Schema zur Analytik von synth. Peptiden Synthese (manuel, automatisch, parallel) Abspaltung (Fällung aus unpolarem Lösungsmittel) Gefriertrocknung HPLC MS MS/MS Sequenzierung Kopplung mit UV, MS Aminosäurenanalyse ggf. an chiraler Säule Reinheit Identität Salzgehalt Entantiomerenreinheit 1
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Schema zur Analytik von synth. PeptidenSynthese (manuel, automatisch, parallel)
Abspaltung (Fällung aus unpolarem Lösungsmittel)
Gefriertrocknung
HPLCMSMS/MSSequenzierung
Kopplung mitUV, MS
Aminosäurenanalyseggf. an chiraler Säule
Reinheit
Identität
SalzgehaltEntantiomerenreinheit
1
Chromatographie
Peptidsynthese in Lösung
2
Säulehydrophob: SiR3-O-C12H25
Pumpen
Laufmittel: Wasser, pH 2; Acetonitril
Probenaufgabesystem
Detektor
Octadecyl‐Phase C18
3
Wellenlänge [nm]
Peptid (enthält Tyrosin)
Peptid (mit Fmoc-Schutzgruppe)
Peptid (mit Mtr-Schutzgruppe)
UV-Spektren von Peptiden mit und ohne Schutzgruppen
Wird mit einem hydrophoben Lösungsmittel extrahiert
Sequenzierung nach Edman
(Phenylthiocarbamoylpeptid)
9
Phenylthiohydantoin-Aminosäure
3. Schritt: Umwandlung (Hydrolyse+ Umlagerung)
Phenylthiocarbamoyl-Aminosäure
Sequenzierung nach Edman
10
W
min
Analyse mittels HPLC
11
12
Massenspektrometrie
Essentielle Eigenschaften von allen MS Verfahren:• Erzeugung von Ionen in der Gas- oder Plasmaphase• Beschleunigung der Ionen in einem elektrischen Feld• Trennung der Ionen entsprechend der m/z Verhältnis
in einen Massenanalysator• Detektion der Ionen
13
Massenspektrometer
“soft"
14
MALD-Ionisierung
• Probe in lichtabsorbierender Matrix• Laserbestrahlung• thermische, photochemische Anregung Ionisierung
Probe + Matrix Ionen mit gleicher Masseverschiedener Geschwindigkeit
Problem: Peaks sind inhärent breit in MALDI-TOF Spektra (niedrige Massenauflösung)
Ungleiche Energieverteilung bei der Ionisierung +
20
MALDI-TOF-MassenspektrometrieMethoden zur Kompensation der initialen Geschwindigkeits‐verteilung der Ionen:• Verzögerte Ionenextration (delayed extraction)
Das elektrische Feld wird zeitversetzt zum Laser Desorptionsimpuls eingeschaltet.
• Ionenspiegeln (Reflektoren)Elektrisches Gegenfeld angeschlossen an die Driftstrecke
SchärferePeaks
21
Kein elektrisches Feld, Ionen streuen.
++ +
Ionen mit gleicher Masse, unterschiedlicher Geschwindigkeit
Feld angelegt, langsame Ionen beschleunigen mehr als die Schnelleren
0 V.
0 V.
++ +
Langsame Ionen erreichen die Schnellen
20 kV.
20 kV.
0 V.
0 V.+++
MALDI-TOF-Massenspektrometrie
Delayed extraction
1.
2.
3.
22
MALDI-TOF-Massenspektrometrie
Reflektor
23
TOF: Time-of-flight
• Trennung der Ionen aufgrund unterschiedlicher Flugzeit bei vorgegebenem Wegt = f ( 2m/z )
• Reflektor und Delayed Extraction (DE): erhöhen Genauigkeit und Empfindlichkeit
24
MALDI-TOF von Angiotensin: M+H+theor. 1046.54
25
MALDI-TOF von recombinant SERPINA12 / Vaspin
26
Elektrospray-Ionisierung
Spray Elektrospray
27
Elektrospray-Ionisierung
28
Elektrospray-Ionisierung
Verdampfungdes Lösungsmittels
29
Elektrospray-Ionisierung
• protonenhaltige Lösung der Probe• Zerstäubung im Hochspannungsfeld• Lösungsmittel verdunstet• Zerfall der Molekülcluster in vielfachgeladene Ionen:[M+nH]n+ oder [M‐nH]n‐
John B. Fenn
Nobel Price in Chemistry 20021/4 share
30
Interface zwischen ESI-Quelle und Quadrupole
Atmosphärendruck Hochvakuum
Vorvakuum
31
Quadrupol-Filter
-
-
+
+
-
-+
+
32
Quadrupol-Filter
33
Quadrupol-Detektion
• Massentrennung durch Schwingung der Ionen in einem hochfrequenten elektrischen Feld(Kombination von Radiofrequenzspannung V und Gleichspannung U)
• V/U konstant nur ein m/z‐Ion stabil• Veränderung der Amplitude Spektrum
34
ESI-MS von Neurotensin 1673,5
35
36
MALDI gegen ESI
MALDI ESIAnalyte in matrix Analyte in solutionSample bombardment with laser to desolvate ions
Dissolved charged sample desolvated, “cold ions”
Ionization takes place through the matrix
Ions are brought to the gas phase
Ionization in vacuum Spray in atmospheric pressureGenerates ion pulses Generates a continuous current