Biochemie A: eiwitten en enzymenHoorcollege 1 & 2 Algemene
opbouw eiwitten, hemoglobine en myoglobineEiwittenPrimaire
structuurEiwitten zijn opgebouwd uit aminozuren. Deze aminozuren
bestaan allemaal uit dezelfde basisformule:
De basisformule bestaat uit een tetrader met daaraan een
aminogroep (NH2), een carboxylgroep (COOH), een waterstof (H) en
een restgroep (R). De C in het midden is een asymmetrisch koolstof
atoom (C).De R groep is de rest groep en is voor elk aminozuur
verschillend. De zijgroepen zijn zeer bepalend voor de functie en
de vorm van een eiwit. De aminozuren zijn gekoppeld door een
peptide binding. Deze binding zit tussen de aminogroep (NH-groep)
van het ene aminozuur en de carboxy groep van het andere aminozuur.
Deze binding ligt samen met de twee C-atomen in een plat vlak. Dit
is de primaire structuur: de lineaire aaneenschakeling van een
specifieke volgorde van aminozuren.
De primaire structuur is zeer belangrijk voor de vorming van de
secundaire structuur. Om een secundaire structuur te vormen zijn er
een paar belangrijke dingen: Disulfide bindingen. 2 cystenes die
bij elkaar in de buurt komen, kunnen onder oxiderende
omstandigheden een zwavelbrug vormen. Deze zwavelbrug is een
covalente binding. Het kan optreden binnen een eiwit. Op deze
manier kan de lineaire structuur dus worden gevouwen. De peptide
binding is niet zo goed draaibaar. Dit komt door resonantie.
Resonantie is het steeds overklappen van een dubbele binding. Bij
een peptide binding vindt dit plaats tussen de dubbel gebonden O en
de peptide binding. Dit zorgt voor stijfheid van de peptide
binding. De draaiing kan wel plaatsvinden tussen het C atoom en de
amino of carboxy groep. Een amino en een carboxyl groep kunnen
waterstof bruggen vormen. Niet binnen een aminozuur, maar wel
tussen aminozuren. Dit is de belangrijkste parameter voor het
vormen van een secundaire structuur.Secundaire structuurEen vorm
van secundaire structuur is de helix. Dit is een rechtsdraaiende
helix. Hierbij steken de zijgroepen naar buiten. Er is maar weinig
ruimte tussen de aminozuren, het is dus een compacte structuur. Er
zijn 3,6 residuen per winding. Alle hoofdketengroepen, dus carboxy
en amino groepen, vormen waterstofbruggen. De waterstofbrug wordt
gevormd met een aminozuur wat 4 aminozuren verder op ligt. O uit de
carboxy groep maakt een waterstofbrug met een rechts liggende
NH-groep dat dus 4 residuen verder op ligt. Door deze
waterstofbruggen ontstaat de helix.
Niet alle aminozuren kunnen in een helix. Wanneer het hele grote
zijgroepen heeft, kan er geen compacte vouwing meer plaatsvinden.
Dit wordt sterische hindering genoemd. Dit gaat vaak om vertakte
zijketens of zijketens met grote cyclische verbindingen
(V,T,I,S,D,N,P). De aminozuren valine, threonine, isoleucine,
serine, aspartaat, asparagine en proline kunnen niet in de
-helix.
Een andere secundaire structuur is de sheet of vouwblad
structuur. Dit wordt weergegeven met pijlen. Hier zit meer ruimte
tussen de aminozuren, dus is het een vrijere structuur. Bij deze
structuur gaan alle carboxy groepen waterstofbruggen aan met amino
groepen. Het is geen systematische binding. Het is dus niet te
voorspellen welke carboxy met welke amino bindt. Er zijn 2 vormen
van sheets: parallel en antiparallel. Antiparallel gaat van carboxy
naar amino en terug (of andersom). Bij parallel gaan allebei de
ketens dezelfde kant op. Dus van carboxy naar amino, via een loop
weer terug en weer van carboxy naar amino. antiparallelparallel
een sheet kan bestaan uit parallel en antiparallel door elkaar.
Een eiwit bestaat uit een mix van helices en sheets. Deze worden
gelinkt in de 3D structuur via loops. Dit zijn ongestructureerde
delen van het eiwit, maar dit zorgt puur voor een goede structuur.
Daarnaast zijn er ook speciale vormen van helices, bijvoorbeeld de
coiled-coils helices. Daarvan wordt keratine gevormd (en dus
bijvoorbeeld je haar). Dit zijn helices die om elkaar heen zijn
gedraaid en deze zijn ook verbonden met waterstofbruggen.Tertiaire
structuurDit is de 3D structuur van het eiwit met de interacties
tussen de helices en de sheets. Over het algemeen zitten aan de
buitenkant de hydrofiele aminozuren en aan de binnenkant de
hydrofobe aminozuren. Dat aan de binnenkant het hydrofoob is en aan
de buitenkant hydrofiel, noemt men amfipatisch, eiwitten zijn dus
amfipatisch. De vouwing van het eiwit wordt bepaald door de
volgorde van de aminozuursequentie en dit zorgt weer voor
specifieke interacties tussen helices en sheets, waardoor het eiwit
vouwt. De interacties tussen helices en sheets kunnen disulfide
bindingen, vanderwaals binding, H bruggen of covalente bindingen
zijn. Het is echter niet te voorspellen hoe een eiwit vouwt. De
structuur kan alleen experimenteel worden bepaald.
Wanneer het eiwit is gevormd kan het nog verder gemodificeerd
worden, dit worden posttranslationele modificaties genoemd. Een
voorbeeld is fosforylering. Hierbij wordt een fosfaatgroep op
serine, threonine of tyrosine gezet, want deze bevatten een OH
groep. Quaternaire structuurHierbij gaan eiwitten met verschillende
andere eiwitten interacties aan om een functioneel complex te
vormen. Dit zijn bijvoorbeeld dimeren, hierbij gaan 2 eiwitten met
elkaar een interactie aan. Er zijn homodimeren (2 dezelfde
eiwitten) en heterodimeren (2 verschillende eiwitten). Sommige
eiwitten kunnen enkel functioneel zijn wanneer deze plaats hebben
in een complex, anders worden ze afgebroken omdat ze instabiel
zijn. MyoglobineMyoglobine is 1 subunit en bestaat uit helices. Het
is een spiereiwit en heeft als belangrijkste functie het opslaan
van zuurstof in de spieren en de weefsels. Dit is een van de eerste
waarvan de kristal structuur is ontdekt. De helices zijn gelinkt
door loops en verder heeft het een globulaire vorm. Aan de
binnenkant van het eiwit zit een hydrofobe holte en daarin zit een
prosthetische groep genaamd heem. Een prosthetische groep is een
niet eiwit onderdeel, maar wat wel deel uit maakt van het eiwit.
Het is noodzakelijk dat deze groep er is.
In heem zit een ijzer molecuul en dit bindt zuurstof. Het
molecuul heem wordt ook wel een ijzer protoporphyrine genoemd. Het
bestaat uit een aantal amino groepen gebonden aan het ijzer en aan
die groepen zitten cyclische groepen. Een kant met zijketens
(onder) zijn hydrofoob en willen dus in het eiwit zitten, de andere
2 zijketens zijn hydrofiel (2x COO, boven). Dit zorgt ervoor dat
heem op de juiste manier in myoglobine zit.
De heem groep wordt op zijn plek gehouden door een proximale
histidine. Dit is een histidine die uit de helix steekt van
myoglobine. Daarnaast is er ook een distale histidine en deze is
van belang bij het binden van zuurstof aan myoglobine. In het
midden van de heem groep zit het ijzer gebonden aan de 4 cyclische
structuren. Met de 5e binding zit het ijzer vast aan de amino groep
van de proximale histidine. Met de 6e bindingsplek kan het ijzer
zuurstof binden. Door de binding van zuurstof aan ijzer kan het
zuurstof nu waterstofbruggen vormen met de distale histidine.
Doordat dat gebeurd wordt de ijzer een beetje omhoog getrokken,
zodat het in het vlak ligt van de heem groep. Daardoor wordt ook de
proximale histidine omhoog getrokken en dit is belangrijk voor de
functie van de globines. Wanneer zuurstof aan hemoglobine of
myoglobine is gebonden, wordt het oxyhemoglobine of oxymyoglobine
genoemd. HemoglobineDit bestaat uit 4 subunits (22). Elke subunit
lijkt op een myoglobine. Ze worden gecodeerd door andere genen,
maar lijken erg op elkaar als je kijkt naar de aminozuur structuur.
Doordat het uit 4 subunits bestaat, heeft hemoglobine een andere
functie, namelijk het transporten van zuurstof van de longen naar
de weefsels. Elke subunit heeft 1 heemgroep en hier kan dus
zuurstof aan binden. de subuntis gaan ook interacties met elkaar
aan: 1 met 2 en 1 met 2.
Hemoglobine heeft een lagere affiniteit voor zuurstof dan
myoglobine. Bij een lage zuurstofdruk is er namelijk al veel
myoglobine verzadigd met zuurstof. Bij hemoglobine is dit anders.
Hierbij wordt bij een lage zuurstofdruk weinig zuurstof gebonden en
bij een hoge zuurstofdruk veel zuurstof gebonden. Dit is belangrijk
voor de functie. In de spieren is de zuurstofdruk namelijk laag (20
torr), wanneer hemoglobine dus in die omgeving komt, zal het zijn
zuurstof afgeven aan myoglobine. Hemoglobine zal in de longen wel
verzadigd zijn want daar is de zuurstof druk hoog (100 torr). Dit
maakt hemoglobine tot een goede transporter en myoglobine tot een
goed opslagmolecuul. Vervoer longen weefselsEen voorwaarde voor het
vervoer is goede binding van O2 in de longen en snel loslaten in
weefsels. Er moet dus snelle verzadiging van O2 zijn bij hoge
zuurstofdruk en snelle afgifte bij lage zuurstofdruk. Dit wordt
gedaan door coperatieve binding, dit betekend: hoe meer zuurstof is
gebonden, hoe hoger de affiniteit voor zuurstof wordt. Dit levert
een S-vormige (simoide) verzadigingsgrafiek op. Wanneer deze soort
binding er niet was zou de binding van zuurstof aan hemoglobine
veel minder efficint zijn. De grafiek zou dan als die van
myoglobine lopen, alleen niet tot 100% verzadigd. Als je dan kijkt
naar de efficintie van zuurstof afgifte in de spieren (dus van 100
naar 20 torr) levert dat met coperatieve binding 66% afgifte op en
zonder levert het 38% afgifte op. De efficintie van myoglobine is
17% van 100 naar 20 torr.
Het transport van zuurstof veranderd ook wanneer het lichaam
meer zuurstof nodig heeft. Als het lichaam in rust is, heeft
hemoglobine een afgifte van 21%, dit komt doordat in weefsels en
spieren dan niet veel zuurstof wordt verbruikt en er dus een hogere
zuurstofspanning is (40 torr). Wanneer er beweging plaats vindt is
er dus een efficientie van 66% (dus 20 torr). CoperativiteitHoe kan
binding van zuurstof in 1 subunit ervoor zorgen dat er in de andere
subunits sneller zuurstof bindt?Dit komt doordat het ijzer in 1
vlak wordt getrokken wanneer zuurstof heeft gebonden. Wanneer dit
gebeurt wordt ook de proximale histidine van zn plaats gehaald en
hierdoor vinden er in allerlei helices en loops kleine structuur
veranderingen plaats. Dit heeft een invloed op de bindingsinterface
(interactie) van de en subunits. Want wanneer er in 1 subunit een
verandering plaats vindt, zorgt dit er voor dat er in andere
subunits ook een verandering plaats vindt. Dit kan dus alleen
wanneer een eiwit bestaat uit subunits die met elkaar verbonden
zijn, vandaar dat dit niet mogelijk is bij myoglobine. Door die
verandering maken 2 en 2 een kleine draaiing ten opzichte van de 1
en 1 subunits. Deze draaiing is 15. Hiervoor moeten een aantal
zoutbruggen worden verbroken tussen de subunits (bijv. bij tyr en
asp). Zoutbruggen zorgen namelijk in de tense state voor
stabiliteit en bij het binden van zuurstof worden zoutbruggen
verbroken. Naar mate er meer zuurstof bindt, zullen er dus meer
zoutbruggen verbroken worden en hierdoor kan het dus makkelijker
naar de relaxed state. Door de draaiing komt er een nieuwe
interactie in de R state die ook gestabiliseerd wordt met een
nieuwe zoutbrug (asp en asp).
Het lichaam is zo gebouwd dat het moeilijk is om de draaiing te
maken, het houdt het eiwit in de open (tense) stand en dit maakt
het dus een goede transporter. De oxyhemoglobine wordt de R-vorm
(relaxed) genoemd en de deoxyhemoglobine is de T-vorm (tense). De
deoxyhemoglobine wordt zo genoemd omdat de structuur hiervan
gespannen is. De R-vorm heet relaxed omdat dit een lager
energetische staat is voor hemoglobine, en dus relaxed is.
Modellen voor coperativiteitEr zijn verschillende modellen over
hoe de coperatieve binding plaats vindt. 1. Het concerted
modelHierbij kan hemoglobine alleen in 1 van de twee staten
verkeren: of in de T of in de R. Er is geen overgangstaat mogelijk.
Hierbij gaat het hemoglobine van de T staat naar de R staat. De
kans wordt verhoogd wanneer er een zuurstof is gebonden aan het
heem. En hoe meer zuurstof is gebonden, hoe groter de kans is dat
ie in de R state zit. Wanneer de R state is bereikt, wordt de
affiniteit van de subunits veel hoger. Dit model is zeer
waarschijnlijk omdat een hemoglobine met 3 zuurstoffen gebonden,
altijd in de R-state staat. De affiniteit om dan het laatste
zuurstof molecuul te binden is dan 20x hoger dan in
deoxyhemoglobine.
2. Het sequentile modelHierbij bestaan tussenvormen van de T en
R state. Dit betekend dat er bij elke zuurstofbinding een klein
beetje veranderd in de subunits, zodat ze een hogere affiniteit
krijgen voor zuurstof. Bij onderzoek blijkt dat met 1 O gebonden
dat het dan altijd in de T state zit, maar dat de affiniteit voor
zuurstof in de overige subunits 3 keer hoger is.
Deze twee modellen bevatten allebei een kern van waarheid, maar
het precieze model is nog niet ontdekt. Waarschijnlijk zal het dus
een combinatie van deze twee zijn.
Bij de afgifte van zuurstof werkt het ook ongeveer zo. Wanneer
er 1 zuurstof wordt afgegeven, zullen de andere zuurstofmoleculen
ook sneller loslaten. Wanneer hemoglobine helemaal met zuurstof is
gebonden, zit het in de R-state. Dit is een stabielere vorm en
blijft hier het liefst in zitten. Wanneer het in een lage
zuurstofspanning komt, moet het zijn zuurstof afstaan en dus weer
naar de T-state. Hiervoor moet dus iets zijn, wat de afgifte
bevorderd en dus wat het blijven in de R-state tegenwerkt. Ook moet
de T state bevoordeeld zijn in de longen omdat hemoglobine niet
zomaar naar de R state moet gaan. Hiervoor zijn verschillende
manieren.BPGDit zit in rode bloedcellen en bemoeilijkt de opname
van zuurstof en bevorderd de afgifte van zuurstof. Het stabiliseert
de T-state. De volledige naam in bifosfoglyceraat en is een zeer
negatief molecuul. Het verlaagt de affiniteit van hemoglobine voor
zuurstof. Wanneer rode bloedcellen geen BPG bevatten is de
efficintie van afgifte maar 18%. BPG bindt in het centrum van het
hemoglobine molecuul. Dit is alleen bereikbaar in de T-state. Door
de draaiing in de R-state is dit gat verdwenen.Het kan binden in
het gat doordat er in de subunits positieve aminozuren (lysine)
zitten die kunnen binden aan het negatieve (fosfaatgroep, COO-)
BPG.Wanneer de zuurstofspanning hoog is en er dus zuurstof bindt
aan hemoglobine, wordt het BPG (door de draaiing) uit het molecuul
gedrukt. Wanneer het dan komt in een gebied met lage
zuurstofspanning, zal er wat zuurstof loslaten waardoor de draaiing
naar de T-state plaats kan vinden. BPG zal dan meteen zijn plek in
het gat weer innemen, waardoor het niet meer terug kan vallen in de
R-state.
BPG kan niet binden aan foetaal hemoglobine. Dit maakt foetaal
hemoglobine een hele goede opnemer van zuurstof uit het bloed van
de moeder. Foetaal hemoglobine heeft namelijk y subunits in plaats
van subunits, waardoor het er net iets anders uit ziet. Hierdoor
heeft het een hogere affiniteit voor zuurstof. De grafiek van het
foetale hemoglobine is opgeschoven naar links. Dus bij een lage
zuurstofspanning, zal het zuurstof van volwassen hemoglobine worden
overgedragen op foetaal hemoglobine. Foetaal hemoglobine ligt
tussen volwassen hemoglobine en myoglobine in. Het kan dus afnemen
van volwassen hemoglobine en vervolgens wel weer doorgeven aan het
eigen myoglobine. BPG kan niet binden aan foetaal hemoglobine
doordat er in de y ketens een mutatie heeft plaats gevonden. Daar
is namelijk his143, wat normaal in de ketens zit, vervangen door
een serine. Hierdoor hebben de zijketens van myoglobine dus geen
interactie met het BPG. De T state is dan minder stabiel en het
gaat dus makkelijker naar de R state. Foetaal hemoglobine heeft dus
een hogere kans dat het zich in de R-state bevindt bij een lagere
zuurstofspanning. Omgeving weefselsWeefsels gebruiken energie en
dit zorgt voor afgifte van CO2 en een lagere pH. Ook dit zorgt voor
een snellere afgifte van zuurstof. CO2 komt via de capillaire wand
bij de rode bloedcellen en reageert daar met water tot HCO3-
(koolzuur) en H+. De hoge concentratie van CO2 en H+ waardoor de
affiniteit van zuurstof aan hemoglobine verlaagd, wordt het Bohr
effect genoemd en ook dit bevorderd dus de T-state. H+ bindt aan
histidines in de subunits die op de grens van de subunits zitten
(het is het laatste aminozuur van een subunit). Deze histidine 146
kan daardoor een zoutbrug vormen met aspartaat. Dit bevindt zich in
dezelfde keten, maar zorgt dan voor een meer rigide structuur. Ook
zit his 146 vlak bij een carboxy groep, wat van invloed is bij de
binden van CO2. CO2 bindt aan de aminoterminus (dus de eerste keten
van een subunit), er wordt dan een carbonaat groep gevormd, deze
zijn negatief geladen. Door de negatieve lading kunnen deze
carbonaatgroepen zoutbruggen vormen met geprotoneerde (door de lage
pH) histidines.
Ook dit principe vindt alleen plaats in de T-state. Deze
zoutbruggen kunnen dus alleen gevormd worden wanneer hemoglobine in
de T-state zit.
Doordat hemoglobine H+ opneemt zal de reactie van CO2 naar HCO3-
nog meer verlopen en zo wordt CO2 dus naar de longen vervoerd. In
de longen zal het koolzuur dan weer loslaten.
Alles bij elkaar, dus coperativiteit, BPG en het bohr effect,
maakt hemoglobine een allosterisch eiwit. Allosterie houdt in:
regulatie van een eiwit door de binding van moleculen aan het eiwit
op een plek wat niet het actieve centrum is. Dit gebeurd bij veel
eiwitten in een cel. Ziekten bij hemoglobineEen ziekte door een
mutatie in hemoglobine is sikkelcelanemie. Er wordt namelijk een
glutamaat vervangen door een valine aan de buitenkant van een
subunit. Hierdoor gaan hemoglobine polymeriseren, dus aan elkaar
binden. Dit zorgt ervoor dat hemoglobine niet meer werkt en de rode
bloedcel sterft. Deze mutatie is nog steeds aanwezig omdat het
zorgt voor resistentie tegen malaria. Dit komt dus ook vaak in
malaria gebieden voor.
Andere ziektes door mutaties in hemoglobine zijn:
Hoorcollege 3 & 4 Thermodynamica, enzymkinetiek &
enzymologie
Enzymen zijn van groot belang in de cel omdat deze chemische
reacties versnellen en in gang zetten. Hiervoor moet je begrijpen
wat chemische processen inhouden en hiervoor is enige kennis van
thermodynamica nodig. Naast de thermodynamische wetten moet je
begrijpen dat om ons heen de chaos regeert, omdat de eigenschap van
energie is zich verdelen over de ruimte.
Volgens de regels van de natuur moet alle energie verdeeld zijn
over het hele universum. Alle systemen werken tegen deze regel in.
Energie gaat niet verloren. Entropie (S) is de maat voor de
diffusie van energie, de maat voor chaos. Elk systeem neigt naar
een verhoogde entropie, dus naar een verhoogde diffusie van energie
in dat systeem. Bijvoorbeeld de roestende auto. Zonder er energie
in te steken, zal het systeem vervallen in meer chaos (dus het gaat
roesten). Hierdoor gaat de overgang, van bijvoorbeeld een eiwit,
van geordend naar wanorde snel. Het is mogelijk om van een
wanorde-staat naar een iets georganiseerdere staat te komen, als de
energie-staat daarvan lager is. Dit gaat heel langzaam. Enzymen
kunnen deze reacties katalyseren wanneer deze reactie ook spontaan
kan plaatsvinden. De reactie wordt dan zodanig versneld dat de
reactie zin heeft in levende cellen. Ook kunnen enzymen niet
spontane reactie mogelijk maken om zo nog meer georganiseerde
staten te bereiken.Enzymen verkrijgen de energie via de zon
(fotosynthese). Dit geldt voor alle organismen. Enzymen katalyseren
(versnellen) een traag proces naar een evenwicht. Dit evenwicht
wordt bepaald door de wetten van de thermodynamica.De kennis over
enzymen is belangrijk omdat enzymen de schakelaars zijn van
reacties in cellen. Daarnaast spelen medicijnen vaak in op de
werking van enzymen. ThermodynamicaDe eerste wet: Er gaat geen
energie verloren.Dit wil zeggen dat het heelal wordt gezien als een
gesloten systeem met een bepaalde hoeveelheid energie die altijd
constant blijft. Energie kan wel overgaan in verschillende vormen
van energie zoals warmte of licht. Ook kan je de energie in een
systeem bekijken, bijvoorbeeld de energie in een cel. Het systeem
is dan het deel van het heelal dat je wilt bestuderen, de cel. De
omgeving is de rest van het heelal. De interne energie E is alle
energie van het systeem. Alle systemen hebben zon interne energie.
De energie in een lichaam kan worden gebruikt voor dagelijkse
handelingen, maar een ook zit er energie in de chemische
verbindingen, wat ontstaan is bij de bouw. De toename of afname van
de energie is afhankelijk van opgenomen warmte (Q) en de gedane
arbeid (W):
E = E2 - E1 = Q W
Het systeem krijgt niet alle energie wat er in wordt gestopt.
Een deel van de energie wordt namelijk omgezet in arbeid.
De tweede wet: Tijdens een proces moet de totale entropie van
het heelal moet toenemen. Oftewel: alle vormen van energie in de
materiele wereld spreiden uit na verloop van tijd, tenzij dit
verhinderd wordt, of: reacties verlopen alleen maar als energie
vrijkomt, tenzij je energie toevoegt. De entropie van een systeem
(dit is immers een deel van het heelal) kan afnemen, zolang de
entropie van de omgeving maar toeneemt. Dus de verandering van
entropie in een systeem + de verandering van entropie in de
omgeving moet altijd meer zijn dan 0:
Ssysteem + Somgeving > 0
De entropie is echter heel moeilijk te meten, daarom zijn hier
andere manieren voor.
Gibbs(vrije)-energie (G) is het deel van de energie die nuttig
gebruikt kan worden, oftewel de energie die beschikbaar is voor
reacties. In de gibbs energie zitten de eerste 2 wetten van de
thermodynamica verwerkt. De Gibbs-energie wordt gemeten in
kcal/mol. De formule voor de gibbs vrije energie luidt:
G = H TSWaarbij H de enthalpie is (de interne energie die in een
biologisch systeem gerekend kan worden in warmte, oftewel de
hitte-inhoud van het systeem), T de absolute temperatuur en S de
entropie (die afhangt van de temperatuur).H bevat hierin de eerste
wet, namelijk de toe of afname van hitte, warmte in een systeem. S
bevat de tweede wet, namelijk de verandering in entropie.
In biologische systemen bestaat de energie inhoud meestal uit
beschikbare warmte, dus H=E:
G = E TS
Wanneer G negatief is verloopt de reactie spontaan (de energie
die gebruikt kan worden is na de reactie minder). Bijvoorbeeld bij
het hete kopje koffie, deze bevat meer warmte voor afkoeling dan
daarna. H is dus negatief. Na afkoeling heeft het kopje koffie dus
minder beschikbare energie om af te koelen, wat logisch is. Het
eind product heeft dus een lagere energetische staat dan het begin
product. wanneer G nul is, is de reactie in evenwicht. Dit is dus
wanneer het kopje koffie even heet is als de omgeving. Het zal dan
niet afkoelen. Wanneer G positief is verloopt de reactie niet
spontaan. Denk aan een heet kopje koffie in een nog hetere kamer.
De warmte van het kopje koffie zou dan naar de omgeving moeten,
maar deze omgeving is al heter dan het kopje koffie, dit zal dus
niet gebeuren. G zegt niks over de manier van verloop van de
reactie of de reactiesnelheid.Rekenen met Gibbs-energie
Er is een reactie: A B. Daarvan kan je de evenwichtsconstante
bepalen Keq = [A]/[B]. Deze evenwichtsconstante hangt af van de
concentraties van A en B. De formule van gibbs vrije energie kan
worden omgezet, via allerlei wiskundige routes naar de volgende
formule:
G = G0 + RT ln[A]/[B]R = gasconstanteT = absolute temperatuurG0
= de standaard vrije energieverandering van een bepaalde reacties
bij 1 M reactanten
Bij evenwicht geldt dat G = 0. Hierdoor kan je de formule dus
als volgt weergeven:G0 = - RT ln[A]/[B]
Onder standaard omstandigheden, dus bij 25 graden en een pH 7,0
heeft R x T een vaste waarde en kan je ln omzetten tot log:G0 = -
1,36 log[A]/[B]Onder de standaardomstandigheden en 1M reactanten
kun je zeggen dat G0 is G0.
G0 is een constante die (voor vrijwel alle reacties) al bepaald
is. Met de G0 kan je de G van een reactie met een andere
hoeveelheid reactanten berekenen. G0 vul je alleen in in de
volledige formule wanneer de temperatuur 25 graden is en de pH 7,0
is. Wanneer de omstandigheden anders zijn moet je G0 invullen. G =
G0 + 1,36 log[A]/[B]G0 = G0eind - G0beginEnzymenEnzymen zorgen
ervoor dat een reactie versnelt kan worden, het katalyseert de
reactie. Dit doen ze door een molecuul te binden, het vormt dan een
enzym-substraat complex. Vervolgens zal de katalyse plaats vinden
waardoor het substraat wordt omgezet naar een product. Het product
zit nog steeds gebonden aan het enzym en dus vormt het nu een
enzym-product complex. Vervolgens zal het enzym het product
verlaten. Het enzym verandert in tegenstelling tot het molecuul
niet.
De gibbs vrije energie (zoals in de afbeelding is te zien) is
bij het substraat vaak hoger dan bij het product. G is dus negatief
wat wil zeggen dat de reactie spontaan verloopt. Om deze reactie te
laten verlopen moet de reactie eerst een soort hobbel nemen, dit
wordt de transition state of overgangstoestand genoemd. De vorm van
het subtraat in de transition state is energetisch hoger dan de
energie van het oorspronkelijke substraat. De energie die nodig is
om de transition state te bereiken wordt de activeringsenergie (G)
genoemd. Wanneer de transition state bereikt is en de hobbel is
genomen, zal de reactie weer vanzelf verlopen. Enzymen verlagen de
activeringsenergie en faciliteren zo de overgang naar de transition
state. De binding van een enzym aan het substraat via veel zwakke
interacties zorgt ervoor dat het enzym door een
conformatieverandering in een lagere energietoestand terecht komt.
De energie van het enzym wordt dus op die manier verlaagt. Deze
bindingsenergie die vrijkomt, dus de verlaging van energie van het
enzym, wanneer het substraat aan het enzym bindt wordt gebruikt om
de activeringsenergie te verlagen. Hoe specifieker het substraat
is, des te meer zwakke bindingen er worden gevormd, des te meer
bindingsenergie er vrijkomt en des te meer kan de
activeringsenergie worden verlaagd. De interacties van het enzym
met het substraat zijn optimaal wanneer het substraat zich in de
overgangstoestand bevindt. Dit zorgt ervoor dat het enzym het
substraat stabiliseert om het nog even in de overgangstoestand te
houden zodat er nog meer energie kan worden gegeven door het
enzym.
Er zijn 3 principes van katalyse door een enzym: Het veranderen
van conformatie van de reactant (zoals hierboven uitgelegd). Het
bij elkaar brengen van reactanten. Doordat reactanten bij elkaar
worden gebracht kan dit de concentratie erg verhogen, waardoor de
reactie opeens wel spontaan kan verlopen. De lading van de reactant
veranderen. Een geladen enzym kan de lading van het reactant
beinvloeden zodat deze makkelijker de overgangstoestand
bereikt.
Een reactant bindt aan een enzym in de active site. Hiervoor
zijn verschillende modellen. Een model is het sleutel-slot model.
Dit houdt in dat het substraat precies in de active site van een
enzym past, zoals een sleutel in een slot. Een ander model is het
induced fit model. Dit houdt in dat wanneer een substraat bindt aan
de actieve site van een enzym, dit ervoor zorgt dat het enzym zo
verandert dat het ook daadwerkelijk kan katalyseren. Het substraat
verandert dan naar een lagere energetische toestand. Dit kan dus
een lading of conformatie verandering betreffen.
Daarnaast kan een enzym maar in n richting werken en zorgt er
ook voor dat reacties in de juiste volgorde plaatsvinden. Een enzym
kan een substraat omzetten tot 1 product. Dit komt door de
specificiteit van enzym-substraat bindingen. Doordat een enzym een
substraat omzet tot 1 bepaald product en dit product kan weer
dienen als een ander substraat kan een ander enzym dit weer
omzetten tot 1 specifiek product. Een cascade van reacties kan zo
in een precieze richting leiden.
EnzymkinetiekWanneer je aan een reactie met een enzym meer
substraat ([S], substraatconcentratie) toevoegt krijg je initieel
een hoge snelheid van productvorming (V0) en daarna zal de reactie
in een evenwicht terecht komen. De curve zal na de initiele hoge
reactie snelheid afvlakken omdat het het evenwicht bereikt. Wanneer
er weinig substraat is, zal er een lineaire curve worden gevormd en
dit heeft een minder hoge snelheid, dus wordt het evenwicht later
bereikt. Met enzym wordt het evenwicht sneller bereikt, dan
zonder.
Wanneer je die curves uitzet in een nieuwe grafiek met de
concentratie substraat en de reactiesnelheid, dus hoe snel
substraat wordt omgezet tot een product door een enzym, zie je dat
bij de hoogste substraat concentratie een maximale snelheid wordt
bereikt. Dit houdt in dat bij die concentratie alle enzymen bezet
zijn met het substraat en dat alle enzymen bezig zijn met het
vormen van product. Als je de ontstane curve bekijkt zie je dat het
een asymptotische curve is. Dit betekend dat de curve richting de
Vmax zal lopen, maar deze nooit echt zal bereiken. Dit komt doordat
de reactie altijd weer terug zal lopen (evenwichtsreactie!!) en dus
zullen niet alle enzymen bezig zijn met het vormen van product.De
half maximale snelheid (Vmax/2) is een maat voor specificiteit voor
dat substraat. Daarnaast kan je bij de Vmax/2 de Km bepalen, dit is
een ook maat voor specificiteit van het enzym voor zn substraat. De
Km is die substraatconcentratie waarbij de Vmax/2 wordt bereikt.
Wanneer je een hoge substraat concentratie nodig hebt om de Vmax/2
te bereiken is de specificiteit van het enzym voor het substraat
dus niet heel hoog. Er is immers veel substraat nodig om de helft
van de Vmax te bereiken. Hoe lager dus de Km, hoe hoger de
specificiteit van een enzym voor zijn substraat. Dit alles wordt
samengebracht in de Michaelis-Menten vergelijking:
Deze formule houdt in hoeveel product kan worden gevormd in een
bepaalde tijdseenheid met een bepaald enzym en zijn substraat.
Wanneer de parameters Vmax en Km bekend zijn, kan je dus de
snelheid van omzetting van een substraat berekenen.
De Km kan je bepalen met de volgende formule:
Deze formule is af te leiden uit de afbeelding waarbij er eerst
een enzym en een substraat zijn, wanneer deze binden vormt er een
enzym substraatcomplex (ES). Vervolgens zal het substraat om worden
gezet in een product en wordt het een enzym productcomplex, dit zie
je niet terug in de reactie. Het enzym zal vervolgens los laten en
er zal een enzym en een product zijn. Er zijn in deze reactie 3
evenwichtsconstantes:K1 = evenwicht van de reactie van het enzym en
het substraat naar een enzym-substraatcomplexK2 = evenwicht van de
reactie van het enzym-substraatcomplex naar een enzym en een
productK-1 = evenwicht van de terug reactie van
enzym-substraatcomplex, naar een enzym en een substraat.
De Km kan je dan als volgt berekenen:
Het blijkt dat de Km gelijk staat aan hoe snel ES wordt
opgebouwd en hoe snel het ook weer wordt afgebroken.Wanneer een
substraat een sterke affiniteit heeft voor een enzym, zal er snel
een enzym substraatcomplex worden gevormd en dus zal K1 groot zijn.
De noemer van de formule is dus groot. Daarnaast zal de K-1 juist
heel klein zijn wanneer er hoge specificiteit van een enzym voor
een substraat is. Wanneer de K1 groot is en de K-1 klein, zal de
totale breuk klein zijn en dus zal de Km laag zijn. Er zal dus
weinig enzym nodig zijn om de helft van de maximale reactiesnelheid
te bereiken. De Km is een constante voor elk enzym-substraat paar.
Dit wordt de Michaelis Menten constante genoemd.
Om tot de michaelis menten vergelijking te komen, zullen er een
aantal stappen moeten worden genomen. Als eerste is er de formule
voor de katalytische snelheid. De katalystische snelheid geeft aan
hoeveel product er wordt gevormd per tijdseenheid. Dit hangt af van
K2 en de concentratie van ES. Je krijgt dan de volgende formule, de
eerste vergelijking:
(met V als katalystische snelheid)
De concentratie ES wordt bepaald door:
Wanneer de substraatconcentratie heel hoog is en de VMAX is
bereikt spreken we van een steady state van ES, waarbij vorming =
afbraak, dus:
Dit kan je vervolgens weer omzetten tot:
En dit kan je weer herschrijven tot:
Bij deze vergelijking zijn er een aantal aannames die gedaan
moeten worden. [E] en [S] moeten nog worden vastgesteld. Hiervoor
gelden de volgende regels:
Voor [E] geldt dat er een deel van de concentratie van het enzym
zich bevindt in het enzym-substraatcomples. Voor [S] geldt dit niet
omdat je aanneemt dat de concentratie van het substraat in overmaat
is. Dit geldt namelijk voor elke reactie in cellen. De vergelijking
die we hadden kunnen we dan nu omzetten tot de volgende
vergelijking:
Deze vergelijking kan je na een aantal stappen weer herschrijven
als de tweede vergelijking.
Wanneer je de eerste en de tweede vergelijking verwerkt in 1
vergelijking, krijg je de volgende vergelijking, deze lijkt al heel
erg op de Michaelis Menten vergelijking.
Maar bij een overmaat van substraat is al het enzym betrokken in
ES, dus de [ES] = [ET] en de snelheid bij een overmaat van
substraat zal gelijk zijn aan de Vmax, dus: V = VMAXHier uit kan je
dus concluderen dat: Vmax = K2 x [ET]Door met deze gegevens te
substitueren krijg je de Michaelis-Menten-vergelijking:
Met deze vergelijking kunnen we nu de snelheid van
productvorming per tijdseenheid bepalen bij een bepaald enzym
substraat paar. Uit deze formule kun je een aantal dingen afleiden:
[S] > Km. Wanneer de substraatconcentratie veel groter is dan de
KM, kan de KM worden verwaarloosd en kan de reactievergelijking
worden omgeschreven naar V = VMAXDit betekent dat wanneer de
substraatconcentratie heel veel groter is dan de KM, de relatieve
snelheid gelijk is aan de maximale snelheid. En dit klopt want
wanneer er een hoge [S] is, zijn alle enzymen bezet en is de
snelheid dus gelijk aan Vmax. [S] = Km. Wanneer de
substraatconcentratie gelijk is aan de KM kan de vergelijking
worden omgeschreven naar:V = VMAXDus, zoals we al weten, is KM de
substraatconcentratie bij de half maximale snelheid. Dit komt
doordat de breuk in de M-M vergelijking allemaal dezelfde
hoeveelheden bevat. De breuk wordt dan 1/2, wat dus de Vmax
geeft.
De Michaelis Menten vergelijking verteld dus precies hoe de tijd
voor product verandert bij verschillende
substraatconcentraties.
Als je een enzym en een substraat hebt waar je nog geen
parameters van hebt is het lastig om de bovenstaande grafiek te
produceren. Een truc hiervoor is om een grafiek met een rechte lijn
te produceren. Dit doe je met behulp van een dubbelreciproke
weergave (Lineweaver-Burk plot) van de
Michaelis-Menten-vergelijking; je draait hierbij de noemers en de
tellers van de vergelijking om (zie figuur 2). Dit doe je door V =
VMAX [S] / [S]+KM om te schrijven naar: 1/V = S + KM / VMAX S 1/V =
(S / VMAX S) + (KM / VMAX S)
1/V = 1/VMAX + KM / VMAX 1 / [S]
Hiermee krijg je een rechte lijn in je grafiek (doordat je de
vergelijk nu hebt omgeschreven naar een vorm van y =
a(Km/Vmax)x(1/[S]) + b (1/Vmax). Hierbij is b het snijpunt met de
y-as en a de richtingscofficint. Met deze rechte lijn kan je bij
een nieuw enzym met drie metingen deze grafiek construeren.
Figuur 2: Lineweaver-Burk plot
De KM heeft meerdere afgeleide betekenissen. Ten eerste geeft de
KM de enzymconcentratie waarbij de helft van de active sites zijn
gevuld, dus de half maximale snelheid. Op deze manier geeft de KM
een maat voor de substraatconcentratie die nodig is om een
significante enzymactiviteit te bereiken. Ten tweede zegt ook iets
over de bindingsaffiniteit van het substraat voor het enzym; een
hoge KM staat voor een zwakke binding, een lage KM staat voor een
sterke binding. De VMAX geeft het turnover nummer van een enzym;
het aantal substraatmoleculen die omgezet worden in product per
enzymmolecuul per tijdseenheid bij maximale snelheid.
EnzymremmersDe werking van enzymen kan worden benvloed door
remmers, die de enzymactiviteit verlagen of stoppen, en door
activatoren, die de enzymactiviteit stimuleren. Veel medicijnen en
vergiften zijn remmers van enzymen. Daarnaast zorgen remmers van
enzymen ook voor regulatie. Er wordt een onderscheidt gemaakt
tussen reversibele en irreversibele remmers. Irreversibele remmers
blokkeren een enzym permanent. Als irreversibele remmers eenmaal
aan een enzym binden, dissociren ze niet of nauwelijks meer. Het
enzym is dan blijvend vergiftigd. Een voorbeeld is DIPF
(diisopropylfosfofluoridaat), ook wel zenuwgas, is een remmer die
reageert met de acetylcholine-esterase. Het gaat dan een covalente
binding aan in de active site met een serine (OH groep). Een ander
voorbeeld van een reversibele remmer is aspirine. Reversibele
remmers moeten constant worden toegevoegd om hetzelfde effect te
behouden. Een reversibele remmer kan een: competitieve remmer zijn,
die op dezelfde plek als het substraat bindt en daarom competeert
met het substraat, Bij een competitieve remmer blijft de VMAX
onveranderd, want door heel veel substraat toe te voegen zal
uiteindelijk alsnog de VMAX bereikt worden. De KM wordt wel hoger,
dit wordt de Km apparant genoemd, de schijnbare Km in aanwezigheid
van een remmer. een niet-competitieve remmer, die remt de katalyse
door ergens anders te binden. De niet-competitieve remmer haalt het
enzym weg uit de actieve pool, het zorgt ervoor dat het enzym niet
meer werkt. Het kan nog wel substraat binden, maar het kan het
minder goed tot een product omzetten. Hierdoor wordt de VMAX lager,
maar de KM hetzelfde. Dit verschil tussen een competitieve en een
niet-competitieve remmer is te zien in een Lineweaver-Burk plot
(zie figuur 3).
Figuur 3: Lineweaver-Burk plot verschil tussen competitieve en
non-competitieve remmers
Een voorbeeld van een reversibele remmer is antabuse of
disulfiram. Dit zorgt voor een enorme kater bij een kleine inname
van alcohol. Dit wordt toegediend bij alcoholisten. De remmer zorgt
ervoor dat acetaldehyde dehydrogenase wordt geremd en dus blijft
acetaldehyde bestaan, wat zorgt voor de kater.
NIET IN COLLEGE GENOEMD, WEL LERENTransition state analogs zijn
moleculen die erg op de overgangstoestand van het substraat van een
enzym lijken en op deze manier de enzymactiviteit kunnen
verminderen. Suicide inhibitors zijn remmers die een remmende
werking op een enzym hebben doordat het enzym ermee reageert tot
een intermediair, waarna dat intermediair het enzym onwerkzaam
maakt.
Veel enzymen hebben een cofactor nodig: een gebonden niet-eiwit
molecuul. Wanneer dit molecuul sterk is gebonden is het een
prosthetische groep (zoals heem). De cel bevat daarnaast ook
hulpstoffen die niet zo sterk aan het enzym gebonden zijn maar vrij
in de cel voorkomen en daarom met verschillende enzymen kunnen
reageren. Dergelijke hulpstoffen worden co-enzymen genoemd. Een
belangrijk voorbeeld is NAD+.
Hoorcollege 5 & 6 Katalyse en regulatiemechanismen
Stryer Lysozym katalyseert het knippen van polysaccharideketens
in de celwanden van bacterin. De reactie die lysozym katalyseert is
een hydrolyse; er wordt water aan een binding tussen twee suikers
toegevoegd, waardoor de binding verbreekt. De energetische staat na
het knippen van de keten is lager, maar zal spontaan heel langzaam
plaatsvinden. De binding kan alleen verbroken worden als de suikers
eromheen in een afwijkende vorm staan, de transition state. De
activeringsenergie die hiervoor nodig is, is heel hoog. In de
actieve site van lysozym passen 6 gekoppelde suikers. Lysozym houdt
het substraat zo vast dat n van de 2 suikers van de binding die
verbroken wordt een afwijkende, minder stabiele conformatie krijgt.
De binding die wordt verbroken wordt ook dicht bij 2 zure zijketens
gehouden. Door al deze omstandigheden wordt de activeringsenergie
van de overgangsstaat verlaagd. Het verbreken van de binding gaat
via de volgende stappen:1. Het enzym duwt het gebonden substraat
zodat 1 suiker meer gaat lijken op de hoog energetische
overgangstoestand.2. Het negatief geladen asparaginezuur reageert
met het C1-atoom van deze verstoorde suiker, en het glutaminezuur
doneert een proton aan de zuurstof tussen deze en de naastgelegen
suiker. Hierdoor breekt de binding en is het asparaginezuur
covalent gebonden aan de suiker.3. Met behulp van het negatief
geladen glutaminezuur reageert een watermolecuul met het C1-atoom,
waardoor het asparaginezuur loslaat en de hydrolyse compleet
is.ProteolyseProteolyse is een voorbeeld van een enzymatische
reactie waarbij een peptidebinding wordt verbroken tussen C en N.
De peptide-binding resoneert; het is soms een dubbele binding en
soms een enkele binding. Hierdoor is de peptide-binding heel star
en zal het onder normale omstandigheden heel lang duren voordat
deze spontaan zal verbreken. Maar wel spontaan, eiwitten (die
bestaan uit aminozuren) hebben dus de neiging om uit elkaar te
vallen. Het maken van die verbindingen heeft dus energie nodig
(denk aan ribosomen e.d.). Proteases zijn enzymen die de
proteolyse-reactie, het verbreken van de peptide-binding,
katalyseren en dus versnellen tot msec. Ook bij deze reactie is
water nodig om de binding te verbreken.
Chymotrypsine Een voorbeeld van een protease is chymotrypsine.
Dit is een serine-protease dat wordt geproduceerd door
proteolyse-reacties. Het voorlopereiwit chymotrypsinogeen van 25 kD
wordt geknipt door trypsine (familie van) tot -chymotrypsine. Dit
bestaat uit 2 ketens een A keten en een BC keten. Het eiwit is nu
gedeeltelijk actief en zal zichzelf nog een keer knippen, waardoor
er 3 ketens (losse A, B en C) ontstaan. Deze vormen met elkaar een
nieuwe tertiaire structuur, waardoor -chymotrypsine volledig actief
wordt.
Chymotrypsine verbreekt de peptide-binding tussen aminozuren na
grote aromatische (met een cyclische verbinding in de zijgroep,
zoals phenylalanine) of hydrofobe aminozuren (bijv. methionine).
Dit protease knipt aan de C terminale kant van dat aminozuur, dus
rechts ervan. Dit heeft te maken met de vorm en de mogelijk
interacties in de actieve site.
De katalyse van chymotrypsine verloopt in 2 stappen. Na het
binden van het substraat aan het enzym ontstaat eerst het eerste
product door acylering en daarna het tweede product door
deacylering. Chymotrypsine acyleert zichzelf, het koppelt de
acyl-groep van de peptide aan zijn eigen OH-groep (een serine bevat
een OH groep). Er ontstaat hierbij het eerste product. Hierna
deacyleert het zichzelf met behulp van water, door de een OH-groep
aan de acyl-groep van de peptide te binden. Water speelt eigenlijk
bij elke katalyse een rol, het is namelijk nodig voor de
deacylering van het enzym. Het geacyleerde enzym wordt het
acyl-enzyme intermediate genoemd.
Om deze reactie te meten wordt er gebruik gemaakt van een
synthetisch substraat waarvan het tweede product licht geeft. Door
de reactie te meten bleek dat de acylering snel ging en de
deacylering vrij langzaam. Op deze manier komt het enzym in een
steady-state-toestand en kan het niet snel gerecycled worden, omdat
het substraat nog aan het enzym zit. De katalyseDe actieve site van
het chymotrypsine bevat een hydroxylgroep van een reactieve
serine195. De serine zal dus uiteindelijk de peptide binding
verbreken. Chymotrypsine heeft een hydrofobe pocket. Chymotrypsine
maakt bij de katalyse gebruik van een catalytic triad. Door de
specifieke vouwing van chymotrypsine komen aspartaat102,
histidine57 en serine195 bij elkaar in de buurt te liggen.
Aspartaat en histidine zijn ervoor nodig om serine reactief te
maken, ze zijn dus essentieel voor de katalyse. Doordat ze dicht
bij elkaar liggen kunnen ze waterstofbruggen vormen. In
aanwezigheid van substraat komen de aminozuren nog dichter bij
elkaar te liggen waardoor deze waterstofbruggen sterker worden. In
aanwezigheid van het substraat zal een aspartaat het proton van de
amino groep van histidine afpakken. Hierdoor wordt histidine meer
electronegatief. De dubbele binding die tussen de C en de andere N
zit, zal gaan resoneren. Hierdoor wordt de aantrekkingskracht voor
protonen van de andere stikstof sterker en neemt deze de waterstof
van serine over. Serine heeft hierdoor geen hydroxylgroep meer maar
een alkoxide-ion (O), waardoor serine zeer reactief
wordt.acyleringIn aanwezigheid van substraat pakt histidine dus de
waterstof van serine af. De peptide-binding van het eiwit resoneert
(het substraat), waardoor de zuurstof een binding aan kan gaan met
de zuurstof van de peptide-binding. Wanneer de dubbele binding met
de O loslaat en richting de stikstof gaat, neemt de zuurstof van
serine die binding over. Deze toestand heet de tetrahedral
intermediate, dit is de overgangstoestand. Er ontstaat ook een
oxyanion aan het eiwit, die zeer reactief en daardoor instabiel is.
Het enzym stabiliseert dit ion met het oxyanion-gat (oxyanion
hole), dit is een deel van het enzym. Dit oxyanion-gat bestaat uit
peptide-residuen die waterstofbruggen aan kunnen gaan (NH-groepen,
bijvoorbeeld glycine) met het oxyanion, die gebeurt met de
hoofdgroepen, dus niet de zijketens. Op deze manier wordt de
transitional state gestabiliseerd. Hierna wordt de reactie
voortgezet, wanneer dit oxyanion gat er niet zou zijn zou de
reactie terug vallen. De stikstof van de peptide-binding kan nu een
binding aangaan met de waterstof die histidine van serine heeft
afgepakt (dit is thermodynamisch voordeliger). Nu is de
peptide-binding verbroken en het enzym geacyleerd. Je hebt nu geen
tetrhedral intermediate meer omdat C weer 3 zijgroepen heeft. Ook
heb je geen oxyanion hole meer omdat C een extra binding over
heeft, waardoor O niet meer reactief is.
DeacyleringHet amine-deel drijft nu weg, waardoor er plaats is
voor water, dat was voorheen niet en dat is nodig voor de tweede
stap. Water wordt reactief gemaakt door de histidine, net zoals dit
aminozuur bij serine deed. De histidine pakt een proton van water
af. De overgebleven reactieve OH-groep reageert weer met de
koolstof van het substraat, door de dubbele binding bij O. Er is nu
weer sprake van een overgangstoestand, een tetrahedral intermediate
en van een oxyanion hole.
Als laatste wordt de binding van het eiwit met serine verbroken
doordat het energetisch voordeliger is om deze verbinding te
verbreken dan binding tussen C en de OH groep. en krijgt de
zuurstof weer een dubbele binding. Het tweede product kan nu het
enzym verlaten waardoor serine het proton van histidine weer kan
pakken, waardoor het niet meer reactief is.
specificiteit van chymotrypsineChymotrypsine heeft een voorkeur
voor het knippen van een peptide-binding na een lange aromatische
of hydrofobe verbinding, doordat de katalytische site (active site)
een vrij diepe hydrofobe pocket heeft. De zijketens van het
substraat binden op die manier met het enzym dat precies de peptide
binding na een hydrofobe of aromatische zijgroep dicht bij de
serine ligt, waardoor die peptide binding dus wordt geknipt. De
actieve serine ligt vrij diep in een hydrofobe holte. Eiwitten met
langere zijketens kunnen meer interacties aangaan in zon pocket,
waardoor er dus meer bindingsenergie vrijkomt en dus katalytische
activiteit. Ook gaan in de site alleen de zijketens van de
aminozuren in het substraat een interactie aan met de zijketens van
het enzym. Wanneer een substraat net een andere zijketen heeft, kan
dit het katalytisch vermogen benvloeden van een enzym (het kan
daardoor niet binden met een bepaalde zijketen in het enzym),
waardoor katalyse niet meer plaats vindt. Serine proteasesEr zijn
verschillende soorten serine-proteasen. Deze proteasen verschillen
in hun specificiteit. Trypsine heeft bijvoorbeeld een negatieve
zijketen in de pocket zitten, waardoor het eerder bij positieve
zijketens knipt. Elastase heeft twee valines in de pocket zitten,
waardoor het voornamelijk na kleine, hydrofobe ketens kan knippen.
Serine-proteasen zoals trypsine en chymotrypsine hebben eenzelfde
soort katalysewerking en zijn evolutionair verwant (divergente
evolutie). Subtilisine heeft een hele andere katalysewerking, dat
onafhankelijk is ontstaan (convergente evolutie), er is een apart
gen gecreerd. Subtilisine gebruikt in het oxyanion gat geen
hoofdgroepen van aminozuren, maar deze gebruikt zijketens van een
ander deel van het enzym. Dit duidt er dus op dat het niet
eenzelfde voorloper heeft gehad, zoals bij divergente
evolutie.Essentieel voor een enzym is een reactieve zijketen, een
keten die een verbinding van een substraat kan overnemen.Naast
serine-proteasen zijn er ook zink-proteasen (maken gebruik van zink
om een molecuul reactief te maken), thiol(cysteine)-proteasen en
aspartyl(carboxyl)-proteasen.(Thiol)Cystene proteasenVoorbeeld:
papain of caspaseCystene-proteases hebben een reactieve cystene in
plaats van serine. De OH groep van serine is nu dus de SH groep van
cystene. Er is geen catalytic triad nodig, histidine kan zonder
hulp van aspartaat de waterstof van cystene afpakken. Dit komt
doordat de SH groep van zichzelf als iets reactiever is dan de OH
groep. Hierna volgen dezelfde stappen als bij de
serine-proteasereactie.Aspartyl (carboxyl) proteasenVoorbeeld: HIV
protease of reninAspartyl-proteasen hebben twee aspartaat
zijketens, die er voor zorgen dat de peptide-binding kan worden
verbroken. De twee aspartaten delen samen een waterstof door een
waterstofbrug. En van de twee aspartaten gaat een reactie aan met
water. Die aspartaat pakt een proton af van het water en de
gedeelde proton komt bij de andere aspartaat terecht. Het reactieve
zuurstof van het water valt dan aan op de resonerende
peptide-binding, waardoor er een tetrahedral intermediate wordt
gevormd. Deze wordt gestabiliseerd door een waterstofbrug met een
proton van de tweede aspartaat. De stikstof in de peptide-binding
gaat hierdoor een binding aan met de proton van een aspartaat, de
koolstof vormt dan een dubbele binding met het reactieve
zuurstofatoom (dat daardoor niet meer reactief is) en de
peptide-binding is verbroken. Deze reactie verloopt dus in 1 stap!
Dit komt doordat het ene aspartaat water kan activeren en het
andere aspartaat de tetrahedral intermediate kan stabiliseren. Ook
komt het doordat water meteen aanwezig kan zijn.
Zink proteasenVoorbeeld: carboxypeptidase ADe zink-proteasen
worden ook wel de metalloproteasen genoemd. Een base in de actieve
site van het enzym helpt bij de reactie (vaak glutamaat). Het zink
wordt vastgehouden door 3 zijketens van het enzym. Het zink en de
base maken samen water reactief. De hydroxylgroep gaat een binding
aan met de koolstof van de peptide-binding, waardoor de dubbele
binding met de zuurstof verbroken wordt. Deze tetrahedral
intermediate wordt gestabiliseerd door het zink. De stikstof bindt
dan aan het proton van een tyrosine in de buurt, waardoor de
koolstof weer een dubbele binding aan kan gaan met de zuurstof. De
proton van water wordt dan weer overgenomen door tyrosine.
Het principe van een enzymreactie is altijd hetzelfde. Er vindt
altijd een nucleofiele aanval plaats (reactief maken van serine,
cystene of water) Hierna wordt er een tetrahedral intermediate
gevormd (door aanvallen van de C=O) Ook wordt de overgangstoestand
gestabiliseerd (bijvoorbeeld door middel van het oxyanion-gat),
zodat er tijd is voor de stikstof om de peptide-binding te laten
gaan en een proton te binden en het niet reageert met bijvoorbeeld
een andere zijketen.
Het HIV protease is een aspartyl protease en bestaat uit 2
homomeren die samen een dimeer vormen. Doordat het een dimeer is
kunnen de twee aspartaten bij elkaar worden gebracht in de actieve
site. Voor het HIV-protease is een protease-remmer gemaakt.
HIV-protease knipt multi-domeinviruseiwitten in hun actieve vorm.
Het remmen van deze protease blokkeert dus de HIV-infectie. De
remmer is een molecuul die lijkt op het substraat van de
HIV-protease (past in de actieve site), maar het is geen peptide
binding waardoor het niet geknipt kan worden. Dit is een
competitieve remmer die de activiteit van een protease kan
remmen.PenicillinePenicilline remt cross-links (de opbouw) in de
bacteriewand door de remming van glycopeptide-transpeptidase. De
bacteriewand is opgebouwd uit suikerresiduen, alanineresiduen en
glycines. Er bevinden zich reeksen van 5 glycines in de wand, die
we de pentaglycine-reeks noemen. De alanines zitten op een rij van
4 die de D-ala eenheid wordt genoemd. De suikers, de glycines en de
alanines zijn allemaal aan elkaar gebonden. De verbinding tussen de
reeks glycines en de alanines heet de pentaglycine-brug.
Glycopeptide-transpeptidase maakt de verbinding tussen alanine
en glycines. Het koppelt het amino-terminale deel van een
glycine-residue aan het op n na laatste residu van de
alanine-reeks. Hierbij wordt een bestaande peptide-binding
verbroken doordat glycopeptide-transpeptidase zichzelf acyleert (de
actieve site bevat wederom een serine). Er komt dan een tussen
toestand waarna een nieuwe binding, en dus product, wordt gevormd.
Dit komt doordat glycine een tweede substraat is voor het enzym,
waardoor het zal binden aan de alanine. Er zal dus eerst een
proteolytische reactie optreden. Penicilline is een remmer van
glycopeptide-transpeptidase, dat essentieel is voor de opbouw van
vrijwel iedere bacterie.
Penicilline lijkt op het substraat van
glycopeptide-transpeptidase en gaat een covalente binding aan met
het enzym. Het is dus een irreversibele remmer. Het wordt ook wel
een suicide inhibitor genoemd, omdat het enzym hierbij zichzelf
uitschakelt.
Penicilline is een goede remmer door de structuur. En van de
bindingen van penicilline is heel erg reactief, het wilt graag
verbroken worden. Hierdoor past penicilline heel goed in de actieve
pocket van het enzym, het bindt er graag aan.
Restrictie-endonucleasesRestrictie endonucleases knippen
dubbelstrengs DNA van een specifieke sequentie. Door deze
ontdekking kan klonen plaatsvinden. Er zijn er ongeveer 3000 bekend
(600 te koop). Restrictie enzymen zijn twee gedraaide homodimeren,
hierdoor kan het palindroom worden gebonden.EcoRVDeze restrictie
endonuclease is afkomstig uit de E.coli bacterie, Dit knipt de
sequentie GATATC precies in het midden (A-T), blund ends. EcoRV
heeft magnesium nodig als co-factor om de knip plaats te laten
vinden (net als bij zink-proteasen). Het verbreken van de
nucleotide-binding (scissile bond) door restrictie-endonucleases
vereist water. Dit water wordt verdeeld over de uiteinden die
ontstaan bij het verbreken van de binding. In het EcoRV zit een
magnesium dat op zn plaats wordt gehouden door (in dit geval) 2
aspartaten. Dit magnesium is zo geactiveerd dat het, samen met de
twee aspartaten, een watermolecuul kan activeren (doordat er een
proton wordt afgepakt). EcoRV is specifiek voor een bepaalde
sequentie omdat het hierbij veel interacties aan kan gaan. Deze
sequenties zorgen op deze manier dat er zo veel mogelijk
bindingsenergie vrij komt.
Door het groot aantal interacties van het enzym met het
substraat (DNA in dit geval) maakt het enzym een kink in het DNA.
De peptide binding die verbroken moet worden komt op deze manier
precies op plek dichtbij magnesium. Het is dus een enzym dat
katalyseert door de conformatie van het substraat te veranderen.
Door die knik is het energetisch voordeliger om de verbinding te
verbreken. Wanneer een andere sequentie bindt aan het enzym zullen
de interacties minder goed zijn en sowieso minder, de te verbreken
verbinding komt dus niet in de buurt van magnesium. De kink in het
DNA zal minder zijn. De overgangstoestand bij dit enzym is de kink
in het DNA. Een deel van de bindingsenergie wordt dus gebruikt om
het DNA te verbuigen.
Restrictie-enzymen hebben zich in bacterin ontwikkeld om zich te
kunnen verdedigen tegen bijvoorbeeld binnenkomend DNA van virussen.
Door methylering van het bacterie-DNA zorgt de bacterie ervoor dat
de restrictie-enzymen niet het eigen DNA knippen. Dit komt doordat
het DNA dan niet goed meer in de actieve site past en dus de knik
niet kan maken. Regulatie van enzymenEnzymen werken vrijwel altijd
samen. Een enzym kan samenwerken met een cofactor, die anorganisch
(zoals een metaalion: Mg, Zn, Mn, Ca) of organisch (co-enzym,
prosthetische groep) kan zijn. Een andere benaming voor een enzym
en een cofactor samen is een holoenzym, dit is zo omdat het enzym
slechts het eiwit is, maar het zal nooit werken zonder co-factor.
Het enzym wordt hierbij het apo-enzym genoemd. Het enzym blijft
onveranderd tijdens de reactie, maar de co-factor veranderd wel.
Bij magnesium is dat niet zo, maar bij vitamines wel. Een
prosthetische groep is een zeer vast (covalent) gebonden co-factor,
zoals heem. Een co-enzym is een niet-eiwitmolecuul en vaak een
complex molecuul, dat bij de binding van het substraat of bij de
katalyse is betrokken. Hiervan is continue aanvoer nodig, daarom is
het nodig om genoeg vitamines binnen te krijgen omdat dit essentile
bouwstenen zijn van deze co-enzymen. Zo is vitamineB3 een bouwsteen
voor NAD+. Maar een vitamine kan ook een direct co-enzym zijn zoals
vitamineC in metabole pathways.
Enzymen kunnen gereguleerd worden met behulp van: Door activatie
door de binding van kleine moleculen (remmers en activatoren) bij
regulatie-sites Door reversibele covalente modificaties (zoals
fosforylering) Door eiwit-eiwit interacties (bijvoorbeeld
pseudosubstraat remming) Door een proteolytische knip (zoals bij
trypsine uit trypsinogeen)
FosforyleringFosforylatie is effectief omdat: 1 fosfaat zet 2
negatieve ladingen op een eiwit, hierdoor verandert de gehele
chemische omgeving van een residu. 1 fosfaat kan 3 of meer
waterstofbruggen vormen, dit brengt ook grote veranderingen met
zich mee. De G (zeeeer negatief) van fosforylatie is laag, de G
voor de reactie is hoog Het is reversibel, de timing kan zelf
bepaald worden Fosforylatie kan zorgen voor amplificatie (kinases)
Er wordt veel ATP gebruikt in de cel (energievoorziening gekoppeld
aan regulatie van processen).Een fosfaat groep kan op de serine,
threonine en tyrosine worden gezet omdat deze 3 aminozuren een OH
groep bevatten. Kinases zetten de fosfaatgroepen erop, fosfatases
halen ze er weer van af. Door een eiwit te fosforyleren kan je dit
activeren of juist deactiveren. Wanneer op een bepaalde
transcriptiefactor namelijk een fosfaatgroep wordt gezet, kan het
uit de nucleus worden getransporteerd waardoor het inactief wordt.
Kinases worden zelf ook geactiveerd door fosforylering. Een
inactieve kinase heeft een T-loopstructuur die de binding van een
substraat blokkeert. Wanneer deze T-loop wordt gefosforyleerd, door
een andere kinase, verandert de conformatie waardoor de actieve
site vrij komt te liggen.Binding van kleine moleculen of
eiwit-eiwit interactiesProtein kinase A (PKA) is een
heterotetrameer, met 2 dezelfde katalytische en 2 dezelfde
regulatoire subunits. De regulatoire subunit zit in de actieve site
van de katalystische subunit, waardoor het substraat niet kan
binden. de regulatoire subunit bevat geen serine, threonine of
tyrosine waardoor de katalytische subunit niets kan fosforyleren.
De regulatoire subunit werkt dus als een competitieve remmer en
wordt een pseudosubstraat genoemd. Wanneer cAMP wordt geproduceerd
bindt dit aan de regulatoire subunits, waardoor deze van
conformatie veranderen. Hierdoor zullen de loops die met het
katalytische domein kunnen binden een lagere affiniteit hebben voor
het katalytische domein en het enzym zal actief worden. Er ontstaan
dan 2 losse actieve katalytische subunits en 2 aan elkaar gebonden
zijn via regulatoire subunits.De regulatoire subunit werkt als een
pseudosubstraat doordat het twee arginines heeft achter elkaar, wat
een hoge affiniteit heeft voor de actieve site van de katalytische
subunit. Maar het heeft op de plek waar een serine hoort te zitten
(dit zit dus wel in het substraat) een alanine en dit kan niet
gefosforyleerd worden. ATCaseATCase koppelt een carbamoyl-fosfaat
aan een aspartaat. Het product van deze reactie is een belangrijke
component van ATP. Bij deze reactie is er sprake van negatieve
feedback. ATCase wordt geremd door het uiteindelijke product van de
reactie (CTP). Wanneer er veel CTP aanwezig is, zal het ATCase
remmen. CTP is een allosterische inhibitor: het bindt ergens anders
dan de actieve site. ATCase is een allosterisch eiwit en volgt
daarom niet de Michaelis-Menten vergelijking, maar een sigmode
curve (hemoglobine, myoglobine), het substraat bindt dus
coperatief. CTP (product) remt de affiniteit voor het substraat, er
is dus meer enzym nodig om de half maximale snelheid van het
substraat te bereiken. ATP verhoogt de affiniteit voor het
substraat (dit is een maat voor voldoende voedsel).
ATCase kan in regulatoire en katalytische subeenheden worden
verdeeld door toevoeging van bijvoorbeeld p-hydroxymercuribenzoaat,
die met de sulfhydrylgroepen (SH) reageert. ATCase heeft 6
regulatoire en 6 katalytische subunits. De katalytische subunit
bestaat uit 3 grote ketens, de regulatoire subunit uit 2 kleinere
ketens.
Voor ATCase is een substraat gevonden (PALA) dat lijkt op het
intermediair van de reactie (transition state analog). Bij de
binding van PALA veranderd het ATCase van vorm. PALA is een
competitieve remmer omdat het in het actieve centrum bindt.
Hierdoor heeft men kunnen ontdekken dat ATCase een T-state (lage
affiniteit voor substraat, minder actief en dicht) en een R-staat
(hoge affiniteit voor substraat, actiever en open) heeft. In de
R-state zal het enzym open staan en in de T-state dicht, dit is dus
precies andersom dan bij hemoglobine. Het evenwicht tussen de T- en
de R-staat hangt af van het aantal gebonden substraatmoleculen, er
is sprake van coperatieve binding. Bij de binding van CTP wordt
ATCase in de T-vorm gehouden. CTP kan binden aan iedere regulatoire
keten die niet aan de katalytische subunit vastzit (6 keer dus).
CTP stabiliseert zo dus de T-state, de draaiing kan niet makkelijke
plaatsvinden. ATP bindt juist graag aan de R-state zodat ATCase
niet terugklapt naar de T-state zodat katalyse plaats kan vinden.
De substraten binden tussen een regulatoire en een katalytische
subunit, er kunnen er dus 6 binden.ATCase is dus een voorbeeld van
alle manieren van regulatie die eerder aan bod zijn gekomen.
stryerEr zijn 2 verschillende vormen van allosterische regulatie:
homotropische en heterotropisce regulatie. Een homotropische
allosterische modulator is een substraat voor het target-enzym,
maar ook een regulatormolecuul van de enzymactiviteit (typisch een
activator). Een heterotropisch allosterische modulator is een
regulatoir molecuul dat niet het enzymsubstraat is. Dit kan een
activator of een inhibitor van het enzym zijn.
Isozymen, of iso-enzymen, zijn enzymen die verschillen in
aminozuursequentie maar wel dezelfde reactie katalyseren. De
enzymen verschillen dan ook in bijvoorbeeld de KM, of reageren
anders op regulatiemoleculen. Isozymen worden gecodeerd door
verschillende genen en ontstaan vaak door duplicatie en
divergentie. Een voorbeeld van een isozym is LDH, de mens heeft
hier twee vormen van: het H-isozym dat veel tot expressie komt in
het hart en spierweefsel en het N-isozym dat veel tot expressie
komt in botweefsel. Het H-isozym heeft een hogere
substraataffiniteit dan het M-isozym. Hoge concentraties pyruvaat
remt allosterisch het H-isozym, maar niet het M-isozym. H-isozym
functioneert goed in de aanwezigheid van zuurstof, M-isozym
functioneert juist beter wanneer er geen zuurstof aanwezig is.
Voorbeelden van modificaties van een enzym
zijn:ModificatieDonormolecuulVoorbeeld van gemodificeerd
molecuulEiwitfunctie
FosforyleringATPGlycogeen fosforylaseGlucose-homeostase;
energie-transductie
AcyleringAcetyl CoAHistonenDNA-verpakking; transcriptie
UbiquitinyleringUbiquitineCyclineControle van de celcyclus
MethyleringMethylDNAVerpakken van DNA; expressie tegengaan
Fosforylering wordt gedaan door kinases op serine, threonine of
tyrosine. Defosforylering door fosfatases wordt gedaan met behulp
van water. Sommige enzymen moeten door proteolytische knip worden
geactiveerd. Wanneer zon enzym nog niet geknipt is (inactief dus)
heet het een zymogen of pro-enzym. Proteolytische knip kan maar n
keer gebeuren en is irreversibel. Het kan ook buiten de cel
plaatsvinden omdat er geen ATP voor nodig is. Hoorcollege 7 & 8
Eiwittechnieken: eiwitzuivering en detectie
De verzameling van alle eiwitten van een organisme of cel noemt
men een proteosoom. Proteomics is het bestuderen hiervan. De mens
kan op basis van de aminozuursequentie ongeveer 47.000 eiwitten
produceren. Aan deze eiwitten vinden ook posttranslationele
modificaties plaats, waardoor het aantal verschillende eiwitten
wordt geschat op 200.000 tot 2.000.000.
Met onderzoek naar eiwitten kun je eiwitten scheiden of
zuiveren, oftewel detecteren, of karakteriseren (het bepalen van
bijvoorbeeld het molecuulgewicht, aminozuurvolgorde, 3D-structuur
en activiteit). De specifieke activiteit van een eiwit (enzym) is
de activiteit van een enzym per hoeveelheid eiwit.Scheiding
Gelelectroforese Dit is de belangrijkste manier van
eiwitscheiding. Hiermee kan een scheiding worden gemaakt op grootte
en lading. De snelheid van het eiwit (v) is afhankelijk van de
sterkte van het elektrisch veld(E), de lading van het eiwit (z) en
de wrijvingscofficient (f):
V = E z / f
Het dragermateriaal is polyacrylamide. Dit wordt gebruikt als
moleculaire zeef en is hiervoor heel handig omdat het chemisch
inert is (het gaat geen reacties aan met de eiwitten die je erop
brengt), het is gemakkelijk te maken en de poriegrootte kun je
laten variren door de verhouding tussen acrylamide en cross-linker
(methylene, bisacrylamide). Het nadeel ervan is dat de stof
neurotoxisch is.SDS-PAGEBij SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide
gelelectroforese) wordt er alleen gescheiden op grootte. Door SDS
toe te voegen worden alle eiwitten negatief geladen, het bindt per
molecuul 2 aminozuren. -mercaptoethanol denatureert de eiwitten
door de zwavelbruggen te verbreken. Bij gelelectroforese is het
belangrijk dat je ook een marker gebruikt, een serie eiwitten
waarvan je de grootte weet, zodat de resultaten kunnen worden
vergeleken.Iso-electric focussing (IEF)Iso-electric focussing (IEF)
is een techniek waarbij een polyacrylamidegel met een pH-gradint
wordt gebruikt. Deze pH-gradint wordt gecreerd met polyamfolyten
met verschillende ladingen, die in de gel worden gepolymeriseerd,
en nadat er een lading op de gel wordt gezet verspreiden de
polyamfolyten zich in een pH-gradint. Wanneer je eiwitten over deze
gel laten lopen zullen eiwitten naar de positieve of negatieve pool
gaan lopen, en stoppen op het punt waar het iso-electrisch punt
(pI) neutraal is. Op deze manier kunnen de eiwitten dus gescheiden
worden op pI.2D-electroforeseBij 2D-electroforese wordt in een
eerste dimensie IEF toegepast en in een tweede dimensie SDS-PAGE.
Op deze manier worden de eiwitten eerst op pI en daarna op grootte
gesorteerd, waardoor veel meer eiwitten van elkaar kunnen worden
gescheiden.ZuiverenEiwitten kunnen worden gezuiverd op grootte,
oplosbaarheid, lading of bindingsaffiniteit.DialyseDe eerste manier
van zuiveren, eigenlijk verrijken, is dialyse. Hierbij wordt
gebruik gemaakt van een zakje van een semipermeabel membraan in een
bak met buffer. Hierbij worden buffermoleculen gewisseld voor
kleine moleculen. Hierbij ontstaat er door diffusie een evenwicht,
waarbij er geen complete zuivering optreedt (hoewel deze wel
benaderd kan worden met een zeer grote opstelling).GelfiltratieBij
gelfiltratie worden eiwitten gescheiden op grootte. Hierbij laat
men de eiwitten door een kolom lopen met daarin bolletjes met
gangetjes waar alleen kleine eiwitten in kunnen. Hierdoor gaan
kleine eiwitten dus langzamer door de kolom heen dan de grote
eiwitten. Door fracties op te vangen uit de kolom kunnen de
eiwitten gezuiverd worden, al is er eerder sprake van
verrijking.IonenwisselaarDe ionenwisselaar maakt ook gebruik van
een kolom, waar in dit geval bolletjes in zitten die geladen zijn.
Bij positieve bolletjes lopen de negatieve bolletjes langzamer door
de kolom heen. De snelheid waarmee eiwitten door de kolom lopen
hangt af van de sterkte van de lading van het eiwit. Sommige
eiwitten binden heel sterk aan de bolletjes. Deze eiwitten kunnen
door elutie, het toevoegen van zouten, van de kolom worden
verwijderd en worden opgevangen. Er bestaan dus twee verschillende
ionenwisselaars: de anionenwisselaar (negatieve deeltjes binden) en
de kationenwisselaar (positieve deeltjes
binden).UltracentrifugatieBij ultracentrifugatie kunnen eiwitten
worden gescheiden, al is het eerder verrijking. De scheiding, de
mate waarin het deeltje naar de bodem van het buisje afdaalt, hangt
af van de sedimentatiecofficint, die afhankelijk is van de massa en
de vorm van het deeltje, de dichtheid van de oplossing en de
dichtheid van het deeltje.Bij celfractionering via differentile
centrifugatie wordt een homogenaat, mengsel, van een cel, dat je
snel afdraait. De zwaarste componenten worden afgedraaid. Door het
supernatant af te pipetteren kan dit experiment overnieuw, bij een
hogere kracht, worden afgedraaid, waardoor er nog een zuivering
plaatsvindt.Bij gradint-ultracentrifugatie kunnen eiwitten nog
preciezer worden gescheiden. Hierbij wordt het buisje voor de
centrifugatie gevuld met een oplossing van sucrose die van onder
naar boven van een hoge naar een lage dichtheid loopt. Hierbovenop
wordt het supernatant gebracht. Na centrifugatie kan, door onderaan
de buis een gat te maken, in fracties de inhoud van de buis worden
opgevangen.Antillichamen Bij het zuiveren van eiwitten op
bindingsaffiniteit worden voornamelijk antilichamen gebruikt.
Antilichamen hebben een variabele en een specifiek domein. Deze
eiwitten worden opgewekt in dieren. Antilichamen herkennen een
specifiek antigen (dit kan bijvoorbeeld een eiwit zijn). Het
epitoop is het deel van het eiwit dat herkent wordt door een
antilichaam (het is ook mogelijk om een antilichaam op te wekken
voor slecht een serie van 8 aminozuren). Polyclonale antilichamen
is een mengsel van antilichamen die meerdere verschillende epitopen
herkennen en samen vrijwel een heel sequentie kunnen herkennen.
Monoclonale antilichamen herkennen maar 1
epitoop.AffiniteitschromatografieBij affiniteitschromatografie laat
men eiwitten door een kolom lopen met specifieke antilichamen erin.
De eiwitten die binden aan de antilichamen kunnen opgevangen worden
na elutie (veel protonen toevoegen, verstoord alle
waterstofinteracties).ImmunoprecipitatieEen variant hiervan heet
immunoprecipitatie, waarbij dit wordt gecombineerd met
centrifugatie. Na binding met antilichamen worden de bolletjes naar
beneden gedraaid, en kan het supernatant met andere eiwitten worden
verwijderd, waarna de eiwitten door elutie kunnen worden
verwijderd.DetectieEiwitten kunnen worden gedecteerd door
eiwitkleuring of radioactieve markering. Specifieke eiwitten kunnen
gedetecteerd worden met behulp van de activiteit (bij enzymen) of
antilichamen (in combinatie met kleur).
Bij een algemeen principe van eiwitdetectie door antilichamen
wordt een eiwitmengsel vastgemaakt op een drager. Hierover laten we
antilichamen lopen die een specifiek eiwit herkennen, het primaire
antilichaam. Hierna moet de drager goed gewassen worden. Met een
secundair antilichaam dat een fluorescente of gekleurde groep heeft
kan, na wassen, gezien worden of het eerste antilichaam heeft
gebonden.Men kan ook de antilichamen op de drager vastmaken, waar
de eiwitten overheen kunnen lopen. Hierbij moet wel een tweede
primair antilichaam worden toegevoegd, en tenslotte een secundair
antilichaam met een fluorescerende groep.Door een zuiver eiwit op
een drager te brengen, zoals bijvoorbeeld bij een HIV-test wordt
gedaan, kan gekeken worden of er in een mengsel (zoals bloed)
antilichamen aanwezig zijn voor dit eiwit. Hierna moet nog wel een
secundair antilichaam worden toegevoegd. Dit principe heet ELISA,
enzyme-linked immunosorbent assay.Door gebruik te maken van een
primair en een secundair antilichaam kunnen door een enkel
secundair antilichaam meerdere antilichamen (uit n dier) worden
herkent. Bij al deze methoden is het belangrijk dat er na iedere
stap wordt gewassen.
Een voorbeeld van een methode waarbij eiwitten op een drager
worden aangebracht is Western Blotting. Hierbij laat je de eiwitten
over een gel lopen, zoals bij SDS-PAGE. Door hierna een drager
achter de eiwitten te plaatsen die sterk positief is geladen,
zullen eiwitten overgaan naar de drager. Hierna kunnen de primaire
en secundaire antilichamen worden toegevoegd. Op deze manier kan
een specifiek eiwit worden gedetecteerd.
Bij immunofluorescentie wordt direct in een cel gekeken in
plaats van in een mengsel. Dit gebeurt op een weefselpreparaat.
Verschillende antilichamen kunnen samen het preparaat kleuren. Het
green fluorescent protein (GFP) is een eiwit waarvan de zijketens
in het midden de fluorescentie bepalen. Het gen hiervoor kan in een
cel in het genoom gebracht worden, waarna de functie van het eiwit
gevolgd kan worden.KarakteriseringEiwitten kunnen gekarakteriseerd
worden door hun molecuulgewicht, aminozuurvolgorde, 3D-structuur en
activiteit.
Door middel van protein sequencing kan de aminozuursequentie van
een eiwit worden bepaald. Hierbij wordt eerst gekeken uit welke
aminozuren een eiwit bestaat, door het bij een lage pH te
verhitten, de aminozuren te isoleren en door een ionenwisselaar te
scheiden (de mate van elutie die nodig is zegt welk aminozuur het
is). Vervolgens kan de kwantiteit van een aminozuur worden bepaald
door het te laten reageren met een indicator. Edman-degradatie is
de ouderwetse manier om dit te doen. Door het eerste N-terminale
aminozuur aan een stofje te koppelen, waardoor het afsplitst, kan
via pH-chromatografie bepaald worden welk aminozuur dit is. Dit kan
herhaald worden voor andere aminozuren. Na 5 of 6 aminozuren kon
deze techniek al niet meer worden gebruikt.
Bij massaspectrometrie wordt een mengsel van eiwitten (of klein
geknipte eiwitten, door bijvoorbeeld cyanogeenbromide of proteases
zoals trypsine) op een drager met een zuur milieu gebracht
(waardoor de eiwitten positief geladen worden). Met behulp van
bepaalde lasers worden deze eiwitten in de gasfase gebracht, waarna
ze door een elektromagneet versneld worden richting een detector.
De kleinere eiwitten reizen sneller en de TOF (time of flight) kan
worden omgerekend worden naar de exacte massa. Hierbij kunnen de
eiwitten in een eiwitmengsel door een protease worden geknipt. Van
deze proteases weet je ook de specificiteit. Je krijgt dan kleine
stukjes eiwitten waarvan je de massa kan bepalen. De eiwitten
kunnen bij verder knippen nog specifieker worden bepaald. Hierbij
kunnen ook de posttranslationele modificaties worden bekeken. Deze
techniek heet MALDI-TOF.
De tertiaire structuur, de 3D-conformatie, wordt bepaald door
interacties die we niet kunnen voorspellen.
Bij X-ray crystallography laat men de eiwitten kristalliseren
door ze onder bepaalde omstandigheden in een buffer te brengen.
Hierbij is dus een specifieke conformatie gevangen in een kristal.
Door een kristal te bestralen met rntgenstraling, waarbij de
straling verstrooid wordt. Het defractiepatroon is specifiek voor
een bepaald eiwit. De zuiverheid van je preparaat is heel
belangrijk om de structuur van het eiwit te kunnen bepalen.
Een andere techniek om de 3D-structuur te bepalen is NMR.
Hierbij kan echter een dynamische structuur worden gedetecteerd, in
plaats van een enkele structuur. Er kunnen hierbij geen grote
eiwitten worden gebruikt, in tegenstelling tot bij kristallografie.
Onder invloed van radiofrequente straling in een magnetisch veld
kan de spin van een elektron veranderen. Hierbij neemt het atoom
energie op. Deze absorptie van energie in dit magnetisch veld kan
worden gemeten. In een sterk magnetisch veld is het grootste
verschil te zien. De omgeving van een atoom (bijvoorbeeld in de
hoofd- of zijketen) bepaald hoeveel energie een atoom moet opnemen
om de spin van een elektron om te draaien. De resultaten worden
vergeleken met een referentieatoom (nullijn).De absorptie is ook
afhankelijk van andere protonen in de buurt. Door twee metingen
achter elkaar te doen kan men zien of deze twee protonen dicht bij
elkaar zitten. Dit komt doordat na de eerste absorptie energie
wordt overgedragen naar het andere proton, waardoor bij beide
atomen een verschil te zien is in de chemical shift, de mate van
verandering ten opzichte van de referentie.
Aspartaat 1 maakt water reactief
Aspartyl proteasen
Aspartaat 2 stabiliseert oxyanion
H
Zink ion maakt water!reactief
Zink proteasen: Metalloproteasen
Base: vaak Glu
Mechanisme Metalloprotease!(carboxypeptidase A)
http://juang.bst.ntu.edu.tw/BCbasics/Animation1.htm
Mechanisme Metalloprotease!(carboxypeptidase A)
http://juang.bst.ntu.edu.tw/BCbasics/Animation1.htm
Penicilline
Alexander Flemming, ~1928
Penicilline remt cross-links in bacteriewand door remming van
glycopeptide transpeptidase
Pentaglycine-brugD-Ala-brug
Glycopeptide!transpeptidase!
reactie
Text
Penicilline lijkt op substraat en gaat een covalente binding aan
met het enzym
Irreversibele remmer: Suicide Inhibitor
R - D-ala- C - O - ser -
O enzymsubstraatTussenstap in katalyse
penicilline- C - O - ser -
O+ penicilline
Penicilline bindt aan het enzym net zoals het!substraat in
overgangstoestand
Restriction Endonucleases
Hydrolyse DNA backbone mbv water en Mg2+
Mg2+
water geactiveerd door Asp en Mg2+
CTP remt affiniteit voor Substraat
feedback controle
ATP verhoogt affiniteit voor Substraat
maat voor voldoende !voedsel
CTP en ATP zijn regulatoren van ATCase
Sigmoide curve: substraat bindt coperatief!Voegt zich niet naar
M&M kinetiek!
aspartaat
carbamoylfosfaat
Transition state analog
Kleine verandering, Groot effect Hoogtepunten..
- Primaire, secundaire, tertiaire, quaternaire structuur! van
eiwitten
- Hoe worden -helices en -sheets gevormd? - Wat is myoglobine en
waaruit is het opgebouwd?
- Hoe ziet de prosthetische groep eruit, en hoe bindt! zuurstof
aan het ijzer atoom?
- Wat gebeurt er met heme wanneer zuurstof ! bindt, en
waarom?
Myoglobine: 1 subunitFunctie: opslag O2 in spieren / weefsel
Hemoglobine: 4 subunits (22)Functie: transport O2 van longen
naar weefsel
Myoglobine vs Hemoglobine:Opslag vs Transport
Hemoglobine
1
21
2
Coperatieve binding! ! hoe meer O2 er per hemoglobine molecuul
!! bindt, hoe hoger de affiniteit voor O2!
!! S-vormige of sigmoide verzadigingsgrafiek
Efficint O2 transport
!33
Door zuurstof binding verandert de quaternaire!structuur van
hemoglobine.
T-vorm (tense) R-vorm (relaxed)
!44
draaiing subunits t.o.v elkaar! verbreken van zoutbruggen
Het gevolg (2):
!42
2 modellen voor Cooperativiteit O2 binding door hemoglobine:
1. Concerted Model: T of R
Hb met 3 O2 moleculen altijd in R staat.!Laatste O2
bindingsplaats 20X hogere affiniteit voor O2 dan deoxyHb
2. Sequentieel model: tussenvormen T/R
Hb met 1 O2 molecuul altijd in T staat (concerted), maar
affiniteit van overige 3 sites voor O2 is 3X hoger !46
2 modellen voor Cooperativiteit O2 binding door hemoglobine:
1. Concerted Model: T of R
Hb met 3 O2 moleculen altijd in R staat.!Laatste O2
bindingsplaats 20X hogere affiniteit voor O2 dan deoxyHb
2. Sequentieel model: tussenvormen T/R
Hb met 1 O2 molecuul altijd in T staat (concerted), maar
affiniteit van overige 3 sites voor O2 is 3X hoger !46
2,3 bisphosphoglyceraat (BPG)
BPG !verlaagt de O2 affiniteit van Hb!! bindt in centrum van de
tetrameer!! bindt aan T-vorm (laag O2) en niet aan R-vorm
Efficint O2 transport: Verbeterde O2 afgifte
1
!50
Foetaal hemoglobine
Ander eiwit, 22, met hogere affiniteit voor O2!BPG kan niet
binden aan foetaal Hb
ketens! !!!
ketens!!!!
!54
Zoutbruggen in deoxyhemoglobine!(worden verbroken tijdens deoxy
naar oxy overgang)
COO-
Bohr Effect CO2
Bohr Effect H+
!60
Allosterie
Regulatie van de functie van een eiwit door moleculen die binden
aan het eiwit
op een plek dat niet het actieve centrum is
Hb ziekten: 1. Sikkelcel anemie
mutatie Glu Val aan buitenkant -keten
Gevolg: deoxy-HbS polymeren
Hb ziekten: 2. Anemie 3. Thalassemie
4. Porfyrie 5. Polycytemie
Anemie: te weinig HbOorzaak: ijzertekort: weinig heme
productie
Porfyrie: te weinig HbOorzaak: Genetisch defect: weinig heme
productie
Polycytemie: te veel HbOorzaak: Allerlei, waaronder
Overproductie rode bloedcellen, wonen op grote hoogten
Thalassemie: slechte zuurstof opname in weefselsOorzaak: Hb met
slecht 1 soort keten: geen coperativiteit
Indische Gans
Vliegt op hoogtes van 4-6 kmIs gespot tijdens vlucht over M.
Everest
Hb heeft 4 aminozuur veranderingen:
Groter gat tussen dimerenMinder stramme T-stateIJzer meer in
vlak van porfyrineHogere affiniteit voor O2Meer O2 opname bij
lagere pO2
Enzym versnelt omzetting substraat in product
ES EP PS
Enzymen verlagen de activeringsenergie
A + B C + D
ligging evenwicht wordt bepaald door wetten thermodynamica
reactie verloopt tot evenwicht
A + B C + D
Wat doen enzymen?
snelheid wordt bepaald door !activeringsenergie
G
SXP
Enzymen zorgen voor een juiste volgorde !van reacties
Enzymkinetiek
Relatie snelheid V en substraat S
Michaelis-Menten vergelijking:
Vmax en KM bepalen kinetiek van een enzym
Enzymkinetiek
Relatie snelheid V en substraat S
Michaelis-Menten vergelijking:
Vmax en KM bepalen kinetiek van een enzym
Enzymkinetiek
Relatie snelheid V en substraat S
Michaelis-Menten vergelijking:
Vmax en KM bepalen kinetiek van een enzym
Michaelis - Menten constante
Wat is de KM?
KM is een constante voor een enzym-substraat paar
kafbraak van ESkopbouw van ES
KM=k-1 + k2
k1
k2
k-1
Michaelis - Menten constante
Wat is de KM?
KM is een constante voor een enzym-substraat paar
kafbraak van ESkopbouw van ES
KM=k-1 + k2
k1
k2
k-1
Katalytische snelheid: (1)V= k2 [ES]
1. vorming: ! k1 [E] [S]!2. afbraak: ! (k-1 + k2) [ES]
Concentratie ES wordt bepaald door:! !
k2
k-1
of
k1 [E] [S] = (k-1 + k2) [ES]
In steady state van ES: vorming = afbraak
[E] [S][ES] =
KMDus:
= KM
[E] [S][ES] =
(k-1 + k2)/k1constante
Katalytische snelheid: (1)V= k2 [ES]
1. vorming: ! k1 [E] [S]!2. afbraak: ! (k-1 + k2) [ES]
Concentratie ES wordt bepaald door:! !
k2
k-1
of
k1 [E] [S] = (k-1 + k2) [ES]
In steady state van ES: vorming = afbraak
[E] [S][ES] =
KMDus:
= KM
[E] [S][ES] =
(k-1 + k2)/k1constante
Katalytische snelheid: (1)V= k2 [ES]
1. vorming: ! k1 [E] [S]!2. afbraak: ! (k-1 + k2) [ES]
Concentratie ES wordt bepaald door:! !
k2
k-1
of
k1 [E] [S] = (k-1 + k2) [ES]
In steady state van ES: vorming = afbraak
[E] [S][ES] =
KMDus:
= KM
[E] [S][ES] =
(k-1 + k2)/k1constante
Katalytische snelheid: (1)V= k2 [ES]
1. vorming: ! k1 [E] [S]!2. afbraak: ! (k-1 + k2) [ES]
Concentratie ES wordt bepaald door:! !
k2
k-1
of
k1 [E] [S] = (k-1 + k2) [ES]
In steady state van ES: vorming = afbraak
[E] [S][ES] =
KMDus:
= KM
[E] [S][ES] =
(k-1 + k2)/k1constante
Katalytische snelheid: (1)V= k2 [ES]
1. vorming: ! k1 [E] [S]!2. afbraak: ! (k-1 + k2) [ES]
Concentratie ES wordt bepaald door:! !
k2
k-1
of
k1 [E] [S] = (k-1 + k2) [ES]
In steady state van ES: vorming = afbraak
[E] [S][ES] =
KMDus:
= KM
[E] [S][ES] =
(k-1 + k2)/k1constante
[E] [S][ES] =
KM[E] = [Etotaal] - [ES]
[S] = [Stotaal] als [S]>>[E] (aanname)
([ET] - [ES]) [S][ES] =
KM
[S]
[ES] =KM + [S]
[ET]
[ES] KM = [ET] [S] - [ES] [S]
[ES] KM + [ES] [S] = [ET] [S]
[ES] (KM + [S]) = [ET] [S]
[S][ES] =
[S] + KM[ET] of (2)
E definiren en S definiren
k2
k-1
[E] [S][ES] =
KM[E] = [Etotaal] - [ES]
[S] = [Stotaal] als [S]>>[E] (aanname)
([ET] - [ES]) [S][ES] =
KM
[S]
[ES] =KM + [S]
[ET]
[ES] KM = [ET] [S] - [ES] [S]
[ES] KM + [ES] [S] = [ET] [S]
[ES] (KM + [S]) = [ET] [S]
[S][ES] =
[S] + KM[ET] of (2)
E definiren en S definiren
k2
k-1
Irreversibele remmers
Zenuwgas
Reversibele remmers
Competitieve remmer
remt vorming enzym-substraat complex ! (remt k1)
Niet - competitieve remmer
remt katalyse (turnover number) ! (remt k2)
snelle dissociatie van enzym-remmer complex
k2
k-1
Reversibele remmers
Competitieve remmer
remt vorming enzym-substraat complex ! (remt k1)
Niet - competitieve remmer
remt katalyse (turnover number) ! (remt k2)
snelle dissociatie van enzym-remmer complex
k2
k-1
Reversibele remmers
Competitieve remmer
remt vorming enzym-substraat complex ! (remt k1)
Niet - competitieve remmer
remt katalyse (turnover number) ! (remt k2)
snelle dissociatie van enzym-remmer complex
k2
k-1
Voorbeeld Reversibele remmer uit de praktijk
Antabuse (Disulfiram): Medicijn tegen alcoholisme:!Zorgt voor
enorme kater bij inname beetje alcohol
C H3
C=O
alcohol
Alcohol!dehydrogenase!
(+NAD)
Acetaldehyde!dehydrogenase
C H3
C H2 OH
acetaldehyde
Misselijk!Hoofdpijn
azijnzuur
H
C H3
C=O
OH
Competitieve remmer !
C H3
R-S=O
H
Antabuse
Proteolyse
10-1000 jaar stabiel!(vanwege resonantie) Proteases:!
versnellen proteolyse tot msec
serine protease!! !25 Kd!!voorloper: !chymotrypsinogeen
Chymotrypsine
!!1. acylering: covalente binding !! enzym met n van de
producten!!!2. deacylering: losmaken ! enzym-product
Katalyse verloopt via 2 stappen
Acyl
Principe katalyse door Chymotrypsine:!reactief maken van de
OH-groep van serine
Histidine en aspartaat maken serine reactief
catalytic triad
base catalystIn aanwezigheid van substraat
Thermodynamica:!Stap 2: G voordeligst voor interactie van
koolstof in substraat met alkoxide ion van Ser195. Oxyanion mag
niet direct reageren met andere moleculen, dus stabilisatie door
Oxyanion hole is gewenst.
De katalyse, Stap 1: Acylering
mogelijk gemaakt door resonantie peptide binding
O- wordt gestabiliseerd door!hoofdketen groepen
Thermodynamica:!Stap 3: koolstof-stikstof binding in substraat
instabiel vanwege resonantie met oxyanion, en dus G voordeligst
voor interactie stikstof van substraat met proton in histidine van
enzym.
De katalyse, Stap 1: Acylering
De katalyse, Stap 2: Deacylering
Thermodynamica:!Stap 6: OH- reageert met koolstof van acyl-enzym
complex. Oxyanion Hole stabiliseert wederom instabiele
overgangstoestand.
De katalyse, Stap 2: Deacylering
Thermodynamica:!Stap 7: G voordeligst voor verbreking interactie
tussen Acyl en Enzym.!
Serine proteasen
bindingsplaats van substraat
Zelfde catalyse, verschillende specificiteit
Histidine maakt !cysteine (S-H) reactief
Cysteine proteasen