Unidad /División J Carrera Materia / ' Título Fecha L/ Nombre / Matrícula ~ Asesora Iztapalapa CBS Biología Experimental Seminario de Investigación Efecto dela Pentoxifilina sobre la Expresión del Factor de Necrosis Tumoral alfa Inducida por Etanol en Diferentes Tipos Celulares Hepáticos. 2 Diciembre 1999-12-02 Blanca Eugenia Farfan Labonne 94327369 Concepción Gutiérrez Ruíz
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Unidad
/División
J Carrera
Materia
/ ' Título
Fecha
L/ Nombre /
Matrícula
~ Asesora
Iztapalapa
CBS
Biología Experimental
Seminario de Investigación
Efecto dela Pentoxifilina sobre la
Expresión del Factor de Necrosis
Tumoral alfa Inducida por Etanol en
Diferentes Tipos Celulares Hepáticos.
2 Diciembre 1999-12-02
Blanca Eugenia Farfan Labonne
94327369
Concepción Gutiérrez Ruíz
"Efecto De La Pentoxifilina Sobre La Expresión
Del Factor De Necrosis Tumoral a (TNFa)
Inducida Por Etanol En Diferentes Tipos
Cel u la res Hepáticos"
Presenta: Blanca Eugenia Farfan Labonne
Tutora: Dra. Ma. Concepción Gutiérrez Ruíz
Sede: Universidad Autónoma Metropolitana lztapalapa
Laboratorio de Fisiología Celular
Abreviaturas empleadas
ECM
HSC
KC
MFB
PC
TGFp
TNFa
RT
PCR
ADH
MEOS
PTX
LPS
RNA
DEPC
Matriz Extracelular
Células Estelares Hepáticas
Células de Kupffer
Miofibroblasto
Hepatocito
Factor de Crecimiento Transformantep
Factor de Necrosis Tumoral CL
Reacción de Retro-transcripción
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Deshidrogenasa alcohólica
Sistema Oxidativo Microsomal del Etanol
Pentoxifilina
Lipopolisacárido
Ácido Ribonucléico
Dietilpirocarbonato
2
Introducción.
Tipos Celulares Hepáticos.
El hígado es la glándula más grande del cuerpo que está formada por células
parenquimatosas (hepatocitos) y cuatro tipos celulares no parenquimatosos
asociados con los sinusoides; las células endoteliales, las células de Kupffer
(macrófagos residentes), las células "pit", y las células estelares hepáticas (Arias,
1988).
Los hepatocitos (PC) son la unidad funcional del hígado. Se encuentran
empaquetados en forma de malla en el plano central del canaliculo biliar y están
rodeados por sinusoides en ambos lados. Son los responsables del metabolismo
hepático participando en las vías metabólicas del ciclo de la urea, en la regulación
específica del metabolismo de los lípidos, asi como en la formación de bilirubina y
de ácidos biliares (Fawcett, 1989). En forma estructural el hepatocito está
constituido por tres regiones; la superficie basolateral que contiene algunas
microvellosidades, la región contigua y el canalículo biliar.
A su vez, los hepatocitos se asocian en unidades denominadas acinos, estos se
dividen, con base en la circulación sanguínea, en una zona periportal y una zona
perivenosa, estableciendo una regionalidad metabólica en los hepatocitos en
función del flujo sanguíneo como resultado de una disminución gradual del
sustrato disponible y de oxígeno.
En lo que respecta a la secreción exocrina de bilis, esta se lleva a cabo en la
región del polo apical del hepatocito presente en la membrana canalicular
alrededor de la periferia de las células parenquimatosas. Esta polaridad del
complejo de señales intracelulares es capaz de dirigir correctamente los procesos
de síntesis y secreción del tejido hepático.
Las células endoteliales se encuentran en el límite externo de los sinusoides,
tienen numerosas funciones entre las que se encuentran el transporte activo de
distintos sustratos, la coagulación, la respuesta inmune, etc. Las células de
Kupffer (KC) se localizan en la zona periportal y están ancladas al endotelio de los
sinusoides, son macrófagos y componentes del sistema de fagocitos
mononucleares. Las células "pit" están localizadas en el límite endotelial, y son
linfocitos granulares grandes con actividad de células asesinas. Juegan un papel
importante de defensa contra infecciones virales y metástasis tumoral.
Las células estelares (HSC), también denominadas lipocitos, células de Ito ó
perisinusoidales, se localizan en el espacio perisinusoidal de Disse, adyacentes a
los hepatocitos y a la capa de células endoteliales sinusoidales. Son las
encargadas del almacenaje y metabolismo de retinoides y también producen
componentes de matriz extracelular ( ECM ) en cantidad moderada. En el hígado
A
sano, las células estelares representan alrededor del 10% del tejido hepático.
Este tipo celular puede transformarse a miofibroblasto por una variedad de
estímulos. Durante la activación estas células pueden sufrir algunos cambios, por
ejemplo, los núcleos se hacen más grandes y las vacuolas de vitamina A se
reducen. Las HSC parecen jugar un papel relevante en la fibrosis hepática, ya
que no solo producen y secretan ECM, sino también enzimas para su degradación
(Friedman, 1992; Arthur, 1992). Como se mencionará más adelante, la
transformación de estas células a un fenotipo de miofibroblasto es reconocido
como el evento central de la fibrogénesis hepática.
Metabolismo del Etanol.
El etanol (CH,-COOH) es una molécula pequeña parcialmente polar. Debido a
ello, es miscible en agua y en lípidos. Estás características le permiten moverse
por difusión simple a través de las membranas celulares, de tal manera que su
concentración se equilibra rápidamente entre la sangre y los tejidos (Crabb, 1987).
El principal órgano involucrado en el metabolismo del etanol en el humano es el
hígado, ya que en él se lleva a cabo un 90% de su oxidación (Rubin, 1981).
Después de su absorción en el intestino, el etanol pasa a la circulación portal
hepática y posteriormente a la circulación sistémica; difundiéndose rápidamente
en el organismo.
El hepatocito posee tres sistemas enzimáticos para metabolizar el etanol: el
sistema de la deshidrogenasa alcohólica (ADH) localizada en el citosol; el sistema
oxidativo microsomal (MEOS) ligado al retículo endoplásmico liso y el sistema de
la catalasa, ubicado en los peroxisomas. Estos tres sistemas llevan a cabo la
conversión del etanol a acetaldehido, el cual a su vez, es el sustrato de la
deshidrogenasa aldehídica que genera acetato. El acetato se transforma
finalmente a acetil-coenzima A que se incorpora al ciclo del ácido tricarboxílico.
Toxicidad del acetaldehído.
El acetaldehido, metabolito del etanol, es una molécula altamente reactiva, dada
su naturaleza electrofílica. Por lo tanto, su acumulación en el organismo después
de la ingestión del etanol puede producir alteraciones patológicas (Lauterberg,
1988).
La concentración del acetaldehido en los tejidos y en la circulación sistémica
después de una ingestión aguda de etanol es baja, aún en el higado; pero en los
casos de ingestión crónica se incrementa la Concentración de este tóxico (Lieber,
1988), lo que indica que podria existir un aumento en la producción de
acetaldehido a partir de la oxidación del etanol Ó bien, por una disminución del
catabolismo del acetaldehido.
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El acetaldehido induce cambios mitocondriales que incluyen daño estructural,
fragilidad y alteración en las membranas. In vitro, se ha demostrado que el
acetaldehido tiene varios efectos sobre el metabolismo mitocondrial, inhibe el sitio
I de la fosforilación oxidativa y por lo tanto, disminuye el consumo de oxígeno.
Las mitocondrias hepáticas son más susceptibles a la acción del acetaldehído
después de una ingestión crónica de etanol (Rubin, 1974).
Enfermedad Hepática Alcohólica.
En los últimos años ha habido grandes avances en la comprensión del mecanismo
por el que se produce el daño hepático debido a la ingestión del alcohol
(Friedman, 1999; Tuma, 1998). Se considera que es un proceso complejo, en el
cual están involucrados distintos tipos celulares hepáticos que incluyen a los
hepatocitos, las células de Kupffer, las células estelares, células endoteliales
además de monocitos y neutrófilos. Los cambios en la abundancia y función de
estas células, asi como de sus matrices dentro de la región perisinusoidal del
higado, constituyen la patologia crónica progresiva. El entendimiento de los
cambios en las funciones celulares requieren de una interpretación cuidadosa del
modo como las señales intercelulares provocan cambios acumulativos lentos que
llevan de las interacciones normales a las patológicas (Dong, 1998; Kawada,
1998; Pinzani, 1998).
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En los últimos años han surgido nuevas ideas acerca de las complejas
interacciones celulares, de manera que en la actualidad se considera que algunas
de las interacciones tienen una retroalimentación positiva que desestabiliza la red
de señales celulares normales, mientras que otras tienen el efecto de tratar de
mantener el balance homeostático normal. Más aún, algunas de las interacciones
cambian la estructura y función del tejido de manera reversible, mientras que otras
producen efectos dificiles de revertir.
Es conveniente señalar ahora que la desestabilización de la red normal de
señales celulares se debe, en parte, a cambios en los patrones de expresión de
citocinas. Estas moléculas son mediadores de la comunicación celular de bajo
peso molecular (~30Kd) y se encargan de mantener la homeostasis fisiológica en
el organismo sano; sin embargo, se ha demostrado que modulan muchas de las
manifestaciones sistémicas de la ALD y ciertos aspectos del proceso de daño y
reparación hepática.
Fibrosis Hepática.
La fibrosis hepática es una consecuencia de algunas enfermedades crónicas que
se presentan en el hígado (Matsuoka, 1988). En la actualidad se sabe que la
fibrosis es el resultado de un proceso múltiple de reparación del daño al higado,
que conlleva a la acumulación de ECM en detrimento de la estructura y función
celular (Bisell, 1997).
X
Los factores etiológicos que producen daño hepático pueden ser enfermedades
debidas a parásitos, infecciones virales, enfermedades autoinmunes, daño tóxico
por agentes químicos como el haloetano y el acetaminofen (Iredale, 1997), o bien,
por la ingesta crónica de alcohol.
Una de las características principales del daño crónico hepático es la alteración en
los patrones de mediadores de comunicación celular. Trabajos recientes
demuestran que las señales celulares y moleculares que los diferentes tipos
celulares hepáticos envían como resultado del daño producido por el etanol
inciden sobre las células estelares hepáticas. Como resultado de este proceso,
estas células sufren una transformación fenotípica, de células de reserva de
retinoides a un fenotipo productor de ECM, y llegan a ser las principales
responsables de la fibrogénesis (Gressner, 1995).
Se considera que una célula estelar se ha transdiferenciado a MFB cuando
presenta las siguientes características: 1 .- su proliferación se ve estimulada; 2.- la
expresión de los genes de varios componentes de la matriz extracelular está
amplificada; 3.- adquiere contractilidad debida a la expresión de filamentos de
alfa actina característicos de músculo; y finalmente, 4.- debe expresar un amplio
espectro de citocinas.
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Modelo de Activación de las Células Estelares Hepáticas.
El conocimiento presente acerca de las interacciones moleculares y celulares que
se presentan en el datio hepático se ha integrado en un modelo de activación de
las HSC. este modelo se conoce como mecanismo de cascada de tres pasos y
fue propuesto por el grupo del Dr. Gressner en Alemania ( Gressner A. y Bachem
M., 1995).
En la fase preinflamatoria se produce un daño a los hepatocitos, y como resultado
de este daño se liberan agentes mitogénicos que actúan sobre las células
estelares.
En una fase inflamatoria subsecuente (fase ll), citocinas de las KC (macrófagos
residentes del hígado), de plaquetas y de hepatocitos dañados, estimulan a las
HSC a proliferar y transformarse en MFB. La activación de las KC residentes y de
los monocitos invasores es principalmente iniciada por la fagocitosis de los
hepatocitos dañados. Esta activación de las KC induce un nuevo daño a los
hepatocitos (necrosis, apoptosis) vía la liberación de proteasas, citocinas tóxicas
(TNFu), y radicales de oxígeno (Orrenius S.. 1997 y Amin A.,1997).
En esta fase inflamatoria, se ha propuesto a la citocina TGFp 1 como prototipo de
citocina fibrogénica ya que acelera la transdiferenciación de las HSC a MFB y
puede promover la apoptosis de los hepatocitos, lo cual puede a su vez perpetuar
el proceso fibrogénico.
Los MFB son estimulados durante la fase post-inflamatoria (fase Ill) vía una
estimulación autócrina generada por las citocinas expresadas y secretadas por los
MFB, esto ocurre debido a que además se sintetizan receptores para las mismas
citocinas que se están expresando. De esta manera los MFB pueden auto
perpetuar la fibrogénesis incluso después de que la estimulación por el agente
causal inicial ha terminado.
Finalmente, se ha propuesto que la matriz extracelular generada por lo MFB
puede modular la actividad de citocinas secretadas por la formación de zonas de
almacenamiento extracelular de dichas citocinas.
El Factor de Necrosis Tumoral Alfa.
En los últimos años, se ha realizado un gran esfuerzo para clarificar los
mecanismos de fibrogénesis por medio de la identificación de la naturaleza,
propiedades y origen de los mediadores fibrogénicos y mitogénicos que estimulan
la activación de las células estelares hepáticas. Estos trabajos han permitido
conocer algunas de las citocinas importantes en este proceso, como el TGFD y el
TNFa; este Último, ha sido propuesto como el factor inicial en la cascada de
señalización en el desarrollo del daño hepático (Bedosa, 1995;lgnotz, 1986;
Inuzuka, 1995).
El TNFa (catenina) consiste de dos péptidos diferentes con múltiples actividades
inmunológicas locales e inflamatorias sistémicas (Garcia, 1997).
El TNFa tiene efectos antitóxicos, vasculares, antiocluyentes, pirogénicos y
antitumorales in vivo. Por otro lado, el TNFa incrementa la adhesividad de las
células endoteliales y neutrófilos (Thomson, 1994; Remick, 1987; Beutler, 1987).
En cuanto a la actividad biológica del TNFa en el higado, esta citocina aumenta la
expresión de las proteinas de fase aguda en hepatocitos humanos in vitro; asi
mismo, aumenta la cantidad de proteinas de fase aguda en suero y reduce la
biosíntesis de albúmina (Thomson, 1994; Nagakaza, 1990). El TNFa también
estimula la biosintesis de lipidos, y la degradación de aminoácidos por los
hepatocitos. Todos estos efectos del TNFa pueden ser potenciados por otras
citocinas como las interleucinas 1 y 6.
Estudios in vivo han demostrado un incremento significativo en los niveles séricos
y número de receptores tisulares del TNFa en pacientes con daño hepático agudo
Fig. 10. En esta imagen se muestran los productos de PCR para TNF alfa en células HepG2
tratadas con acetaldehido 175 pM durante 24 horas. En los carriles 1 y 2 se muestran los productos
obtenidos para beta 2 microglobulina a 53 y 55’C de temperatura de hibridación respectivamente;
en el carril 3 se muestra el producto de amplificación de TNF actuando sobre el plasmido pQA-1. En
los carriles 4 a 9 se muestran los productos cuando la temperatura de hibridación fue de 53°C con
diferentes concentraciones de MgCI, (0.2, 0.5. 1, 2, 3, y 4 pl de la solución estándar por reacción).
En los carriles 10 a 13 se muestran los productos de PCR cuando la temperatura de hibridación fue
de 55% Los productos de amplificación que se obtuvieron a la temperatura de hibridación de 57OC
no se presentan ya que son similares a los aqui mostrados. Se setialan del lado izquierdo de la
imagen los amplicones obtenidos.
Puede observarse que la calidad de los productos no es satisfactoria. Se
muestran en el mismo gel algunos productos de amplificación obtenidos con los
oligos de p 2 microglobulina así como con los oligos de TNF actuando sobre el
plásmido pQA-I. De estos resultados podemos afirmar que la calidad del RNA
era buena ya que se logra la amplificación del RNA mensajero de 2
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microglobulina y, por otro lado, las condiciones empleadas son propicias a la
amplificación de TNF a ya que el plásmido amplifica satisfactoriamente.
Otra variación que se intentó para mejorar el desempetio de la amplificación fue
un proceso de desnaturalización del RNA antes de llevar a cabo la reacción de
RT-PCR, ya que consideramos que el problema podía deberse a que el RNA
estuviera plegado por lo que se generarían diferentes productos de amplificación
dependiendo del estado de plegamiento. Para llevar a cabo la desnaturalización
del RNA se emplearon dos estrategias, por un lado se calentó el RNA a 75 OC
durante 5 minutos seguidos los cuales se colocó el RNA en hielo durante 5
minutos; y por otro lado, se empleó DTT 1 pM como agente desnaturalizante, este
se adicionó directamente a la mezcla de reacción de la RT.
En la figura 11 se muestra uno de los geles que se realizaron para verificar la
calidad de los productos de PCR y como puede observarse no hubo amplificación
alguna; por ello podemos afirmar que los procesos de desnaturalización
combinados con las variantes ya empleadas no son adecuados para mejorar la
calidad de los productos de reacción.
Por las pruebas antes realizadas solo nos restaba pensar que los oligos
empleados para la amplificación del TNF a no eran óptimos para los tipos
celulares empleados a pesar de que estos se construyeron para reconocer una
región altamente conservada de la secuencia de RNA mensajero del TNFw, para
verificar que las modificaciones empleadas en el presente estudio hubieran sido
las adecuadas se emplearon oligos para la amplificación de TGFP, IL 1 p e IL 8.
Se realizaron las reacciones de RT-PCR partiendo del RNA extraído de las células
sometidas a los tratamientos con acetaldehído 175 pM y de los diferentes
tratamientos realizados para este estudio.
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Las reacciones se realizaron utilizando las diferentes condiciones para
temperatura de hibridación y concentración de MgCI,. Algunos de los resultados
se muestran en la figura 12 en los que se muestran los productos de PCR para la
amplificación de TGFp, IL 8 e IL 1 p respectivamente.
Carril MP 1 2 3 4 5 6 7 8
MgCI, DTT CdiiFrío
0.5 I 2 3 0.5 1 2 3 * * * *
* * * *
Fig 11.Productos de RT-PCR de muestras de RNA sometido a un proceso de desnaturalización. En
esta figura pueden observarse los productos de amplificación de TNF alfa en células estelares. En
los primeros cuatro carriles se colocaron los productos de amplificación de las células estelares
tratadas con acetaldehido 175 pM 24 horas, con un tratamiento previo de desnaturalización con
DTT, la reacción de PCR se llevó a cabo con las concentraciones de MgCI, señaladas. En los
carriles 5 al 8 se muestran los productos de amplificación células estelares con un pre tratamiento
de calor/ frío (75T durante 5 minutos y hielo durante 5 minutos).El resultado que se obtuvo con
células HepG2 no se muestra ya que tampoco hubo amplificación de ningún producto.
Como puede observarse en la los tres casos se encontraron las condiciones
adecuadas para la amplificación de las citocinas elegidas dentro del rango de
variaciones que elegimos para este estudio. Las variaciones en la amplificación
que se observan pueden deberse a la expresión diferencial de los RNA’s
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mensajeros en los diferentes tratamientos. Con esto podemos corroborar que los
rangos de variación de concentraciones de MgCI, y temperaturas de hibridación
son las adecuadas para la amplificación de varias citocinas por la técnica de RT-
PCR.
Ahora bien, dado que no se logró la amplificación del RNA mensajero del TNF a
en las diferentes condiciones podemos suponer que el problema se debe a que
los oligos empleados (uno o ambos) no reconocen específicamente el RNA
mensajero del TNF, por ello se observan en la mayoría de los casos varios
productos inespecíficos. La afinidad con que se dan estas interacciones es lo
suficientemente fuerte para que a pesar de emplear diferentes condiciones de
astringencia no fuera posible eliminar la amplificación de estos productos.
Lo que correspondería hacer sería cambiar los oligos, sin embargo debe
recordarse que los oligos se construyeron sobre la base del plásmido pQA-1, cuyo
empleo es indispensable para poder realizar los ensayos de RT-PCR cuantitativo.
Es decir, de modificar los oligos el ensayo perdería su calidad de cuantitativo. En
la actualidad se están montando técnicas de RT-PCR semicuantitativo y se están
realizando los ensayos con un par de oligos diferentes que fueron construidos a
partir de secuencias registradas para células de origen murino y que fueron
amablemente proporcionados por el Dr. Rogelio Hernández Pando del
Departamento de Patología Experimental del Instituto Nacional de Nutrición
Salvador Zubirán.
Sin embargo, los resultados preliminares indican que dicha secuencia no
reconoce los RNA mensajeros del TNFa de ninguno de los tipos celulares
empleados en este estudio; esperábamos que con estos nuevos oligos pudiera
llevarse a cabo la amplificación del TNFa de las células estelares ya que estas
fueron aisladas de rata y, por lo tanto, esperábamos que existiera una alta
homología entre los RNAm de ambas especies.
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A. TCFg
B. IL 6
C. IL 8
Carril
200pb e
Carril
260pb d
247vb I
MP I 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0
MP I 2 3 4 5 6 7 8 9 I O II 1213 14
Fig 12. Productos de RT-PCR de tres citocinas diferentes con RNA experimentales. A) En esta
figura se muestran los productos de amplificación de TGF p. En los carriles 1 a 5 se colocaron los
productos obtenidos de células HepG2 en el siguiente orden: carril 1, control; carril 2 control
negativo; carril 3, tratamiento con etanol; carril 4, tratamiento con acetaldehido y, carril 5,
tratamiento con etanol y Pentoxifilina, en los carriles 6 a 10 se muestran los productos de
amplificación obtenidos de células estelares; las muestras se colocaron de la siguiente manera:
carril 6, control; carril 7, control negativo; carril 8. tratamiento con medio condicionado con etanol;
carril 9, tratamiento con el medio condicionado con acetaldehído; carril 10 tratamiento con medio
condicionado con etanol y pentoxifilina. B) En esta figura se muestran los productos de
amplificación de IL6 las muestras se colocaron de la siguiente manera: carril 1, control HepG2;
carril 2. control negativo; carril 3, Células HepG2 tratadas con acetaldehído; carril 4, células HepG2
tratadas con etanol; carril 5, control de células estelares; carriles 6 y 7, células estelares tratadas
con medios condicionados de etanol; carriles 8 y 9. células estelares tratadas con medios
condicionados con acetaldehido; carriles 10 y 11, células estelares con medios condicionados con
etanol y pentoxifilina; carriles 12 y 13, células estelares con medios condicionados con acetaldehido
y pentoxifilina; y finalmente, carril 14, control de células estelares. En la figura 12 C) Se muestran
los productos de amplificación de IL 8, las muestras se colocaron como se mencionó anteriormente
para'lL 6 hasta el carril 13.
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Conclusiones y Metas alcanzadas.
En el calendario propuesto en el proyecto inicial de servicio social se planificaron
las siguientes actividades; por un lado, desarrollar los experimentos, montar la
técnica de extracción del RNA por el método del Trizol; el montaje de la técnica
de RT-PCR para la amplificación del RNA de p2 microglobulina, y el montaje de la
técnica de RT-PCR para la amplificación de TNFn para finalmente realizar los
análisis competitivos. De estas metas planteadas se alcanzaron todas ellas salvo
el montaje de la RT-PCR de TNFa, en la que no se tuvo éxito a pesar de que se
emplearon dos tipos diferentes de oligos (humanos y rnurinos). Como se
mencionó con anterioridad la técnica de RT-PCR fue montada para diferentes
citocinas así como para P2pglobulina; sin embargo, los oligos para TNFa parecen
no ser los más adecuados al modelo de estudio.
El plásmido pQA-I y los oligos empleados durante el presente trabajo fueron
construidos en base a secuencias descritas para humanos; así pues,
esperábamos que dichos oligos tuvieran una alta homología con el RNA del TNF
n de las células HepG2 ya que estas son de origen humano. Por otro lado, las
células estelares fueron aisladas de rata; sin embargo, decidimos emplear los
mismos oligos ya que, a pesar de sus diferentes orígenes, ambos tipos celulares
presentan homologías.
Ahora bien, la amplificación del TNFa no pudo llevarse a cabo de manera eficiente
para ninguno de los dos tipos celulares empleados ya que los oligos utilizados
resultaron no tener una especificidad suficientemente alta por el RNAm del TNFn,
podemos afirmar esto ya que no se logró la eliminación de productos
inespecíficos a pesar de todas las modificaciones que se hicieron a la técnica
original.
Por otro lado, para confirmar que las modificaciones realizadas fueran las
pertinentes, se realizaron los montajes de la técnica de RT-PCR para otras
citocinas que no fueron contempladas en el proyecto inicial. Así pues, como parte
del trabajo realizado para este proyecto se logró la amplificación de TGF P I , y de
las interleucinas 1 y 8 de manera satisfactoria.
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