)

H&E PAS

Células caliciformes

Técnicas histoquímicas: Localización de ADN

Técnica de Feulgen

1) Hidrólisis ácida débil con HCl que elimina bases purínicas del ADN (A y G) y expone grupos aldehído.

2) Los grupos aldehídos formados se ponen en evidencia por la unión del reactivo de Schiff (fucsina ácida decolorada por anhídrido sulfuroso)

Ácidos nucleicos (raíz de cebolla)

H&EFeulgen

Técnicas histoquímicas: Localización de lípidos

Nervio, mielina (OsO4)

Tinción por solubilidad diferencial (método físico, no químico)

Sudán III grasas (naranja)

Sudán IV (rojo escarlata) grasas neutras (rojo vivo), ést. de colest. (rosa)

Sudán negro B fosfolípidos

Aceite rojo O triacilglicéridos

Azul de Nilo fosfolípidos

Tetróxido de osmio (OsO4) mielina (marrón o negro)

Adipocitos (H&E) Adipocitos (Sudán rojo)

Glándula mamaria (OsO4-verde de metilo)

Técnicas histoquímicas: Localización de enzimas

Fosfatasa alcalina (bazo; técnica de Gomori)

Demostración de lectina PNA que se une a galactosil-N-acetilgalactosamina de glucoproteínas por reacción de la

peroxidasa-DAB (epitelio respiratorio)

Fundamento: localización de la reacción enzimática por demostración del lugar en el que se encuentra una enzima que transforma un sustrato en un producto; el producto, con un reactivo agregado, forma un compuesto insoluble y coloreado

Demostración de NADPH-diaforasa (deshidrogenasa; corteza frontal, neuronas nitrérgicas) (Boccoli, Loidl, López-Costa, Pistone Creydt, Ibarra, Goldstein (2008) Brain Res)

Técnicas de impregnación argéntica:

Depósito de sales de plata metálica

Método de del Río Hortega (microgliocito)

Método de Cajal para neurofibrillas (neurona)

Impregnación argéntica de Gomori para fibras reticulares (hígado)

Método de Golgi (neurona)

Técnica de de Olmos (amino-cupro-argéntica; neuronas en

degeneración)Aparato de Golgi (enterocitos)

Inmunohistoquímica:

Se basa en: la detección de reacciones antígeno-anticuerpo por medio de la marcación de los anticuerpos.

Sirve para: detectar sustancias (principalmente proteínas), muy específicamente, que pueden estar en muy bajas concentracioens en el tejido en estudio.

Métodos: existen dos grupos, el directo y el indirecto.

Tipos de anticuerpos: policlonales y monoclonales

Ludwig A. SternbergerAlbert H. Coons

(1912-1978)

Ac. con fluoresceína (1941) Técnica de PAP (1970)

César Milstein (1927-2002) Georges Köhler (1946-1995)

Ac. monoclonales (1975)

Inmunohistoquímica:

Inmunohistoquímica:

Nf-200 (neurona, c. frontal; Evrard, Duhalde-Vega, Tagliaferro, Mirochnic, Caltana,

Brusco (2006) Exp Neurol)

MTCO2, marcador demitocondrias humanas (glioblastoma humano)

Células en cultivo marcadas para actina, tubulina y núcleo

GluR4

(neurona glutamatérgica, hipocampo)

SMI 131(neurona, corteza motora)