Seminario CHIKV

Introduction

The human skin is a complex organ composed of multiple cell types, which plays a key role in the detection and defenseagainst pathogens.

Keratinocytes are the most abundant cells of this organ, are important because they play a key role in the detection and control of pathogens, their promotion by some virus (CHIKV) stimulates an intense antiviral program which differs from some other virus, that on the contrary are aimed these cells.

CHICUNGUNYA VIRUS

Vector

•Aedes albopictus

•Aedes aegypti

Virus

•Alphavirus with a positive sense single stranded RNA genome of about 11.6kb

Symptoms

•sudden onset

•biphasic fever

•strong joint pain or stiffness

•Rash (usually maculopapular)

•muscle pain,

•headache,

•fatigue

•nausea or vomiting

•iridocyclitis or uveitis

•retina lesions

QUERATINOCITOS

• Son las células predominantes de la epidermis (90% APROX)

¿QUE SON?

• Barrera contra daños ambientales (patógenos, perdida de calor, rayos UV, perdida de agua)

• Inductores de respuesta inmuneFUNCIÓN

Replicación viral

Relación

CHIKV the particles are endocytosed by

keratinocytes

Expression of non-structural proteins

CHIKV activates an innate immune

response in human keratinocytes

transcriptional induction of innate

antiviral genes upon CHIKV challenge

keratinocytes are unable to replicate

the virus

In these cells, expression of non-structural proteins

and synthesis of genomic RNA are

impaired

General Objective

Materiales y Metodos

Celulas

• Aedes albopictus

• Queratinocitos epidérmicos primarios

• HaCaT

• HEK293T

Virus

• pCHIKV-LR-3′GFP

• CHIKV(mCherry)

Anticuerpos y reactivos

• Inhibidores de BX795 y AG490

• C42 mAbs

• Anti-Rab5 mAbs

• Anti-mouse Ig

• Alexa 647-labeled

• Anti-human IFNα/β neutralizing serum

Materiales y Métodos

RT-PCR

Monitoriza la producción de nuevas

partículas virales

cuantifica ARN genómico viral en las

células

Examina la inducción transcripcional de genes antivirales

Amplificación enzimática de una secuencia de RNA


Inmunofluorescencia

la capacidad de CHIKV para ser endocitado por los

queratinocitos

detección de proteínas estructurales virales

Unión de anticuerpos a una sustancia fluorescente para demostrar la presencia de una molécula determinada


PCR en tiempo real

Cuantifica cantidad de ADN en la muestra

Producto de amplificación monitorizado conforme

avanza la reacción

Detecta de manera muy sensible los niveles de

ARNm

Detectar y cuantificar las secuencias especificas de ácidos nucleicos mediante

el uso de reporteros fluorescentes en la reacción


Transfección

Usada para infectar las células

Producción de pseudotipos virales

Permite la introducción de

material genético en las células

Primary and immortalized human keratinocytes are poorly permissive for

CHIKV replication

Células • NHEK

• HaCaT

• 293T

Proceso • Se uso GFP para el

control de la replicación

Tiempo • 24 horas

• 48 horas

ResultadosFigura 1A

CHIKV particles are endocyted by HaCaTcells

Células

• HaCaT.

Proceso

• Se incubaron con CHIKV. MOI=100

• Por 1hora a 37C.

Tinción

• Anti-capsidmAbs

• Alexa 647 marcado con aglutinina de germen de trigo (WGA)

ResultadosFigura 2A


Células HaCaT.

Sometidas a CHIKV por 10minutos

MOI=500

Para aumentar la probabilidad de detectar CHIKV en el citoplasma.

Micrografía

Presencia de partículas virales en el citoplasma.

Resultados Figura 2B

15% de antígenos asociados a CHIKV


Se evaluó

•En HaCaT

•La capacidad el CHIKV de colonizar endosomas Rab5

Qué se uso

•Antígenos específicos de proteínas de caspide : VERDE

•Antígeno Rab5: ROJO

Qué se obtuvo

•Presencia de gránulos amarillos/naranja.

•En el citoplasma expuesto a CHIKV por 30 minutos

Resultados Figura 2C

Resultados Figura 3A

Keratinocytes membranes support fusionwith CHIKV envelope glycoproteins

pCMV: Promotor de Citomegalovirus.

Transporta los genes E3/E2/E1. Codón optimizado del CHIKV.


EF1a: Factor de elongación junto con un potenciador.

Facilita los procesos de transcripción.

VSV-G (estomatosis vesicular)


pHR: péptido de señalización especifica.

Transportar el GFP (proteína verde fluorescente).

HIV: necesario para la incorporación de LTR Y VLPS.

VLPS (pseudoparticulas retrovirales).

LTR (reparación terminal larga)



Las células infectadas con CHIKV

liberaron pseudoparticulas de

100-120nm.

Presentaban una caspide crónica

característica del VIH1 maduro.

Pseudotipos de control: vectores que

codificaban la glicoproteína P del

VSV-G

ResultadosFigura 3B


Análisis de Western blot.

Lisis celular Proteínas retrovirales en

estado inmaduro

Células libres

Proteínas retrovirales que se dividieron de

manera eficaz en caspsidas maduras

Resultados Figura 3C

Env: glicoproteínas de envoltura


•VLPs de CHIKV y de VSV-G

•Células 293T y HaCaT

Incubación

•Demostrar la funcionalidad de los reactivos (VLPs).

Para •La capacidad de las

glicoproteínas virales de fusionarse con la membrana de las células

•Dirigieron la expresión de GFP

Se demostró

ResultadosFigura 3D

Expresión del plásmido reportero pHR-CMV-GFP

Analysis of early CHIKV replication eventsin human keratinocytes

Pasos de replicación del CHIKV en:

293T.

HaCaT.

MOI=10.

Por 9, 14 y 48 horas.

CHIKV

Se marco con mCherry (rojo) que marca proteínas no estructurales nsP3.

Se hizo QRT-PCR

Para evaluar la acumulación de CHIKV RNA en las células.

Por 6, 9 y 14 horas.


Resultados Figura 4B

HaCaT NO hay síntesis de CHIKV RNA

CHIKV replication in keratinocytes withperturbation of the IFN signalling

pathway

Células HaCaT.

Infectadas con siRNA.

Para IRF3 y IRF7.

Se incubo por 72 horas.

Prueba de western blot.


Discussion

PERSON WHAT HE SAID? YES NO

Beglin

Here, we report that CHIKV poorlyreplicates in cultures of primaryand immortalized keratinocytesand despite differentiation status of these cells may be crucial forinfection/replication of someviruses (e.g. human papillomavirus) CHIKV behaved independentlyfrom the maturation stage of keratinocytes used in this study.

✔

Discussion


Bernard

Despite internalizing viral particlesthat colocalized with Rab5-positive endosomal compartmentscompetent for CHIKV entry in permissive cells and while supportingfusion with viral membranes, keratinocytes are unable to replicatethe virus. In these cells, expression of non-structural proteins and synthesis of genomic RNA are impaired.

✔

Discussion


Surasombatpattana

keratinocytes were proposed as keyplayers of early arboviral infectioncapable to produce high levels of infectious viruses in the skin favoringviral dissemination to the entirebody.

✔

Discussion


Salvador

It is well known that alphavirusesdisplay a wide spectrum of target cells. Regarding CHIKV, a largevariety of in vitro susceptible cellshas been identified, includingfibroblasts, hepatocytes, neurons, astrocytes, microglial cells, neuroblastoma cells, skeletalmuscle progenitor cells, epithelialand endothelial cells

✔

Conclusions

keratinocytes represents a primary barrier againstinfection of CHIKV.

keratinocytes prevent the replication of CHIKV.

Keratinocytes membranes stimulate the fusion withCHIKV.

Other cells are permissive to replication and propagation of chikunguya such as kidney cells.

Seminario CHIKV

Health & Medicine

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