VKT - D12 2/11/2015 1 SẢN XUẤT KHÁNG SINH Mục tiêu 1. Nắm được qui trình chung sản xuất kháng sinh 2. Xây dựng qui trình sản xuất benzylpenicillin 3. Mở rộng triển khai qui trình sản xuất một số kháng sinh khác Kháng sinh – Lịch sử phát triển Alexander Fleming Howard Walter Florey 1928: phát hiện nấm mốc xanh Penicillium có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn ~ 1940: phát hiện chủng Penicillium mới có khả năng sản xuất penicillin với số lượng lớn Salman Waksman Kháng sinh – Lịch sử phát triển 1944: phát hiện streptomycin từ xạ khuẩn Streptomyces Một số kháng sinh khác: Actinomycin, neomycin, streptothricin từ Streptomyces Polymyxin, chloramphenicol, tetracyclin,.. Từ 1970, kháng sinh có nguồn gốc bán tổng hợp
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
VKT - D12 2/11/2015
1
SẢN XUẤT KHÁNG SINH
Mục tiêu
1. Nắm được qui trình chung sản xuất kháng sinh
2. Xây dựng qui trình sản xuất benzylpenicillin
3. Mở rộng triển khai qui trình sản xuất một số kháng sinh khác
Kháng sinh – Lịch sử phát triển
Alexander Fleming
Howard Walter Florey
1928: phát hiện nấm mốc xanh Penicillium có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn
~ 1940: phát hiện chủng Penicilliummới có khả năng sản xuất penicillin với số lượng lớn
Salman Waksman
Kháng sinh – Lịch sử phát triển
1944: phát hiện streptomycin từ xạ khuẩn Streptomyces
Một số kháng sinh khác:
Actinomycin, neomycin, streptothricin từ Streptomyces
Polymyxin, chloramphenicol, tetracyclin,..
Từ 1970, kháng sinh có nguồn gốc bán tổng hợp
VKT - D12 2/11/2015
2
Sản xuất kháng sinh – Các giai đoạn
Sản xuất
Chiết tách
Tinh chế
Đóng gói
Sản xuất kháng sinh – Giai đoạn lên men
Nguyên liệu thô Vi sinh vật Kháng sinh
Quá trình lên men
Sản xuất kháng sinh – Giai đoạn lên men
Nguyên liệu thô
Nguồn carbon Nguồn nitơ Khoáng chất, vitamin
Rỉ đường, đậu nành
Lactose, glucose Muối amoni
Sulfat, hydrophosphat
S, P, Cu, Zn, Mg
Chất chống bọt
Dầu thực vật, silicon
Vi sinh vật sản xuất kháng sinh
Nuôi cấy vi sinh vật trong bình lắc với mội trường tăng trưởng
Bình lên men
Giai đoạn lên men
Trong quá trình lên men, VSV tiếp tục tăng trưởng và sản xuất 1 lượng lớn kháng sinhBình chứa môi trường được trang
bị đĩa khuấy để trộn môi trường và bơm không khí vô trùng
Sản xuất kháng sinh – Giai đoạn chiết tách và tinh chế
4. Giai đoạn chiết tách và tinh chế:
Sau 3-5 ngày lên men, lượng kháng sinh thu được đạt tối đa bắt đầu giai đoạn chiết tách
Kháng sinh tan trong nước: chiết tách bằng phương pháp trao đổi ion
• Tách kháng sinh ra khỏi tạp chất hữu cơ
• Tách kháng sinh với các hợp chất tan trong nước khác
Sản xuất kháng sinh – Giai đoạn chiết tách và tinh chế
Nguyên tắc chiết tách kháng sinh bằng pp trao đổi ion
http://www.waters.com/waters
Kháng sinh tan trong dầu: chiết tách bằng dung môi• Dịch lên men được xử lý bằng dung môi hữu cơ: butyl acetat, methyl isobutyl keton hòa tan kháng sinh• Phục hồi kháng sinh bằng các chất hữu cơ
Kháng sinh thu được ở dạng bột tinh khiết
Sản xuất kháng sinh – Giai đoạn chiết tách và tinh chế
Sản xuất kháng sinh – Giai đoạn hoàn chỉnh
5. Sản xuất kháng sinh với các dạng bào chế khác nhau:
• Dạng tiêm truyền tĩnh mạch: kháng sinh được hòa trong dung môi, đóng gói và hàn kín
Tạo chủng vi sinh vật sản xuất penicillin với hiệu suất cao
Sản xuất benzylpenicillin – Nhân giống
Chủng vi sinh vật gốc
Nuôi cấy trên môi trường rắn
Hoạt hóa trong môi trường lỏng
Nuôi cấy với môi trường lỏng trong bình lắc
Nuôi cấy với môi trường lỏng trong hệ thống thiết bị
Sản xuất benzylpenicillin – Lên men
Nồi lên men
VKT - D12 2/11/2015
10
Sản xuất benzylpenicillin – Lên men
1. Cung cấp oxy
- Dưới dạng không khí lọc vô trùng
- Tốc độ 0,5 – 1,2 vvm
Trang bị hệ thống cánh khuấy và gờ cản:
• Thúc đẩy quá trình thông khí
• Thúc đẩy sự trộn lẫn tế bào và môi trường
Sản xuất benzylpenicillin – Lên men
2. Kiểm soát nhiệt độ
- Quá trình sản xuất penicillin nhạy cảm với nhiệt độ
- Duy trì nhiệt độ 26±1 oC
Trang bị hệ thống làm lạnh:
• Kiểm soát nhiệt chuyển hóa
• Giảm nhiệt độ của quá trình lên men
• Làm nguội môi trường sau khi tiệt trùng
Sản xuất benzylpenicillin – Lên men
Hệ thống làm lạnh
Nồi lên men
Sản xuất benzylpenicillin – Lên men
3. Thiết bị và tác nhân khử bọt
- Quá trình nuôi cấy vi sinh vật tạo bọt do sự thông khí và khuấy trộn mạnh
Dịch nuôi cấy VSV bị hao hụt theo đường khí thải
Cần trang bị hệ thống phát hiện bọt tự động
Xử lý:
• Tạm thời: tạo áp suất ngược dòng giữ dịch nuôi cấy trong nồi lên men
• Dùng chất khử bọt vô trùng
VKT - D12 2/11/2015
11
Sản xuất benzylpenicillin – Lên men
4. Các trang bị khác
- Các thiết bị khác được trang bị nhằm kiểm tra các thông số như: nhiệt độ, pH, năng lượng tiêu hao của mô tơ điện, dòng khí, oxy hòa tan và phân tích khí thải
- Bộ cảm biến cung cấp dữ liệu cho quá trình kiểm soát chất lượng thủ công hay bằng hệ thống máy tính
http://216.47.139.198/pensim/bground.html
Sản xuất benzylpenicillin – Lên men
Một số thiết bị hỗ trợ quá trình lên men
Sản xuất benzylpenicillin – Lên men
5. Bổ sung môi trường
- Môi trường lên men không chứa tất cả các chất dinh dưỡng cần thiết ngay từ đầu
- Các chất bổ sung:
• Được tiệt trùng từng lô hay tiệt trùng bằng hệ thống liên tục
• Bổ sung trong suốt quá trình lên men bằng hệ thống tự động có thể kiểm soát tốc độ hoặc ngừng cung cấp
Sản xuất benzylpenicillin – Lên men
6. Hệ thống vận chuyển và lấy mẫu
- Hệ thống vận chuyển vô trùng dùng để:
• Chuyển giống vi sinh vật vào nồi lên men
• Lấy mẫu thường qui trong quá trình lên men
• Thu hoạch sản phẩm từng phần khi nồi lên men đầy do bổ sung môi trường
• Chuyển sản phẩm của quá trình lên men sang giai đoạn chiết tách
• Hơi nước phải tiếp xúc được với toàn bộ bộ phận của nồi lên men và hệ thống ống dẫn
Bất cứ khối không khí hay bề mặt thiết bị không tiếp xúc với hơi nước đều có thể là nguyên nhân gây
ngoại nhiễm
Sản xuất benzylpenicillin – Lên men
6. Hệ thống vận chuyển và lấy mãu
- Quá trình lấy mẫu cần thiết nhằm theo dõi:
• Tốc độ tăng trưởng
• Động học của các chất dinh dưỡng
• Nồng độ penicillin
• Sự ngoại nhiễm
Lên men benzylpenicillin – Kiểm soát
- Độ thông khí: tốc độ tăng trưởng VSV trong giai đoạn lên men = giai đoạn nhân giống mật độ VSV trong môi trường cao không đủ thông khí để duy trì sản xuất penicillin
- Nồng độ oxy: nồng độ oxy dưới ngưỡng tới hạn quá trình sinh tổng hợp benzylpenicillin giảm mạnh mặc dù VSV vẫn tăng trưởng
Sản xuất benzylpenicillin – Kiểm soát quá trình lên men
Kiểm soát tốc độ tăng trưởng của VSV:
Duy trì tốc độ tăng trưởng nhanh chỉ đến khi mật độ VSV đạt tối đa so với công suất của nồi lên men
Tốc độ giai đoạn tăng trưởng tiếp theo được kiểm soát bằng cách kiểm tra nghiêm ngặt lượng chất dinh dưỡng cung cấp
Benzylpenicillin được sản xuất với hiệu suất cao
VKT - D12 2/11/2015
13
Lên men benzylpenicillin – Môi trường
Môi trường lên men ban đầu chỉ cung cấp một lượng chất dinh dưỡng nhất định cho quá trình tăng trưởng
VSV trong giai đoạn đầu
1. Nguồn nitơ: cao ngô (Corn Steep Liquor – CSL)
• Là sản phẩm phụ của quá trình sản xuất tinh bột ngô
• Được dùng để nuôi cấy nấm sản xuất penicillin và nhiều loại nấm sản xuất kháng sinh khác
• Cung cấp mốt số hợp chất carbon có ích như: acid, đường
• Cung cấp một số ion vô cơ và yếu tố tăng trưởng
• Rẻ tiền
Lên men benzylpenicillin – Môi trường
1. Nguồn nitơ: cao ngô (Corn Steep Liquor – CSL)
• Là chất dinh dưỡng phức tạp, thành phần hóa học chưa được xác định rõ
• Là hợp chất tự nhiên
• Thành phần khác nhau giữa các lô mẻ sản xuất
Lên men benzylpenicillin – Môi trường
Không có hai lô mẻ lên men hoàn toàn giống nhau
Chuyển sang sử dụng nguồn nitơ có thành phần xác định
Lên men benzylpenicillin – Môi trường
2. Nguồn nitơ phụ trợ và một số chất dinh dưỡng cần thiết khác:
• Canxi: dưới dạng CaCO3 để trung hòa pH acid tự nhiên của cao ngô
• Magie, sulfat, phosphat, kali và các kim loại vi lượng
VKT - D12 2/11/2015
14
Lên men benzylpenicillin – Môi trường lên men
3. Tiệt trùng môi trường:
- Ở 120 oC
- Trong nồi lên men hoặc trong thiết bị đi kèm
- Có thể tiệt trùng liên tục
Lên men benzylpenicillin – Chất dinh dưỡng
- Môi trường tiệt trùng được khuấy trộn, thông khí, điều chỉnh pH, nhiệt độ
- Cấy giống và bắt đầu pha tăng trưởng
- Nguồn carbon ban đầu:
• Chỉ đủ cung cấp cho giai đoạn tăng trưởng ban đầu
• Không đủ :
Cung cấp năng lượng cho quá trình sản xuất penicillin
Đảm bảo duy trì sinh khối cần thiết trong các giai đoạn còn lại của quá trình lên men
Lên men benzylpenicillin – Chất dinh dưỡng
- Nguồn carbon được bổ sung liên tục để có thể kiểm soát tốc độ tăng trưởng của VSV
- Nguồn carbon thường được sử dụng: sucrose hoặc glucose. Để giảm chi phí có thể sử dụng dạng không tinh khiết: mật đường hoặc dịch tinh bột thủy phân
- Nguồn carbon khác: nhiều nhà sản xuất sử dụng lactose
Lên men benzylpenicillin – Chất dinh dưỡng
- Khi nồng độ đường còn dư trong môi trường quá thấp không đo được tốc độ bổ sung nguồn carbon quyết định dựa trên kinh nghiệm và quan sát hệ thống
- Kiểm soát tỉ lệ cung cấp nguồn carbon sử dụng lactose tốc độ thủy phân lactose thành hexose hạn chế lượng carbon cung cấp chậm và ổn định
VKT - D12 2/11/2015
15
Lên men benzylpenicillin – Chất dinh dưỡng
- Canxi, magie, phosphat và các kim loại vi lượng được cung cấp từ đầu đủ dùng cho cả quá trình lên men
- Nitơ và lưu huỳnh cần bổ sung để cân bằng với nguồn carbon
• Bổ sung nitơ dưới dạng khí amoniac
• Bổ sung sulfat dưới dạng kết hợp với đường
Lên men benzylpenicillin – Chất dinh dưỡng
- Tỉ lệ cân bằng giữa nitơ và carbon giúp:
• Đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của VSV
• Duy trì lượng dự trữ ion amoni
• Cân bằng pH môi trường: quá trình chuyển hóa carbon tạo pH acid sẽ được cân bằng pH kiềm của amoniac
Lên men benzylpenicillin – Chất dinh dưỡng
- Pha tăng trưởng nhanh chóng chuyển sang pha sản xuất penicillin
pH và nhiệt độ tối ưu của pha tăng trưởng không phải là tối ưu của pha sản xuất penicillin
thay đổi pH và nhiệt độ
- Acid phenylacetic (PAA) là chất bổ sung cuối cùng sẽ được cung cấp liên tục
Lên men benzylpenicillin – Chất dinh dưỡng
- Các chất dinh dưỡng được tiệt trùng trước khi đưa vào nồi lên men
- Hiếm khi xảy ra nhiễm vi khuẩn đề kháng kháng sinh
- Ngoại nhiễm gây ảnh hưởng đến chất lượng quá trình lên men. VD: vi khuẩn sản xuất β-lactamase gây:
• Phá hủy penicillin
• Sử dụng chất dinh dưỡng của môi trường
• Mất kiểm soát pH môi trường
• Ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất
VKT - D12 2/11/2015
16
Sản xuất benzylpenicillin – Lên men
Yêu cầu quan trọng của quá trình lên men là điều kiện vô trùng duy trì sự tăng trưởng của VSV sản xuất kháng sinh, không có sự phát triển của VSV ngoại nhiễm
Lên men benzylpenicillin – Kích thích bằng PAA
- PAA cung cấp nhánh bên cho penicillin
- Không có PAA, hiệu suất sản xuất penicillin giảm mạnh
- PAA ức chế sự tổng hợp các penicillin không mong muốn khác
- Nồng độ PAA cao gây độc
- PAA có giá thành cao
Kiểm soát lượng PAA không đạt tới giới hạn gây độc giảm lượng PAA ngay trước khi quá trình lên men kết thúc
Lên men benzylpenicillin – Kích thích bằng PAA
- PAA hiện diện trong cao ngô: do hệ vi khuẩn tự nhiên biến đổi từ phenylalanin có trong hạt ngô
Nhánh acyl Acid 6-aminopenicillanic
PAA
Lên men benzylpenicillin – Kích thích bằng PAA
+ PAA
VKT - D12 2/11/2015
17
Sinh tổng hợp và bán tổng hợp các penicillin
Sản xuất benzylpenicillin – Nguyên liệu
Môi trường nuôi cấy sản xuất penicillin:Thành phần Tỉ lệ [% (w/v)]NướcCao ngô 2,0Lactose 4,0NaNO3 0,3K2HPO4 0,05MgSO4 0,025CaCO3 0,4Β- phenylethylamin 0,25Chất chống tạo bọt 3 giọt/100 ml
Lên men benzylpenicillin – Kết thúc
- Kết thúc quá trình lên men phụ thuộc nhiều yếu tố và là một quyết định phức tạp
- Ngừng quá trình lên men khi bắt đầu giảm hiệu suất biến đổi các nguyên liệu thô đắt tiền thành penicillin
Lên men benzylpenicillin – Kết thúc
Động học quá trình lên men penicillin
VKT - D12 2/11/2015
18
Sản xuất benzylpenicillin – Chiết xuất
1. Loại bỏ tế bào
Bezylpenicillin và các chất chuyển hóa khác hòa tan ngoại bào cùng với các thành phần môi trường dinh dưỡng
Bước đầu tiên sau lên men là loại bỏ tế bào VSV khỏi môi trường lỏng: dùng phương pháp lọc hoặc ly tâm
Tuyệt đối tránh ngoại nhiễm VSV có khả năng sản xuất β-lactamase – là nguyên nhân gây thất thoát
sản phẩm
Chiết xuất benzylpenicillin – Chiết tách
2. Tách bezylpenicillin
- Thường tách bằng dung môi. Ngoài ra có thể dùng phương pháp sắc ký trao đổi ion, kết tủa
- Ở pH 2-2,5, penicillin có hệ số tách cao trong các dung môi hữu cơ như amyl acetat, butyl acetat, metyl isobutyl keton
Thực hiện chiết tách nhanh vì benzylpenicillin không bền ở pH thấp
- Tách penicillin trở lại pha nước bằng hệ đệm pH 7,5
- Kết tinh và sấy khô bezylpenicillin
Chiết xuất benzylpenicillin – Xử lý sản phẩm thô
3. Xử lý bezylpenicillin
- Bezylpenicillin được sản xuất dưới các dạng muối khác nhau, tùy mục đích sử dụng:
• Là nguyên liệu bán tổng hợp các kháng sinh nhóm β-lactam
• Dùng trong lâm sàng
- Gồm ba bước cơ bản:
1. Tạo muối thích hợp
2. Loại bỏ chí nhiệt tố
3. Tiệt trùng: lọc hay nhiệt khô
Chiết xuất benzylpenicillin – Xử lý sản phẩm thô
3. Xử lý bezylpenicillin
- Bào chế:
Dùng đường tiêm: kháng sinh được đóng gói trong lọ vô trùng dưới dạng bột đông khô hay huyền dịch
Dùng đường uống: được bào chế dưới dạng viên bao phim hay các dạng khác
- Kiểm nghiệm:
Lấy ngẫu nhiên số lượng thích hợp mẫu thành phẩm kiểm tra hoạt tính, độ tinh khiết, chí nhiệt tố và độ vô trùng
VKT - D12 2/11/2015
19
Sản xuất penicillin V
Cung cấp các chất cho acyl khác nhau
Tổng hợp các penicillin khác nhau
Chất cho acyl PenicillinPAAPhenoxyacetyl
Benzylpenicillin Penicillin V
Sản xuất penicillin V
Chủng VSV: P. chrysogenum
Dùng một chủng đột biến để sản xuất hai kháng sinh
Dùng các chủng đột biến khác nhau để sản xuất hai loại penicillin
Penicillin V
Penicillin V:
- Sử dụng trong lâm sàng
- Là nguyên liệu bán tổng hợp các penicillin khác không sản xuất trực tiếp được bằng phương pháp lên men
- Chủng gốc Acremonium chrysogenum (trước đây có tên Cephalosporium acremonium): được phân lập ở bờ biển Sardinian (Địa Trung Hải), năm 1945
- Cephalosporin C được phân lập năm 1952
- Sau một thập kỷ, các cephalosporin bán tổng hợp mới được sử dụng trong lâm sàng
Lên men cephalosporin C
- Chủng gốc Acremonium chrysogenum (trước đây có tên Cephalosporium acremonium): được phân lập ở bờ biển Sardinian (Địa Trung Hải), năm 1945
- Cephalosporin C được phân lập năm 1952
- Sau một thập kỷ, các cephalosporin bán tổng hợp mới được sử dụng trong lâm sàng
Lên men cephalosporin C
Isopenicillin N
Penicillin N
Desacetoxycephalosprin C
Desacetylcephalosprin C
Cephalosprin C
Cephamycin C
Sinh tổng hợp penicillin Sinh tổng hợp cephalosporin C
=
Kháng sinh nhóm cephem
Cephalosporin C
Cephamycin C
VKT - D12 2/11/2015
22
Lên men cephalosporin C
- Quá trình lên men cephalosporin C tương tự như benzylpenicillin
- Không cần tiền chất dinh dưỡng chuyên biệt cho quá trình lên men
- Các chất chuyển hóa của sinh vật cung cấp đủ cơ chất mang nhóm acetyl cho phản ứng vận chuyển acetyl (acetyltransferase)
Chiết tách cephalosporin C
Chiết tách cephalosporin chủ yếu bằng phương pháp hấp phụ trên carbon hay resin, không sử dụng dung môi
Qui trình sản xuất kháng sinh khác nhau ở giai đoạn phục hồi, không khác nhau ở giai đoạn lên men
Thực hành sản xuất tốt thuốc kháng sinh
Sản xuất
Chiết tách
Tinh chế
Đóng gói
GMP Đảm bảo chất lượng
Thực hành sản xuất tốt thuốc kháng sinh
Kiểm tra chất lượng
Dạng chưa thành phẩm
Dạng thành phẩm
VKT - D12 2/11/2015
23
Thực hành sản xuất tốt thuốc kháng sinh
Một số yêu cầu cơ bản của GMP:
1. Tất cả giai đoạn sản xuất phải được xác định rõ và nguyên vật liệu phải ổn định để đảm bảo chất lượng cũng như các tiêu chuẩn chuyên biệt
2. Các bước quyết định và những thay đổi lớn đến quá trình phải được xem xét
Một số yêu cầu cơ bản của GMP:
3. Tất cả các yếu tố thuận lợi cần thiết cho GMP phải được chuẩn bị:
• Đào tạo nhân lực
• Nhà xưởng
• Trang thiết bị
• Nguyên vật liệu, bao bì, nhãn
• Qui trình, tài liệu chuẩn
• Kho và phương tiện vận chuyển phù hợp
Thực hành sản xuất tốt thuốc kháng sinh
Thực hành sản xuất tốt thuốc kháng sinh
Một số yêu cầu cơ bản của GMP:
4. Tài liệu và qui trình được viết rõ ràng, ngôn ngữ dễ hiểu
5. Người vận hành được đào tạo để thực hiện đúng qui trình
6. Ghi lại báo cáo từng giai đoạn sản xuất, những thay đổi và điều tra nguyên nhân
7. Báo cáo quá trình sản xuất và phân phối của từng lô mẻ
Thực hành sản xuất tốt thuốc kháng sinh
Một số yêu cầu cơ bản của GMP:
8. Giảm thiểu nguy cơ ảnh hưởng đến chất lượng trong quá trình phân phối
9. Có hệ thống sẵn sàng thu hồi bất cứ lô mẻ sản xuất nào từ nhà kinh doanh hay phân phối
10. Xem xét tất cả các ý kiến phản hồi
VKT - D12 2/11/2015
24
Sản xuất erythromycin
Sản xuất erythromycin từ Saccharopolyspora erythraea
Xạ khuẩn Actinomyces:
- Phân bố rộng rãi trong tự nhiên: đất, nước
- Cung cấp nhiều chất chuyển hóa thứ cấp
- 9.000 hợp chất, chiếm 70-80% chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học do Actinomyces sản xuất:
• Chiếm 2/3 tổng số kháng sinh do VSV sản xuất
• 60% chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học không phải là kháng sinh
• 80% do vi khuẩn thuộc chi Streptomyces sản xuất
Sản xuất erythromycin từ S. erythraea
Xạ khuẩn Actinomyces:
- Có thể sử dụng Actinomyces với qui mô công nghiệp để sản xuất hợp chất polyketide có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau như chống ung thư, kháng sinh, ức chế miễn dịch,…
- S. erythraea có khả năng sản xuất kháng sinh nhóm macrolid erythromycin – là một polyketide nhóm I
Sản xuất erythromycin từ S. erythraea
- Erythromycin được phân lập từ S. erythraea (trước đây có tên là Streptomyces erythraea)
- Waksman phân lập S. erythraea năm 1919
- 1952, hoạt tính kháng sinh của chủng S. erythraeaNRRL2338 có nguồn gốc từ chủng phân lập đầu tiên được công bố
- Chủng NRRL2338 sản xuất 0,25-1 g erythromycin trong 1 l môi trường, tùy điều kiện lên men
- Sau 50 năm, hiệu suất tăng gấp 10 lần, 10-13 g/l môi trường
VKT - D12 2/11/2015
25
- Quá trình sinh tổng hợp erythromycin do nhóm gen ery có kích thước khoảng 60 kb mã hóa
Sản xuất erythromycin từ S. erythraea
- Quá trình lên men tạo hỗn hợp erythromycin A, B, C và D:
• Chỉ có erythromycin A là chất mong muốn
• Các chất khác là sản phẩm trung gian bị hydroxy hay methyl hóa
- Chủng VSV tốt có khả năng sản xuất 8-10 g/l erythromycin, chiếm >90% hàm lượng
Sản xuất erythromycin từ S. erythraea
- 1952, Lilly là công ty đầu tiên sản xuất erythromycin cung cấp cho thị trường
- Những năm 1970, Abbot là nhà cung cấp lớn nhất về số lượng cũng như giá trị
- Mỗi năm sản xuất ~ 4.000 tấn erythromycin:
• 1.000 tấn dùng ở dạng erythromycin
• 1.500 tấn chuyển thành azithromycin
• 1.500 tấn chuyển thành clarithromycin
• 400 tấn chuyển thàng roxithromycin
Sản xuất erythromycin từ S. erythraea
Chọn giống, giữ giống và lên men
Khuẩn lạc S. erythraea
Các chủng năng suất cao dễ bị biến đổi di truyền liên tục phân lập lại để giữ chủng cho năng suất cao đồng thời có ít sản phẩm phụ erythromycin B, C
VKT - D12 2/11/2015
26
Chọn giống, giữ giống và lên men
1. Chọn chủng S. erythaea năng suất cao:
- Chọn chủng từ ống thạch nghiêng, đông khô hay huyền phù bào tử
- Nuôi cấy trong 30 ml môi trường lỏng V1
- Sau 48 h, pha loãng và trải trên môi trường M1 hay CMAE-1 để thu các khuẩn lạc riêng rẽ
Chọn giống, giữ giống và lên men
1. Chọn chủng S. erythaea năng suất cao:
- Sau 10-14 ngày ủ ở 34 oC, khuẩn lạc mọc:
• Giống ngôi sao
• Đường kính ~ 3 mm
• Màu xám hồng, mặt dưới màu nâu đậm
• Chọn các khuẩn lạc có hình thái khóm khác nhau và cấy trên ống thạch nghiêng
Chọn giống, giữ giống và lên men
2. Giữ giống S. erythaea:
- Ống thạch nghiêng:
• Ủ 10-14 ngày ở 34 oC
• Bảo quản ở 4 oC trong 1 tháng
- Huyền phù bào tử:
• Thêm 5 ml nước vô trùng vào ống thạch nghiêng
• Thêm 20% glycerol
• Phân nhỏ thành ống 1,5 ml
• Bảo quản ở -80 oC trong 1 năm
Chọn giống, giữ giống và lên men
Kiểm tra khả năng sản xuất erythromycin:
- 1 ml huyền phù bào tử mới pha hoặc 1,5 ml huyền phù bào tử đông khô + 30 ml môi trường V1. Ủ 40 giờ ở 34 oC trên máy lắc
- Lấy 3 ml dịch nuôi cấy + 27 ml môi trường F1, nuôi trong 9 ngày và bổ sung:
• Ngày 0-6: dầu đậu nành, 0,2 ml/ngày
• Ngày 0-5: n-propanol, 0,1 ml/ngày
• Ngày 6-9: n-propanol, 0,15 ml/ngày
VKT - D12 2/11/2015
27
Chọn giống, giữ giống và lên men
Kiểm tra khả năng sản xuất erythromycin:
- Cân bình và bổ sung lượng nước bay hơi hàng ngày
- Lấy mẫu, lọc và định lượng erythromycin
- Chọn chủng tốt nhất để đông khô
Chọn giống, giữ giống và lên men
3. Lên men:
- Giai đoạn 1: nuôi cấy giống trong 35 ml MT V1
- Giai đoạn 2: sau 48 giờ:
• Cấy vào 3,5 l môi trường V2
• Tốc độ thông khí 0,6 vvm
• Nhiệt độ 34 oC
Theo dõi lượng oxy hòa tan, pH, quá trình oxy hóa khử, nồng độ khí thải CO2
Theo dõi sự tăng trưởng: ly tâm đo thể tích hệ sợi hoặc cân sinh khối
Chọn giống, giữ giống và lên men
3. Lên men:
- Giai đoạn 3: sau ~ 40 giờ, chuyển 1,5 l dịch nuôi cấy vào bình lên men 20 l chứa 10 l môi trường F1
• Nhiệt độ 34 oC
• Chỉnh pH ≤ 7,2 bằng H2SO4
• Tốc độ khuấy 700 vòng/phút
• Tốc độ thông khí 0,37 vvm trong 12 giờ đầu, sau đó tăng lên 0,83 vvm
Theo dõi quá trình oxy hóa khử, nồng độ khí thải CO2, glucose tự do
Hàng ngày lấy 50-100 ml dịch nuôi cấy để định lượng erythromycin
Soi kính hiển vi để kiểm tra ngoại nhiễm và hình thái VSV
VKT - D12 2/11/2015
28
Chiết tách erythromycin
Tách erythromycin gồm các bước chính:
1. Tách erythromycin-isothiocyanat
2. Tạo erythromycin base
3. Kiểm tra độ tinh khiết và hoạt tính erythromycin
Chiết tách erythromycin
1. Tách erythromycin-isothiocyanat
- Chỉnh pH 8,5 bằng NaOH 20%
- Ly tâm với vận tốc 3.000 g ở 4 oC để loại bỏ sinh khối. Dịch nổi tiếp tục lọc bằng sợi thủy tinh
- Chỉnh pH 9,5 ± 0,1
- Thêm 1,5% methylisobutylketon và khuấy đều trong 10 phút ở 4 oC
- Ly tâm với vận tốc 2.000 g trong 5 phút
- Thu pha hữu cơ và định lượng erythromycin bằng HPLC
Chiết tách erythromycin
1. Tách erythromycin-isothiocyanat
- Đun pha hữu cơ đến 30 oC, thêm 0,63 l dung dịch Na isothiocyanat 33% cho mỗi gam erythromycin
- Chỉnh pH 5,8 bằng acid acetic 10%
- Làm nguội hỗn hợp đến 10 oC, ủ trong 3 giờ và khuấy nhẹ để kết tinh erythromycin, duy trì pH 5,8
- Lọc và rửa tủa bằng nước cất
- Sấy chân không ở 50 oC
- Hiệu suất của giai đoạn này khoảng 83%
Chiết tách erythromycin
2. Tạo erythromycin base
- Hòa tan bằng cách khuấy nhẹ erythromycin –isothiocyanat trong dichloromethan ở 33 oC, chỉnh pH 9,5-10 bằng NaOH 15%
- Lọc huyền dịch với chất trợ lọc, than hoạt. Rửa lại bằng 1 lượng nhỏ dichloromethan
- Tách pha hữu cơ (dịch lọc) với nước khử ion ở 33 oC, khuấy nhẹ
- Cô quay dịch chiết để tăng nồng độ erythromycin dễ dàng kết tinh
VKT - D12 2/11/2015
29
Chiết tách erythromycin2. Tạo erythromycin base
- Kết tinh erythromycin ở 5 oC trong 3-5 giờ
- Phục hồi erythromycin bằng ly tâm hay lọc, rửa lại bằng dichloromethan, sấy khô ở 50 oC
- Hòa tan erythromycin base thô trong nước khử ion và đun ở 50-60 oC
- Thêm lauryl sulfat. Ly tâm hay lọc, rửa với nước khử ion (60 oC) để thu erythromycin base tinh khiết
- Erythromycin base có thể chuyển thành dạng ester, muối hay dẫn chất bán tổng hợp
Chiết tách erythromycin
3. Thử hoạt tính sinh học và độ tinh khiết
Thử hoạt tính sinh học của eruthromycin bằng phương pháp sinh học và thực hiện song song với erythromycin chuẩn, gồm các bước:
- Đổ 35 ml môi trường TSB vào hộp petri (12x12 cm)
- Khi môi trường đông đặc, thêm lớp thứ hai gồm 35 ml TSB và 35 μl dịch nuôi cấy của Micrococcus luteus( nuôi 18 giờ, ở 30 oC trong môi trường LB)
Chiết tách erythromycin
3. Thử hoạt tính sinh học và độ tinh khiết
- Nhỏ 10 μl phần nổi của dịch nuôi cấy (hoặc dạng hòa tan trong methanol) lên đĩa thử kháng sinh đặt trên bề mặt hộp thạch. Ủ ở 30 oC trong 48 giờ, đo vùng ức chế tăng trưởng của M. luteus và tính lượng erythromycin dựa vào đường cong chuẩn
- Thử độ tinh khiết bằng HPLC: định lượng erythromycin A, B, C