Scytalidium thermophilum Katalaz-Fenol Oksidazının ...akademikpersonel.kocaeli.edu.tr/yonca.yuzugullu/bildiri/yonca... · V123C mutantında histidin (His82) ve sistein (Cys123)

Scytalidium thermophilum

Katalaz-Fenol Oksidazının

Fonksiyonel ve Yapısal Analizi

Yonca Yüzügüllü, Zümrüt B. Ögel, Michael J. McPherson, Chi H. Trinh,

Arwen R. Pearson, Mark A. Smith, Lucy Fairhust, Didem S. Kocabaş, Ufuk

Bölükbaşı, Simon Phillips

21.Ulusal Biyoloji Kongresi 2012 -Ege Üniversitesi

Neden Katalaz??

Popüler

Aktivitesi kolay ölçülebilir

Substratı (H2O2) ucuz, rahat bulunabilir

Reaksiyon :


2 H2O2 → 2 H2O + O2 (1)

Enz (Por–FeIII) + H2O2 → Cpd I (Por+•–FeIV=O) + H2O (2)

Cpd I (Por+•–FeIV=O) + H2O2 → Enz (Por–FeIII) + H2O + O2 (3)

1)Chelikani P, Fita I and Loewen PC. CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 61: 192–208 (2004)

2) Swatala J and Loewen PC. ABB, Arch. Biochem. Biophys. 401: 145-154 (2002)

Sınıflandırma


Katalazlar

Monofonksiyonel katalazlar

Katalaz-peroksidazlar

Mn-içeren katalazlar

Diğer katalazlar

1)Chelikani P, Fita I and Loewen PC. CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 61: 192–208 (2004)

2)Nicholls P, Fita I and Loewen PC. Adv. Org. Chem. 51 (2001)

3)Swatala J and Loewen PC. ABB, Arch. Biochem. Biophys. 401: 145-154 (2002)

Monofonksiyonel Katalazlar (EC 1.11.1.6)


b yada d tipi hem grubu

Tetramer

Soret bant (406 nm)

Büyük alt birimli (75-84 kDa) ve küçük

alt birimli (55-69 kDa) katalazlar

Büyük alt birimli katalazlar, yüksek

sıcaklığa ve proteolize karşı daha

dayanıklılar

Hem b (A) Hem d (B)

1)Chelikani P, Fita I and Loewen PC. CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 61: 192-208 (2004)

2)Loewen PC.Cold Spring Harbor Laboratory Pres: 273-308 (1997)

3)Nicholls P, Fita I and Loewen PC. Adv. Org. Chem. 51 (2001)

Monofonksiyonel Katalazlar (EC 1.11.1.6)


Aktif Bölge


Neurospora crassa katalazı

Díaz, A., Horjales, E., Rudiño-Piñera, E., Arreola, R., Hansberg, W., 2004,

“Unusual Cys-Tyr Covalent Bond in a Large Catalase”, Journal of Molecular

Biology, 342: 971-985.

S.thermophilum Katalaz-Fenol Oksidazı

(CATPO)


Hidrojen peroksidi parçaladığı (katalaz aktivitesi) gibi H2O2 yokluğunda da

o-difenoliklerin oksidasyonunu (fenol oksidaz aktivitesi) gerçekleştirmekte

Oksidaz aktivitesi gösteren memeli katalazları literatürdeki tek benzer

örnektir

Penicillium katalazı (PVC)’na

benzemekte

PVC

1)Kocabas DS, Bakir U, Phillips SEV, McPherson MJ and. Ogel ZB. Appl. Microbiol. Biotechnol. 79: 407–415 (2008)

2)Kocabas DS, Pearson AR, Phillips, SEV, Bakir U, Ogel ZB, McPherson, MJ and Trinh,CH. Acta Crystallog. F 65 (2009)

3)Ögel ZB, Yüzügüllü Y, Mete S, Bakir U, Kaptan Y, Sutay D, Demir AS. Appl Microbiol. Biotechnol. 71: 853-862 (2006)

4)Vetrano, AM, Heck, DE, Mariano, TM, Mishin, V, Laskin DL, Laskin JD. J. Biol. Chem. 280: 35372-35381 (2005

Amaç


Enzimin üç boyutlu yapısının belirlenmesi

Kataliz mekanizmasının araştırılması


Enzim, iyon değişimi

ve ardından jel

filtrasyon

kromatografi ile

saflaştırıldı

3-9 mg/ml saf enzim

Protein karakterizasyonu

SDS-PAGE

Protein kristalizasyonu


CATPO (2 mg/ml) kristalleri

PEG 2000,18oC


PEG 2000, 0.1M BaCl2, 18oC


PEG 2000, 0.1M BaCl2, 18oC

CATPO(Katalaz-Fenol Oksidaz)


2.7Å’da ışığın kırılma verileri

toplandı

Birim hücre : a= 185.4Ǻ,

b=216.3Ǻ, c=68.6Ǻ ve

α=β=γ=90o

Homotetramer (4 x 80 kDa =

320 kDa)

1 x hem (d tipi) / monomer

670 amino asit / monomer

21 NAG / tetramer


CATPO Monomer, 4AUE

(A zinciri) CATPO Monomer, 4AUE (gri)

PVC Monomer, 2IUF (magenta)

CATPO (Katalaz-Fenol Oksidaz)



!Problemler!

Düşük çözünürlük

324 solvent / tetramer

Aktif bölgede solvent yok

Katalitik merkez hakkında

yeterli bilgi sağlanmadı

Rekombinant CATPO…


Sentetik catpo geni pET28 vektörüne aktarıldı ve Escherichia coli BL21 star

(DE3) hücrelerinde üretildi

Protein üretimi optimize edildi

Aktif bölgedeki korunmuş amino asitler mutasyona uğratıldı

Elde edilen CATPO varyantları afinite kromatografisi ile saflaştırıldı

Protein kristalleri %12 PEG400, 0.2M KCl, 0.01M CaCl2 ve 0.05M Sodyum

kakodilat (pH 5.0-5.6) içeren ortamda elde edildi

Kristaller sıvı nitrogenle donduruldu


1.4 Å!!


Sonuçlar…


Katalaz-fenol oksidazı enzimi(CATPO), mantarlarda tanımlanmış çift aktivite gösteren ilk enzimdir

Spektreskopik çalışmalar, CATPO enziminin d tipi hem grubu içerdiğini göstermektedir

CATPO’nun üç boyutlu yapısı 2.7Å’da belirlenmiş olup enzimin birbiriyle ilişkili dört monomerden

meydana geldiği ve korunmuş bir ‘hem’ merkezi içerdiği gözlendi

Enzimin aktif bölgesi hakkında detaylı bilgi edinmek amacıyla rekombinant ekspreyon sistemi

geliştirildi ve mutasyon çalışmaları gerçekleştirildi

Rekombinant CATPO’nun üç boyutlu yapısı 1.4Å’da belirlendi

CATPO varyantlarından H82N, N155A, V123C ve V123T’in üç boyutlu yapıları sırayla 1.5, 2.25, 1.9 ve

1.7-Å da belirlendi

Protein yapıları karşılaştırıldığında H82N ve V123C mutantlarında d yerine b tipi heme grubu görüldü

Tüm varyantlarda korunmuş olarak iki su molekülünün (W1 ve W2) varlığı keşfedildi

V123C mutantında histidin (His82) ve sistein (Cys123) arasında yeni bir kovalent bağın varlığı

bulundu

Enzim aktivite analizleri histidin (His82) ve asparajin (Asn155) kalıntılarının aktivite için önemli

olduğunu ve ayrıca histidinin hem b nin d ye dönüşümünde önemli rol oynadığını göstermektedir

Her iki aktivitenin (katalaz ve fenol oksidaz) aynı aktif bölgede gerçekleştiği önerilmektedir

Hedefler…


Oksidatif substratların aktif bölgeye nasıl ulaştığını

gözlemek amacıyla fenolik maddeyle inkübe edilmiş

CATPO kristallerinden üç boyutlu yapı eldesi

Aktif bölgede mutasyon çalışmalarının devamı

Teşekkürler…

Fen-Edebiyat Fakültesi

Biyoloji Bölümü

Doktora Sonrası Yurt

Dışı Destek

Programı

2219

School of Molecular

and Cellular Biology

ODTÜ

BAP-08-11-

DPT2002K120510

Kongre Düzenleme

Kurulu

Diamond Light Source

Scytalidium thermophilum Katalaz-Fenol Oksidazının ...akademikpersonel.kocaeli.edu.tr/yonca.yuzugullu/bildiri/yonca... · V123C mutantında histidin (His82) ve sistein (Cys123)

Documents