Academiejaar 2008 - 2009 Screenen van modulatoren voor invasie en viabiliteit in het MCF-7/WISP-2 borstkankermodel Dieter BERWOUTS Promotor: Dr. Olivier De Wever Scriptie voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding tot ARTS Faculteit GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
56
Embed
Screenen van modulatoren voor invasie en viabiliteit in het MCF-7
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Academiejaar 2008 - 2009
Screenen van modulatoren voor invasie en viabiliteit in het MCF-7/WISP-2 borstkankermodel
Dieter BERWOUTS
Promotor: Dr. Olivier De Wever
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
ARTS
Faculteit GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2008 - 2009
Screenen van modulatoren voor invasie en viabiliteit in het MCF-7/WISP-2
borstkankermodel
Dieter BERWOUTS
Promotor: Dr. Olivier De Wever
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
ARTS
Faculteit GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
“De auteur(s) en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie
beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander
gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met
betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van
resultaten uit deze scriptie.”
Datum
handtekening student handtekening promotor
Naam student Naam promotor
Voorwoord
“We schrijven mei 2006-2007, … de thesisonderwerpen voor derde bachelor geneeskunde
komen ter beschikking. Bijna tweehonderd mogelijke onderwerpen worden op ons
losgelaten. Een brede waaier van literatuurstudies en onderzoekprojecten proberen onze
interesse te capteren. Plotseling valt mijn oog op een project van Dr. Apr. O. De Wever op de
afdeling “experimenteel kankeronderzoek”. Interessant, laten we maar es een mailtje
sturen… Reeds van bij het eerste gesprek werd ik geïnspireerd door de gedrevenheid en het
enthousiasme van mijn promotor. Ik kon niet wachten om ook mijn duit in het zakje te
doen…“
Nu, twee jaar later, bleek dat mailtje het begin van een boeiende en enorm leerrijke
samenwerking met mijn promotor.
Arts zijn in de hedendaagse wereld veronderstelt naast een sterke en sociale
persoonlijkheid, ook een sterke wetenschappelijke basis te hebben. Het absolute orgelpunt
in deze tocht naar kennis, is ongetwijfeld het eindwerk. Na jaren anatomie, fysiologie en nog
veel meer, wordt er nu een actief explorerende houding van de student verwacht om zo zélf
een steentje bij te dragen.
De wetenschappelijke kennis neemt exponentieel toe. Waar de artsen die 30 jaar geleden
afstudeerden nauwelijks bekend waren met DNA-helices en cellulaire kanalen, wordt er van
een eerstejaars student geneeskunde tegenwoordig verwacht dat hij het volledige
biochemisch en fysiologisch model van de cel begrijpt en kan verklaren. Of de
moeilijkheidgraad hoger ligt dan vroeger, laat ik in het midden. Het enige wat we met
zekerheid kunnen vaststellen is dat de graad van kennis veel detaillistischer is dan
toendertijd.
In het kader van dit toenemend specialistisch karakter van de geneeskunde en de
wetenschap in het algemeen, probeer ik in deze scriptie mijn druppeltje bij te dragen aan de
steeds expanderende oceaan van kennis.
Onderzoek verrichten is geen soloactiviteit. Zonder de steun van mijn immer hulpvaardige
promotor, van An, George , Arlette en de rest van het laboteam, zou er weinig in huis zijn
gekomen van deze scriptie. Zij hebben mij allen, ten allen tijde met raad en daad bijgestaan
en hebben een plaatsje veroverd in het hart van deze thesisstudent.
Figuur II 4.1.4.3 uit: http://www.watisgenomics.nl/sites/genomics/contents/i000667/translocatie-web.jpg, Sebastiaan Donders Door de uitwisseling van stukken DNA tussen de chromosomen 9 en 22 kan een fusiegen ontstaan van de genen Bcr en Abl*
Het was het eerste lid van een nieuwe klasse agentia die werken door het inhiberen van
specifieke tyrosine kinase enzymen, in plaats van niet-specifieke inhibitie van snel-delende
cellen. Het is een 2-phenylaminopyrimidine derivaat dat functioneert als een specifieke
inhibitor van een aantal tyrosine kinase enzymen. Het zet zich op de TK-actieve positie, wat
leidt tot een vermindering van activiteit. Er is een enorme verscheidenheid van TK-enzymen
in het lichaam. Imatinib is specifiek voor het TK-domein in abl (abelson proto-oncogen), c-kit
en PDGF-R (platelet derived growth factor receptor). In CML leidt het
Philadelphiachromosoom tot een fusieproteïne van abl en bcr (breakpoint cluster region). Dit
is een continu actief tyrosine kinase en imatinib wordt gebruikt om die activiteit te
verminderen. De actieve sites van de tyrosine kinasen hebben elk een bindingsplaats voor
ATP. De enzymale activiteit gekatalyseerd door het tyrosine kinase is een transfer van het
terminale fosfaat van ATP naar het tyrosine kinase. Dit proces is gekend als fosforylatie.
Imatinib is vrij selectief voor bcr-abl, maar het inhibeert ook andere targets zoals hierboven
vermeld.
4.1.4.1.4. M475271
Src, een proto-oncogen, is sterk betrokken bij de groei, progressie en de metastasering van
een aantal menselijke kankers. M475271 is een src tyrosine kinase inhibitor die de pathway
tussen de integrinereceptor en src blokkeert. Het reduceert de fosforylatie en de invasiviteit
van kankercellen. Het is voornamelijk werkzaam op de VEGF – vascularisatie van tumoren.
Figuur III.4.3.4.3.3. Werking Gleevec http://images.goshdawnit.com/uploaded_images/432px-Mechanism_imatinib_svg-750799.png Author of original image was Sodium at en.wikipedia.org, free GPU License
- Bereid een celsuspensie (4.2.1) en breng de cellen over in serumhoudend
groeimedium.
- Zaai de cellen uit in een 96-well plaat in een volume van 200 µl per „well‟. Van iedere
conditie worden 5 herhalingen in de test meegenomen.
- Incubeer de 96-well plaat 24 uur bij 37°C in een waterdampverzadigde 10% CO2
incubator.
- Aspireer het medium en voeg nieuw, serumvrij medium toe, aangerijkt met
groeifactoren of geconditioneerd medium.
- Incubeer 48 uur bij 37°C in een waterdampverzadigde 10% CO2 incubator.
- Verwijder uit iedere „well‟ 100 µl medium en voeg 20 µl MTT-kleurstof toe. Incubeer
de 96-well plaat, gewikkeld in aluminiumfolie, gedurende 2 uur bij 37°C in een
waterdampverzadigde 10% CO2 incubator.
- Aspireer de vloeistof weg en voeg 100 µl DMSO toe aan iedere „well‟. Suspendeer
totdat de neergeslagen kristallen in oplossing gaan.
- Meet de absorbantie bij 490 nm en verwerk de gegevens statistisch via een
ongepaarde, eenzijdige T-test.
4.3.5. Statistische analyse
Alle assays werden minstens in drievoud uitgevoerd tenzij anders aangegeven. Al de
waarden worden meegegeven als gemiddelde +- standaard gemiddelde fout (s.e.m.). In het
sferoïd model werden vergelijkingen uitgevoerd door het gebruik van een ongepaarde
Student-test. De P < 0.05 werd beschouwd als een significant verschil vergeleken met de
controle condities (aangeduid met *).
27
5. Resultaten
5.1. Immunohistochemie
Ductaal borstcarcinoom is het meest bekende type borstkanker bij vrouwen. Het bestaat in
twee vormen: het infiltrerend ductaal carcinoom (IDC), een invasief, maligne en abnormale
proliferatie van neoplastische cellen in het borstweefsel en het ductaal carcinoma in situ
(DCIS), een niet-invasief, mogelijks maligne neoplasma dat nog beperkt is tot de ducti
lactiferi, waar de borstkanker het vaak ontstaat.
Deze figuur toont ons de immunohistochemie van borstkankercellen bij goed
gedifferentieerde en matig tot weinig gedifferentieerde borstcarcinomen. Immunohistochemie
of IHC is het proces waarbij proteïnes gelokaliseerd worden in cellen van een weefselstuk.
Hierbij wordt gebruik gemaakt van de specificiteit van antilichamen die binden met antigenen
in het biologische weefsel.
De „C‟ in de figuur staat voor cellulaire aanwezigheid van WISP-2, terwijl de „N‟ staat voor
nucleaire aanwezigheid van WISP-2.
We zien bij het DCIS (ductaal carcinoma in situ) een duidelijke nucleus met een goede
differentiatie. Zoals gezegd, was de bedoeling om WISP-2 aan te tonen in het
Figuur I.5.1. Immunohistochemie van DCIS en invasief weinig gedifferentieerd
ductaal carcinoma
28
borstkankerweefsel. WISP-2 functioneert namelijk als een inhibitor van snail, hetgeen een
EMT-transciptiefactor is (cfr. Infra). Wanneer we geen WISP-2 meer terugvinden in de kern,
kunnen we bijgevolg verwachten dat er expressie van snail zal plaatsvinden en we een
invasief beeld krijgen. De afwezigheid van nucleair WISP-2 zien we dan ook bij het weinig
gedifferentieerde (en dus kwaadaardige) ductaal carcinoma. Ook zien we dat de cellulaire
aanwezigheid van WISP-2 hier een mindere rol speelt.
Snail is een zinkvinger transcriptiefactor die epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) geeft
door directe suppressie van E-cadherine expressie (Fendrich et al., 2009). Snail is nodig
voor mesodermale en neurale buis vorming bij de embryonale ontwikkeling en is betrokken
bij tumorprogressie. Snail expressie correleert omgekeerd met de graad van differentiatie
van de infiltrerende ductale carcinomen met lymfeknoop metastasen. Snail is dus betrokken
bij de inductie van invasief en migrerend fenotype in epitheliale cellen (De Craene et al.,
2005) en borstkankercellen. Bij deze laatste kan het als een merker van metastaserend
vermogen gezien worden.
5.2. CI assay
De cellijn die gebruikt wordt in deze scriptie, is de MCF-7 borstkankercel. Onder normale
omstandigheden is deze cel niet tot weinig invasief in een bereide collageengel. Wanneer we
echter het WISP-2-gen onderdrukken, wordt deze cellijn invasief.
Er wordt gewerkt met een sferoïdinvasietest (zie inleiding). Dit laat ons toe om een
nauwkeurige kwantificatie te maken van de invasie en migratiecapaciteit van deze cellen. De
kwantificatie kan op verschillende manieren gebeuren zoals in de figuur duidelijk is. Via
lichtmicroscopie kunnen er foto‟ s worden gemaakt waarbij het aantal invasieve cellen
visueel geteld worden of die daarna bewerkt worden en via het programma ImageJ®
gekwantificeerd kunnen worden. Phalloïdine kleuring laat ons toe het filamenteus actine
cytoskelet te onderzoeken via immunofluorescentiemicroscopie.
We kunnen verschillende zaken besluiten:
Invasieve cellen in de matrix zijn licht in tegenstelling tot de cellen in de sferoïde en de
collageenmatrix (A). Dit aantal invasieve cellen is driemaal hoger wanneer WISP-2
onderdrukt is in MCF-7 cellen (B). Computergestuurde kwantificatie kan helpen bij deze
celtelling. Hiervoor werden tweedimensionale fasecontrastbeelden geïnverteerd en binair
gemaakt onder identieke condities (C). Het gemiddelde invasiegebied is veel groter wanneer
WISP-2-expressie onderdrukt is (D). Nog een andere methode is een invadogram waarin het
totaal aantal pixels uitgezet wordt over de afstand van de sferoïde (E). Na binair maken van
29
de beelden, hebben we een aantal concentrische cirkels vanaf de sferoïdgrens
geconstrueerd, door opeenvolgende vergrotingen met een vast interval vanaf de
sferoïdgrenzen te maken (E, links). Dit invadogram toont ons dat de MCF-7shWISP-2 cellen
de matrix infiltreren in groter aantal en over een grotere afstand. Door een analyse te maken
van het F-actinecytoskelet werd er via confocale microscopie een morfometrische analyse
gemaakt. Uitschakelen van WISP-2 stimuleert de invasie van MCF-7 cellen die uit de
sferoïdstructuur komen. Soms zien we groepen cellen met een leidercel waaraan een ketting
cellen hangt in groepen (F).
30
Figuur I.5.2. Verschillende visualisatie en kwantificatietechnieken van invasie bij
MCF-7 cellen
31
5.3. Matrix screening
Figuur I.5.3. Invloed van elementen van de extracellulaire matrix en basale
membraan op invasie van MCF-7 cellen in collageen-type-I matrix.
32
We hebben deze screening uitgevoerd om het effect van verschillende elementen van de
extracellulaire matrix en basale membraan op invasie te bestuderen. Zoals uit deze figuur
blijkt, zien wij uiterst links boven de controle situatie.
*FN staat voor fibronectine. We zien dat er geen inhibitie te zien is bij toevoeging aan de
gelmatrix.
Fibronectine is een hoogmoleculair gewicht extracellulair matrix glycoproteïne. Het bindt aan
membraangebonden receptorproteïnen; de integrines. Fibronectine bindt eveneens aan
extracellulaire matrixcomponenten zoals collageen, fibrine en heparansulfaat
proteoglycanen. Het bestaat als een dimeer dat bestaat uit twee vrijwel identieke
monomeren, verbonden door disulfidebruggen. Er bestaat een oplosbare vorm (gevonden in
bloedplasma) en een onoplosbare vorm (een element van de extracellulaire matrix) (Ohashi
en Erickson, 2009). Fibronectine speelt een belangrijke rol in de celadhesie, groei, migratie
en differentiatie. Het is ook betrokken in processen zoals wondheling en embryonale
ontwikkeling. Verstoorde fibronectine expressie, degradatie en organisatie hangt samen met
kanker en fibrose.
*TNC staat voor tenascin-C. Ook hier zien we geen invloed op de invasie.
Tenascines zijn extracellulaire matrix proteïnes. Ze worden frequent gevonden in de
extracellulaire matrix van vertebratenembryo in ontwikkeling en verschijnen rond helende
wonden en in het stroma van verschillende tumoren.
Tenascine-C is de belangrijkste van de 4 Tenascinegenenfamilie (-R –X –W) (Ueda et al.,
2009). Tenascine-C wordt gevonden in het embryo en wordt gemaakt in de neurale
zenuwlijst. Het is ook aanwezig bij ontwikkelende pezen, bot en kraakbeen. Het heeft verder
anti-adhesieve eigenschappen, wat ervoor zorgt dat de cellen ronder worden bij additie in
medium. Dit kan verklaard worden door de mogelijkheid om te binden aan het ECMP
Fibronectine, en zo wordt verhinderd dat deze binden aan specifieke syndecans. Wanneer
Tenascine-C gevonden wordt in tumoren, is er een slechte prognose (Emoto et al., 2001).
*DEC staat voor Decorine. Hier zien we geen invloed op de invasie.
Decorine is een proteoglycaan dat behoort tot de „small leucine-rich proteoglycan family‟. Het
bestaat uit een proteïnekern met glycosaminoglycanen, bestaand uit chondroitinesulfaat of
dermatansulfaat. Decorine is een klein (peri-)cellulair matrixproteoglycaan. Het is een
component van het bindweefsel, bindt aan collageen I fibrillen en speelt een rol in de
matrixassemblage.
33
Decorine speelt een rol in de fibrillogenese (Fiedler en Eble, 2009). Er is interactie met
fibronectine, thrombospondine, complementfactor C1q, EGFR en TGF-β. In de publicatie
wordt aangetoond dat het de activiteit van TGF-β1 kan veranderen (stimuleren of inhiberen).
Hieruit kan besloten worden dat de primaire functie van decorine zich bevindt ter hoogte van
de celcyclus. Het zou anti-tumorigene eigenschappen hebben. Mutaties in het decorinegen
zijn geassocieerd aan congenitaal stromaal corneale dystrofie.
*MAT staat voor Matrigel. Een combinatie van verschillende componenten die deel uitmaken
van de basale membraan. We zien dat hier ook een sterke inhibitie te zien valt. Dit kan
verklaard worden door het grote aandeel van laminine in Matrigel en strookt met de
bevindingen bij laminine.
Matrigel is de naam van een gelatineus proteïnemengsel, gesecreteerd door
muizentumorcellen en op de markt gebracht door BD Biosciences. Dit mengsel lijkt op het
complexe extracellulaire milieu dat gevonden wordt in vele weefsels. De hoofdcomponenten
van Matrigel zijn laminine en collageen. Zij vertegenwoordigen de adhesieve
peptidensequenties die in natuurlijke omgeving worden gevonden.
*LAM staat voor laminine. Hier zien we een sterke vermindering van invasie.
Laminine is een proteïne dat gevonden wordt in de extracellulaire matrix. Het is het
belangrijkste niet-collageneuze element in de basale membraan waarop de cellen van een
epitheel liggen. Het heeft 4 armen waarop 4 andere molecules kunnen binden. De 3 kortere
armen zijn vooral bedoeld om andere lamininemoleculen te binden. Dit is de reden waarom
laminine dergelijke sterke sheets vormt. De lange arm kan binden aan cellen, zodat het als
anker dient in het membraan.
Laminine is noodzakelijk om alle lichaamsstructuren samen te houden. Foutieve productie
kan bijvoorbeeld spierdystrofie geven.
Elke lamininemolecule is een heterotrimeer bestaande uit alfa-, bèta, en gammaketens.
Reeds 15 lamininetrimeren zijn geïdentificeerd (Carpenter et al., 2009).
Laminine vormt onafhankelijke netwerken en is geassocieerd met type IV collageen
netwerken via entactine en perlecan. Het bindt ook aan celmembranen via
integrinereceptoren en andere plasmamembraan moleculen. Door deze interacties vervult
laminine een kritische rol in de celvasthechting en differentiatie, celvorm en beweging,
onderhoud van het weefselfenotype en celoverleving. (Een specifieke sequentie van
laminine, op de alfa-ketting, zorgt voor de adhesie van endotheliale cellen)
34
*COL IV staat voor collageen IV, een component van de basale membraan. Ook hier zien we
geen inhibitie van de migratie.
Type IV collageen is een type collageen dat vooral in de basale membraan wordt gevonden.
De C-terminus is niet verwijderd bij het post-translationele proces en de vezels liggen kop-
aan-kop in plaats van parallel. Het heeft ook niet het typische glycineresidu dat zorgt voor de
strakke collageenhelix.
*ENT staat voor Entactine. Dit is een component van laminine. Deze blijkt echter niet
voldoende te zijn om de invasie te inhiberen.
Entactine of nidogen is een component van de basale membraan. Dit gen codeert voor een
lid van de nidogenfamilie en zou een rol spelen in de interactie met andere basale
membraancomponenten en extracellulaire matrix.
5.4. Array
Nadat we de matrixscreening hebben gedaan, wilden we enkele MAPK-pathways
onderzoeken op hun activiteit met en zonder laminine in een collageenmatrix.
Figuur I.5.4. Array in collageen ter screening van MAPK-kinase pathways
35
Hieronder wordt een tabel weergegeven met alle coördinaten. Pathways die een positief signaal geven zijn belangrijk, maar ook degene die geen signaal geven zijn van betekenis.
Figuur I.5.7. MTT test ter controle van viabiliteit bij gebruik van verschillende
inhibitoren in het MCF-7 borstkankermodel met tabel.
SD = standaard deviatie; SE = standaard fout
42
We hebben deze MTT uitgevoerd om de viabiliteit te kunnen testen van de cellen nadat ze
behandeld werden met de inhibitoren. Door de vorming van de formazankristallen krijgen we
een beeld van de hoeveelheid mitochondriale activiteit. De grafiek toont een duidelijke
verdeling. We hebben de waarden uitgewerkt ten opzichte van de controlelijn zodat we een
relatieve vergelijking kunnen maken. Zoals we reeds vermoeden, is er inhibitie aanwezig van
SP600125, Gleevec®, M475271 en BIM-46174. Deze inhibitoren hadden bij voorgaande
tests ook de meeste invloed op de invasie. We hebben ook enkele andere inhibitoren getest,
maar we zien dat deze geen verminderde invloed hebben op de viabiliteit. De concentraties
waarin we de inhibitoren gebruiken, zorgen dus niet voor het afsterven van de cellen. Dit is
een belangrijke vaststelling in verband met het gebruik in vivo.
We hebben een tweezijdige student t-test uitgevoerd om de significantie kunnen te kunnen
bepalen. Waar onze p-waarde <0,05 is, is de test significant (*) te noemen. Enkel PD98 is
dus niet als significant te beschouwen.
We hebben geopteerd om de resultaten voor de WISP-2-cellijn hier te tonen. Deze cellen
werden in concentraties van 10000 cellen per well bekomen.
6. Discussie
Er werd gekozen voor de MCF-7 borstkankercellijn, omdat het een vaak gebruikte cellijn is
om farmacologische en klinische inhibitoren te testen. In dit werkstuk werd er gebruikt
gemaakt van twee afgeleide vormen van deze cellijn.
Om nu de eigenschappen van deze cellen optimaal te kunnen screenen, werd er een
onderdrukking van het WISP-2 gen uitgevoerd door middel van een short hairpin. Er wordt
een vector ingebracht in de cellen gekoppeld aan een promotor die zo de expressie
onderdrukt. Deze modificatie dient overerfbaar te zijn. Door het inbrengen van deze promotor
wordt er een stukje RNA gefabriceerd dat bindt op het RNA dat normaal tot expressie
gebracht wordt en zo wordt de expressie uitgeschakeld.
Het WISP-2-gen (CCN5) is gekend om te functioneren als transcriptieregulator van genen
die celproliferatie en motiliteit controleren in epitheliaal borstweefsel. Door de
immunohistochemie konden we vaststellen dat het CCN5/WISP-2-proteïne vooral in het
cytoplasma gelokaliseerd is. De lokalisatie is echter niet beperkt tot het cytoplasma, want
ook in de nucleus vinden we dit proteïne terug. Deze nucleaire activiteit vinden we terug bij
het niet-invasieve fenotype en we kunnen dus veronderstellen dat verlies van nucleaire
43
expressie van WISP-2 een rol speelt bij invasie. De cytoplasmatische WISP-2 expressie was
eveneens sterker bij het niet-invasieve fenotype, maar was niet specifiek voor invasie. We
hebben dus gezien dat uitschakelen van het WISP-2-gen bijdraagt aan maligne
transformatie. Het mechanisme hierachter kunnen we als volgt proberen verklaren. Door de
onderdrukking van WISP-2, werd er een verhoogde expressie van Snail gezien, maar een
verminderde expressie van E-cadherine. Deze verminderde expressie van E-cadherine zorgt
voor een slechtere prognose, omdat verlies van E-cadherine de cellen van elkaar losmaakt,
zodat er invasie kan optreden (Gould Rothberg en Bracken, 2006).
Na het bepalen van de cellijn, was de volgende stap het vinden van een goed protocol om
het invasief gedrag van deze cellen te bestuderen. Er werd gekozen voor sferoïden die in
een 3D-collageenmatrix werden geplaatst. Deze collageenmatrix dient het extracellulair
milieu in vivo zo goed mogelijk na te bootsen. Allereerst werd de meeste optimale
concentratie collageen bepaald, welke werd vastgesteld op 1mg/ml. Dit houdt in dat er een
evenwicht moet zijn tussen de stabiliteit van het milieu en toch mogelijkheden laat tot invasie.
Deze celmatrix laat ons toe een mooi 3D-model te bekomen van de bestudeerde sferoïden
en leent zich ideaal om foto‟ s te maken ter kwantificatie van de invasie.
Eén van de voorwaarden voor initiatie van invasie is het verzwakken van de cel-cel
contacten. Zoals hierboven beschreven is een van de mechanismen die hiertoe bijdraagt, de
verminderde expressie van E(pitheliaal)-cadherine. Collageen type I zorgt voor een
verminderde expressie van E-cadherine (Menke et al., 2001).
Als eerste luik in deze thesis hebben we verschillende matrixproteïnes onder de loep
genomen. Zo konden we laminine identificeren als een sterke inhibitor van invasie in het
sferoïdinvasiemodel. Andere extracellulaire matrixproteïnes en delen van de basale
membraan bleken een niet significante rol te spelen bij de invasie. Bij de introductie van
groeifactoren (EGF en TGF-β) zagen we ook geen significantie inhibitie of activatie van de
invasie (data niet getoond), zodat we konden concluderen dat het invasiepotentieel reeds
optimaal benut werd bij de WISP-2-onderdrukte cellen.
Deze screening naar betrokken matrixproteïnen is uitermate belangrijk indien we
terugkoppelen naar de in vivo omstandigheden omdat deze componenten een doel kunnen
vormen voor toekomstige therapieën. Al de testen werden in drievoud uitgevoerd om
toevallige variaties zoveel mogelijk uit te sluiten. Naast laminine vermelden we ook Matrigel.
Een substantie die qua samenstelling heel sterk aanleunt bij het weefsel in vivo. Zoals in de
lijn van de verwachtingen ligt, gezien de grote concentratie laminine in Matrigel, vinden we
ook hier een sterke inhibitie terug. Belangrijk is om de mechanismen die bij de epitheliale-
mesenchymale overgang (EMT) een rol spelen, te ontrafelen. De epitheliale-mesenchymale
44
transitie (EMT) zorgt voor gewijzigde eigenschappen van de cel. In dit proces vinden we een
verlies van celadhesies, repressie van de E-cadherine-expressie en verhoogde celmobiliteit
(Voulgari en Pintzas, 2009). Er zijn verschillende oncogene pathways gekend waardoor
EMT geïnduceerd wordt. In het bijzonder de Ras-MAPK pathway. Hieraan zijn twee
transciptiefactoren gerelateerd, nl Snail en Slug. Zij zijn beide inhibitoren van E-Cadherine
(welke zorgt voor stevige celcontacten) (Fritah et al., 2008), (Yilmaz en Christofori, 2009).
Deze EMT is zo belangrijk omdat ze een eerste stap is in de initiatie van de metastasering.
Het verlies van cel-cel contacten is gemediëerd door E-Cadherine repressie en een
verhoging van de cel mobiliteit. Dit is een karakteristieke eigenschap van cellen die
prolifereren (De Wever et al., 2008).
Nadat we onze matrixproteïnen hebben gescreend, hebben we een manier gezocht om de
verschillende pathways te onderzoeken. We hebben hiervoor dan een MAPK array gebruikt
samen met een collageenmatrix waaraan al dan niet laminine werd toegevoegd. Deze MAPK
array doet vermoeden dat JNK fosforylatie essentieel is in WISP-2 onderdrukte invasie.
Nu de pathways blootgelegd zijn, gaan we over naar een tweede belangrijke luik van deze
thesis: de farmacologische inhibitoren.
We bespreken hier het effect van JNK inhibitoren, Rho inhibitoren, ROCK inhibitoren.
SP600125, welke een JNK inhibitor is, zorgt voor significante inhibitie van de invasie. Zoals
we reeds hoger hebben beschreven, was deze pathway actief in de MAPK array die we
hebben uitgevoerd. Deze inhibitor zorgt dus voor een concentratiegerelateerde inhibitie van
invasie. Verder hebben we ook enkele Rho-modulatoren getest. Ook hier hebben we enkele
inhibitoren geïdentificeerd die een vermindering van invasie tot gevolg hebben. C3T is een
Rho-inhibitor, Y27632 is een ROCK inhibitor en CNF geeft ons Rho-activatie. Deze laatste
activator toont een lichte, doch niet significante verhoging van de invasie. Het exo-enzyme
C3T geeft inhibitie, net zoals de verder downstream werkende ROCK inhibitor Y27632.
Een derde luik zijn de klinische inhibitoren. We hebben deze getest om toch ook enkele in de
praktijk gebruikte te testen. Deze medicatie werkt via bepaalde pathways, waarvan sommige
nog niet bekend zijn in een bepaald type tumor. Het is dus zeker nuttig om een screening
van dergelijke producten uit te voeren. Gleevec®, M475271, Iressa (EGFR-inhibitor) en BIM-
46174 werden getest in onze collageenmatrix.
Hierbij is het interessant om te zien dat M475271 voor een zeer sterke inhibitie zorgt van
invasie. Deze inhibitor werkt op een integrine receptor complex. Dit zijn
celoppervlaktereceptoren die interageren met de extracellulaire matrix en intracellulaire
45
signalen mediëren. Ze zorgen voor de cellulaire vorm, mobiliteit en reguleren de celcyclus.
Integrines spelen vooral een rol in de cel-matrix contacten. Daarnaast spelen ze ook een rol
in de signaaltransductie, wat inhoudt dat een signaal omgezet wordt door de cel in een ander
signaal. De integrines hebben een heterodimere vorm bestaande uit α en β subunits. In
relatie met onze bestudeerde matrixproteïnes vinden we bij de liganden onder andere
fibronectine, collageen en laminine. Ze zorgen vooral voor de trekvastheid. Men kan ze
eigenlijk vergelijken met een soort gesofisticeerde haken waarmee de cel zich vasthecht aan
zijn omgeving via complexen. M475271 werkt specifiek op de Src kinase, een van de twee
kinasesystemen (naast focal adhesion kinase) dat zo substraten fosforyleert en op die
manier nieuwe signalen produceert.
Integrines blijken enorm belangrijk te zijn voor verschillende processen zoals celgroei,
celdeling, celoverleving, cellulaire differentiatie en apoptose. Het feit dat M475271 een
dergelijke sterke inhibitie geeft, schept zeker mogelijkheden voor verdere trials met deze
specifieke inhibitor bij borstkanker (De Wever et al., 2008). Gleevec® en BIM-46174 geven
een minder sterke inhibitie, doch hun effect is zeker waarneembaar. Verdere trials dienen
zich aan. Iressa aan de andere kant toonde ons geen effect. Iressa is echter zeker bruikbaar
in de behandeling van borstkanker, gezien recente studies pathways aangeven die bij
borsttumoren kunnen gebruikt worden (McGovern et al., 2009).
Het werk in deze thesis toont aan dat matrixproteïnen een enorme rol spelen in het MCF-7
shWISP-2 model. Laminine, een belangrijke component van de basale membraan, heeft een
inhiberend effect op de RhoA-ROCK-JNK pathway die op zijn beurt essentieel is voor
invasie.
46
7. Referentielijst
ALI N., YOSHIZUMI M., YANO S., SONE S., OHNISHI H., ISHIZAWA K., KANEMATSU Y., TSUCHIYA K.,TAMAKI T.: The novel Src kinase inhibitor M475271 inhibits VEGF-induced vascular endothelial-cadherin and beta-catenin phosphorylation but increases their association. J Pharmacol Sci, 2006, 102 (1), 112-20.
ARAUJO V. C., FURUSE C., CURY P. R., ALTEMANI A., ALVES V. A.,DE ARAUJO N. S.: Tenascin and fibronectin expression in carcinoma ex pleomorphic adenoma. Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2008, 16 (1), 48-53.
CARPENTER P. M., DAO A. V., ARAIN Z. S., CHANG M. K., NGUYEN H. P., ARAIN S., WANG-RODRIGUEZ J., KWON S. Y.,WILCZYNSKI S. P.: Motility induction in breast carcinoma by mammary epithelial laminin 332 (laminin 5). Mol Cancer Res, 2009, 7 (4), 462-75.
CHU D.,LU J.: Novel therapies in breast cancer: what is new from ASCO 2008. J Hematol Oncol, 2008, 1 16.
COOPMAN P., VERHASSELT B., BRACKE M., DE BRUYNE G., CASTRONOVO V., SOBEL M., FOIDART J. M., VAN ROY F.,MAREEL M.: Arrest of MCF-7 cell migration by laminin in vitro: possible mechanisms. Clin Exp Metastasis, 1991, 9 (5), 469-84.
CRAWFORD Y., KASMAN I., YU L., ZHONG C., WU X., MODRUSAN Z., KAMINKER J.,FERRARA N.: PDGF-C mediates the angiogenic and tumorigenic properties of fibroblasts associated with tumors refractory to anti-VEGF treatment. Cancer Cell, 2009, 15 (1), 21-34.
DE CRAENE B., GILBERT B., STOVE C., BRUYNEEL E., VAN ROY F.,BERX G.: The transcription factor snail induces tumor cell invasion through modulation of the epithelial cell differentiation program. Cancer Res, 2005, 65 (14), 6237-44.
DE WEVER O., PAUWELS P., DE CRAENE B., SABBAH M., EMAMI S., REDEUILH G., GESPACH C., BRACKE M.,BERX G.: Molecular and pathological signatures of epithelial-mesenchymal transitions at the cancer invasion front. Histochem Cell Biol, 2008, 130 (3), 481-94.
DI LULLO G. A., SWEENEY S. M., KORKKO J., ALA-KOKKO L.,SAN ANTONIO J. D.: Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J Biol Chem, 2002, 277 (6), 4223-31.
DO S. I., JUNG W. W., KIM H. S.,PARK Y. K.: The expression of epidermal growth factor receptor and its downstream signaling molecules in osteosarcoma. Int J Oncol, 2009, 34 (3), 797-803.
EMOTO K., YAMADA Y., SAWADA H., FUJIMOTO H., UENO M., TAKAYAMA T., KAMADA K., NAITO A., HIRAO S.,NAKAJIMA Y.: Annexin II overexpression correlates with stromal tenascin-C overexpression: a prognostic marker in colorectal carcinoma. Cancer, 2001, 92 (6), 1419-26.
ESSLER M., LINDER S., SCHELL B., HUFNER K., WIEDEMANN A., RANDHAHN K., STADDON J. M.,AEPFELBACHER M.: Cytotoxic necrotizing factor 1 of Escherichia coli stimulates Rho/Rho-kinase-dependent myosin light-chain phosphorylation without inactivating myosin light-chain phosphatase in endothelial cells. Infect Immun, 2003, 71 (9), 5188-93.
FENDRICH V., WALDMANN J., FELDMANN G., SCHLOSSER K., KONIG A., RAMASWAMY A., BARTSCH D. K.,KARAKAS E.: Unique expression pattern of the EMT markers Snail, Twist and E-cadherin in benign and malignant parathyroid neoplasia. Eur J Endocrinol, 2009, 160 (4), 695-703.
FIEDLER L. R.,EBLE J. A.: Decorin regulates endothelial cell-matrix interactions during angiogenesis. Cell Adh Migr, 2009, 3 (1),
FIEDLER L. R., SCHONHERR E., WADDINGTON R., NILAND S., SEIDLER D. G., AESCHLIMANN D.,EBLE J. A.: Decorin regulates endothelial cell motility on collagen I through activation of insulin-like growth factor I receptor and modulation of alpha2beta1 integrin activity. J Biol Chem, 2008, 283 (25), 17406-15.
47
FREITAS M. R., ETO M., KIRKBRIDE J. A., SCHOTT C., SASSARD J.,STOCLET J. C.: Y27632, a Rho-activated kinase inhibitor, normalizes dysregulation in alpha1-adrenergic receptor-induced contraction of Lyon hypertensive rat artery smooth muscle. Fundam Clin Pharmacol, 2009,
FRITAH A., SAUCIER C., DE WEVER O., BRACKE M., BIECHE I., LIDEREAU R., GESPACH C., DROUOT S., REDEUILH G.,SABBAH M.: Role of WISP-2/CCN5 in the maintenance of a differentiated and noninvasive phenotype in human breast cancer cells. Mol Cell Biol, 2008, 28 (3), 1114-23.
GOULD ROTHBERG B. E.,BRACKEN M. B.: E-cadherin immunohistochemical expression as a prognostic factor in infiltrating ductal carcinoma of the breast: a systematic review and meta-analysis. Breast Cancer Res Treat, 2006, 100 (2), 139-48.
GUPTA S. K., DOUGLAS-JONES A. G., JASANI B., MORGAN J. M., PIGNATELLI M.,MANSEL R. E.: E-cadherin (E-cad) expression in duct carcinoma in situ (DCIS) of the breast. Virchows Arch, 1997, 430 (1), 23-8.
HUELSENBECK J., DREGER S. C., GERHARD R., FRITZ G., JUST I.,GENTH H.: Upregulation of the immediate early gene product RhoB by exoenzyme C3 from Clostridium limosum and toxin B from Clostridium difficile. Biochemistry, 2007, 46 (16), 4923-31.
KIM C., AMANO T., PARK J., CARTER M. G., TIAN X.,YANG X.: Improvement of embryonic stem cell line derivation efficiency with novel medium, glucose concentration, and epigenetic modifications. Cloning Stem Cells, 2009, 11 (1), 89-100.
KUWAHARA K., SAITO Y., NAKAGAWA O., KISHIMOTO I., HARADA M., OGAWA E., MIYAMOTO Y., HAMANAKA I., KAJIYAMA N., TAKAHASHI N., IZUMI T., KAWAKAMI R., TAMURA N., OGAWA Y.,NAKAO K.: The effects of the selective ROCK inhibitor, Y27632, on ET-1-induced hypertrophic response in neonatal rat cardiac myocytes--possible involvement of Rho/ROCK pathway in cardiac muscle cell hypertrophy. FEBS Lett, 1999, 452 (3), 314-8.
LISTOV-SAABYE N., JENSEN M. B., KIEHR B., HANSEN E. W., SVENDSEN J. E., LUNDBY A., HOLM G. M.,OLEKSIEWICZ M. B.: MCF-7 human mammary adenocarcinoma cells exhibit augmented responses to human insulin on a collagen IV surface. J Appl Toxicol, 2009,
LOBO M. V., HUERTA L., ARENAS M. I., BUSTO R., LASUNCION M. A.,MARTIN-HIDALGO A.: Hormone-sensitive lipase expression and IHC localization in the rat ovary, oviduct, and uterus. J Histochem Cytochem, 2009, 57 (1), 51-60.
MCGOVERN U. B., FRANCIS R. E., PECK B., GUEST S. K., WANG J., MYATT S. S., KROL J., KWOK J. M., POLYCHRONIS A., COOMBES R. C.,LAM E. W.: Gefitinib (Iressa) represses FOXM1 expression via FOXO3a in breast cancer. Mol Cancer Ther, 2009, 8 (3), 582-91.
MENKE A., PHILIPPI C., VOGELMANN R., SEIDEL B., LUTZ M. P., ADLER G.,WEDLICH D.: Down-regulation of E-cadherin gene expression by collagen type I and type III in pancreatic cancer cell lines. Cancer Res, 2001, 61 (8), 3508-17.
NANKI N., FUJITA J., YANG Y., HOJO S., BANDOH S., YAMAJI Y.,ISHIDA T.: Expression of oncofetal fibronectin and syndecan-1 mRNA in 18 human lung cancer cell lines. Tumour Biol, 2001, 22 (6), 390-6.
OHASHI T.,ERICKSON H. P.: Revisiting the mystery of fibronectin multimers: The fibronectin matrix is composed of fibronectin dimers cross-linked by non-covalent bonds. Matrix Biol, 2009,
PREVOST G. P., LONCHAMPT M. O., HOLBECK S., ATTOUB S., ZAHAREVITZ D., ALLEY M., WRIGHT J., BREZAK M. C., COULOMB H., SAVOLA A., HUCHET M., CHAUMERON S., NGUYEN Q. D., FORGEZ P., BRUYNEEL E., BRACKE M., FERRANDIS E., ROUBERT P., DEMARQUAY D., GESPACH C.,KASPRZYK P. G.: Anticancer activity of BIM-46174, a new inhibitor of the heterotrimeric Galpha/Gbetagamma protein complex. Cancer Res, 2006, 66 (18), 9227-34.
RICKETTS M. H.: Cancer--approaching a universal molecular mechanism? S Afr Med J, 1990, 77 (7), 351-3.
RODAHL E., VAN GINDERDEUREN R., KNAPPSKOG P. M., BREDRUP C.,BOMAN H.: A second decorin frame shift mutation in a family with congenital stromal corneal dystrophy. Am J Ophthalmol, 2006, 142 (3), 520-1.
48
SHINTANI K., MATSUMINE A., KUSUZAKI K., MORIKAWA J., MATSUBARA T., WAKABAYASHI T., ARAKI K., SATONAKA H., WAKABAYASHI H., IINO T.,UCHIDA A.: Decorin suppresses lung metastases of murine osteosarcoma. Oncol Rep, 2008, 19 (6), 1533-9.
SWEENEY S. M., ORGEL J. P., FERTALA A., MCAULIFFE J. D., TURNER K. R., DI LULLO G. A., CHEN S., ANTIPOVA O., PERUMAL S., ALA-KOKKO L., FORLINO A., CABRAL W. A., BARNES A. M., MARINI J. C.,SAN ANTONIO J. D.: Candidate cell and matrix interaction domains on the collagen fibril, the predominant protein of vertebrates. J Biol Chem, 2008, 283 (30), 21187-97.
UEDA K., SHIMIZU O., OKA S., SAITO M., HIDE M.,MATSUMOTO M.: Distribution of tenascin-C, fibronectin and collagen types III and IV during regeneration of rat submandibular gland. Int J Oral Maxillofac Surg, 2009, 38 (1), 79-84.
VOULGARI A.,PINTZAS A.: Epithelial-mesenchymal transition in cancer metastasis: Mechanisms, markers and strategies to overcome drug resistance in the clinic. Biochim Biophys Acta, 2009,
YILMAZ M.,CHRISTOFORI G.: EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion. Cancer Metastasis Rev, 2009, 28 (1-2), 15-33.