Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng cà định dạng của tập đoàn cây Dó Bầu ( Aquilaria SP.) tại Hà Tĩnh Hoàng Đăng Hiếu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Khoa Sinh học Luận văn Thạc sĩ ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70 Người hướng dẫn: PGS.TS. Chu Hoàng Hà Năm bảo vệ: 2012 Abstract. Tổng quan về cây dó bầu; phương pháp sử dụng trong việc định danh loài và xác định quan hệ di truyền; DNA barcode - quan điểm mới trong phân loại; locus được sử dụng trong phương pháp DNA barcode ở thực vật; tình hình nghiên cứu DNA barcode ở thực vật. Tìm hiểu một số kết quả trong nghiên cứu về cây dó bầu tại Việt Nam và trên thế giới, Nghiên cứu thu thập 18 mẫu lá các cây dó dầu tại Hà Tĩnh, Phú Quốc và tại Lào, tách chiết tinh sạch DNA. Sử dụng phương pháp PCR để nhân bản đoạn gen quan tâm với mồi đặc hiệu. Tách dòng đoạn gen và xác định trình tự gen. Đưa ra kết quả và thảo luận: kết quả tách chiết và tinh sạch DNA tổng số; tìm nhiệt độ gắn mồi đăc hiệu của phản ứng PCR; nhân bản gen với các cặp mồi; kết quả tách dòng gen; xác định và phân tích trình tự nucleotide của các đoạn DNA chỉ thị. Keywords. Di truyền học; Cây dó dầu; Sinh học phân tử Content 1. Đặt vấn đề Cây dó bầu (Aquilaria sp) là một trong những loài thực vật đặc hữu của nước ta, cây dó bầu mang lại giá trị kinh tế rất lớn với mục đích chủ yếu là khai thác trầm hương, một mặt hàng có giá trị kinh tế cao sử dụng trong công nghiệp mỹ phẩm, trong dược liệu, trong tôn giáo, chế tác đồ thủ công mỹ nghệ. Tuy nhiên, hiện nay các loài dó bầu ở Việt Nam bị lai tạp rất nhiều, công tác lựa chọn giống đưa vào trồng dựa chủ yếu vào quan sát hình thái, theo kinh nghiệm của mỗi cá nhân,
13
Embed
Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trongrepository.vnu.edu.vn/bitstream/VNU_123/7820/1/01050000145.pdf · - Thu thập mẫu lá ở các cây dó bầu - Tách chiết
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong
phân tích đa dạng cà định dạng của tập đoàn
cây Dó Bầu ( Aquilaria SP.) tại Hà Tĩnh
Hoàng Đăng Hiếu
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Khoa Sinh học
Luận văn Thạc sĩ ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70
Người hướng dẫn: PGS.TS. Chu Hoàng Hà
Năm bảo vệ: 2012
Abstract. Tổng quan về cây dó bầu; phương pháp sử dụng trong việc định danh loài
và xác định quan hệ di truyền; DNA barcode - quan điểm mới trong phân loại; locus
được sử dụng trong phương pháp DNA barcode ở thực vật; tình hình nghiên cứu
DNA barcode ở thực vật. Tìm hiểu một số kết quả trong nghiên cứu về cây dó bầu
tại Việt Nam và trên thế giới, Nghiên cứu thu thập 18 mẫu lá các cây dó dầu tại Hà
Tĩnh, Phú Quốc và tại Lào, tách chiết tinh sạch DNA. Sử dụng phương pháp PCR để
nhân bản đoạn gen quan tâm với mồi đặc hiệu. Tách dòng đoạn gen và xác định
trình tự gen. Đưa ra kết quả và thảo luận: kết quả tách chiết và tinh sạch DNA tổng
số; tìm nhiệt độ gắn mồi đăc hiệu của phản ứng PCR; nhân bản gen với các cặp mồi;
kết quả tách dòng gen; xác định và phân tích trình tự nucleotide của các đoạn DNA
chỉ thị.
Keywords. Di truyền học; Cây dó dầu; Sinh học phân tử
Content
1. Đặt vấn đề
Cây dó bầu (Aquilaria sp) là một trong những loài thực vật đặc hữu của nước ta, cây
dó bầu mang lại giá trị kinh tế rất lớn với mục đích chủ yếu là khai thác trầm hương, một mặt
hàng có giá trị kinh tế cao sử dụng trong công nghiệp mỹ phẩm, trong dược liệu, trong tôn
giáo, chế tác đồ thủ công mỹ nghệ.
Tuy nhiên, hiện nay các loài dó bầu ở Việt Nam bị lai tạp rất nhiều, công tác lựa chọn
giống đưa vào trồng dựa chủ yếu vào quan sát hình thái, theo kinh nghiệm của mỗi cá nhân,
dẫn đến năng suất và chất lượng trầm thu được không ổn định. Do vậy, việc chọn lọc giống
cây ban đầu để đưa vào triển khai là hết sức quan trọng và là nhiệm vụ cấp thiết trong công
tác bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen quý.
Hiện nay phương pháp DNA barcode là một trong những công cụ phục vụ định danh
loài chính xác, nhanh chóng, tự động hóa bằng cách sử dụng một vùng DNA chuẩn hay còn
gọi là chỉ thị DNA hay mã vạch DNA (DNA barcode). Việc xác định loài bằng DNA chỉ thị
có hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài thực vật trong đó có dó bầu ở Việt Nam khi
những quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ sở để định danh hoặc phân biệt
loài.
2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Gồm 18 mẫu lá cây dó bầu được thu thập tại Hà Tĩnh, Phú Quốc và tại Lào
Chủng vi khuẩn Escherichia coli (DH5α) sử dụng cho mục đích tách dòng do Phòng
Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
Các bước nghiên cứu:
- Thu thập mẫu lá ở các cây dó bầu
- Tách chiết tinh sạch DNA tổng số từ 18 mẫu dó bầu
- Sử dụng phương pháp PCR để nhân bản đoạn gen quan tâm với mồi đặc hiệu
- Tách dòng đoạn gen quan tâm
- Xác định trình tự gen và phân tích kết quả
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA
Các mẫu dó bầu sau khi thu thập được tiến hành ách triết DNA theo phương pháp
CTAB
T1 T2 T3 T4 T6 T7 T8 T9 T10 T11
Hình 1. Kết quả điện di DNA tổng số của một số mẫu dó bầu nghiên cứu
Kết quả sau khi điện di trên gel agarose 0,8% và nhuộm bằng Ethidium bromide (hình
1) cho thấy DNA thu được sau khi tách có chất lượng tốt, DNA không bị đứt gẫy, các băng
vạch đều sáng rõ.
3.2. Tìm nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu của phản ứng PCR
Bốn cặp mồi chúng tôi tiến hành nghiên cứu được thiết kế dựa theo Vijayan và Tsou
(2010). Chúng tôi tiến hành thử nghiệm nhiệt độ gắn mồi của 4 cặp mồi và kiểm tra kích
thước nhân bản thực tế của 4 gen này với 18 mẫu dó bầu. Sau quá trình thử nghiệm với các
dải nhiệt độ gắn mồi khác nhau, đã xác định được nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu cho 4 cặp mồi
nghiên cứu và kích thức nhân bản của 4 gen này so với dự đoán ban đầu có sự thay đổi thể
hiện trên bảng 1.
Bảng 1 Nhiệt độ bắt mồi và kích thước gen của các cặp mồi nghiên cứu
STT Vùng gen
nhân bản
Ký hiệu
mồi
Kích thước
đoạn gen nhân
bản
Nhiệt độ bắt
cặp mồi lý
thuyết
Nhiết độ bắt cặp
mồi thực tế
1 rbcL P2F 750 bp 53 54
P2R 60
2 rpoB P5F 500 bp 59 54
P5R 60
3 psbA-trnH P10F 450 bp 57 56
P10R 72
4 ITS P12F 800 bp 74 57
P12R 76
3.3. Kết quả nhân bản gen với các cặp mồi nghiên cứu
Sau khi tối ưu được nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu chúng tôi đã tiến hành nhân bản bằng
phản ứng PCR với 4 cặp mồi nghiên cứu. Kết quả cho thấy 18 mẫu dó bầu nhân bản tốt với 4
cặp mồi nghiên cứu.
Hình 2. Kết quả PCR gen ITS Hình 3. Kết PCR gen psbA – trnH
Hình 4. Kết quả PCR gen rpoB Hình 5. Kết quả PCR gen rbcL
3.4. Kết quả tách dòng gen
3.4.1 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel)
Sản phẩm PCR thu được sau phản ứng khuếch đại gen có các tạp chất như mồi, đệm
PCR, các nucleotide,...còn dư, và đôi khi có thể chứa các sản phẩm phụ sẽ ảnh hưởng đến kết
quả của quá trình tách dòng, do vậy cần tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR trước khi tiến
hành quá trình đưa gen vào vector tách dòng.
Các đoạn gen sau khi tinh sạch được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0.8% để
kiểm tra chất lượng và xác định sơ bộ hàm lượng DNA tinh sạch, kết quả thể hiện ở hình 6.
Hình 6. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR gen rpoB
M : thang Marker1Kb; AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4,
T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch ở hình 6 cho thấy chỉ có một băng vạch
có kích thước tương ứng với đoạn gen được nhân lên bằng mồi barcode tương ứng. Các băng
vạch rõ nét chứng tỏ các DNA không bị đứt gãy trong quá trình tinh sạch, có thể tiến hành
phản ứng ghép nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng tiếp theo.
Tương tự với các sản phẩm PCR của các gen còn lại cũng đã được tiến hành tinh sạch
và cho kết quả tốt tương tự gen rpoB.
3.4.2. Kết quả chuyển gen vào vector tách dòng
Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch, chạy điện di kiểm tra và tính toán hàm lượng
DNA để dùng cho phản ứng ghép nối vào vector tách dòng pBT. Phản ứng ghép nối là phản
ứng hình thành liên kết phosphodiester giữa base Adenin ở đầu 5’ của sản phẩm PCR với
base Thymine ở đầu 3’ của vector tách dòng nhờ hoạt tính nối của enzyme T4 ligase.
3.4.3. Kết quả biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E. coli
Sản phẩm của quá trình chuyển gen vào vector pBT sẽ được biến nạp vào vi khuẩn
E.coli DH5α, sau đó được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung carbenicilin 50 mg/l,
500 bp
X-gal 0,004% và IPTG 100μM. Kết quả của quá trình này sẽ là sự xuất hiện của những khuẩn
lạc xanh và trắng, trong đó khuẩn lạc trắng là những khuẩn lạc chúng ta quan tâm.
Hình 7. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến
Hình 7 cho thấy kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến có kết quả tốt,
trên đĩa nuôi cấy xuất hiện những khuẩn lạc xanh và trắng mật độ và số lượng tương đối lớn
đủ để qúa trình chọn lọn khuẩn lạc diễn ra dễ dàng.
3.4.4 Kết quả chọn lọc dòng tế bào mang gen tái tổ hợp
Để xác định chính xác khuẩn lạc nào mang vector gắn đoạn DNA quan tâm chúng tôi
tiến hành phản ứng colony - PCR. Với phương pháp này giúp chúng ta phát hiện nhanh
những dòng khuẩn lạc nào mang gen đích, giảm chi phí và tiết kiệm thời gian. Tiến hành
chọn lọc các khuẩn lạc trắng trên đĩa khuẩn lạc, sau đó thực hiện phản ứng colony-PCR với
cặp mồi vector pUC-18.
Hình 8. Kết quả điện di sản phẩm PCR - clony khuẩn lạc mồi rbcL