SEKOLAH PASCASARJANA FAKULTAS MIPA UNIVERSITAS …

Karakterisasi dan Bioaktivitas Antikanker Metabolit Sekunder

Spons Cinachyrella australiensis dan Cinachyrella sp. Dari Perairan Spermonde Sulawesi Selatan

Characterization and Secondary Metabolite’s Anticancer Bioactivity of the Sponge Cinachyrella australiensis and Cinachyrella sp.

from Spermonde Archipelago, South Sulawesi

ABRAHAM RAHMAN

P0700314403

SEKOLAH PASCASARJANA FAKULTAS MIPA

UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR

2018

Karakterisasi dan Bioaktivitas Antikanker Metabolit Sekunder

Spons Cinachyrella australiensis dan Cinachyrella sp. Dari Perairan Spermonde Sulawesi Selatan

Disertasi Sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar Doktor

Program Studi S3 Ilmu Kimia

Disusun dan diajukan oleh

ABRAHAM RAHMAN P0700314403

Kepada

Sekolah Pascasarjana Fakultas MIPA Universitas Hasanuddin

Makassar

2018

KATA PENGANTAR

Syukur Alhamdulillah penulis panjatkan kehadirat Allah Swt., atas

Rahmat dan KaruniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian

dan penyusunan Disertasi ini, sebagai salah satu syarat dalam

menyelesaikan pendidikan S3 pada Program Studi Doktor Ilmu Kimia di

Universitas Hasanuddin Makassar.

Dalam proses penelitian dan penyusunan Disertasi ini, penulis banyak

menemukan kesulitan, kendala, rintangan, dan hambatan. Berkat bantuan

dari berbagai pihak maka pada akhirnya penulis dapat menyelesaikannya.

Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis menyampaikan terima kasih

dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada :

1. Ibu Prof. Dr. Nunuk Hariani Soekamto, MS. sebagai promotor, Ibu Dr.

Hasnah Natsir, M.Si. sebagai Kopromotor, Bapak Prof. Dr. Yana

Maolana Syah, MS. sebagai Kopromotor atas keihlasannya

meluangkan waktu dalam memberikan saran, koreksi, bimbingan

selama penelitian dan penulisan Disertasi ini.

2. Bapak. Prof. Dr. rer.nat Muharram, M.Si., Bapak Prof. Ahyar Ahmad,

Bapak Dr. Firdaus, MS., Ibu Dr. Paulina Taba, M. Phil., Ibu Dr.

Seniwati Dali, MS. sebagai penguji/penilai yang banyak memberrikan

petunjuk dan saran untuk penyempurnaan Disertasi ini.

3. Kementrian Riset, Teknologi dan Pendidikan Tinggi atas bantuan

Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri 2014 dan Hibah

Penelitian Disertasi Doktor 2017.

4. Rektor Universitas Halu Oleo Kendari yang telah memberikan

kesempatan mengikuti program S3.

5. Rektor Universitas Hasanuddin Makassar, Dekan Sekolah

Pascasarjana Unhas, Dekan FMIPA Unhas, Ketua Program Studi Ilmu

Kimia Sekolah Pascasarjana FMIPA Unhas beserta seluruh staf atas

dukungan yang diberikan dalam jenjang pendidikan Doktor.

6. Kepala Lab. Kimia Organik FMIPA Unhas, Kepala Lab. Fitokimia

Fakultas Farmasi Unhas, Kepala Lab. Bioarganik dan Organik Sintesis

FMIPA ITB Bandung, Kepala Lab. Kimia Organik Bahan Alam ITB

Bandung beserta seluruh staf atas dukungan fasilitas laboratorium

selama pelaksanaan penelitian.

7. Kepala Lab. Spektroskopi Massa dan NMR FMIPA ITB Bandung atas

bantuan pengukuran NMR dan HRMS isolat senyawa, Kepala Lab.

Anatomi dan Biologi Sel FKU Unpad Bandung khususnya bapak dr.

Andri Rezano, M.Kes., Ph.D. atas pengukuran aktivitas in vitro isolat

senyawa pada sel HeLa, Kepala Pusat Penelitian Oseanografi LIPI

Jakarta Utara khususnya bapak Tri Aryo Hadi, MSi. atas identifikasi

sampel spons.

8. Rekan-rekan mahasiswa selama penelitian di Lab. Kimia Organik

Unhas, di Lab. Bioarganik dan Organik Sintesis ITB, dan di Lab. Kimia

Organik Bahan Alam ITB mulai dari program S1, S2, dan S3 atas

bantuan dan kerjasamanya.

9. Ayahanda Andi Abd. Rahman Nusu dan Ibunda Andi Sitti Hamidah

tercinta, Adik-adikku tersayang dr. Suhartini Rahman SPOG., Dr. Andi

Abubakar Rahman, SIP., MSi., Andi Mulia Rahman, SP., MP. yang

senantiasa memberikan motivasi, doa, dan dukungannya.

10. Istriku tercinta Halijah, Am.Keb., SKM. atas segala doa, dukungan

dan pengorbanannya, Anak-anakku tersayang Andi Ramlah Avianti,

Andi Muhammad Said, Andi Nurismi Rahmani atas pengertiannya

selama penulis menempuh pendidikan doktor.

11. Semua pihak yang telah membantu penulis dan tidak sempat disebut

satu persatu.

Semoga Allah Swt. menerimanya sebagai amal ibadah atas semua

bantuan yang telah diberikan kepada penulis. Semoga hasil Disertasi ini

dapat memberi manfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan

khususnya pada ilmu kimia dan bidang kesehatan, Amin.

Makassar, 02 Juli 2018

Penulis

Abraham Rahman

ABSTRAK

ABRAHAM RAHMAN. Karakterisasi dan Bioaktivitas Antikanker Metabolit Sekunder Spons Cinachyrella australiensis dan Cinachyrella sp. dari Perairan Spermonde Sulawesi Selatan (dibimbing oleh Nunuk Hariani Soekamto, Hasnah Natsir, dan Yana Maolana Syah). Isolasi senyawa metabolit sekunder dari spons C. australiensis dan Cinachyrella sp. yang dikumpulkan dari perairan Spermonde Sulawesi Selatan telah dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi metabolit sekunder, dan mengungkap potensi bioaktivitasnya terhadap sel HeLa. Metode karakterisasi yang digunakan dalam penelitian adalah spektroskopi NMR dan HRMS. Bioaktivitas senyawa antikanker diketahui melalui uji sitotoksik dan antiproliferasi terhadap sel line kanker serviks. Berdasarkan hasil karakterisasi, senyawa yang diperoleh adalah guneribol [1]; 3-hidroksi-3-metil-2-indolinon [2]; 3-karbonitril indol [3]; asam -3-(4-hidroksi fenil) propanoat [4]; 4-hidroksi benzonitril [5]; asam-4-metil benzoat [6]. Senyawa-senyawa tersebut baru pertama kali ditemukan pada spons genus Cinachyrella. Hasil uji bioaktivitas menunjukkan bahwa senyawa 1, 2, 3, dan 6 memiliki aktivitas antikanker terhadap sel HeLa dengan nilai IC50 masing-masing 9,89; 6,42; 9,32 dan 5,45 ppm, sedangkan senyawa 4 dan 5 dengan nilai IC50 masing-masing 12,98 dan 20,63 ppm tidak aktif terhadap sel HeLa. Kata kunci : Cinachyrella, guneribol, 3-hidroksi-3-metil-2-indolinon,

3-karbonitril indol, asam-3-(4-hidroksi fenil) propanoat, 4-hidroksi benzonitril, asam-4-metil benzoat, sel line kanker serviks.

ABSTRACT

Abraham, Characterization and Secondary Metabolite’s Anticancer Bioactivity of the Sponge Cinachyrella australiensis and Cinachyrella sp. from Spermonde Archipelago, South Sulawesi (supervised by Nunuk Hariani Soekamto, Hasnah Natsir, and Yana Maolana Syah). Isolation of secondary metabolites of C. australiensis and Cinachyrella sp. obtained from Spermonde Archypelago, South Sulawesi has been done. This research aims to characterize secondary metabolites, and reveal their potential bioactivity as anticancer toward HeLa cells. The characterization methods of secondary metabolites used in the study were NMR and HRMS spectroscopy. The bioactivity of the anticancer compounds was performed by cytotoxic and antiproliferation assay against cervical cancer cell lines. Based on the characterization, compopunds obtained were guneribol [1]; 3-hydroxy-3-methyl-2-indolinone [2]; Indole-3-carbonitrile [3]; 3-(4-hydroxy phenyl) propanoic acid [4]; 4-hydroxy benzonitrile [5]; 4-methyl benzoic acid [6]. The compounds were firstly found from the sponges of the Cinachyrella genus. The bioactivity assay showed that compounds 1, 2, 3, and 6 had anticancer activity against HeLa cells with IC50 values 9.89; 6.42; 9.32 and 5.45 ppm respectively, whereas compouns 4 and 5 with the IC50 values 12.98 and 20.63 ppm respectively are not active against HeLa cells.

Keywords : Cinachyrella, guneribol, 3-hydroxy-3-methyl-2-indolinone,

Indole-3-carbonitrile, 3-(4-hydroxy phenyl) propanoic acid, 4-hydroxy benzonitrile, 4-methyl benzoic acid, cervical cancer’s line cells.

DAFTAR ISI

halaman

HALAMAN JUDUL i

HALAMAN PENGESAHAN iii

KATA PENGANTAR iv

ABSTRAK vii

ABSTRACT viii

DAFTAR ISI ix

BAB I. PENDAHULUAN 1

A. Latar Belakang 1

B. Rumusan Masalah 6

C. Tujuan Penelitian 7

D. Manfaat Penelitian 7

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA 8

A. Spons Cinachyrella 8

B. Komponen Senyawa Spons Cinachyrella 10

1. Senyawa Steroid 10

2. Senyawa Alkaloid 13

3. Senyawa Turunan Benzen 13

C. Bioaktivitas Senyawa dan Ekstrak dari Spons Cinachyrella

14

D. Toksisitas 16

E. Antioksidan 16

F. Sitotoksik 17

E. Proliferasi 18

D. Kerangka Pikir 19

E. Hipotesis 22

BAB III. METODE PENELITIAN 23

A. Waktu dan Tempat 23

B. Alat dan Bahan 23

C. Prosedur Penelitian 24

1. Sampel 24

2. Preparasi Sampel 25

3. Ekstraksi Sampel 25

4. Uji Bioaktivitas Ekstrak 26

5. Pemisahan dan Pemurnian Senyawa 28

6. Uji Aktivitas Senyawa Pada Sel line Kanker Serviks

30

BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 33

A. Komponen Senyawa Hasil Isolasi dari Spons Cinachyrella

35

1. Guneribol [1] 35

2. 3-hidroksi-3-metil-2-indolinon [2] 37

3. 3-karbonitril indol [3] 38

4. Asam-3-(4-hidroksi fenil) propanoat [4] 40

5. 4-hidroksi benzonitril [5] 41

6. Asam-4-metil benzoat [6] 42

B. Metabolit Sekunder Spons Cinachyrella dan Bahan Alam Lain

43

C. Bioaktivitas Senyawa-Senyawa Hasil Isolasi dari Spons Cinachyrella

46

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 51

A. Kesimpulan 51

B. Saran 52

DAFTAR PUSTAKA 53

LAMPIRAN 61

RIWAYAT HIDUP 64

1

BAB I.

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Indonesia merupakan negara kepulauan dengan wilayah laut yang

sangat luas, dan Kawasan Timur Indonesia terletak pada pusat

keanekaragaman hayati. Sebagai salah satu daerah di kawasan timur,

Sulawesi Selatan berada di dua ecoregion laut, yaitu ecoregion perairan

Selayar yang berada di laut Banda dan ecoregion Selat Makassar.

Perairan Spermonde yang meliputi perairan Pangkep, perairan Kota

Makassar, dan perairan Bulukumba terdapat di Selat Makassar (Huffard,

et al., 2012).

Ekosistem terumbu karang di perairan Spermonde merupakan habitat

bagi beraneka ragam biota laut, baik berupa tumbuhan maupun hewan.

Salah satu biomassa utama dan terbesar pada terumbu karang adalah

spons (Hochmuth, et al., 2010). Cleary, et al. (2005) mengidentifikasi 150

spesies spons di perairan spermonde yang terdistribusi mulai dari laut

dangkal dekat pantai sampai laut dalam.

Spons sebagai hewan sessile filter feeder memiliki mekanisme

pertahanan terhadap infeksi, nudibranch, gastropoda pemangsa spons,

dan ikan karnivora (Muller, et al. 2004), serta memproduksi bermacam-

macam metabolit sekunder (Bell, 2008) yang seringkali memiliki struktur

unik atau baru dan gugus fungsi yang tidak biasa ditemukan pada

organisme teresterial (Oku. et al., 2010).

2

Spons Cinachyrella merupakan genus terbesar pada famili Tetillidae

(Rützler dan Smith, 1992). Beberapa komponen senyawa ditemukan pada

spons genus Cinachyrella. Senyawa (3E)-kolest-4-en-3,6-dion-3-oksim

diisolasi dari spons C. australiensis dengan aktivitas sitotoksik tehadap

virus hepatitis B (Xiao, et al., 2005). Cinasiramin diperoleh dari spons

Cinachyrella sp. dengan aktivitas sitotoksik terhadap sel HeLa S3

(Shimogawa, et al., 2006). Dua senyawa keramid dari spons C. carvenosa

menunjukkan peran sebagai molekul penekan tumor yang mendorong

apoptosis dan induksi yang menghambat siklus sel (Lakshmia, et al.,

2008). Enigmazol A dari spons C. enigmatica menunjukkan sitotoksik

terhadap sel line NCI 60 antitumor (Oku, et al., 2010). Lektin dari spons

C. apion menunjukkan potensi antiproliferasi terhadap sel line tumor

(Rabelo, et al., 2012). Cinantrenol A, yang terdiri atas fenantren dan

sistem spiro [2,4] heptan, diisolasi dari spons laut Cinachyrella sp. dengan

aktivitas estrogen (Machida et al., 2014).

Senyawa 1,4,9-triazatrisiklo-[7,3,1,0]-trideka-3,5(13),10-trien-8-ol dari

spons laut Cinachyrella sp. (Nurhayati, et al., 2014a), menunjukkan

mekanisme seluler terhadap sel T47D, penghambatan proliferasi seluler,

menginduksi apoptosis dan menghambat siklus sel (Nurhayati, et al.,

2015a). Pendekatan molekular docking menunjukkan bahwa

1,4,9-triazatrisiklo-[7,3,1,0]-trideka-3,5(13),10-trien-8-ol menghambat

enzim cyclin dependent kinase 2 (cdk2) (Nurhayati. et al., 2015b).

Senyawa-senyawa yang telah dilaporkan dari beberapa spons genus

3

Cinachyrella sebagian besar adalah golongan steroid dan alkaloid dengan

berbagai aktivitas biologi terutama sebagai antikanker.

Toksisitas suatu sampel (ekstrak) terhadap larva Artemia salina

merupakan skrining awal isolasi senyawa dengan aktivitas antikanker

(McLaughlin and Rogers, 1998). Spons mampu memproduksi senyawa

metabolit sekunder yang bersifat toksik, sebagai konsekuensi terhadap

tekanan lingkungan yang ekstrem (Perdicaris, et al. 2013) dan kompetisi

ruang dengan organisme lain (Schupp, et al. 1999). Pembentukan

senyawa metabolit sekunder pada spons sangat dipengaruhi oleh kondisi

lingkungan. Spons dengan jenis yang sama tetapi berasal dari lingkungan

yang berbeda menunjukkan kandungan metabolit sekunder yang berbeda

dan aktivitas biologis yang juga berbeda (Rachmat, 2007).

Kanker dapat disebabkan oleh paparan zat karsinogen seperti

senyawa radikal bebas yang berlebihan dan dapat mengakibatkan mutasi

DNA yang memicu terjadinya pertumbuhan dan perkembangan sel yang

abnormal. Senyawa radikal bebas dapat dinetralisir oleh antioksidan.

Senyawa antioksidan mempunyai struktur molekul yang dapat

memberikan elektronnya kepada radikal bebas dan menetralisir reaksi

berantai dari radikal bebas tersebut, sehingga kerusakan pada sel dapat

dicegah (Antolovich, et al., 2002). Hal tersebut menunjukkan bahwa

aktivitas antioksidan suatu sampel (ekstrak) merupakan gambaran

potensinya sebagai antikanker.

4

Riset Kesehatan Dasar 2013 yang dilakukan Badan Litbangkes

Kementerian Kesehatan RI menunjukkan bahwa kanker serviks

(leher rahim) merupakan penyakit kanker dengan prevalensi tertinggi di

Indonesia. Kanker serviks disebabkan oleh infeksi Human Pappiloma

Virus (HPV) yang menyerang leher rahim dan tidak sembuh dalam waktu

yang lama. Sel line kanker serviks adalah sel HeLa, merupakan kultur sel

line pertama yang diisolasi tahun 1951 dari kanker serviks seorang wanita

yang bernama Henrietta Lacks. Sel ini tidak dapat berhenti berproliferasi

secara normal dan dapat membelah secara tidak terbatas sehingga

menimbulkan pertumbuhan jaringan yang tidak normal (Kappel, 2011;

Ullah, et al., 2009).

Obat antikanker yang berasal dari bahan alam seperti tanaman dan

organisme laut jumlahnya lebih dari 60%. Senyawa derivat dari bahan

alam mempunyai target bioaktif yang spesifik dan efek samping yang

rendah (Iwamaru, et al., 2007), sehingga pencarian obat antikanker bahan

alam terutama dari laut masih terus dilakukan (Nobili, et al., 2009).

Pencarian senyawa antikanker dapat dilakukan dengan pendekatan

selular melalui penelitian in vitro (Castell, et al., 1997). Pada penelitian

disertasi ini dilakukan uji aktivitas sitotoksik in vitro isolat senyawa

terhadap sel kanker sirviks dan untuk mengetahui toksisitas senyawa yang

berpotensi sebagai antikanker dilakukan melalui uji antiproliferasi terhadap

sel HeLa.

5

Pada penelitian ini diusulkan pula jalur biogenesis senyawa yang

diisolasi dari spons Cinachyrella. Isolat senyawa diproduksi secara

spesifik oleh spons mengikuti jalur biogenesis yang sesuai untuk senyawa

metabolit sekunder tersebut sehingga dapat diketahui hubungan

kekerabatan organisme berdasarkan kandungan metabolit sekundernya

(kemotaksonomi).

Penelitian ini berhasil mengidentifikasi satu senyawa sterol, dua

senyawa alkaloid indol, dan tiga senyawa turunan benzen yang diisolasi

dari spons C. australiensis dan Cinachyrella sp. yang dikumpulkan dari

perairan Spermonde Sulawesi Selatan. Senyawa tersebut adalah

guneribol [1], 3-hidroksi-3-metil-2-indolinon [2], 3-karbonitril indol [3],

asam-3-(4-hidroksi fenil) propanoat [4], 4-hidroksi benzonitril [5], asam

-4-metil benzoat [6]. Senyawa 1-6 baru pertama kali ditemukan pada

spons genus Cinachyrella.

Studi in vitro pada senyawa 1, 2, 3, 4, 5 dan 6 terhadap sel line kanker

serviks menunjukkan aktivitas sitotoksik senyawa-senyawa tersebut

dengan nilai IC50 berturut-turut 9,89; 6,42; 9,32; 12,98; 20,63 dan 5,45

ppm. Analisis antiproliferasi menunjukkan bahwa senyawa 1, 2, 3, dan 6

memiliki aktivitas antikanker terhadap sel HeLa dengan nilai IC50 kurang

dari 10 ppm.

Aktivitas senyawa yang diperoleh pada penelitian ini terhadap sel

HeLa merupakan gambaran in vitro senyawa sebagai antikanker

khususnya pada kanker serviks. Data penelitian ini, dapat digunakan

6

sebagai dasar bagi penelitian selanjutnya guna mewujudkan obat

antikanker baru dari bahan alam laut. Sebagian dari hasil penelitian ini

telah dipublikasikan dalam jurnal ilmiah dan disajikan dalam pertemuan

ilmiah (Abraham et. al., 2016, 2017, 2018).

B. Rumusan Masalah

Dalam rangka mengkarakterisasi senyawa dan bioaktivitas antikanker

metabolit sekunder spons C. australiensis dan Cinachyrella sp. dari

perairan Spermonde Sulawesi Selatan, maka dirumuskan masalah berikut

1. Bagaimanakah toksisitas ekstrak dari spons C. australiensis dan

Cinachyrella sp. terhadap larva Artemia salina ?

2. Bagaimanakah sifat antioksidan ekstrak dari spons C. australiensis

dan Cinachyrella sp.?

3. Senyawa metabolit sekunder apakah yang dapat diisolasi dan

diidentifikasi dari spons C. australiensis dan Cinachyrella sp.?

4. Bagaimanakah sitotoksiknya dan aktivitas penghambatan proliferasi

terhadap sel HeLa, isolat senyawa murni dari spons C. australiensis

dan Cinachyrella sp.?

5. Bagaimanakah jalur biogenesis senyawa yang diisolasi dari spons

C. australiensis dan Cinachyrella sp.?

7

C. Tujuan Penelitian.

Tujuan dari penelitian ini adalah :

1. Menganalisis toksisitas ekstrak kedua spons terhadap larva Artemia

salina.

2. Menganalisis sifat antioksidan ekstrak kedua spons.

3. Mengkarakterisasi senyawa metabolit sekunder yang diisolasi dari

spons C. australiensis dan Cinachyrella sp.

4. Menganalisis sitotoksik dan aktivitas antiproliferasi isolat senyawa

murni yang diperoleh dari kedua spons terhadap sel HeLa.

5. Mengusulkan jalur biogenesis senyawa yang diisolasi dari spons

C. australiensis dan Cinachyrella sp.

D. Manfaat Penelitian

Penelitian ini memberikan kontribusi ilmiah berupa informasi

kandungan kimia dan struktur senyawa, gambaran bioaktivitas in vitro

senyawa terhadap sel line kanker serviks, serta jalur biogenesis senyawa

metabolit sekunder spons C. australiensis dan Cinachyrella sp. dari

perairan Spermonde Sulawesi Selatan.

8

BAB II.

TINJAUAN PUSTAKA

A. Spons Cinachyrella

Spons merupakan hewan invertebrata multiseluler dengan fungsi

jaringan dan organ yang paling sederhana strukturnya dibandingkan

dengan hewan multiseluler yang lain (Bergquist, et al., 1980). Hewan ini

mengandalkan aliran air konstan yang melalui tubuhnya untuk

mendapatkan makanan, oksigen, dan untuk menghilangkan limbah.

Makanan berupa zat-zat organik dan organisme-organisme kecil seperti

plankton masuk melalui permukaan tubuhnya. Makanannya dicerna

secara intraseluler oleh sel-sel koanosit. Di dalam sel, makanan dicerna

oleh vakuola makanan, kemudian diteruskan oleh sel amebosit dan

diedarkan ke seluruh tubuh. Sisa makanan diteruskan ke spongosol

kemudian dikeluarkan melalui oskulum. Sistem pernafasan yang dimiliki

sangat sederhana, oksigen diambil langsung dari air oleh sel-sel koanosit

secara absorpsi. Karbondioksida hasil pernafasan dikeluarkan langsung

dari dalam sel ke lingkungan (Amir dan Budiyanto, 1996). Demospongiae

(demo = tebal, spongiae = spons) merupakan kelas terbesar yang

mencakup 90% spons laut di Indonesia (van Soest,1989), termasuk spons

Cinachyrella dari famili Tetilidae.

Famili Tetillidae dikenal sebagai spons bulan atau spons globular,

spons ini berbentuk bulat berdiameter hingga 5 cm, eksoskeletonnya

tersusun atas kerangka lunak dengan struktur tulang radial. Spons jenis ini

9

memiliki lubang-lubang kecil (rongga) atau pori-pori (ostia) seperti busa

(spons) yang disebut spongosol atau porocalices yang tersebar tak teratur

pada tubuhnya (Chambers, et al., 2013). Tetilidae terdiri atas 8 genus :

Acanthotetilla, Amphitethya, Cinachyra, Cinachyrella, Craniella,

Fangophilina, Paratetilla, dan Tetilla (van Soest and Rützler, 2002).

Cinachyrella adalah genus terbesar pada spons Tetilidae, dengan lebih

dari 49 spesies. Spons Cinachyrella mudah dikenali namun spesiesnya

masih kurang dipahami. Kesulitan utama mengidentifikasi Cinachyrella

dan sebagian besar Tetillidae adalah banyaknya variasi morfologi

eksternal dan karakter skeletal (misalnya bentuk spikula, komposisi dan

frekuensi) (Rützler dan Smith, 1992).

Karakter penting untuk membedakan genus Cinachyra dan

Cinachyrella adalah ―ada atau tidak adanya‖ korteks khas. Genus

Cinachyra saat ini hanya terdiri atas empat spesies : C. barbata Sollas,

C. crustata (Wilson), C. uteoides Dendy, dan C. helena sp. Nov., semua

spesies serupa yang tidak memiliki korteks digolongkan ke genus

Cinachyrella termasuk C. australiensis (Rodriguez dan Muricy, 2007).

Szitenberg. et al. (2013) mengklasifikasikan spons Cinachyrella sebagai

berikut :

Kingdom : Animalia

Filum : Porifera

Kelas : Demospongiae

Sub Kelas : Tetratinomorpha

10

Ordo : Spirophorida

Famili : Tetillidae

Genus : Cinachyrella

Spesies 1 : Cinachyrella australiensis

Spesies 2 : Cinachyrella sp.

B. Komponen Senyawa Spons Cinachyrella

Beberapa informasi hasil penelitian komponen senyawa steroid,

alkaloid, dan turunan benzen dari spons genus Cinachyrella dijelaskan

berikut ini :

1. Senyawa Steroid.

Ekstrak metanol spons C. tarentina, menunjukkan adanya senyawa

kolesterol [7], 24-metilkolesta-5,22-dien-3β-ol [8], 24-metilkolesta

-5,24(28)-dien-3β-ol [9], kolest-4-en-3-on [10], 24-metilkolesta-4,22-dien

-3-on [11], 24-metilkolesta-4,24(28)-dien-3-on [12], kolest-4-en-3,6-dion

[13] dan 24-etilkolest-4-en-3,6-dion [14]. Sebelumnya, senyawa 13 dan 14

ditemukan tidak sebagai senyawa alami (Aiello, et al., 1991).

.

11

Barnathan, et al. (1992) melaporkan komposisi sterol dari tiga spesies

spons laut genus Cinachyrella : C. alloclada dan C. kukenthali yang

terdapat di pantai Sinegal dan C. aff. schulzei dari laut Noumea Kaledonia

baru. Berdasarkan studi gas chromatography-mass spectrometer (GC-

MS) dan GC, empat belas sterol diidentifikasi dari ketiga spesies yaitu

senyawa 7, 8, 9, latosterol [15], kampesterol [16], kolestanol [17],

23,24-dimetilkolesta-5,22-dien-3ol [18], stigmasta-5,22-dien-3ol [19],

klionasterol [20], fukosterol [21], isofukosterol [22] 24-norkolesta-5,22-

dien-3ol [23], 22(Z)-dehidrokolesterol [24], 22(E)-dehidrokolesterol [25].

Rodriguez, et al. (1997) telah mengisolasi dua steroid hidroksimino

baru, yaitu (6E)-24-etilkolest-6-hidroksimino-4-en-3-on [26] dan (6E)

kolest-6-hidroksimino-4-en-3-on [27], serta senyawa 10 dari campuran dua

morfospesies spons Cinachyrella (C. alloclada dan C. apion). Dengan

GC-MS, Barnathan, et al. (2003) mengidentifikasi delapan belas sterol

yaitu senyawa 7, 9, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, stigmasta

-7-en-3-ol [28], stigmastanol [29], stigmasterol [30], klerosterol [31],

kampesta-7-en-3-ol [32] dan sebuah sterol baru yaitu gorgosterol [33] dari

spons C. alloclada dan C. kukenthali. Li, et al. (2004) telah mengelusidasi

kolesta-4-en-3-ol [34] dari spons laut C. australiensis.

12

Sebuah senyawa steroid baru diisolasi dari fraksi etil asetat spons laut

C. australiensis yang dikumpulkan di Laut Cina Selatan. Strukturnya

diketahui sebagai (3E)-kolest-4-en-3,6-dion-3-oksim [35] (Xiao, et al.,

2005).

13

Sebuah steroid baru yaitu Cinantrenol A [36], yang terdiri atas fenantren

dan sistem spiro [2,4] hepten, diisolasi dari spons laut Cinachyrella sp.

Senyawa 36 tersebut merupakan steroid pertama yang mengandung

fenantren (Machida et al., 2014). Wahidullah, et al. (2015) mengidentifikasi

senyawa 7, 9, 16, 17, 20, 22, 24, 25, 37, 38a-c, 39, 40, 41, 42, 43 dari C.

cavernosa dengan GC-MS.

2. Senyawa Alkaloid.

Li, et al. (2004) mengelusidasi sebuah alkaloid baru isolumikrom [44]

serta timidin [45] dan zarzissin [46] dari spons laut C. australiensis.

.Shimogawa, et al. (2006) mengisolasi sebuah alkaloid baru, cinasiramin

[47] yang berupa garam trifluoroasetat dari spons laut Cinachyrella sp. dari

Okinawa. Nurhayati, et al. (2014a) mengisolasi alkaloid turunan senyawa

cinasiramin dari spons laut Cinachyrella sp. yang diidentifikasi sebagai

1,4,9-triazatrisiklo-[7,3,1,0]-trideka-3,5(13),10-trien-8-ol (C10H13N3O) [48].

3. Senyawa Turunan Benzen.

Li, et al. (2004) mengelusidasi lima senyawa turunan benzen dari

spons laut C. australiensis yaitu : p-hidroksi benzaldehid [49], p-hidroksi

benziletanol [50], p-hidroksi benzilpropanol [51], dibutil ftalat [52],

bis-(2-etilheksil) ftalat [53]. Wahidullah, et al. (2015) mengidentifikasi

14

senyawa 52, 53 dan diisobutil ftalat [54] dari spons C. cavernosa dengan

GC-MS.

C. Bioaktivitas Senyawa dan Ekstrak Spons Cinachyrella.

Beberapa peneliti mempelajari aktivitas biologi komponen senyawa

dan ekstrak spons genus Cinachyrella, ditampilkan pada Tabel 1.

Tabel 1.Biokativitas Beberapa Komponen Senyawa dan Ekstrak Spons Cinachyrella

No Spons Komponen

Senyawa/Ekstrak Bioaktivitas

1. C. australiensis (3E)-kolest-4-en-3,6-dion-3-oksim [35] (Xiao, et al., 2005)

sitotoksik tehadap virus hepatitis B.

2 Cinachyrella sp. cinachyramin [47] (Shimogawa, et al., 2006)

menunjukkan aktivitas sitotoksik terhadap sel HeLa S3 dengan IC50 6.8 mg/mL.

3. C. carvenosa Keramid 1 [55] dan 2 [56] (Lakshmia, et al., 2008)

berperan penting sebagai tumor suppressor yang kuat (molekul signaling) yakni mendorong apoptosis dan induksi yang menghambat siklus sel.

4. Cinachyrella sp. Ekstrak air (Marinho. et al., 2008)

menunjukkan aktivitas terhadap resistensi bakteri dengan spektrum yang luas seperti Staphylococcus aureus, koagulase negatif staphylococci dan Enterococcus faecalis.

15

5. C. enigmatica enigmazol A [57] (Oku, et al., 2010)

menunjukkan sitotoksik yang signifikan terhadap NCi 60-sel line screen antitumor, dengan rata-rata GI50 1.7 mM.

6. C. tarentine ekstrak diklorometan dan etanolnya (El-Amraoui, et al., 2010)

menunjukkan aktivitas antijamur yang kuat.

7. C. apion Lektin (Rabelo, et al., 2012)

menunjukkan potensi antiproliferatif terhadap sel line tumor.

8. Cinachyrella sp. Cinanthrenol A [36] (Machida et al., 2014).

menunjukkan aktivitas estrogen.

9. Cinachyrella sp. ekstrak etanol (Nurhayati. et al., 2014b).

sitotoksik terhadap sel HeLa dengan nilai IC50 897,809 μg/mL, tetapi tidak toksik terhadap sel T47D, WiDr dan Vero.

4 fraksi dari ekstrak etanol (Nurhayati. et al., 2014b).

sitotoksik terhadap sel T47D dengan nilai IC50 F1 (82,744 μg/mL); F2 (163,679 μg/mL); F3 (66,522 μg/mL) dan F4 (333,026 μg/mL). F3 pada 31,5 μg/mL menghambat proliferasi sel T47D pada inkubasi 24 jam

10. Cinachyrella sp 1,4,9-triazatrisiklo-[7,3,1,0]-trideka-3,5(13),10-trien -8-ol [48]. (Nurhayati, et al., 2014a).

Senyawa [48] menunjukkan mekanisme seluler terhadap sel T47D dengan nilai IC50 123.18 μg/mL, penghambatan proliferasi seluler pada inkubasi 48 jam, menginduksi apoptosis 11,77%, dan menghambat siklus sel pada fase sub-G1 5,87% dan fase G2/M 50,5% (Nurhayati, et al., 2015a).

Uji in vitro senyawa [48] menginduksi penghambatan siklus sel pada fase sub-G1 dan G2/M. Pendekatan molekular docking menunjukkan senyawa [48] menghambat enzim cdk2. Kekuatan interaksi antara [48] dan cdk2 (nilai docking = -65,43) lebih stabil dibanding interaksi antara doxorubicin dan cdk2 (-36,59) (Nurhayati. et al., 2015b).

16

D. Toksisitas

Toksisitas merupakan potensi suatu bahan kimia untuk dapat

menyebabkan kerusakan ketika senyawa tersebut mengenai atau masuk

ke dalam tubuh hewan uji. Pengujian toksisitas suatu sampel dapat

dilakukan dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) sebagai uji

pendahuluan untuk penapisan aktivitas farmakologis suatu sampel,

maupun skrining senyawa bioaktif antikanker (McLaughlin and Rogers,

1998). Hasil yang diperoleh dihitung sebagai nilai Lethal Concentration

50% (LC50) ekstrak uji, yaitu jumlah dosis atau konsentrasi ekstrak uji

yang dapat menyebabkan kematian larva udang sejumlah 50% setelah

masa inkubasi 24 jam (Meyer, et al., 1982). Secara spesifik kategori

toksisitas suatu ekstrak adalah:

Tabel 2. Tingkat Toksisitas Ekstrak sesuai kriteria Meyer et al. (1982).

Nilai LC50 (ppm) Aktivitas Toksik

Kurang dari 30 Sangat toksik 30 – 1000 Toksik

Lebih dari 1000 Tidak toksik

E. Antioksidan

Tubuh manusia mempunyai sistem antioksidan yang diproduksi

secara kontinyu untuk menangkal atau meredam radikal bebas. Bila

jumlah senyawa radikal bebas melebihi jumlah antioksidan alami dalam

tubuh maka radikal bebas akan menyerang komponen lipid, protein dan

DNA. Sehingga dibutuhkan asupan antioksidan yang dapat membantu

melindungi tubuh dari serangan radikal bebas (Antolovich, et al., 2002).

Antioksidan merupakan senyawa reduktor yang mampu menginaktivasi

17

reaksi oksidasi dengan mencegah terbentuknya radikal melalui pemberian

elektron (elektron donor) (Molyneux, 2004). Salah satu metode yang

umum digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan adalah dengan

radikal bebas 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) (Antolovich, et al., 2002).

Parameter untuk menginterpretasikan hasil pengujian DPPH adalah

dengan nilai IC50. Nilai IC50 merupakan konsentrasi larutan sampel yang

mampu mereduksi aktivitas DPPH sebesar 50%. Semakin kecil nilai IC50

berarti semakin tinggi aktivitas antioksidan (Molyneux, 2004). Secara

spesifik kategori aktivitas antioksidan suatu ekstrak adalah:

Tabel 3. Aktivitas Antioksidan Ekstrak sesuai kriteria Molyneux (2004)

Nilai IC50 (ppm) Aktivitas Antioksidan

Kurang dari 50 Sangat kuat 50 – 100 Kuat

100 – 150 Sedang 150 – 200 Lemah

Lebih dari 200 Sangat lemah

F. Sitotoksik

Sitotoksik adalah sifat toksik atau beracun yang dimiliki oleh suatu

ekstrak atau senyawa tertentu terhadap sel hidup. Uji sitotoksik adalah

suatu uji in vitro yang dilakukan menggunakan kultur sel untuk

menentukan potensi ketoksikan suatu ekstrak atau senyawa terhadap sel

berdasarkan parameter nilai IC50 (Sismindari, 2003). Dua metode umum

yang digunakan untuk uji sitotoksik adalah metode perhitungan langsung

(direct counting) dengan menggunakan trypan blue dan metode MTT.

Semakin besar nilai IC50, semakin banyak kristal formazan yang terbentuk

(kristal ini memberi warna ungu), maka semakin tinggi nilai absorbansinya

18

pada ELISA reader, mengindikasikan mortalitas yang rendah karena

semakin banyak sel yang hidup, sehingga ekstrak atau senyawa tersebut

semakin tidak toksik (Lasisi and Idowu, 2011).

G. Proliferasi

Proliferasi adalah fase sel saat mengalami siklus sel yang

berlangsung terus-menerus dan berulang (siklik) tanpa hambatan. Siklus

sel adalah proses duplikasi secara akurat untuk menghasilkan jumlah

DNA kromosom yang cukup banyak dan untuk menghasilkan dua sel

anakan yang identik secara genetik. Sel-sel normal akan mati dengan

sendirinya tanpa ada efek peradangan melalui proses apoptosis, ini

merupakan suatu proses kematian sel melalui digesti enzimatik oleh

dirinya sendiri dan mekanisme yang efisien untuk mengeliminasi sel yang

tidak diperlukan dan mungkin berbahaya bagi tubuh. Program terminasi

sel ini penting untuk menjaga homeostasis perkembangbiakan sel, dengan

program ini dapat diatur berapa jumlah sel yang dibutuhkan dalam tubuh

secara fungsional dan menempati tempat yang tepat dengan umur

tertentu (Wargasetia, 2008). Pada sel-sel kanker, sel mengalami

metastasis. Sel kanker akan terus hidup meski seharusnya mati (immortal)

(Schneiders, et al., 2009). Sel yang rusak dapat terus membelah tanpa

batas, yang akhirnya menjadi kanker (Beesoo, et al., 2014)

19

H. Kerangka Pikir

Demospongiae merupakan jenis spons laut yang terbanyak di

Indonesia, seperti spons Cinachyrella. Sebagai organisme laut, spons

merupakan sumber metabolit sekunder yang seringkali memiliki struktur

unik atau baru dan gugus fungsi yang tidak biasa ditemukan pada

organisme teresterial. Spons Cinachyrella merupakan genus terbesar

pada famili Tetillidae. Beberapa komponen senyawa ditemukan pada

spons genus Cinachyrella. Senyawa 35 merupakan steroid baru yang

beranggotakan 27 atom karbon dengan aktivitas sitotoksik terhadap virus

hepatitis B. Steroid ini memiliki keunikan pada kerangka molekulnya

dengan adanya gugus oxim di C-3 dan gugus keton di C-6. Senyawa 36

merupakan steroid baru yang mengandung fenantren dan sistem spiro

[2,4] heptan dengan aktivitas estrogen. Senyawa 47 merupakan suatu

alkaloid baru dengan aktivitas sitotoksik terhadap sel HeLa. Kerangka

molekul alkaloid ini mirip dengan quinolin dan isoquinolin tanpa ikatan

rangkap terkonjugasi.

Senyawa 48 merupakan senyawa alkaloid turunan cinasiramin.

Senyawa 48 menunjukkan mekanisme seluler terhadap sel T47D,

penghambatan proliferasi seluler pada inkubasi 48 jam, menginduksi

apoptosis dan menghambat siklus sel. Pendekatan molekular docking

menunjukkan, senyawa 48 menghambat enzim cdk2. Kekuatan interaksi

antara senyawa 48 dan cdk2 (nilai docking = -65,43) lebih stabil dibanding

interaksi antara doxorubicin dan cdk2 (-36,59). Senyawa keramid [55] dan

20

[56] merupakan suatu spingolipid baru dengan aktivitas yang mendorong

apoptosis dan induksi yang menghambat siklus sel. Senyawa keramid ini

memiliki gugus hidroksi yang lebih banyak dan tidak memiliki ikatan

rangkap C-C. Senyawa 57 merupakan suatu makrolida baru dengan

aktivitas sitotoksik terhadap sel line NCI 60. Makrolida ini memiliki

keunikan pada cincin laktonnya yang dibangun oleh ester siklik dan eter

siklik serta terdapat subtituen asam fosfat. Senyawa-senyawa yang telah

diisolasi dari spons genus Cinachyrella sebagian besar adalah golongan

steroid dan alkaloid dengan bioaktivitas umumnya sebagai antikanker

termasuk pada sel HeLa

Spons Cinachyrella ditemukan pula di perairan Spermonde Sulawesi

Selatan. Metabolit sekunder yang dihasilkan spons tersebut dapat berupa

komponen steroid dan alkaloid yang berbeda dari yang telah ditemukan

sebelumnya karena pengaruh kondisi lingkungan yang berbeda. Akan

tetapi hingga tahun 2016 belum ada laporan informasi kimia maupun

aktivitas antikanker spons Cinachyrella dari Perairan Spermonde

khususnya C. australiensis dan Cinachyrella sp.

Pada penelitian ini dilakukan karakterisasi metabolit sekunder spons

C. australiensis dan Cinachyrella sp. dari perairan Spermonde yang

diawali dengan ekstraksi sampel spons dengan pelarut organik. Ekstrak

dengan aktivitas toksik dan antioksidan yang terbaik dipisahkan dan

dimurnikan dengan teknik kromatografi. Struktur senyawa-senyawa murni

yang diperoleh ditetapkan melalui analisis spektrum NMR dan HRMS.

21

Bioaktivitas in vitro senyawa-senyawa murni sebagai antikanker

ditentukan melalui uji sitotoksik dan antiproliferasi terhadap sel HeLa. Jalur

biogenesis Isolat senyawa diusulkan sesuai dengan biosintesis senyawa-

senyawa metabolit sekunder. Hasil penelitian ini dapat digunakan sebagai

dasar bagi penelitian selanjutnya baik dalam bidang kimia sebagai model

untuk sintesis senyawa dengan bioaktivitas yang lebih baik maupun dalam

bidang kesehatan untuk memperoleh obat antikanker baru dari derivat

senyawa bahan alam laut yang lebih aman dalam pemakaiannya. Secara

garis besar bagan kerangka pikir disajikan pada Gambar 1.

Gambar 1. Bagan Kerangka Pikir Penelitian

Komponen Senyawa (steroid dan alkaloid)

Bioaktivitas antikanker (sel HeLa)

Spons Cinachyrella

Spons C. australiensis dan Cinachyrella sp. di perairan Spermonde Sulawesi Selatan

Ekstrak Spons dengan aktivitas Toksik dan Antioksidan

Isolat Senyawa Murni

Struktur Senyawa Bioaktivitas Antikanker Senyawa

Usulan Jalur Biogenesis Senyawa

~ Sintesis senyawa dengan bioaktivitas antikanker yang lebih baik ~ Obat antikanker baru yang lebih aman dalam pemakaiannya

22

I. Hipotesis

Spons C. australiensis dan Cinachyrella sp. dari perairan Spermonde

Sulawesi Selatan mengandung komponen kimia seperti steroid dan

alkaloid yang memiliki bioaktivitas antikanker terhadap sel HeLa.

23

BAB III.

METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Oktober 2015 sampai

November 2017. Lokasi pengambilan sampel spons adalah di perairan

Spermonde Sulawesi Selatan. Proses ekstraksi dan uji bioaktivitas ekstrak

(uji toksisitas dan uji antioksidan) dilakukan di Laboratorium Kimia Organik

Fakultas MIPA Unhas dan Laboratorium Fitokimia Fakultas Farmasi

Unhas Makassar. Pemisahan dan pemurnian senyawa serta analisis

spektroskopi Nuclear Magnetic Resonance (NMR) dan High Resolution

Mass Spectrometry (HRMS) dilakukan di Laboratorium Kimia Organik

FMIPA ITB Bandung. Uji sitotoksik dan antiproliferasi senyawa murni

dilakukan di Laboratorium Anatomi dan Biologi Sel FKU Unpad Bandung.

B. Alat dan Bahan

Spektrum NMR diukur menggunakan Agilent 500 MHz, NMR Proton

(1H-NMR) 500 MHz dan NMR Karbon (13C-NMR) 125 MHz. Spektrum

massa resolusi tinggi diukur dengan HRESI-MS Waters LCT Premier XE

detektor TOF. Penentuan titik leleh dengan alat penetapan titik leleh

Fisher Johns 120 V, 1.4 A, 60/60 Hz seri 4631.

Analisis kromatografi vakum cair (KVC) dengan adsorben Si gel

Merck 60 GF254, kromatografi radial (KR) menggunakan alat kromatotron

dengan Si gel Merck 60 PF254, dan analisis kromatografi lapis tipis (KLT)

24

pada plat berlapis Si gel Merck Kieselgel 60 F254. Pereaksi penampak

noda digunakan larutan asam sulfat 5%.

Ekstraksi dan kromatografi menggunakan pelarut metanol, etil asetat,

dan n-heksan teknis yang telah didestilasi. Untuk kromatografi digunakan

pula aseton teknis yang telah didestilasi, kloroform dan diisopropil eter

berkualitas pro analis (pa).

Uji toksisitas digunakan metanol (pa), garam dapur, aquades, telur

Artemia salina, inkubator dengan aerator dan lampu pijar 40 watt. Uji

antioksidan digunakan DPPH dan metanol (pa), serapannya diukur

dengan UV-Vis Agilent 8453.

Uji sitotoksik dan antiproliferasi digunakan sel line kanker serviks

HeLa dari American Type Culture Collection, RPMI-1640, MTT, DMSO,

FBS, PBS, SDS, etoposide, ELISA reader; mikroplate.

Berbagai alat-alat gelas yang umum digunakan dalam laboratorium,

neraca analitik, lampu ultraviolet (UV), rotary evaporator, hotplate, lemari

pendingin, hammer mill, aluminium foil, kertas saring, etanol 70%.

C. Prosedur Penelitian

1. Sampel

Sampel spons dikumpulkan di perairan Spermonde Sulawesi Selatan,

pada kedalaman 10-25 m selama September-Oktober 2015. Kemudian

dicuci dan dibersihkan lalu dipreparasi dan analisis selanjutnya.

Karakterisasi morfologi pada Pusat Penelitian Oseanografi LIPI di Jakarta

25

Utara diidentifikasi sebagai Cinachyrella australiensis (SVP 01/10/15) dan

Cinachyrella sp. (SVP 02/10/15).

2. Preparasi Sampel.

Sampel spons yang telah bersih, dicelupkan pada alkohol 70%

kemudian dikering anginkan, lalu dipotong-potong dan digiling sampai

halus (80-100 mesh).

3. Ekstraksi Sampel

Sampel spons halus (C. autraliensis dan Cinachyrella sp.) masing-

masing ditimbang 10 kg dimaserasi dengan pelarut metanol beberapa kali,

pelarutnya diuapkan dengan rotary evaporator dan diperoleh ekstrak

metanol (ekstrak kasar dan garamnya + lapisan air dan garamnya).

Ekstrak metanol kasar dan garamnya dipisahkan dengan lapisan air dan

garamnya menggunakan corong pisah.

Ekstrak metanol kasar dilarutkan dengan metanol dan dipartisi

dengan n-heksan. Diperoleh lapisan n-heksan, lapisan metanol, dan

garam. Lapisan metanol dipartisi lagi dengan etil asetat, diperoleh lapisan

etil asetat dan lapisan metanol sisa. Pelarutnya diuapkan sehingga

diperoleh ekstrak n-heksan, etil asetat, dan metanol.

Lapisan air dipartisi dengan n-heksan, diperoleh lapisan n-heksan dan

lapisan air. Lapisan air dipartisi lagi dengan etil asetat, diperoleh lapisan

etil asetat dan lapisan air. Lapisan air dicuci dengan metanol, diperoleh

lapisan metanol dan garam. Pelarutnya diuapkan sehingga diperoleh

ekstrak n-heksan, etil asetat, dan metanol dari lapisan air.

26

4. Uji Bioaktivitas Ekstrak.

Seluruh ekstrak (dari metanol kasar dan dari lapisan air) diuji

toksisitas dengan BSLT serta diuji fitokimia. Ekstrak n-heksan, etil asetat,

dan metanol yang diperoleh dari metanol kasar diuji antioksidan dengan

DPPH.

a. Uji Toksisitas (Muaja, et al., 2013).

1) Penyiapan larva uji (A. salina)

Telur A. salina (1 g) direndam dalam air selama 10–15 menit, telur

yang ada di dasar wadah diambil dan ditetaskan dalam wadah yang berisi

2 L air laut buatan, diberi penerangan lampu pijar 40 watt dan aerator.

Telur A. salina menetas menjadi larva setelah 24 jam, larva dibiarkan lagi

selama 24 jam. Setelah 48 jam larva aktif (nauplii) siap sebagai larva uji.

2) Pembuatan konsentrasi larutan uji

Larutan uji dibuat dengan konsentrasi 1000 μg/mL, 100 μg/mL,

10 μg/mL. Ekstrak (50 mg), dilarutkan dalam 5 mL metanol, diperoleh

konsentrasi larutan stok 10.000 μg/mL.

Larutan uji 1000 μg/mL dibuat dengan memipet 0,5 mL larutan stok

dan dimasukkan ke dalam vial uji lalu ditambahkan 5 mL air laut. Untuk

larutan uji 100 μg/mL dibuat dari larutan 1000 μg/ml dan larutan uji

10 μg/mL dibuat dari larutan 100 μg/ml dengan cara yang sama.

Perlakuan kontrol dilakukan dengan cara yang sama dengan sampel

dengan menggunakan air laut dan pelarut metanol.

27

3) Uji BSLT

Larva A. salina (10 ekor) dimasukkan ke dalam masing-masing vial.

Volumenya dicukupkan dengan ditambahkan air laut buatan, diulang 3 kali

untuk tiap konsentrasi larutan uji dan kontrol. Disimpan ditempat yang

cukup mendapat sinar lampu. Pengamatan jumlah larva yang mati

dilakukan setelah 24 jam.

Data larva yang mati untuk tiap konsentrasi larutan uji dan kontrol

dihitung dan ditabulasi. Data dianalisis probit untuk menentukan nilai LC50

setiap ekstrak.

b. Uji Antioksidan (Selvasundhari, et al., 2014).

1) Pembuatan larutan DPPH (0,4 mM)

DPPH (BM=394,32) sebanyak 15,8 mg dilarutkan dengan metanol

(pa) sampai 100 mL, ditempatkan dalam botol gelap.

2) Pembuatan larutan blanko

Larutan DPPH (0,4 mM) dipipet sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke

dalam labu takar 5 mL, ditambahkan metanol (pa) sampai tanda, lalu

dihomogenasi.

3) Pembuatan larutan uji

Sampel ekstrak (5 mg) dilarutkan dalam 5 mL metanol (1000 ppm),

larutan ini merupakan larutan induk. Larutan induk masing-masing dipipet

25, 50, 125, 250, dan 500 μL dan dimasukkan ke dalam labu takar 5 mL.

Larutan DPPH sebanyak 1 mL dan metanol (pa) ditambahkan sampai

28

tanda batas, kemudian dihomogenisasi dan diperoleh larutan uji dengan

konsentrasi 5, 10, 25, 50, dan 100 μg/mL.

4) Pengukuran dan perhitungan nilai IC50

Larutan uji dengan beberapa konsentrasi serta larutan blanko

diinkubasi pada suhu 37 0C selama 30 menit (tepat), kemudian

serapannya diukur pada panjang gelombang maksimum 517 nm dengan

spektrofotometri UV-Vis. Serapan larutan uji dan blanko ditabulasi dan

dihitung persen hambatannya, selanjutnya data dianalisis probit untuk

menentukan nilai IC50 setiap ekstrak.

5. Pemisahan dan Pemurnian Senyawa

Ekstrak etil asetat dari metanol kasar kedua spesies spons dipisahkan

dengan KVC menggunakan adsorben silika gel. Fraksi-fraksinya

dipisahkan dan dimurnikan dengan KR dan rekristalisasi sehingga

diperoleh senyawa-senyawa murni.

a. Pemisahan dan pemurnian senyawa dari ekstrak etil asetat spons

C. australiensis.

Ekstrak etil asetat spons C. australiensis (33,28 g) difraksinasi

menggunakan KVC, diperoleh dua puluh fraksi

1) Pemisahan dan Pemurnian Senyawa 1 dari Spons C. australiensis

F3 (333,9 mg) merupakan kristal berminyak berwarna kekuningan,

direkristalisasi beberapa kali sehingga membentuk kristal putih (8 mg).

Kristal senyawa 1 (AB1.3) diukur titik lelehnya dan dianalisis KLT

menunjukkan satu spot.

29

2) Pemisahan dan Pemurnian Senyawa 2 dari Spons C. australiensis

F13-15 digabung (1,5 g), difraksinasi dengan KVC diperoleh 20 fraksi.

F6-13 digabung (570,5 mg), kemudian direfraksinasi dengan KR diperoleh

3 fraksi. F3 (42,2 mg) dimurnikan dengan KR, diperoleh F3 (6,4 mg)

berupa serbuk berwarna hijau muda (AB1.4) dan dianalisis dengan KLT.

3) Pemisahan dan Pemurnian Senyawa 4.

F18-20 digabung (467,1 mg) lalu difraksinasi dengan KR, diperoleh

13 fraksi. F9-11 digabung (27,5 mg) dan difraksinasi dengan KR, diperoleh

6 fraksi. F2-4 digabung (14,7 mg), dimurnikan dengan KR dan diperoleh

isolat senyawa 4 (6,1 mg), lalu dianalisis dengan NMR dan HRMS.

b. Pemisahan dan pemurnian senyawa dari ekstrak etil asetat spons

Cinachyrella sp.

Ekstrak etil asetat spons Cinachyrella sp. (28 g) difraksinasi

menggunakan KVC sehingga diperoleh dua belas fraksi.

1) Pemisahan dan Pemurnian Senyawa 3, 5, dan 6.

F5 (53 mg) difraksinasi dengan KR, diperoleh 10 fraksi. F5 (2,2 mg)

sebagai senyawa 3, F7 (2,3 mg) sebagai senyawa 5, dan F9 (3,0 mg)

sebagai senyawa 6 dianalisis dengan NMR. Ketiga isolat senyawa

diklarifikasi strukturnya berdasarkan data HRMS.

2) Pemisahan dan Pemurnian Senyawa 1 dari Spons Cinachyrella sp.

F4 (107,7 mg) merupakan kristal berminyak yang berwarna

kekuningan, direkristalisasi beberapa kali sehingga membentuk kristal

30

putih (6,3 mg), analisis KLT kristal senyawa 1 (AB2.4) menunjukkan satu

spot.

Analisis KLT antara isolat AB1.3 dari spons C. australiensis dengan

isolat AB2.4 dari spons Cinachyrella sp., disimpulkan sebagai senyawa

yang sama (senyawa 1). Kristal senyawa 1 kemudian dianalisis NMR.

3) Pemisahan dan Pemurnian Senyawa 2 dari Spons Cinachyrella sp.

F10 (119,8 mg) difraksinasi dengan KR, diperoleh 5 fraksi. F3 (25,3

mg) dimurnikan dengan KR dan diperoleh F3 (4,4 mg) yang diberi kode

AB2.6.

F12 (500 mg) difraksinasi dengan KR, diperoleh 3 fraksi. F3 (139,4

mg) direfraksinasi dengan KR dan diperoleh F4 (21,6 mg). F4 dimurnikan

dengan KR dan diperoleh F1 (8,2 mg) yang diberi kode AB2.7.

Analisis KLT antara isolat AB1.4 dari spons C. australiensis dengan

isolat senyawa AB2.6 dan AB2.7 dari Spons Cinachyrella sp. disimpulkan

sebagai senyawa yang sama (senyawa 2). Serbuk senyawa 2 kemudian

dianalisis dengan NMR dan HRMS.

6. Uji Aktivitas Senyawa Pada Sel line Kanker Serviks

Senyawa-senyawa murni diuji sitotoksik dan antiproliferasi terhadap

sel HeLa mengikuti prosedur Rezano, et al., 2013.

a. Uji Sitotoksik dengan MTT.

Suspensi sel line kanker serviks (sel HeLa) ditanam pada 96 sumuran

dan diinkubasikan pada suhu 37°C selama 24-48 jam sampai sel

mencapai konfluen 70-80%. Sel kemudian diberi perlakuan variasi

31

konsentrasi 0, 1, 3, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 µg/mL

kemudin diinkubasi kembali selama 24, 48, dan 72 jam pada suhu 37°C.

Perlakuan ini dilakukan duplikat pada satu waktu dan diulang tiga kali

pada waktu berbeda. Sebagai kontrol positif digunakan etoposide dengan

konsentrasi 50 uM dan medium digunakan sebagai kontrol negatif. DMSO

digunakan sebagai pelarut obat dengan konsentrasi akhir < 1 %.

Pada akhir inkubasi, medium pada masing-masing sumuran dibuang,

dicuci dengan PBS 10% lalu diberikan reagen MTT sebanyak 100 µL dan

diinkubasi kembali selama 4 jam. Reduksi garam kuning tetrazolium MTT

oleh enzim reduktase (indikator sel hidup) yang terdapat dalam rantai

respirasi sel pada mitokondria membentuk kristal formazan berwarna

ungu. Reagen stopper SDS (bersifat detergenik) kemudian ditambahkan

yang akan melarutkan kristal formazan. Nilai absorbansi (Abs.) dari

masing-masing sumuran kemudian dibaca menggunakan ELISA reader

pada panjang gelombang 450 nm. Intensitas warna ungu yang terbentuk

proporsional dengan jumlah sel hidup. Persentase sel hidup dihitung

menggunakan rumus :

Penentuan nilai IC50 dilakukan dengan menganalisis respon konsentrasi

serial menggunakan regresi logaritmik.

32

b. Uji proliferasi sel dengan trypan blue

Metode trypan blue dilakukan dengan memberi perlakuan variasi

konsentrasi senyawa terhadap sel HeLa pada konsentrasi di sekitar

konsentrasi IC50 senyawa uji. Sel ditanam pada 6 sumuran sebanyak

5x105 sel per sumuran, diinkubasi selama 24 jam sampai sel mencapai

konfluen 70-80%. Selanjutnya, sel HeLa diberi perlakuan dengan

memberikan 10 µg/mL senyawa uji yang memiliki aktivitas sitotoksik pada

konsentrasi diatas dan dibawah 10 ppm dan diinkubasi serial waktu

selama 0, 1, 2, 3, 4, 5 hari. Perlakuan ini dilakukan duplikat pada satu

waktu dan diulang dua kali pada waktu berbeda .

Pada akhir inkubasi, medium sel dibuang dan dicuci dengan PBS

10%, kemudian sel dipanen menggunakan trypsin. Sebanyak 10 µL

suspensi sel dalam PBS dimasukkan ke 96 sumuran. Tambahkan trypan

blue dengan volume yang sama dengan volume suspensi sel, aduk

sampai homogen dengan menggunakan pipet. Masukkan suspensi

sel-trypan blue ke dalam kamar hemositometer. Hitung sel di bawah

mikroskop cahaya dengan tally counter. Sel yang mati akan terwarnai

trypan blue berwarna biru sedangkan sel yang hidup akan bulat, refraktif

dan tidak berwarna. Selanjutnya, proliferasi sel Hela dianalisis

menggunakan kurva linear dengan membandingkan jumlah sel (106)

terhadap serial waktu inkubasi.

33

BAB IV.

HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

Perolehan ekstrak kedua spons genus Cinachyrella dari perairan

Spermonde, metabolit sekunder yang terkandung pada ekstrak, toksisitas,

dan antioksidannya ditampilkan pada Tabel 4.

Tabel 4. Perolehan, Metabolit Sekunder, Toksisitas, dan Antioksidan Ekstrak Spons C. australiensis dan Cinachyrella sp.

Spesies Spons

Ekstrak Massa (gram)

Metabolit Sekunder

Toksisitas (LC50 ppm)

Antioksidan (IC50 ppm)

C.

au

str

alie

nsis

Meta

no

l K

asa

r

n-heksan 245,00 steroid (+) 7265,92 25176,76

Etil asetat 33,28 steroid (+) 247,57 1076,46

Metanol 166,00 alkaloid (+++) 624,97 5023,42

Cin

ach

yre

lla

sp

.

n-heksan 265,64 steroid (+) 742,56 849,37

Etil asetat 28,00 steroid (+) 338,31 639,73

Metanol 214,87 alkaloid (+++) 1952,84 1172,19

C.

au

str

alie

nsis

La

pis

an

Air

n-heksan 1,33 steroid (+) 4794,45

Etil asetat 9,40 372,71

Metanol 463,12 alkaloid (+) 15629,17

Cin

ach

yre

lla

sp

.

n-heksan 0,82 steroid (+) 297,25

Etil asetat 2,14 387,21

Metanol 227,00 alkaloid (+) 3676,98

Keterangan alkaloid (+++); positif Wegner, Meyer, Dragendorf alkaloid (+); positif Dragendorf

steroid (+); positif Liebermann Burchard

Senyawa yang terkandung pada ekstrak metanol kasar dari

C. australiensis dan Cinachyrella sp., didominasi senyawa-senyawa

non-polar. Tabel 4 menunjukkan bahwa perolehan ekstrak n-heksan

paling besar pada kedua spesies spons, selanjutnya ekstrak metanol

34

(senyawa polar), dan yang terkecil ekstrak etil asetat (senyawa

semi-polar). Sementara pada ekstrak lapisan air kedua spons lebih

didominasi senyawa-senyawa polar. Pada Tabel 4, tampak perolehan

ekstrak metanol kedua spons paling besar dibanding ekstrak etil asetat

dan n-heksan.

Berdasarkan kriteria toksisitas Meyer et al. (1982) pada Tabel 2,

empat ekstrak dari metanol kasar menunjukkan aktivitas toksik terhadap

larva A. salina. Tampak pada Tabel 4 nilai LC50 ekstrak etil asetat

C. australiensis (247,57 ppm) dan Cinachyrella sp. (338,31 ppm) lebih

rendah dari ekstrak metanol C. australiensis (624,97 ppm), dan ekstrak

n-heksan Cinachyrella sp. (742,56 ppm). Data tersebut menunjukkan

bahwa ekstrak etil asetat dari kedua spesies spons memiliki aktivitas

toksik yang terbesar dibanding ekstrak lainnya dan mengandung senyawa

golongan steroid. Pada Tabel 4, juga tampak ada tiga ekstrak dari lapisan

air yang menunjukkan aktivitas toksik terhadap larva A. salina yaitu

ekstrak etil asetat (LC50 372,71 ppm) C. australiensis, ekstrak n-heksan

(297,25 ppm) dan etil asetat (387,21 ppm) spons Chynachyrella sp., akan

tetapi kuantitas ekstrak tersebut sangat sedikit. Aktivitas toksik ekstrak

khususnya ekstrak etil asetat dari metanol kasar, merupakan indikasi

potensi aktif senyawa yang terkandung pada ekstrak etil asetat dari

C. australiensis dan Cinachyrella sp. terhadap sel kanker.

Aktivitas antioksidan seluruh ekstrak dari metanol kasar spons genus

Cinachyrella menunjukkan nilai IC50 > 200 ppm. Sesuai kriteria Molyneux

35

(2004) pada Tabel 3, nilai IC50 > 200 ppm merupakan aktivitas antioksidan

yang sangat lemah. Tabel 4 menunjukkan aktivitas antioksidan ekstrak

setiap spesies spons berbanding lurus dengan aktivitas toksik ekstrak

tersebut. Ekstrak etil asetat spons C. australiensis dan Cinachyrella sp.

dengan aktivitas terbaik dibanding ekstrak lainnya, masing-masing dengan

nilai LC50 (247,57 dan 338,31 ppm) dan IC50 (1076,46 dan 639,73 ppm).

Hal tersebut merupakan indikasi bahwa senyawa dengan potensi

antikanker terkandung pada ekstrak etil asetat kedua spesies spons.

A. Komponen Senyawa Hasil Isolasi dari Spons Cinachyrella.

1. Guneribol [1].

Senyawa 1 diperoleh berupa kristal pasir berwarna putih dengan titik

leleh 130-133 0C. Data NMR (1H, 13C, DEPT, HSQC, HMBC, H2BC)

senyawa 1 ditampilakan pada Tabel 5.

Hubungan korelasi H2BC dan HMBC antara proton (empat angka

dibelakang koma) ke karbon (dua angka dibelakang koma) pada senyawa

1 digambar sebagai berikut. .

H2BC HMBC

36

Tabel 5. Data NMR senyawa 1

No C

HSQC DEPT HMBC H2BC

δC (ppm) δH (ppm)

1 37,22 1,8173 CH2 C3, C5, C10, C19 1,0626 C2, C10

2 31,46 1,8173 CH2 C3, C4, C10 1,4757

3 71,61 3,4950 CH C2, C4

4 42,11 2,2546 CH2

5 140,74 C

6 121,66 5,3329 CH C4, C7, C10

7 31,88 1,9382 CH2 C9 1,5173 C8

8 31,86 1,4327 CH C9, C14

9 50,09 0,9051 CH C11

10 36,47 C

11 21,05 1,4826 CH2 1,4240

12 39,74 1,9842 CH2 1,1466 C18 C11

13 42,28 C

14 56,72 0,9929 CH C17, C18 C13

15 24,27 1,5495 CH2 1,0536 C14

16 28,22 1,8173 CH2 1,2408 C17

17 55,99 1,0839 CH C18 C20

18 11,83 0,6650 CH3

19 19,37 0,9925 CH3 C1, C5, C9, C10

20 35,86 1,3501 CH C21, C22

21 18,67 0,9051 CH3 C20

22 18,69 0,9051 CH3 C20

Data HSQC menunjukkan bahwa ada delapan karbon metilen yang

seluruhnya terangkai pada kerangka cincin, menguatkan analisis NMR.

Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa senyawa 1 adalah Guneribol

37

[1]

2. 3-hidroksi-3-metil-2-indolinon [2].

Senyawa 2 diperoleh berupa serbuk berwarna hijau muda. Data NMR

(1H, 13C, HSQC, HMBC) senyawa 2 ditampilakan pada Tabel 6.

Tabel 6. Data NMR senyawa 2.

No. C

δC (ppm) δH [i, m, J (Hz)] (ppm) 1H 13C

2 2* 2 2* HSQC HMBC

1 - - 9.32 [1H, bs] (proton NH)

7.81 [1H, bs, -NH]

- -

2 179.51 180.2 - - - -

3 73.07 73.9 - - - -

3a 133.35 131.7 - - - -

4 109.69 110.2 6.91 [1H, d, 7.4]

6.88 [1H, bd, 7.8]

C4 C3, C3a, C5

5 121.95 123.3 7.02 [1H, td, 7.5, 7.4]

7.09 [1H,ddd, 7.8, 7.8, 1.1]

C5 C3a, C4, C6, C7

6 128.93 129.7 7.23 [1H, td, 7.8, 7.5]

7.26 [1H,ddd, 7.8, 7.8, 1.1]

C6 C4, C7, C7a

7 123.50 123.9 7.37 [1H, d, 7.8]

7.40 [1H, bd, 7.8]

C7 C3, C6, C7a

7a 141.18 139.7 - - - -

8 24.19 24.8 1.50 [3H, s] 1.60 [s, Me] C8 C2, C3, C3a

- - - 4.99 [1H, s] (proton OH)

2.85 [1H,s, -OH]

- C2, C3, C3a, C8

2 Senyawa hasil isolasi (1H NMR, 500 MHz; 13C NMR, 125 MHz; aseton-d6) 2* Chen, et al. (2015) (1H NMR, 600 MHz; 13C NMR, 150 MHz; CDCl3)

38

Hubungan korelasi HSQC (garis tebal) dan HMBC (tanda panah),

antara proton ke karbon pada senyawa 2 digambar sebagai berikut.

Spektrum HRMS menunjukkan massa ion molekul pada m/z 162.0559

dan massa kalkulasi 162.0555 yang sesuai dengan formula molekul

C9H8NO2 [M-H]. Data HRMS menunjukkan struktur senyawa 2

mengandung heteroatom N menguatkan usulan struktur dari analisis

NMR, maka senyawa 2 adalah 3-hidroksi-3-metil-2-indolinon.

[2]

3. 3-karbonitril indol [3].

Senyawa 3 diperoleh berupa gel berwarna coklat. Spektrum TOCSY

menunjukkan proton pada δH 7,48 ppm kopling tiga ikatan dengan proton

δH 7,35 ppm dan kopling empat ikatan dengan proton δH 7,32 ppm. Hal ini

berarti bahwa proton δH 7,48 kopling orto dengan proton δH 7,35 ppm,

proton δH 7,35 kopling orto pula dengan proton δH 7,32 ppm, dan proton

δH 7,32 juga kopling orto dengan proton δH 7,80 ppm. Proton pada δH 7,75

ppm tidak kopling dengan proton aromatik yang ada, sebab proton δH 7,75

39

terangkai pada gugus alkena dan ada C kuarterner yang membatasi

korelasinya ke proton aromatik. Data NMR (1H, 13C, HSQC, HMBC, hmbc

3Hz, CIGAR) senyawa 3 ditampilakan pada Tabel 7.

Tabel 7. Data NMR senyawa 3

No. C

δC (ppm) δH [i, m, J (Hz)] (ppm) 1H 13C

3 3* 3 3* HSQC HMBC HMBC 3HZ

CIGAR

1 - - 8,80 [1H, bs]

8.86 [1H, s]

- - - -

2 131,74 131.7 7,75 [1H,d,2.8]

7.76 [1H, s]

C2 C3a, C7a, C8

C3, C7a

C3,C3a, C8

3 115,75 115.7 - - - - - -

3a 126,94 126.9 - - - - - -

4. 119,75 119.6 7,80 [1H,d,7.6]

7.81 [1H,d,6.4]

C4 C6, C7a - -

5 122,39 122.3 7,32 [1H,t,7.2]

7.31 [1H, m]

C5 C3a, C7 - -

6 124,33 124.3 7,35 [1H,t,7]

7.42 [1H, m]

C6 C4, C7a - -

7 111,99 112.0 7,48 [1H,d,7.9]

7.51 [1H,d,8.4]

C7 C3a, C5 - -

7a 134,80 134.8 - - - - - -

8 87,63 87.5 - - - - - -

3 Senyawa hasil isolasi (1H NMR, 500 MHz; 13C NMR, 125 MHz; CDCl3) 3* Yuen, et al. (2013) (1H NMR, 400 MHz; 13C NMR, 100 MHz; CDCl3)

Korelasi HSQC (garis tebal), HMBC ( ), HMBC 3Hz ( ), dan CIGAR ( ) antara proton ke karbon pada usulan struktur senyawa 3 adalah :

40

Data HRMS menunjukkan massa ion molekul pada m/z 141.0453 dan

massa kalkulasi 141.0453 yang sesuai dengan formula molekul C9H5N2

[M-H]. Data HRMS mendukung usulan struktur dari analisis NMR, maka

senyawa 3 adalah 3-karbonitril indol.

[3]

4. Asam-3-(4-hidroksi fenil) propanoat [4].

Senyawa 4 diperoleh berupa gel berwarna hijau kekuningan.

Data 1H dan 13C NMR senyawa 4 dibandingkan dengan senyawa

asam-3-(4-hidroksi fenil) propanoat yang telah dilaporkan pada literatur

disajikan pada Tabel 8.

Tabel 8. Data 1H dan 13C NMR asam-3-(4-hidroksi fenil) propanoat.

No C. δC δH [integrasi, m, J (Hz)]

4 4* 4 4*

1 176,47 179,9 - -

2 37,11 35,5 2,89 [2H,t, 7.5] 2,89 [2H,t, 8.0]

3 35,68 29,8 2,63 [2H,t, 7.5] 2,64 [2H,t, 8.0]

1’ 132,23 131,1 - -

2’ & 6’ 129,41 129,4 7,07 [2H,d, 8.2] 7,07 [2H,d, 8.0]

3’ & 5’ 115,38 115,4 6,76 [2H,d, 8.2] 6,76 [2H,d, 8.0]

4’ 154,19 155,6 - - 4 Senyawa hasil isolasi (1H NMR, 500 MHz; 13C NMR, 125 MHz; CDCl3) 4* Takahashi, et al. (2010) (1H NMR, 400 MHz; 13C NMR, 100 MHz; CDCl3)

Data HRMS menunjukkan massa ion molekul pada m/z 165,0547 dan

massa kalkulasi 165,0552 sesuai dengan formula molekul C9H9O3 [M-H],

maka senyawa 4 adalah asam-3-(4-hidroksi fenil) propanoat.

41

[4]

5. 4-hidroksi benzonitril [5].

Senyawa 5 diperoleh berupa gel berwarna kecoklatan. Data 1H NMR

Senyawa 5 dibandingkan dengan senyawa 4-hidroksi benzonitril yang

telah dilaporkan pada literatur disajikan pada Tabel 9.

Tabel 9. Data 1H NMR Senyawa 4-hidroksi benzonitril

δH [integrasi, m, J (Hz)]

5 5*

5.37 [1H, bs] 6.79 [1H, bs]

6.94 [2H, d, 8.4] 6.94 [2H, d, 8.6]

7.54 [2H, d, 8.4] 7.56 [2H, d, 8.6]

5 Senyawa hasil isolasi (1H NMR, 500 MHz; CDCl3) 5* Chankeshwara, et al. (2008) (1H NMR, 300 MHz; CDCl3)

Data tersebut mengindikasikan adanya bidang simetri pada cincin

benzen. Signal brod singlet pada δH 5.37 ppm merupakan signal proton

gugus –OH yang terangkai ke cincin aromatik dan berposisi para terhadap

subtituen berikutnya.

Spektrum HRMS menunjukkan massa ion molekul pada m/z 118.0298

dan massa kalkulasi 118.0293 yang sesuai dengan formula molekul

C7H4NO [M-H], mengindikasikan bahwa subtituen berikutnya adalah

gugus –CΞN. Berdasarkan analisis data 1H NMR dan HRMS maka

senyawa 5 adalah 4-hidroksi benzonitril.

42

[5]

6. Asam-4-metil benzoat [6].

Senyawa 6 diperoleh berupa gel berwarna kecoklatan. Data 1H NMR

Senyawa 6 dibandingkan dengan senyawa asam-4-metil benzoat yang

telah dilaporkan pada literatur disajikan pada Tabel 10.

Tabel 10. Data 1H NMR Senyawa Asam-4-metil benzoat

δH [integrasi, m, J (Hz)]

6 6*

2.56 [3H, s] 2.43 [3H, s] 6.89 [2H, d, 8.8] 7.28 [2H, d, 8.1] 7.90 [2H, d, 8.8] 8.01 [2H, d, 8.1] 6 Senyawa hasil isolasi (1H NMR, 500 MHz; CDCl3) 6* Nemoto, et al. (2010) (1H NMR, 400 MHz; CDCl3)

Data tersebut mengindikasikan adanya bidang simetri pada cincin

benzen. Signal singlet pada δH 2.56 ppm merupakan signal proton gugus

–CH3 yang terangkai ke cincin aromatik dan berposisi para terhadap

subtituen berikutnya.

Spektrum HRMS menunjukkan massa ion molekul pada m/z 135.0441

dan massa kalkulasi 135.0446 yang sesuai dengan formula molekul

C8H7O2 [M-H], mengindikasikan bahwa subtituen berikutnya adalah gugus

–COOH. Berdasarkan analisis data 1H NMR dan HRMS maka senyawa 6

adalah asam-4-metil benzoat.

[6]

43

B. Metabolit Sekunder Spons Cinachyrella dan Bahan Alam Lain

1. Sterol

Guneribol [1] merupakan senyawa sterol dengan rantai samping

pendek (kurang dari delapan atom karbon), yang secara biosintesis jarang

ditemukan. Carlson et al. (1978), telah mengidentifikasi sterol dengan

rantai samping pendek pada ekstrak beberapa invertebrata laut (Porifera

dan Coelenterata). Palermo et al. (1996) mengidentifikasi sterol dengan

rantai samping pendek yaitu senyawa 1 dan 20-etilpregn-5-en-3β-ol dari

pir laut Polyzoa opuntia. Kamenarska et al. (2002) mengidentifikasi

senyawa 1 (0,3%) dari alga coklat Cystoseira crinita dengan GC.

Senyawa 1 yang berhasil diisolasi pada penelitian ini, pertama kali

diidentifikasi dari spons laut genus Cinachyrella.

Senyawa 1 terbentuk melalui jalur biosintesis yang lazim pada

pembentukan senyawa sterol, diawali pembentukan asetat teraktifasi

melalui jalur asam mevalonat hingga menghasilkan farnesil pirofosfat

(FPP). Dua molekul FPP kemudian bergabung secara ekor-ekor

membentuk triterpen skualen yang kemudian menggalami oksidasi

menjadi 2,3-epoksiskualen, selanjutnya terjadi siklisasi ganda disusul

penataan atom-atom hidrogen dan gugus metil menghasilkan lanosterol.

Kemudian terjadi pelepasan tiga gugus metil (2 gugus metil pada C4 dan

dan 1 gugus metil pada C14) membentuk kolesterol (Dewick, 2002).

Kolesterol kemudian mengalami reduksi pada rantai samping membentuk

guneribol dengan melepaskan isopentan.

44

2. Alkaloid Indol.

Senyawa 3-hidroksi-3-metil-2-indolinon [2] dan 3-karbonitril indol [3]

merupakan senyawa alkaloid indol yang telah dikenal sebelumnya.

Senyawa 2 diidentifikasi dari urin pasien schizophrenic dengan

spektrometri massa dan NMR, senyawa tersebut yang tidak berkaitan

dengan obat yang diberikan. Laporan ini yang pertama kali mengaitkan

senyawa 2 dengan biokimia manusia dan diduga sebagai produk oksidasi

in vivo 3-metil indol melalui jalur metabolisme triptofan yang diproduksi

oleh bakteri di usus besar (Albrecht. et al., 1989). Skiles. et al. (1989)

mengidentifikasi senyawa 2 sebagai metabolit utama pada urine tikus, ini

adalah identifikasi pertama indole dari sumber mamalia.

Dua senyawa baru turunan nitrotiramine dan senyawa 3 diisolasi dari

broth kultur bakteri halofilik anaerob Barillus murinus. Senyawa 3

sebelumnya dikenal sebagai produk sintetis, ini untuk pertama kalinya

dilaporkan sebagai produk alami (Fu dan Schmitz, 1995). Senyawa 3 dan

sepuluh senyawa lain, berhasil diisolasi dari alga merah Grateloupia

turuturu. Kesebelas komponen tersebut pertama kali diisolasi dari

G. turuturu (Li. et al., 2008).

Hasil fermentasi cair jamur endophytic Hypoxylon sp. yang berasosiasi

dengan akar tumbuhan Taiwanese Ilex formosana, berhasil diisolasi

senyawa 2 untuk pertama kalinya dari sumber alami (Chen.et al., 2015).

He., et al. (2015), berhasil mengisolasi senyawa 2 dari jamur Capnodium

sp. yang berasosiasi dengan mangrove. Ekstrak jamur menunjukkan efek

45

penghambatan yang baik pada pertumbuhan miselium jamur Fusarium

graminearum pada 100 μg/mL, namun senyawa 2 tidak menunjukkan

aktivitas antijamur yang diharapkan.

Senyawa 2 dan 3 baru pertama kali diisolasi dan diidentifikasi dari

spons laut genus Cinachyrella. Kedua senyawa terbentuk melalui jalur

biosintesis 3-metil indol sebagai produk degradasi asam amino triptopan

oleh bakteri simbion sponge C. australiensis dan Cinachyrella sp.

Senyawa 3-metil indol mengalami oksidasi membentuk 2,3-epoksi-3-metil

indol, kemudian teroksidasi lebih lanjut menjadi 3-metiloksindol

selanjutnya membentuk senyawa 2. Senyawa 2,3-epoksi-3-metil indol

melalui beberapa tahap berubah menjadi 3-hidroksi-3-metilindolenin dan

selanjutnya teroksidasi menjadi senyawa 2. Senyawa 3-metil indol

mengalami pelepasan elektron menjadi 3-metilenindolenin (Lanza et al.,

1999; D’Agostino et al., 2009). Karbon metilen pada 3-metilenindolenin

kemudian berikatan dengan NH3 yang merupakan produk deaminasi dari

asam amino, kemudian mengalami dehidrogenasi membentuk senyawa 3.

3. Senyawa Turunan Benzen.

Senyawa asam-3-(4-hidroksi fenil) propanoat [4]; 4-hidroksi benzonitril

[5]; dan asam-4-metil benzoat [6] merupakan senyawa aromatik turunan

benzen yang dikenal sebagai produk sintetis. Senyawa 4, 5, 6 untuk

pertama kalinya diisolasi dan diidentifikasi dari spons genus Cinachyrella.

Beberapa senyawa turunan benzena yaitu etil 4-hidroksi benzoat,

asam 4-hidroksi benzoat, asam 4-metoksi benzoat, dan 4-hidroksi

46

benzaldehid berhasil diisolasi dari spons laut Ianthella sp. (Zhang. et al.,

2012). Analisis GC-MS mengidentifikasi senyawa 4 dan 54 senyawa lain

dari ekstrak supernatan statis dan ekstrak miselium jamur Aspergillus

unguis. Ekstrak jamur diisolasi dari sponge Agelas sp. (Abd El-Hady. et

al., 2015).

C. Bioaktivitas Senyawa-Senyawa Hasil Isolasi dari Spons Cinachyrella.

Aktivitas sitotoksik keenam senyawa [1-6] yang berhasil diisolasi dari

spons C. australiensis dan Cinachyrella sp. terhadap sel line kanker

serviks (sel HeLa) disajikan pada Tabel 11.

Tabel 11. Aktivitas Sitotoksik Senyawa Terhadap Sel HeLa

Senyawa Sitotoksik (IC50 ppm)

Asam-4-metil benzoat [6] 5,45

3-hidroksi-3-metil-2-indolinon [2] 6,42

3-karbonitril indol [3] 9,32

Guneribol [1] 9,89

Asam-3-(4-hidroksi fenil) propanoat [4] 12,98

4-hidroksi benzonitril [5] 20,63

Senyawa 6 memiliki potensi ketoksikan paling aktif terhadap sel HeLa

dengan nilai IC50 terkecil dibandingkan senyawa lain yang berhasil

diisolasi Uji aktivitas antiproliferasi dilakukan terhadap senyawa di sekitar

konsentrasi IC50 senyawa [1-6]. Agar kinetika pertumbuhan sel dapat

diamati maka senyawa 1 dan 4 dengan nilai IC50 masing-masing 9,89

dan12,98 ppm dipilih sebagai senyawa uji.

Analisis proliferasi dilakukan dengan membandingkan waktu inkubasi

0-5 hari terhadap persen inhibisi proliferasi sel HeLa pada kontrol medium

47

dan 10 µg/mL senyawa uji [1 dan 4]. Gambar 2 menunjukkan bahwa

proliferasi sel pada kontrol tidak mengalami hambatan, sehingga

pertumbuhan jumlah sel terus meningkat seiring waktu inkubasi. Ini berarti

bahwa sel mampu beradaptasi dengan lingkungan media. Hal yang

hampir sama terlihat pada perlakuan dengan 10 µg/mL senyawa 4,

proliferasi sel HeLa tidak mengalami hambatan sehingga jumlah sel terus

bertambah seiring waktu inkubasi. Ini berarti senyawa 4 tidak sitotoksik

terhadap sel HeLa.

a. b.

Gambar 2. Kinetika Proliferasi Sel HeLa pada 10 µg/mL Senyawa Uji

Pada perlakuan dengan 10 µg/mL senyawa 1, proliferasi sel terus

berlangsung sampai hari ke-2. Penghambatan proliferasi sel mulai tampak

pada hari ke-3 dengan persen inhibisi 1,77% dan terus berlangsung pada

hari ke-4 (2,65%) hingga hari ke-5 (15,75%). Ini berati senyawa 1

sitotoksik terhadap sel HeLa yang ditunjukkan dari kemampuannya untuk

menghambat proliferasi sel setelah hari ke-2 sehingga jumlah sel hidup

berkurang seiring waktu inkubasi. Berdasarkan profil kinetika proliferasi

pada Gambar 2, senyawa 6, 2, dan 3 dengan nilai IC50 lebih kecil dari IC50

48

senyawa 1 juga memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel dan mampu

menghambat proliferasi sel HeLa, sementara senyawa 4 dan 5 tidak

sitotoksik terhadap sel HeLa.

Mekanisme aktivitas senyawa dari spons genus Cinachyrella terhadap

sel kanker serviks diawali oleh interaksi antara senyawa dengan reseptor

pada sel membentuk kompleks senyawa-reseptor yang memicu timbulnya

respon biologis dan mempengaruhi aktivitas sel. Reseptor merupakan

bagian pada struktur sel yang berfungsi mengenal dan mengikat suatu

senyawa kemudian meneruskannya ke dalam sel (Ahmad, 2012). Ikatan

kimia yang membentuk kompleks senyawa-reseptor dipengaruhi oleh

struktur molekul dan gugus fungsi dari senyawa. Perbedaan aktivitas

senyawa 4, 5, dan 6 yang merupakan turunan benzen, disebabkan

perbedaan gugus fungsi pada cincin benzen.

Senyawa 4 dan 5 memiliki gugus fungsi yang memungkinkan

terbentuknya ikatan hidrogen intermolekul dan membentuk polimer linier.

Polimer linier tersebut memiliki ikatan hidrogen antar molekul yang

menghalangi pembentukan kompleks senyawa-reseptor, sehingga

senyawa tersebut sukar menembus membran sel. Hal tersebut

menyebabkan senyawa 4 dan 5 memiliki aktivitas yang lemah terhadap

sel kanker serviks.

Aktivitas senyawa 5 terhadap sel HeLa lebih lemah dibandingkan

dengan senyawa 4. Energi ikatan hidrogen antar molekul pada senyawa 5

lebih besar dibandingkan dengan senyawa 4, sehingga pembentukan

49

kompleks senyawa-reseptor pada senyawa 5 menjadi lebih susah. Pada

senyawa 5, delokalisasi elektron dari cincin benzen akan meningkatkan

rapatan elektron pada atom N dari gugus CN dengan mengemban muatan

negatif dan mengurangi rapatan elektron pada atom O dari gugus OH

dengan mengemban muatan positif, sehingga energi ikatan hidrogen

intermolekulnya menjadi lebih besar dan akan lebih kuat menghalangi

pembentukan kompleks senyawa-reseptor.

Pada senyawa 4, induksi elektron ke arah gugus propanoat tidak

meningkatkan rapatan elektron pada gugus karboksil yang berjarak tiga

ikatan dari cincin benzen. Rapatan elektron yang kurang melimpah pada

gugus karboksil menyebabkan energi ikatan hidrogen intermolekulnya

menjadi lebih kecil dan akan lebih lemah untuk menghalangi pembentukan

kompleks senyawa-reseptor.

Gugus fungsi pada senyawa 6 hanya dapat membentuk dimer melalui

ikatan hidrogen intermolekul antar gugus karboksil tanpa melibatkan

gugus metil pada posisi orto, sehingga strukturnya menjadi lebih nonpolar.

Gugus metil yang bebas dari ikatan hidrogen dan sturuktur dimer yang

nonpolar menyebabkan senyawa 6 mudah berinteraksi dengan reseptor

untuk membentuk kompleks senyawa-reseptor dan lebih mudah

menembus membran sel sehingga sangat sitotoksik terhadap sel kanker

serviks dibandingkan dengan isolat lainnya.

Senyawa 2 dan 3 merupakan alkaloid jenis indol. Kedua senyawa

menunjukkan aktivitas sitotoksik terhadap sel HeLa dengan nilai IC50 yang

50

sedikit berbeda karena dipengaruhi oleh gugus fungsinya. Struktur

senyawa 3 dapat membentuk dimer melalui ikatan hidrogen intermolekul

yang menghalangi efektivitas interaksi gugus aktifnya (CN dan NH)

dengan reseptor, sehingga kompleks senyawa-reseptor lebih sulit

terbentuk.

Struktur senyawa 2 dapat membentuk kelat melalui ikatan hidrogen

intramolekul antara oksigen karbonil dengan hidrogen hidroksi, sehingga

efektivitas interaksi gugus aktifnya (CH3 dan NH) dengan reseptor tidak

terhalang. Sturuktur senyawa 2 yang lebih mudah berinteraksi dengan

reseptor membentuk kompleks senyawa-reseptor yang menyebabkan

sitotoksisitasnya lebih tinggi karena senyawa tersebut lebih mudah

menembus membran sel dibandingkan dengan senyawa 3.

51

BAB V.

KESIMPULAN DAN SARAN

A. KESIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian karakterisasi senyawa dan bioaktivitas

antikanker metabolit sekunder dari spons C. australiensis dan Cinachyrella

sp. asal perairan Spermonde Sulawesi Selatan, maka disimpulkan

sebagai berikut :

1. Ekstrak etil asetat spons C. australiensis dan Cinachyrella sp. asal

perairan Spermonde Sulawesi Selatan menunjukkan aktivitas toksik

yang lebih baik dari ekstrak lainnya dengan nilai LC50 masing-masing

247,57 dan 338,31 ppm.

2. Aktivitas antioksidan ekstrak spons C. australiensis dan Cinachyrella

sp. asal perairan Spermonde Sulawesi Selatan berbanding lurus

dengan aktivitas toksik ekstrak tersebut. Ekstrak etil asetat kedua

spesies spons memiliki nilai IC50 dan LC50 paling rendah dibandingkan

ekstrak lainnya.

3. Komponen senyawa yang berhasil diisolasi dan diidentifikasi dari

spons C. australiensis dan Cinachyrella sp. asal perairan Spermonde

Sulawesi Selatan adalah; satu senyawa sterol yaitu guneribol [1],

dua senyawa alkaloid indol yaitu 3-hidroksi-3-metil-2-indolinon [2],

3-karbonitril indol [3], dan tiga senyawa turunan benzen yaitu

asam-3-(4-hidroksi fenil) propanoat [4], 4-hidroksi benzonitril [5],

asam-4-metil benzoat [6].

52

4. Keenam senyawa [1, 2, 3, 4, 5, 6] bersifat sitotoksik terhadap sel

HeLa dengan nilai IC50 berturut-turut 9,89; 6,42; 9,32; 12,98; 20,63

dan 5,45 ppm. Analisis antiproliferasi menunjukkan bahwa empat

senyawa [1, 2, 3, 6] memiliki aktivitas antikanker terhadap sel HeLa

dengan nilai IC50 < 10 ppm.

5. Senyawa 1 terbentuk melalui jalur asam mevalonat yang

menghasilkan kolesterol kemudian mengalami reduksi membentuk

senyawa 1. Senyawa 2 dan 3 terbentuk dari 3-metil indol yang

merupakan hasil degradasi asam amino triptopan. 3-metil indol

mengalami beberapa tahap oksidasi dan membentuk senyawa 2.

3-metil indol mengalami pelepasan elektron kemudian berikatan

dengan gugus NH3 membentuk senyawa 3.

B. SARAN.

1. Perlu dilakukan penelitian lanjutan guna mewujudkan obat antikanker

baru dari bahan alam laut, mulai dari sintesis senyawa dengan

aktivitas antikanker terhadap sel HeLa, dilanjutkan dengan uji in vivo

guna mengetahui aktivitas senyawa pada jaringan kanker, hingga uji

pra klinis dan klinis pada bidang medis.

2. Perlu dilakukan penelitian dengan uji bioaktivitas yang lain, sehingga

potensi senyawa dari spons Cinachyrella dengan spektrum yang lebih

luas dapat diketahui.

53

DAFTAR PUSTAKA

Abd El-Hady, F.K., Abdel-Aziz, M.S., Shaker, K.H., El-Shahid, Z.A.,

Ibrahim, L.S. 2015. Antioxidant, Acetylcholinesterase and α-Glucosidase Potentials of Metabolites from the Marine Fungus Aspergillus unguis RSPG_204 Associated with the Sponge (Agelas sp.) Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res. 30(1), No. 48, 272-278.

Abraham, Soekamto, N.H., Natsir, H., Syah, Y.M. 2016. Studi Pendahuluan Ekstrak Lapisan Air Spons Genus Cinachyrella Asal Perairan Spermonde Sulawesi Selatan. Buku Abstrak Simposium Nasional Kimia Bahan Alam Indonesia XXIV, Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta, 17-19 Oktober, 59.

Abraham, Syah, Y.M., Natsir, H., Soekamto, N.H. 2017. Anticancer Pre-screening of Marine Sponge Cinachyrella Extract From Spermonde Archipelago, South Sulawesi, Indonesia. Res. J. Pharm. Biol. Chem. Sci. 8(4): 833-837.

Abraham, Syah, Y.M., Natsir, H., Soekamto, N.H. 2018. Benzene derivatives from the marine sponges Cinachyrella. J. Phys. Conf. Ser. 979. 012022. 1-4.

Ahmad, A. 2012. Pendekatan Biokimia dan Medisinal Senyawa Kimia Obat. Dua Satu Press. ISBN: 978-602-18631-1-4

Aiello, A., Fattorusso, E., Magno, S., Menna, M., and Panzini, M. 1991. Steroids of The Marine Sponge Cinachyra tarentina : Isolation of Cholest-4-ene-3,6-dione and (24R)-24- Ethylcholest-4-ene-3,6-dione. J. Nat. Prod. 54(1): 281-285.

Albrecht C.F., Chorn D.J., dan Wessels P.L. 1989. Detection of 3-Hydroxy-3-Methyloxindole in Human Urine. Life Sci. 45(12) : 1119-1126.

Amir, I. dan Budiyanto, A. 1996. Mengenal Spons Laut (Demospongiae) Secara Umum. Oseana. XXI(2) : 15-31.

Antolovich, M., Prenzler, P.D., Patsalides, E., McDonanald, S., Robards, K. 2002. Methods for testing antioxidant activity. Analyst. 127 : 183–198.

Barnathan, G., Miralles, J., Njinkoue, J.M., Mangoni, A., Fattorusso, E., Debitus, C., Esnault, N.B., and Kornprobst, J.M. 1992. Sterol Composition of Three Marine Sponge Species from the Genus Cinachyrella. Comp. Biochem. Physiol. 103B(4) : 1043-1047.

54

Barnathan, G., Genin, E., Velosaotsy, N.E., Kornprobst, J.M., Al-Lihaibi, S., Al-Sofyani, A., Nongonierma, R. 2003. Phospholipid fatty acids and sterols of two Cinachyrella sponges from the Saudi Arabian Red Sea: comparison with Cinachyrella species from other origins. Comp. Biochem. Physiol. Part B. 135 : 297-308.

Beesoo, R., Vidushi, N.-B., Bhagooli, R., Bahorun, T. 2014. Apoptosis inducing lead compounds isolated from marine organisms of potential relevance in cancer treatment. Mutat. Res. 768 : 84–97.

Bell, J.J. 2008. Sponges as agents of biological disturbance. Mar. Ecol. Prog. Ser. 368 : 127–135.

Bergquist, P.R., Hofheinz, W., and Oesterhelt, G. 1980. Sterol Composition and the Classification of the Demospongiae. Biochem. Syst. Ecol. 8 : 423-435.

Carlson, R.M.K., Popov, S., Massey, I., Delseth, C., Ayanoglu, E., Varkony, T.H., and Carl Djerassi, C., 1978. Minor and Trace Sterols in Marine Invertebrates. VI. Occurrence and Possible Origins of Sterols Possessing Unusually Short Hydrocarbon Side Chains. Bioorg. Chem. 7 : 453-479.

Castell, J.V., Gomez-Lechon, M.J., Ponsoda, X., and Bort, R. 1997. In vitro Investigation of Molecular Mechanisms of Hepatotoxicity. Arch. Toxicol. 19 : 313-321.

Chambers, K., Padovan, A., Alvarez, B., and Gibb, K. 2013. Microbial signatures can help distinguish moon sponges (family Tetillidae) from Darwin Harbour, Australia. Mar. Freshwater Res.

Chankeshwara, S.V., Chebolu, R., and Chakraborti, A.K. 2008. Organocatalytic Methods for Chemoselective O-tert-Butoxycarbonylation of Phenols and Their Regeneration from the O-t-Boc Derivatives. J. Org. Chem. 73 : 8615–8618.

Chen. Y-S., Cheng. M-J., Hsiao. Y., Hing-Yuen Chan. H-Y., Hsieh. S-Y., Chang. C-W., Liu. T-W., Chang. H-S., and Chen. I-S. 2015. Chemical Constituents of the Endophytic Fungus Hypoxylon sp. 12F 0687 Isolated from Taiwanese Ilex formosana. Helv. Chim. Acta. 98 : 1167-1176

Cleary, D.F.R., Becking, L.E., de Voogd, N.J., Renema, W., de Beer, M., van Soest, R.W.M., Hoeksema, B.W. 2005. Variation in the diversity and composition of benthic taxa as a function of distance offshore, depth and exposure in the Spermonde Archipelago, Indonesia. Estuar. Coast. Shelf Sci. 65 : 557-570.

55

D’Agostino J., Zhuo X., Shadid M., Morgan D.G., Zhang X., Humphreys W.G., Yue-Zhong S., Yost G.S., and Ding X. 2009. The Pneumotoxin 3-Methylindole Is a Substrate and a Mechanism-Based Inactivator of CYP2A13, a Human Cytochrome P450 Enzyme Preferentially Expressed in the Respiratory Tract. Drug Metab. Dispos. 37(10) : 2018-2027.

Dewick P.M., 2009. Medicinal Natural Products: A Biosynthetic Approach, 3rd Edition. John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-74168-9

El-Amraoui, B., Biard, J.-F., Uriz, M.J., Rifai, S., Fassouane, A. 2010. Antifungal and antibacterial activity of Porifera extracts from the Moroccan Atlantic coasts. J. de Mycol. Méd. 20 : 70—74.

Fu X. dan Schmitz F. J. 1995. Chemical Constituents of Halophilic Facultatively Anaerobic Bacteria, 1. J. Nat. Prod. 58(12) : 1950-1954

He H., Ma Z., Wang Q., Liu Y., and Xu H. 2015. Chemical constituents of the mangrove-associated fungus Capnodium sp. SZ-F22. A new eremophilane sesquiterpene. Nat. Prod. Res. 1-6.

Hochmuth, T., Niederkruger, H., Gernert, C., Siegl, A., Taudien, S., Platzer, M., Crews, P., Hentschel, U., and Piel, J. 2010. Linking Chemical and Microbial Diversity in Marine Sponges: Possible Role for Poribacteria as Producers of Methyl-Branched Fatty Acids. ChemBioChem. 11: 2572 – 2578.

Huffard C.L., Erdmann M.V., Gunawan T.R.P. 2012. Geographic Priorities for Marine Biodiversity Conservation in Indonesia. ResearchGate (Online). (http://www.researchgate.net/ publication/263083689. diakses 31 Desember 2015)

Iwamaru, A., Szymanski, S., Iwado, E., Aoki, H., Yokoyama, T., Fokt, I., Hess, K., Conrad, C., Madden, T., Sawaya, R., Kondo, S., Priebe, W., and Kondo, Y. 2007. A novel inhibitor of the STAT3 pathway induces apoptosis in malignant glioma cells both in vitro and in vivo. Oncogene. 26 : 2435–2444.

Kamenarska, Z., Yalcın, F.N., Ersöz, T., Calis¸ I., Stefanov K., and Popov, S., 2002. Chemical Composition of Cystoseira crinita Bory from the Eastern Mediterranean. Z. Naturforsch. 57c : 584-590.

Kappel, H. 2011. Henrietta Lacks and Her ―Immortal‖ Cells. Dartmouth Undergrad. J. Sci. 12-13.

Lakshmi, V., Raghubir, R. and Gupta, P. 2008. New ceramides from the sponge Cinachyra cavernosa. J. of Asian Nat. Prod. Res. 10(8) : 747-751.

56

Lanza D.L., Code E., Crespi C.L., Gonzalez F.J., and Yost G.S. 1999. Specific Dehydrogenation of 3-Methylindole and Epoxidation of Naphthalene by Recombinant Human CYP2F1 Expressed in Lymphoblastoid Cells. Drug Metab. Dispos. 27(7) : 798-803.

Lasisi, A. and Idowu, O. 2011. In vitro anthelmintic and cytotoxic activities of extracts from the stem barks of Berlinia confusa (C. Hoyle) and identification of its active constituents. J. of Saudi Chem. Soc. 18 : 939–944.

Li K., Li X.M., Wang B.G. 2008. Chemical constituents of the red alga Grateloupia turuturu. J. Biotechnol. 136, Supplement, S598-S599

Li, Li-Ya., Deng, Zhi-Wei., Li, Jun., Fu, Hong-Zheng., Lin, Wen-Han. 2004. Chemical Constituents from Chinese Marine Sponge Cinchyrella australiensis. J. of Peking Univ. (Health Sci.). 36(1) : 12-17.

Machida, K., Abe, T., Arai, D., Okamoto, M., Shimizu, I., de Voogd, N.J., Fusetani, N., and Nakao, Y. 2014. Cinanthrenol A, an Estrogenic Steroid Containing Phenanthrene Nucleus, from a Marine Sponge Cinachyrella sp. Org. Lett. 16 : 1539−1541

Marinho, P.R., Muricy,G.R.S., Silva, M.F.L., deMarval, M.G., Laport M.S. 2010. Antibiotic-resistant bacteria inhibited by extracts and fractions from Brazilian marine sponges. Revista Brasileira de Farmacognosia Brazilian J. Pharm. 20(2) : 267-275.

McLaughlin, J.L. and Rogers, L.L. 1998. The Use of Biological Assays to Evaluate Botanicals. Drug Inf. J. 32 : 513-524.

Meyer, B.N., Ferrigni, N.R., Putnam, J.E., Jacobsen, L.B., Nichols, D.E., McLaughlin, J.L. 1982. Brine Shrimp: A Convenient General Bioassay for active Plant Constituets. J. Med. Plant Res. 45 : 31-34.

Molyneux, P. 2004. The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. Songklanakarin J. Sci. Technol. 26(2) : 211-219.

Muaja, A. D., Koleangan, H. S. J., Runtuwene, M. R. J. 2013. Uji

Toksisitas dengan Metode BSLT dan Analisis Kandungan Fitokimia Ekstrak Daun Soyogik (Saurauia bracteosa DC) dengan Metode Soxhletasi. J. Mipa Unsrat Online. 2(2) : 115-118.

57

Muller, W.E.G., Sanja, P-O., Cetkovic, H., Gamulin, V., Schröder, H.C., Kropf, K., Moss, C., Korzhev, M., Bärbel, D-S., Müller, I.M. 2004. Molecular markers for germ cell differentiation in the demosponge Suberites domuncula. Int. J. Dev. Biol. 48 : 293-305.

Nemoto, K., Yoshida, H., Egusa, N., Morohashi, N., and Hattori, T. 2010. Direct Carboxylation of Arenes and Halobenzenes with CO2 by the Combined Use of AlBr3 and R3SiCl. J. Org. Chem. 75 : 7855–7862.

Nobili, S., Lippi, D., Witort, E., Donnini, M., Bausi, L., Mini, E., Capaccioli, S. 2009. Natural compounds for cancer treatment and prevention. Pharmacol. Res. 59 : 365–378.

Nurhayati, A.P.D., Pratiwi, R., Wahyuwono, S., Istriyati., Fadlan, A., Syamsudin. 2014a. Isolation and Identification of Alkaloid Compound of Marine Sponge Cinachyrella sp. (Family Tetillidae). J. of Adv. Bot. Zool. 2(1) : 1-4.

Nurhayati, A.P.D., Pratiwi, R., Wahyuono, S., Istriyati., and De Voogt, N.J. 2014b. The Anticancer Activity of Marine Sponge Cinachyrella sp. (Family Tetillidae). IPTEK, J. Technol. Sci. 25(3) : 71-77.

Nurhayati, A.P.D., Pratiwi, R., Wahyuono, S., Istriyati., Abdillah, S. 2015a. Cellular mechanism of anti-cancerous activity in active marine sponge Cinachyrella anomala against T47D cell. Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci. 4(3): 785-791.

Nurhayati, A.P.D., Pratiwi, R., Wahyuono, S., Istriyati., Purnomo, H., Abdillah, S. 2015b. In Vitro Test and Molecular Docking of Alkaloid Compound in Marine Sponge Cinachyrella anomala against T47D Cell Cycle. J. Marine Sci. Res. Dev. 5:2.

Oku, N., Takada, K., Fuller, R.W., Wilson, J.A., Peach, M.L., Pannell, L.K., McMahon, J.B., and Gustafson, K.R. 2010. Isolation, Structural Elucidation, and Absolute Stereochemistry of Enigmazole A, a Cytotoxic Phosphomacrolide from the Papua New Guinea Marine Sponge Cinachyrella enigmatica. J. Am. Chem. Soc. 132 : 10278-10285.

Palermo, J.A., Brasco, M.F.R., Hughes, E.A., Seldes, A.M., Balzaretti, V.T., and Cabezas, E., 1996. Short side chain sterols from the tunicate Polizoa opuntia. Steroids. 61 : 2-6.

58

Perdicaris, S., Vlachogianni, T. and Valavanidis, A. 2013. Bioactive Natural Substances from Marine Sponges: New Developments and Prospects for Future Pharmaceuticals. Nat. Prod. Chem. Res. 1(1) : 1-8.

Rabelo, L., Monteiro, N., Serquiz, R., Santos, P., Oliveira, R., Oliveira, A., Rocha, H, Morais, A.H., Uchoa, A., and Santos, E. 2012. A Lactose-Binding Lectin from the Marine Sponge Cinachyrella apion (CaL) Induces Cell Death in Human Cervical Adenocarcinoma Cells. Mar. Drugs. 10 : 727-743.

Rachmat, R. 2007. SPONS INDONESIA KAWASAN TIMUR Keragaman,Distribusi, Kelimpahan, dan Kandungan Metabolit Sekundernya. Oseanologi dan Limnologi di Indonesia. 33 : 123 – 138.

Rezano, A., Kuwahara, K., Yamamoto-Ibusuki, M., Kitabatake, M., Moolthiya, P., Phimsen, S., Suda, T., Tone, S., Yamamoto, Y., Iwase, H., and Sakaguchi, N. 2013. Breast cancers with high DSS1 expression that potentially maintains BRCA2 stability have poor prognosis in the relapse-free survival. BMC Cancer. 13(562) : 1-12

Rodriguez, P.R.D., Muricy, G. 2007. A new species of Cinachyra (Demospongiae: Tetillidae) collected by Project REVIZEE off Espírito Santo State, SE Brazil. Porifera Research: Biodiversity, Innovation and Sustainability. 547-553.

Rodriguez, J., Nunez, L., Peixinho, S., and Jimenez, C. 1997. Isolation and Synthesis of the First Natural 6-Hydroximino-4-en-3-one Steroids from the Sponges Cinachyrella spp. Tetrahedron Lett. Pergamon. 38(10) : 1833-1836.

Rützler, K. dan Smith, K.P. 1992. Guide to Western Atlantic Species of Cinachyrella (Porifera: Tetillidae). Proc. Biol. Soc. Wash. 105(1) : 148-164

Schneiders, U.M., Schyschka, L., Rudy, A.,Vollmar, A.M. 2009. BH3-only proteins Mcl-1 and Bim as well as endonuclease G are targeted in spongistatin 1–induced apoptosis in breast cancer cells. Mol. Cancer Ther. 8(10) : 2914-2925.

Schupp, P., Eder, C., Paul, V., Proksch, P. 1999. Distribution of secondary metabolites in the sponge Oceanapia sp. and its ecological implications. Mar. Biol. 135 : 573-580.

59

Selvasundhari, L., Babu, V., Jenifer, V., Jeyasudha, S., Thiruneelakandan, G., Sivakami, R., and Anthoni, S.A. 2014. In Vitro Antioxidant Activity of Bark Extracts of Rhizophora mucronata. Sci. Technol. Arts. Res. J. 3(1) : 21-25.

Shimogawa, H., Kuribayashi, S., Teruya, T., Suenaga, K., and Kigoshi, H. 2006. Cinacchyramine, the novel alkaloid possessing a hydrazone and two aminals from Cinachyrella sp. Tetrahedron Lett. 47 : 1409-1411.

Sismindari. 2003. Cytotoxic effects of methanol extract isolated from Erythrina fusca Lour leaves on cancer cell-lines. Berkala llmu Kedokferan. 35(2) : 75-78.

Skiles G.L., Adams J.D, Yost Jr., and G.S. 1989. Isolation and Identification of 3-Hydroxy-3-methyloxindole, the Major Murine Metabolite of 3-Methylindole. Chem. Res. Toxicol. 2(4) : 254-259.

Szitenberg A., Becking L.E., Vargas S., Fernandez J.C.C, Santodomingo N., Wörheide G., Ilan M., Kelly M., Huchon D. 2013. Phylogeny of Tetillidae (Porifera, Demospongiae, Spirophorida) based on three molecular markers. Mol. Phylogen. Evol. 67 : 509–519

Takahashi, T., Miyazawa, M. 2010. Tyrosinase inhibitory activities of cinnamic acid analogues. Pharm. 65 : 913–918.

Ullah, Z., Lee, C.Y., and DePamphilis, M.L. 2009. Cip/Kip cyclin-dependent protein kinase inhibitors and the road topolyploidy. Cell Div. 4(10) : 1-15.

van Soest, RWM. 1989. The Indonesian Sponge Fauna: A Status Report. Neth. J. of Sea Res. 23(2): 223-230.

van Soest RWM., Rützler K. 2002. Family Tetillidae Sollas, 1886. Systema Porifera: a guide to the classification of sponges. In: Hooper JNA, van Soest RWM (eds). Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York. 85-98.

Wahidullah, S., Naik, B.G., Al-Fadhli, A.A. 2015. Chemotaxonomic study of the demosponge Cinachyrella cavernosa (Lamarck). Biochem. Syst. Ecol. 58 : 91-96.

Wargasetia, T.L. 2008. Peran Gen p63 dalam Regulasi Proliferasi Sel. JKM. 7(2) : 1-6.

Xiao, D.-J., Peng, X.-D., Deng, S.-Z., Ma, W.-J., Wu, H.-M. 2005. Structure Elucidation of (3E)-Cholest-4-en-3,6-dione-3-oxime in Marine Sponge Cinachyrella australiensis from the South China Sea. Chin. J. Org. Chem. 25(12) : 1606-1609.

60

Yuen, O.Y., Choy, P.Y., Chow, W.K., Wong, W.T., and Kwong, F.Y. 2013. Synthesis of 3-Cyanoindole Derivatives Mediated by Copper(I) Iodide Using Benzyl Cyanide. J. Org. Chem., 78(7) : 3374-3378

Zhang, H., Conte, M.M., Huang, X.-C., Khalil, Z., and Capon, R.J. 2012. A search for BACE inhibitors reveals new biosynthetically related pyrrolidones, furanones and pyrroles from a southern Australian marine sponge, Ianthella sp. Org. Biomol. Chem. 10 : 2656-2663.

61

Lampiran 1. Gambar Spons Cinachyrella australiensis dan Cinachyrella sp.

A. Spons Cinachyrella australiensis

Foto di dalam laut Foto di permukaan

B. Spons Cinachyrella sp.

Foto di dalam laut Foto di permukaan

62

dimaserasi dengan metanol beberapa kali di KLT

dievaporasi

dilarutkan dengan metanol dipartisi dengan heksan beberapa kali

dievaporasi dipartisi dengan etil asetat

beberapa kali

dievaporasi dievaporasi

dipartisi dengan heksan beberapa kali

dievaporasi dipartisi dengan etil asetat beberapa kali

dievaporasi

dievaporasi

dicuci dengan metanol beberapa kali

Lampiran 2. Bagan Ekstraksi Spons C. autraliensis dan Cinachyrella sp.

10 kg Sampel Spons Halus

Maserat Metanol Residu

Ekstrak Metanol (ekstrak kasar & garamnya + lapisan air & garamnya)

Lapisan heksan

Ekstrak heksan

Lapisan metanol

Ekstrak etil asetat

Lapisan etil asetat

Ekstrak metanol

Lapisan metanol sisa

Ekstrak kasar & garamnya

Lapisan air & garamnya

garam

Lapisan heksan

Ekstrak heksan dari lapisan air

Lapisan air & garamnya

Lapisan etil asetat

Ekstrak metanol dari lapisan air

garam

Ekstrak etil asetat dari lapisan air

Lapisan metanol

Lapisan air & garamnya

63

Lampiran 3. Surat Keterangan Determinasi Sampel Spons

64

RIWAYAT HIDUP

1. Data Pribadi

Nama : Abraham Rahman

Tempat, Tgl. Lahir : Bone, 19 Desember 1972

Agama : Islam

Pekerjaan : Dosen Pada Jurusan Pendidikan Kimia FKIP

Universitas Halu Oleo Kendari

NIP / NIDN : 197212192000121001 / 0019027205

Pangkat/Golongan : Penata Tingkat I, III/d

Jabatan Fungsional : Lektor

Alamat Rumah :

Jln. Rambutan No. 27 Kendari Sulawesi Tenggara (93117)

Perumahan Mega Buana Dallah Taibah Moncongloe Maros

Sulawesi Selatan

Nama Istri : Halijah, Am.Keb., SKM.

Anak : 1. Andi Ramlah Avianti

2. Andi Muhammad Said

3. Andi Nurismi Rahmani

Orang Tua

a. Ayah : Andi Abd. Rahman Nusu

b. Ibu : Andi Sitti Hamidah

2. Riwayat Pendidikan :

SDN 2 WUA-WUA KENDARI, 1985

MTsN KENDARI, 1988

SMAN MANDONGA KENDARI, 1991

S-1 Pendidikan Kimia Universitas Haluoleo Kendari, 1997

S-2 Ilmu Kimia (Kimia Organik) Universitas Padjadjaran Bandung,

2002

S-3 Ilmu Kimia Universitas Hasanuddin Makassar, 2018

65

3. Publikasi Ilmiah Selama Studi S3

Abraham, Soekamto, N.H., Natsir, H., Syah, Y.M. 2016. Studi

Pendahuluan Ekstrak Lapisan Air Spons Genus Cinachyrella Asal

Perairan Spermonde Sulawesi Selatan. Buku Abstrak Simposium

Nasional Kimia Bahan Alam Indonesia XXIV, Universitas Islam

Indonesia, Yogyakarta, 17-19 Oktober, 59.

Abraham, Syah, Y.M., Natsir, H., Soekamto, N.H. 2017a.

Anticancer Pre-screening of Marine Sponge Cinachyrella Extract

From Spermonde Archipelago, South Sulawesi, Indonesia.

Res. J. Pharm. Biol. Chem. Sci. 8(4): 833-837.

Abraham, Syah, Y.M., Natsir, H., Soekamto, N.H. 2018. Benzene

derivatives from the marine sponges Cinachyrella.

J. Phys. Conf. Ser. 979. 012022. 1-4.

4. Beberapa Kegiatan Ilmiah Selama Studi S3

Workshop Penulisan Proposal Jurnal Internasional.

19-20 November 2015. Makassar

Workshop Penulisan Artikel Jurnal Internasional.

19 Desember 2015. Makassar.

Workshop Nuclear Magnetic Resonance (NMR), X-Ray Difraction

(X-RD), High Performance Liquid Chromatography (HPLC).

17 Oktober 2016. Yogyakarta.

Workshop dan Klinik Peningkatan Kualitas Hasil Penelitian Program

Peningkatan Kapasitas Riset Tahun 2017. 24-26 Agustus 2017.

Makassar

The 2nd International Conference on Science. Hasanuddin

University, Makassar, Indonesia, November 2nd – 3nd, 2017.

Seminar on Publishing and Scientific Writing. November 30, 2017.

Makassar.

Pelatihan Pemanfaatan Hasil Penelitian, dan Pengabdian kepada

Masyarakat yang berpotensi Paten. 15-17 Maret 2018. Makassar.