Selección de detectores en cromatografía de líquido … · cargas, permite el análisis de compuestos de muy ... •2,4,6 – Trinitrotolueno 10.59 eV •4-Nitrotolueno 9.5 eV

Selección de detectores en cromatografía de

líquido masas

Manuel Gayo

Responsable de Ventas Easy Choice

ACOPLAMIENTO DE DETECTORES DE ESPECTROMETRIA DE MASAS

Tiempo

Inte

nsi

dad

La identificación se basa en

• Tiempo de Retención

• Peso Molecular (nominal o “exacto”)

• Información Estructural

•MS/MSn : Relación específica entre Precursor y Fragmentos

(proporciona excelente información estructural)

Las Técnicas de Ionización API suelen proporcionar poca Fragmentación

[M-B] + [M+H]

+ [M-A]

+

A B

LC/MS proporciona :

Selectividad / Información Estructural

Full Scan CID MS/MS of m/z 359 using Ramped CID Voltage

136.8

146.7

160.7170.7 186.7196.7

212.8

222.8

236.9252.9

266.9

276.9

287.0

295.0

305.0

313.1

323.1

341.1

+MS/MS(359), 2.2-2.8min (#151-#171)

0.0

0.5

1.0

1.5

4x10

Intens.

100 150 200 250 300 350 m/z

Full Scan CID MS/MS of m/z 359 using Ramped CID Voltage

136.8

146.7

160.7170.7 186.7196.7

212.8

222.8

236.9252.9

266.9

276.9

287.0

295.0

305.0

313.1

323.1

341.1

+MS/MS(359), 2.2-2.8min (#151-#171)

0.0

0.5

1.0

1.5

4x10

Intens.

100 150 200 250 300 350 m/z

300 400 500 600 700 800 900 1000

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

110000

m/z-->

Abundance

603639

903

987

<- [M+NH ] 4

+

Triolein (C18:1,[cis]-9) MW 884.781 C57H104O6

Selectividad & M

Inform. Estructural

2.- Técnicas de ionización en LC/MS:

Aplicabilidad relativa de las técnicas de ionización

LC/MS

Pe

so

Mo

lec

ula

r

Polaridad del analito/

Solubilidad en Agua

API-

Electrospray

APCI 1000

100,000

10,000

no polar muy polar

GC/MS

API-Electrospray: • La técnica de ionización más suave.

• Ideal también para compuestos lábiles.

• Interfase con mayor sensibilidad y aplicabilidad.

• Válida para compuestos de baja-media a muy

alta polaridad que se puedan ionizar en solución.

• Mediante la formación de iones con múltiples

cargas, permite el análisis de compuestos de muy

elevado peso molecular.

APCI: • Válida para compuestos de baja a alta polaridad;

no se requiere que estén ionizados en solución.

• Requiere compuestos con una cierta volatilidad.

• Buena sensibilidad para compuestos de polaridad

y peso molecular intermedios.

• Técnica que complementa a API - Electrospray

para el análisis de analitos poco polares.

APPI: • Válida para compuestos de muy baja a alta polaridad;

no requiere que estén ionizados en solución.

• Requiere compuestos con una cierta volatilidad.

• Posibilita el análisis de compuestos apolares.

Las interfases LC/MS tipo API (Electrospray

/APCI) son hoy en día las más utilizadas

APPI

Fuente de ionización API Electrospray

Zona

SEPARACION

IONES

Zona

NEBULIZACION

E IONIZACION

Zona

FOCALIZACION

Zona

DETECCION

Cámara de

Nebulización a

Presión

Atmosférica

Nebulizador HPLC

+ + +

+

+

+ + + +

N2

N2

+

+ + +

Capilar

Zona de

FRAGMENTACION

(CID)

“Skimmers”

Octopolo

Lentes Cuadrupolo

N2

Dínodo de Alta

Energía (HED)

Electromultiplicador

(EM)

+

Gas de

secado

ESI

Zonas

Diseño Ortogonal de la Fuente de Iones API – Electrospray

Evaporación Límite

Rayleig

Alcanzado

Explosión

Coulomb

Iónes Analito

Desolvatado Evaporación

+

-

+ +

-

+

+

+ + +

+

+

+ + + +

- - -

- -

- +

+ +

+

+ + + +

+ + +

- - -

- - - +

+ +

+

+ + + +

+ +

+ - - -

- - -

+

+ + + +

+ + +

- - -

- -

+ + +

+ +

+

- - - -

+ + + +

+ + - - - -

+ +

+ + +

+ - -

-

-

+ + + +

+

+ - -

-

-

+

+ + + +

+ - - - -

+

+ + + +

+ - - -

+

+

+ + +

+

+

+ + + +

- - -

- -

- + + + + + +

+ +

+ + +

- -

- - - + + +

+

+ + + +

+ + +

- - -

- - -

+

+

+ + +

+ - -

- -

+

Iones Desolvatados

+

Gas de secado

(nitrógeno calentado)

Entrada Capilar

Dieléctrico

Disolvente

Nebulizado

Gas de

Nebulización

(N2)

-4.500 V (End Plate)

en un angulo de 90º con La punta del nebulizador está

respecto a la entrada del

NEBULIZADOR ORTOGONAL

capilar

+

+

+ +

+

+ + + + + + + + + + + + + + + +

HPLC

p.e. Vcap: -5,000 V (típico -1500 -6000)

0 V (nebulizador conectado a tierra)

muy conveniente para CE/MS

Mesh Assembly: -3500 V (atraerá cargas + a la superficie

de la gota)

Ejemplo con

Polaridad +

Iones en solución

N2

SECADO

La presencia de sales no volátiles dificultara considerablemente la eficiencia del proceso de desolvatación

Para óptima sensibilidad los analitos deben estar totalmente ionizados al pH del eluyente

+

+

+

+

+

+

+ +

+

+

Proceso APCI (Ionización Química)

Proceso APPI (Fotoionización)

Capilar MS

Capilar

Entrada

HPLC Nebulizador

Vaporizador

(calentador)

hv

Gas de

Secado

+ + + + + + +

Lámpara

Kripton

Se fotoioniza a un Agente

Dopante y éste actúa como gas

reactivo

Vapor

Evaporación

Aerosol que contiene

al analito

Iones de

Analito +

+

+ +

+

+ + + +

+ +

+

+

+

+

+

+

+ +

+

+

+

+

Fotones

ionizan al

analito (con

P.I.<10eV) +

+ + +

+

+

+ +

+

+

hv

hv

APPI

Lámpara PhotoMate

Kripton emite e- de 10.0 eV y 10.6 eV

Potenciales de Ionización (PI)

• 2,4,6 – Trinitrotolueno 10.59 eV

• 4-Nitrotolueno 9.5 eV

• Cafeina 8.0 eV

• Fluoranteno 7.8 eV

• Antraceno 7.4 eV

Potenciales de Ionización de

Disolventes (PI)

• Agua 12.61 eV

• Acetonitrilo 12.19 eV

• Metanol 10.85 eV

• Acetona 9.70 eV

• Tolueno 8.82 eV

Valores de Energía de Fotoionización

S

i se

io

niz

an

N

o s

e io

niz

an

Energia lámpara Kripton 10.0 eV, 10.6 eV

Fuentes APCI y APPI para el LC/MSD

Capilar

Entrada

HPLC Nebulizador

Vaporizador

(calentador)

h

Gas de

Secado

+ + + + + +

+

Lámpara

UV

APPI APCI

Capilar

Entrada

HPLC Nebulizador

Vaporizador

(calentador)

Gas de

Secado

+ + + + + +

+

Aguja

Corona

Doble Fuente con detección SIMULTÁNEA (real)

ESI+APCI. Agilent Technologies

Violeta Cristal Vitamina D3

Fuente Multimodo

Fuente ESI Fuente APCI

Fuente Multimodo

Fuente ESI

Fuente APCI

Violeta Cristal

Vitamina D3

Capillary

HPLC inlet

Nebulizer

Drying gas

Corona needle

ESI Zone

APCI Zone

Thermal container

IR emitters

Charging electrode

Reversing electrode

Sensor for vapor temperature

APCI counterelectrode

En la zona ESI se crea un aerosol cargado cuya

dirección es ortogonal a la entrada del capilar MS

El aerosol es secado por lámparas de IR (no

contracorriente de N2) produciendo los iones ESI

El aerosol y los iones pasan con el gas de nebulización

de la zona ESI a la zona APCI

Las lámparas IR vaporizan de modo completo a analito y

disolvente en la zona APCI

APCI corona se produce entre la aguja y el

contraelectrodo y el disolvente se ioniza

El disolvente ionizado transfiere carga al analito

vaporizado produciendo iones de analito

Los iones ESI pasan al lado contrario del separador y

son apartados de la zona de APCI corona

Un sensor controla la temperatura del vapor de forma

que las lámparas IR mantienen la temperatura constante

Finalmente los iones ESI y APCI entran

simultáneamente al capilar y al MS (US patent 6,646,257)

Fuente Multimodo

2.- Técnicas de Filtrado de Masas y Detección en LC/MS:

Q?

QqQ?

TRAP? TOF?

Qq-TOF?

Sector Magnético?

TOF-TOF?

???

SI ¿Sabemos lo que

Buscamos?

Necesitamos

masa exacta MATRIZ SUCIA?

No

Menor de 5 pg En columna? QQQ

No

Necesitamos

Qualifiers

Ions/Spectrum?

Si-spectrum

or MS/MS qualifiers

Trampa

No

SI

No

o Multi ion SIM

CONCENTRACIÓN?

Bbaja concentración

QQQ

SI

No

>1 ng en columna

No

Aceptable %RSD: >8%

No

SI

Q

SI

Necesitamos MS/MS?

No

Q

SI Trampa

MUESTRA

.

SI

QQQ Q

TOF

$$$> $$> $

CUANTITATIVO CUALITATIVO

SI

TOF

TOF

¿PERO QUÉ DETECTOR?

Filtro de Masas

del Cuadrupolo

Fuente de Ionización Externa

Detector

Modelo Conceptual de un Espectrómetro de Masas con Cuadrupolo

Emulación CUADRUPOLO

Resolución Espectral:

“baja”

Modelo Conceptual de Espectrómetros de Masas/Masas basados en Triple Cuadrupolos

Emulación CUADRUPOLO

Modalidad MRM

ideal para

Cuantificación de

Trazas de

“Compuestos Diana”

en matrices sucias

2 modalidades de trabajo:

- Product SCAN: “universal pero menos

sensible”. (Cinta en movimiento continuo). - SRM/MRM: muy sensible pero sólo

detecta unas pocas masas. (Cinta “fija”)

“MS/MS en el espacio”

Analizador de Masas

de Trampa de Iones

Paso 1 - Almacenamiento de Iones

Paso 2 - Eyección de los Iones

Ionización

Externa

• Iones de todas las m/z son almacenados

hasta el momento de la detección

Obtención Espectro

de MS1

Emulación TRAMPA

Resolución Espectral: “media”

Modelo Conceptual de un Espectrómetro de Masas

con Trampa de Iones Externa

Modelo Conceptual de un Espectrómetro de Masas de Tiempo de Vuelo (TOF)

Emulación TIEMPO DE VUELO

(TOF)

Tubo de vuelo del TOF:

Zona libre de campo eléctrico. Opcional: Reflectron (espejo de iones)

0 V

Analizador de Masas

de Tiempo de Vuelo (TOF)

Detección Iones

Ionización

Externa Campo Eléctrico

Pulsante

Resolución Espectral:

“alta”

Técnica “Pulsante”

1 amu

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Intens.

x106 807.00

807.50

807.92

808.60

[M+2H]2+

Δ=0.4

805 810 m/z

Comparación Resolución Espectral: TOF vs Trap & Quads

[M+4H]4+

100

323 324 325 326 327 328

20

40

60

80

324.85

325.10

325.36

m/z

Δ=0.25

Δ=0.26

1 amu

% A

bu

nd

ancia

Re

lativa

Tiempo de Vuelo (TOF)

[M+4H]4+

879.149

879.403 879.649

879.902

880.158

880.398

880.651

Δ=0.25

Iones con 4 cargas: Δm/z = 0.25

Δ=0.5

Iones con 2 cargas: Δm/z =0.5

Δ=0.5

[M+2H]2+

644 646 648 650 652

20

40

60

80

100 648.92

649.40

649.89

Δ=0.5

Resolución Espectral:

TOF > Trap > Q & QQQ

Trampa Iones (Trap) (modo máxima resolución)

Cuadrupolo (Q & QQQ)

1 amu

Analizador-Filtro de Masas: Cuadrupolo

ELECTRODOS NEGATIVOS

AMPLITUD AMPLITUD RF

-DC

-

0

+

( + ) FILTR0

MASAS

BAJAS

( -

) FI

LTR

O

MA

SA

S A

LTA

S

Los voltajes aplicados en ambos pares de

electrodos son iguales en magnitud pero de

signo opuesto. La magnitud del potencial

DC controla la masa seleccionada

ELECTRODOS POSITIVOS

- 0

+

AMPLITUD RF AMPLITUD +DC

FRECUENCIA RF

2 pares de electrodos Hiperbólicos

("rods") a los que se aplica una

componente de corriente alterna y

otra de continua de igual magnitud

pero de signo opuesto

20000

40000

60000

80000

100000

120000

MSD1 TIC, Scan

3.9

25

min 3 4 5 6 7

5000

10000

15000

20000

25000

30000

MSD2 TIC, SIM

2.9

55

3.1

56 6

.914

Adquisición SCAN “versus” SIM 25 pg de 3 sulfamidas (+250 pg de sulfaclorpiridazina) - CUADRUPOLO

Adquisición SCAN: • Proporciona información sobre

componentes inexperados de la

muestra, pero NO proporciona el

mismo nivel de sensibilidad que

el modo SIM

La pérdida de sensibilidad

en modo SIM, por dedicar el

50% del tiempo del ciclo a

adquirir en modo SCAN, es

solamente del 30% 25 pg 25 pg 25 pg

250 pg de compuesto INESPERADO

• La sensibilidad

mejorará en SCAN con la

reducción del rango de

masas seleccionado y en

SIM con la reducción del

nº de iones monitorizado Adquisición SIM:

Proporciona un nivel muy

elevado de sensibilidad, pero

NO da información sobre

componentes inesperados de

la muestra.

Menos Sensible en

modo Barrido que

las Trampas y QqTOF

parent ions enter

collision cell -

collide with

argon gas and

dissociate

Q1 is parked allowing

only parent ions

of a single m/z to pass

to the collision cell

Q3 is scanned

passing full

scan product

ion spectra to

the detector

ion guide

transports

+/- ions to Q1

+/- ions and

neutrals formed

in API source

API

Source

Detector

Triple Cuadrupolo: Barrido Completo MS/MS (MS2)

DIsociación (CID) en Celda Colisión

“MS/MS en el espacio”

Ideal para la Cuantificación

de Trazas de “Compuestos

Diana” en matrices sucias

(coeluciones)

Parent Ions Enter

Collision Cell -

Collide with

Ar Gas and

Dissociates

Q1 is Parked Allowing

Only Parent Ions

of a Single m/z to Pass

to the Collision Cell

Q3 is Parked Passing

Only Product Ions

of a Single m/z

to the Detector

Ion Guide

Transports

+/- Ions to Q1

+/- Ions and

Neutrals Formed

in API Source

API

Source

Detector

Triple Cuadrupolo (QqQ): ejemplo modalidad SRM (MRM sucesivos cambios en los iones producto seleccionados en Q3)

Energía de Fragmentación No Selectivaº

“MS/MS en el espacio”

MRM (Multiple Reaction Monitoring) para Cuantificar con

Máxima Sensibilidad y Selectividad

170 210 250 290

210

222

268 280 165

190 210

210

150 170 190 210

210 158

191

160

158

190

191

sin “fondo químico”

Cuadrupolo “3” (Q3) Filtro Masa: Cuadrupolo 1 (Q1) Celda Colisión

Espectro con

iones del “fondo” (API: ESI, APCI,…)

Q1 sólo deja

pasar el ión

“precursor”

210 pass

Celda Colisión

rompe el ión

210 (y sus

productos)

Q3 monitoriza

sólo los

fragmentos 158 y

191 característicos

del ión 210 para

cuantificar y

cualificar con máx.

sensibilidad

Modo MRM

Modo SCAN

Iones de varios compuestos coeluyentes

Trampas de Iones: Obtención Espectro MSn

Espectro de Masasn

(n=1-11)

(C.I.D.: Disociación Inducida por

Colisión (con helio) del ión precursor)

1-Acumulación

+

3-Excitación 3

6-Detección 6

5-Acumulación

de Fragmentos

5

4-Fragmentación

He

4 2

He

1

2-Aislamiento

Ión

Precursor

Espectro

MSn MS/MSMS/…

La energía de

Fragmentación se aplica

selectivamente. Sólo la

recibe el Ión Precursor o

rango de iones que interese

fragmentar

En una Trampa el proceso de transmisión de Iones

de “Fuente a Detector” es un proceso discontinuo

Acumulación

Detección: MS1

385 352 241 187

MS MS2 MS3 MS4

Agilent 1100 LC/MSD-Trap

Diagrama3D de MS4 de un Péptido, M 384 g/mol

MS1

MS2 (385)

MS4 (385/352/241)

MS3 (385/352)

MS4 (385/352/241)

Fundamentos del TOF ó Tiempo de Vuelo (“Time-of-Flight”)

Acelerar con la misma energía a los iones procedentes de la fuente Los iones de distinta masa adquieran distintas velocidades y

lleguen al detector con distintos “tiempos de vuelo” (menor masa mayor velocidad)

E = - m v 2

2

1 v =

m 2E

t = Long.

m 2E

2(30000) =

1.0

50200

= 91 µsec

Fuente

Iones Zona libre de campo eléctrico.

Opcional: Reflectron (espejo de iones)

Detector

Tiempo 30 kV 0 V

Técnica pulsante con un intervalo típico de generación de pulsos de 100 µseg. (10.000 pulsos/s)

Tiempos Vuelo típicos (vuelo 2m): m/z - µseg.: 118 = 20µs. 622 = 46µs. 3000 =100µs.

Resoluciones en el rango de ppm’s requerirán la medición del tiempo de vuelo con una precisión mejor de 1 nanosegundo

Masa Exacta Requiere una Elevada Resolución Espectral

921.5 922.0 922.5 923.0 923.5 924.0 924.5 m/z, amu

0.00

1000.00

2000.00

3000.00

4000.00

5000.00

6000.00

7000.00

8000.00

9000.00

1.00e4

1.10e4

1.20e4

1.30e4

Inte

nsity

, counts

922.0092

923.0121

0.087

Resolución = M/ΔM

922/0.087 = 10.600

Resolución Espectral:

> 4.000 a masas bajas >10.000 a partir de masas medias

R=13.500

m/z 2722 2724

m/z 118 119 120

R=4.700

m/z = 922

m/z = 2.722

m/z = 118

La elevada resolución espectral proporcionada por los TOF’s

(superior a Trampas y Cuadrupolos) permitirá obtener “masa exacta”

mediante la adición en continuo de algunos compuestos como

referencia interna para m/z.

TOFs

La Importancia de disponer de “Masa Exacta” para “centrar” la búsqueda: Al aumentar la Exactitud de la masa analizada se reducen muy considerablemente el nº

de posibles composiciones elementales que pueden dar la masa en cuestión.

• En moléculas pequeñas el poder determinar el peso molecular con la

tercera cifra decimal permite típicamente definir una fórmula empírica

inequívoca.

Exactitud Masa (u.m.a)

5.687

10

100

1000

1

0,1 0,05 0,01 0,005 0,001 0,0005 0,0001

176

386

882

1347

1672

5687

P.M.

882

176

386

1347

1672

Nº

Po

sib

les

Fó

rmu

las

Em

pír

ica

s

QUADs

RESUMEN: Ventajas del acoplamiento LCMS

• Operación robusta

• Identificación y confirmación

• Sensibilidad y Especificidad

• Facilidad de Uso

• Tecnología asequible

Si hubiera tenido un

LCMS hubiera sabido lo

que era esto antes de

tomármelo