UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE LABORATÓRIO DE TECNOLOGIA FARMACÊUTICA – LFT PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS Rossana Miranda Pessoa Antunes AÇÃO ANTIMICROBIANA E ANTIPLASMIDIAL DO LAPACHOL E SEUS DERIVADOS SOBRE BACTÉRIAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES João Pessoa – PB 2007
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Rossana Miranda Pessoa Antuneslivros01.livrosgratis.com.br/cp100823.pdf · Avaliação da CIM e da CBM do lapachol e derivados frente a microrganismos ...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
LABORATÓRIO DE TECNOLOGIA FARMACÊUTICA – LFT
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS
Rossana Miranda Pessoa Antunes
AÇÃO ANTIMICROBIANA E ANTIPLASMIDIAL DO LAPACHOL E SEUS DERIVADOS SOBRE BACTÉRIAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES
João Pessoa – PB 2007
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AÇÃO ANTIMICROBIANA E ANTIPLASMIDIAL DO LAPACHOL E SEUS
DERIVADOS SOBRE BACTÉRIAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES
Rossana Miranda Pessoa Antunes
Orientadores:
Profª. Drª. Edeltrudes de Oliveira Lima
Prof. Dr. José Maria Barbosa Filho
Co-Orientadores:
Profª. Drª. Maria do Socorro Vieira Pereira
Prof° Dr° Celso Amorim Câmara
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação
em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do
Centro de Ciências da Saúde – Laboratório de
Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal
da Paraíba, em cumprimento às exigências para
obtenção do título de Doutor em Produtos Naturais e
Sintéticos Bioativos (Farmacologia).
- II -
AÇÃO ANTIMICROBIANA E ANTIPLASMIDIAL DO LAPACHOL E SEUSDERIVADOS SOBRE BACTÉRIAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES
Rossana Miranda Pessoa Antunes
Tese submetida ao corpo docente do Programa de Doutorado em Produtos
Naturais e Sintéticos Bioativos/LTF da Universidade Federal da Paraíba. Como parte
dos requisitos necessários à obtenção do seu grau de Doutora.
Aprovada por:
_______________________________________Profª. Drª. Edeltrudes de Oliveira Lima
Orientadora
_______________________________________Profª. Drª. Lindomar de Farias Belém
_______________________________________Profº Dr. Evandro Leite de Souza
_______________________________________Profª. Drª. Margareth de Fátima F. M. Diniz
_______________________________________Profº Dr. José Pinto Siqueira Júnior
- III -
D E D I C A T Ó R I A
À Deus
A meus pais e irmãos
A meu esposo Thúlio e aos meus filhos Beatriz e Daniel grandes companheiros.
- IV -
A G R A D E C I M E N T O S
A Deus, por ter me guiado nesta caminhada, me iluminado para eu concluir este
estudo.
Aos meus filhos, Beatriz e Daniel, pela compreensão das ausências, nas horas
necessárias.
Ao meu marido, Thúlio Antunes de Arruda, pela grande ajuda na elaboração deste
trabalho.
Aos meus familiares e amigos, que me incentivaram.
À professora Edeltrudes de Oliveira Lima, obrigada pelos seus valiosos
ensinamentos e correções que tanto enriqueceram esta tese.
Ao professor José Maria Barbosa Filho, pela acolhida inicial, pelos seus
ensinamentos e disponibilidade sempre presentes em todos os momentos.
Ao professor Celso Amorim Câmara, pelas substâncias alvo desta pesquisa e pelas
suas valiosas correções.
À professora Maria do Socorro Vieira Pereira, pela contribuição, muito obrigada.
À professora Bagnólia Araújo Costa, coordenadora do Programa de Qualificação
Institucional – PQI/ Universidade Federal da Paraíba-UFPB/ Laboratório de
Tecnologia Farmacêutica – LTF, agradeço pela disponibilidade e pelos seus
ensinamentos enquanto docente do programa de doutorado.
À professora Lindomar de Farias Belém, coordenadora do PQI/ Universidade
Estadual da paraíba – UEPB, por estar trilhando, com competência, este caminho.
À amiga Profª Raïssa Mayer Ramalho Catão, companheira do curso de doutorado,
com a qual trabalhei nesta pesquisa, agradeço pelos ensinamentos na área de
microbiologia, sem os quais teria sido mais difícil chegar até aqui.
Aos professores, amigos e companheiros do PQI/UEPB, com os quais compartilhei
esta importante experiência de estudo, o meu agradecimento.
- V -
A todos os demais professores, colegas e funcionários do programa de doutorado do
LTF.
A todos os professores e funcionários do Laboratório de Análises Clínicas – LAC/
UEPB, onde funciona o laboratório de pesquisa em microbiologia do PQI/UEPB,
meu agradecimento.
Ao Laboratório DIAGNOSE, na pessoa da profª Raïssa Mayer Ramalho Catão.
Aos professores e funcionários da Pró-Reitoria de Pós-graduação da UEPB.
À CAPES, pela bolsa de estudos a mim concedida, importante apoio financeiro,
muito obrigada.
- VI -
S U M Á R I O
LISTA DE FIGURAS............................................................................................... VIII LISTA DE TABELAS ................................................................................................ X
LISTA DE QUADROS............................................................................................... XI SIGLAS E ABREVIATURAS ................................................................................... XII RESUMO................................................................................................................. XIII ABSTRACT.............................................................................................................XIV 1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 15 2. OBJETIVOS......................................................................................................... 21
AMH - Agar Mueller-Hinton AS - Agar Sangue ASD - Agar Sabourand Dextrose ATCC - American Type Culture Collection BAB - Blood Agar base BHI - Broth heart infusion BHI - Brain Heart Infusion BORSA - Boderline oxacilin – resistant S. aureus CBM - Concentração bactericida mínima CFM - Concentração fungicida mínima CIM - Concentração inibitória mínima CMH - Caldo Mueller Hinton DAEC - Escherichia coli que adere difusamente DMSO - Dimetil sulfórido EAggEC - Escherichia coli enteroagressiva EHEC - Escherichia coli enterohemorrágica EPEC - Escherichia coli enteropatogênica clássica ETEC - Escherichia coli enterotoxigênica LAFEP - Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco MAS - Agar Manitol Salgado MRSA - Staphylococcus aureus resistente a meticilina MSSA - Staphylococcus aureus sensível a meticilina NCCLS - National Committee for Chemical Laboratory Standands OMS - Organização Mundial de Saúde ORSA - Staphylococcus aureus resistente a oxacilina PCR - Reação em cadeia da polimerase PFGE - Pulsed-field gel eletrophoresis TSA - Teste de sensibilidade a antibióticos VRE - Enterococcus faecium vancomicina resistente
- XIII -
R E S U M O
ANTUNES, R. M. P. Ação antimicrobiana e antiplasmidial do lapachol e seus derivados sobre bactérias e fungos leveduriformes. [Tese-Doutorado], Programa de Pós-graduação em Sintéticos Bioativos/CCS/LTF, João Pessoa (PB): UFPB, Universidade Federal da Paraíba, 2007. Diante da problemática da resistência microbiana, as pesquisas apontam para a descoberta de novos antibióticos que sejam eficazes ante os patógenos emergentes. Neste contexto, estudou-se a ação antimicrobiana e antiplasmidial do lapachol e seus derivados semisintéticos e nitrogenados frente a S.aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, P.aeruginosa ATCC 27853, C.albicans ATCC 76643, 08 cepas de S. aureus de origem animal, 10 cepas de S. aureus de origem ambulatorial, 01 cepa MRSA ambulatorial, 02 cepas de S. aureus de origerm ambiental, 10 cepas de E. coli de origem ambulatorial e 06 cepas de C. albicans de origem ambulatorial. A Concentração inibitória mínima (CIM), a Concentração bactericida mínima (CBM) e a curva de morte foram realizadas para os microrganismos ATCC. Um estudo de estrutura-atividade frente às cepas de S. aureus também foi realizado bem como uma investigação sobre a atividade curagênica das bactérias com perfil plasmidial conhecido. Os resultados estimulam o aprofundamento das pesquisas em microbiologia como também para outras atividades biológicas dessas substâncias obtidas a partir de modificações estruturais da molécula do lapachol por semi-síntese, sendo elas as mais ativas frente à S. aureus ATCC, inclusive MRSA. As curvas de morte indicam que estes produtos têm ação bacteriostática. Os compostos -lapachona e nor-lapachona apresentaram menor CIM para todos os microrganismos testados podendo ser os mais eficazes da série. As mudanças na estrutura química do lapachol aumentaram consideravelmente sua atividade antimicrobiana diante de S. aureus. O produto -lapachona apresentou ação simultânea para a eliminação das marcas de resistência para penicilina e a eritromicina. O potencial promissor dessas substâncias as colocam como alvo de interesse farmacológico e químicos sintéticos devido à variedade de atividades biológicas que essas naftoquinonas apresentam. Palavras-chaves: Atividade antimicrobiana, atividade antiplasmidial, fitoconstituintes, produtos de síntese, lapachol e derivados
- XIV -
A B S T R A C T
ANTUNES, R. M. P. Ação antimicrobiana e antiplasmidial do lapachol e seus derivados sobre bactérias e fungos leveduriformes. [Tese-Doutorado], Programa de Pós-graduação em Sintéticos Bioativos/CCS/LTF, João Pessoa (PB): UFPB, Universidade Federal da Paraíba, 2007. Once there is the problematic with microbial resistance, the researches point to the use of new antibiotics that are efficient with the emerging pathogens. In this context, it were studied the antimicrobial and antiplasmidial actions of lapachol and its semi synthetic and nitrogenated derivates in S.aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, P.aeruginosa ATCC 27853, C.albicans ATCC 76643, 08 animal originated strains of S. aureus, 10 ambulatorial originated strains of S. aureus, 01 ambulatorial MRSA strain, 02 S. aureus originated from the ambient, 10 strains of E. coli originated from ambulatory and 06 strains of C. albicans originated from ambulatory. The MIC, the MBC and the death curve were done with the ATCC microorganisms. A study structure-activity with the strains of S. aureus was done and also an investigation of cure activity in bacteria with plasmidial profile known. The results stimulate the deepening of researches in microbiology and also to other biological activities of these substances obtained by structural modifications of molecule of lapachol by semi synthesis, being those more active in S. aureus ATCC, including MRSA. The death curves indicate that these products have bacteriostatic action. -lapachone and nor-lapachone presented lower MIC to all microorganisms tested, and can be the most potent in the series. The changes in chemical structure of lapachol enhanced considerably its antimicrobial activity with S. aureus. The product lapachone presented simultaneous action to elimination of resistance marks to penicillin and eritromicine. The promising potential of these substances make them a target of pharmacological and synthetic chemical interest due to the variety of biological activities that these naphtoquinones present. Key words: antimicrobial activity, antiplasmidial activity, phytoconstitutes, synthesis products, lapachol and derivates.
I N T R O D U Ç Ã O
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1. INTRODUÇÃO
Com a notável descoberta dos medicamentos de síntese como os antibióticos
e antinflamatórios e com o avanço da indústria farmacêutica, os produtos naturais
caíram em desuso. Entretanto, o aparecimento de numerosos microrganismos
resistentes às drogas, os altos níveis de resíduos tóxicos nos alimentos, aliados ao
desequilíbrio ecológico causado pelo homem, fizeram com que se buscassem
alternativas compatíveis com o modo de vida humano, nas mais diversas facetas do
bem-estar bio-psico-social. A resistência aos antimicrobianos tem se tornado um fato
corriqueiro desde o início da era dos antibióticos quando a descoberta de potentes
agentes antimicrobianos foi considerada como uma das grandes contribuições da
medicina no Séc. XX (MOELLERING Jr., 2000).
Desde o início dos anos 80, o número de antimicrobianos em fase de
desenvolvimento diminuiu consideravelmente. Ao mesmo tempo, a resistência aos
antimicrobianos cresce de forma imensurável. Nos anos 70 e 80, as bactérias Gram-
negativas resistentes eram consideradas como o principal flagelo, entretanto no final
do Séc. XX, as bactérias Gram-positivas, resistentes, têm se tornado mais
importantes. Os microrganismos estão cada vez mais desenvolvendo uma série de
novos mecanismos de resistência. A resistência microbiana resulta em crescente
morbidade e mortalidade, como também eleva os custos de saúde e o
desenvolvimento de qualquer novo antimicrobiano vem sendo acompanhado pelo
aparecimento da resistência bacteriana. Segundo MOELLERING Jr. (2000);
MOREIRA (2004), este fato resulta de vários fatores, tais como: o uso indiscriminado
de antimicrobianos, o uso crescente de procedimentos invasivos, em grande número
de hospedeiros susceptíveis e falhas no controle de infecções, ocasionando
aumento da transmissão de organismos resistentes, principalmente em ambientes
hospitalares e em pacientes imunocomprometidos.
Vários são os mecanismos pelos quais os microrganismos podem escapar
dos efeitos dos antimicrobianos, entre eles incluem-se: alteração da estrutura
molecular de antimicrobianos ou produção de enzimas que inativam a droga a
exemplo das β-lactamases ou enzimas modificadoras de aminoglicosídeos,
alteração das proteínas ligantes da penicilina ou outros pontos-alvo nas paredes das
células, alvos modificados da DNA-girase, mutações de permeabilidade e
modificações ribossômicas (FILE Jr., 2000).
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O uso cada vez maior de antimicrobianos na prática clínica, assim como
também a enorme quantidade de antibióticos utilizados na agricultura, criação de
peixes e criação de animais, possibilitam condições favoráveis para a seleção de
O lapachol é uma hidroxi-naftoquinona substituída, [2 – hidroxi – 3 – (3 – metil
– 2 butemil) – 1,4 – naftalenodina]. Os estudos químicos foram desenvolvidos
inicialmente por S.C. Hooker em 1892 e 1896. Além do lapachol foram isolados na
espécie Tabebuia avellanedae Lor. ex giseb (Bignoniaceae) e em outras espécies,
seis naftoquinonas e nove antraquinonas. A α-lapachona e β-lapachona estão
citadas no primeiro grupo. A presença de filoquinona (vitamina K) foi registrada
apenas nas folhas desta planta. As substâncias mais estudadas nesta espécie são o
lapachol, os dois isômeros (derivados éter metílico do lapachol) α-lapachona e β-
lapachona e a xiloidona (desidro – α – lapachona), todos biologicamente ativos
(FONSECA et al., 2003; Lyra et al., 2004)
lapachol α-lapachona
β-lapachona xiloidona
Figura 8. Estruturas químicas do lapachol e seus derivados semi-sintéticos
O lapachol pode ser obtido por vários métodos de extração, sempre se
baseando na sua solubilidade em solvente orgânico e do seu sal em meio aquoso
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alcalino, gerando, respectivamente, soluções amarelas e vermelhas. Os métodos de
extração desenvolvidos por Gonçalves et al., 1962, consistem na extração do
lapachol da serragem do cerne de Tabebuia spp. (pau d’arco roxo) com benzeno ou
com acetona. A forma de extração do lapachol mais empregada foi descrita por
Paterno em 1882. Este método propicia a obtenção de 80g de lapachol puro,
cristalizado para cada 1 kg de serragem do cerne do vegetal. Os principais
derivados do lapachol podem ser obtidos da seguinte forma: α–lapachona e β-
lapachona podem ser obtidas a partir do lapachol. A xiloidona pode ser obtida
quimicamente pelo método que consiste em refluxar o lapachol, e por um segundo
método que consiste em refluxar o lapachol em anidrido acético e piridina, seguindo-
se de uma hidrólise e oxidação lenta. O lapachol também pode ser transformado em
α–lapachona, β–lapachona e xiloidona por via seca (calor); e a xiloidona aquecida é
transformada em α–lapachona e β–lapachona. Fieser propôs uma rota para a
obtenção sintética do lapachol em 1927, seguido por Hooker, em 1936 e Pettit e
Houghton, em 1971 (FONSECA; BRAGA; SANTANA, 2003).
Em relação as propriedades físico-quimicas, o lapachol tem a forma de
cristais prismáticos ou folhas amarelas, de peso molecular 242,26, sendo sua
formula química C15H14O3, com ponto de fusão 139,5 – 140,2ºC. É bastante solúvel
em acetona, etanol, metanol, clorofórmio, benzeno e ácido acético; solúvel em éter
etílico, insolúvel em água a frio, sendo ligeiramente solúvel em água em ebulição
promovendo uma coloração alaranjada. A solução dissolve-se prontamente em
soluções alcalinas; na presença de hidróxido de sódio, forma um sal sódico que
confere às soluções aquosas uma coloração vermelha brilhante. Esta forma é
extremamente ativa como corante (FONSECA; BRAGA; SANTANA, 2003).
Derivados nitrogenados do lapachol
Atualmente, a exploração da reatividade química da cadeia lateral do
lapachol, tem sido realizada para aumentar a atividade biológica, a exemplo da
susbstituição da hidroxila do lapachol por aminas que vem sendo um dos alvos de
interesse dos pesquisadores. As substituições diretas feitas com simples adição de
aminas secundárias apropriadas à temperatura ambiente tem bons rendimentos,
resultam em um aumento da atividade citotóxica em relação ao lapachol. Estas
substâncias são identificadas neste trabalho com os códigos L-01 a L-08.
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Figura 9. Formação de enamina a partir do lapachol (BARBOSA, 2006)
Atividades Biológicas
Atividade Anticarcinogênica - Vários estudos mostraram ser positiva a
atividade anticancerígena do lapachol. Atualmente no Brasil o lapachol é
comercializado sob a forma de cápsulas gelatinosas indicadas para pacientes
portadores de várias neoplasias malignas, como carcinoma epidermóide do colo
uterino, carcinoma epidermóide do assoalho da boca, adenocarcinoma do aparelho
digestivo, além de auxiliar na quimioterapia (FONSECA; BRAGA; SANTANA, 2003).
Os primeiros estudos antineoplásicos para o lapachol foram desenvolvidos
por Hatwell em 1967. Estes estudos mostraram uma alta atividade antineoplásica do
lapachol sobre o sarcoma de Yoshida (86% de inibição). Posteriormente, foram
pesquisadas as suas ações sobre o carcinoma de Walker 256 e contra o
linfosarcoma de Murphy Sturm. O sal sódico do lapachol é ativo contra leucemia
L1210 e o lapachol também mostrou atividade contra carcinoma ascitíco de Ehrlich.
Sabe-se que a concentração plasmática do lapachol necessária para atividade
contra alguns tipos de câncer (ex: carcinoma de Walker256) é de 30 a 25 µg/mg,
mas que nunca foi alcançada devido o surgimento de efeitos tóxicos (FONSECA;
BRAGA; SANTANA, 2003).
Objetivando o estudo apropriado da relação entre a estrutura química do
lapachol e sua atividade farmacológica, alguns autores observaram que a
substituição dos grupamentos metil por cloro ou bromo, resulta em compostos com
muito boa atividade anticancerígena. Ao contrário de outras drogas anticâncer do
tipo benzantraquinona, que estimulam a peroxidação lipídica dependente de
NADPH: citocromomo P450 redutase microssomal, o lapachol inibe por um
mecanismo potente e desconhecido. O lapachol, como um antagonista da vitamina
K (efeito hipoprotrobinêmico), deve usar todas as reações vitamina K-dependentes,
incluindo a interação 6as6 – AX1 e então bloquear as transduções dos sinais que
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estimulam a produção em tumores onde o oncogene AX1 é expresso. O lapachol
pode ser um agente anticâncer oncogene – especifico. Isso reacende a possibilidade
do uso do lapachol como agente anticâncer (FONSECA; BRAGA; SANTANA, 2003).
Atividade antiinflamatória
Extratos hidroalcoóticos do líber de Tabebuia spp. foram utilizados para o
tratamento de cervicites e cervico-vaginites crônicas com ação antinfamatória e
cicatrizante. Também foram utilizados no tratamento de úlceras de perna, bursites,
tendinites, sinusites e otites agudas e crônicas. Formulações tópicas do lapachol
mantém suas propriedades antiinflamatórias e analgésicas (FONSECA; BRAGA;
SANTANA, 2003; LIRA et al., 2004).
Atividade antimicrobiana
Desde os primeiros trabalhos sobre o lapachol que sua atividade
antimicrobiana é estudada, observando-se uma predominância contra certos
microrganismos Gram-positivos e ácidos resistentes e uma baixa atuação contra
Gram-negativos, exceto contra o gênero Brucella. Verificou-se também que, a
medida que se eleva o grau de pureza do lapachol, diminui-se progressivamente a
sua atividade antimicrobiana, o que pode ser explicado pelo fato de que outras
naftoquinonas extraídas junto com o lapachol, também possuem essa atividade. Nos
testes de atividade fungicida observou-se que a β-lapachona tem uma maior
eficiência do que o lapachol. No total, tanto a β-lapachona quanto o lapachol foram
mais ativos que o cetoconazol. Também tem sido estudada sua atividade antibiótica
contra vírus e atividade tripanosomicida, antimalárica e moluscicida(FONSECA;
BRAGA; SANTANA, 2003; DA SILVA et al., 2003).
Atividade inibidora de sistemas celulares reparadores
Nesse processo as quinonas naturais, cujo principal destaque das
naftoquinonas é o lapachol, atuam de diferentes formas. Como exemplo, destaca-se
o estresse oxidativo que provocam ao induzirem a formação deletéria endógena de
espécies bioativas derivadas do oxigênio (O2-, OH e H2O2) como ocorre no
Trypanosoma cruzi, agente causador da doença de chagas. Outra atividade
marcante destas substâncias, descoberta um tanto recentemente, é a inibição do
complexo das topoisomerases, ação que provoca o desenvolvimento da apoptose
celular (suicídio celular). A interferência das quinonas na apoptose, constitui-se hoje
uma pesquisa interdisciplinar de fronteira na química medicinal, existindo grande
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expectativa quanto a delineação de estratégias racionais, visando o combate de
neoplasias, principalmente as relacionadas ao câncer de próstata. A química das
quinonas, já há muito vem sendo descrita em vários livros publicados, em inúmeras
e excelentes revisões, estando assim bem documentada sua evolução ao longo do
tempo. Destaca-se no grupo das naftoquinonas a β-lapachona com acentuada
atuação tanto na química como na farmacologia e o lapachol, outrora comercializado
para o tratamento de certos tipos de câncer, como coadjuvante, fabricado pelo
LAFEP (Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco) não mais disponível
no mercado. Esta naftoquinona também já constou do catálogo da Aldrich Chemical
Co, em edição antiga (1989). Também não consta nas últimas edições do Índice
Merck (DA SILVA; FERREIRA; SOUZA, 2003).
O principal interesse no lapachol reside em sua capacidade de induzir o
estresse oxidativo através da formação intracelular de espécies reativas do oxigênio
como o peróxido de hidrogênio (H2O2), o ânion radical superóxido (O2-) e o radical
hidroxila (OH). Estas espécies podem danificar alguns componentes celulares
importantes, tanto de células normais como de malignas. Esta interferência
xenobiótica altera o balanço natural de sinais que interferem na divisão celular em
pontos específicos da evolução morfogênica natural (checkpoint ou ponto de
checagem). A alteração da normalidade pode induzir a apoptose como alternativa,
caso não se consiga eliminar por completo o estresse oxidativo. Estudos realizados
indicam que o estresse oxidativo induzido pelo Lapachol, ocorre na enzima P450
redutase. Neste processo espécies reativas do oxigênio, promovem a cisão do DNA.
Este tipo de mecanismo de ação é importante, pois alguns microrganismos
patogênicos são muito mais sensíveis ao estresse oxidativo que os hospedeiros
humanos (DA SILVA; FERREIRA; SOUZA, 2003).
A β-lapachona, exibe in vitro variados tipos de atividade contra diferentes
linhagens de células, principalmente células malignas dos cânceres de pulmão,
mama, colo retal, próstata, melanoma e leucemia. Apesar do amplo espectro de
bioatividades os mecanismos de ação da β-lapachona em modelos experimentais
ainda não estão bem delineados. Além do estresse oxidativo, também se observam
vias biorredutivas alquilantes sobre ácidos nucléicos e/ou protéicos. Entretanto, a
atuação inibitória da β-lapachona sobre sistemas reparadores parece não ser o seu
único modo de atuação uma vez que fungos que não expressam topoisomerase I
também são inibidos por essa quinona. Ao que parece a β-lapachona é um
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xenobiótico de atuação critica sobre mais de um alvo intracelular que não só a
topoisomerase I. Com as informações disponíveis na literatura pode-se apontar para
uma ação de indução da apoptose através da inibição do complexo topoisomerase –
DNA. A possibilidade de uma ação direta da β-lapachona no ciclo catalítico das
enzimas topoisomerases I e II, assim como a geração endógena de O2־ e H2O2, são
sinais decisivos que desencadeiam a apoptose (DA SILVA; FERREIRA; SOUZA,
2003).
Efeitos colaterais e toxicidade
Apesar de sua baixa toxicidade, o lapachol apresenta alguns efeitos como a
anorexia, náusea e mais raramente vômitos, o que pode ser facilmente controlado
com antieméticos. Uma prolongação reversível no tempo de protrombina é
observada a doses elevadas o que é revertido com a administração parenteral de
vitamina K. Apesar da β-lapachona possuir atividades antineoplásica e antibiótica
superiores às do lapachol, bem como atividade antiviral, esse isômero apresenta-se
20 vezes mais tóxico que o Lapachol. A dose de 0,25g de Lapachol/kg administrada
diariamente, via oral durante 28 dias, é considerada a máxima dose tolerada em
macacos e cachorros. A administração de 100 mg/kg de Lapachol em ratas prenhes,
mostrou uma grande incidência de reabsorção do ovo por ação blastocistóxica –
antizigótica e uma atividade abortiva, levando a malformação (FONSECA; BRAGA;
SANTANA, 2003)
De todo modo, não se deve considerar a toxicidade elevada da β-lapachona
como um fator limitante ao uso clínico. Novas expectativas colocam-se nos estudos
futuros da relação atividade biológica versus estrutura química, uma área de atuação
aberta à química medicinal, que pode levar-se à solução de problemas de
toxicidade. (DA SILVA; FERREIRA; SOUZA, 2003).
M A T E R I A L E M É T O D O S
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4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Local da Pesquisa
As atividades de pesquisa foram desenvolvidas nos Laboratórios de Micologia
(DCF/CCS/UFPB), Genética Microbiana (CCEN/UFPB) e Microbiologia (LAC/UEPB),
onde funciona o Laboratório de Pesquisas em Atividades Antimicrobianas do
Programa de Qualificação Institucional – PQI da UEPB. 4.2. Produtos testados As substâncias testadas, lapachol e derivados, foram obtidas no Laboratório
de Tecnologia Farmacêutica (LTF/UFPB) e gentilmente cedidas pelo Profº Dr. Celso
Amorim Câmara. As mesmas foram sintetizadas conforme procedimentos descritos
na literatura (CÂMARA et al, 2001; CAMARA et al, 2002, BARBOSA et al, 2005;
SILVA et al, 2005; BARBOSA, 2006; BARBOSA-FILHO et al, 2006) São elas:
Lapachol e seus derivados semi-sintéticos -lapachona, -nor-lapachona, -I-
lapachona, -lapachona, nor-lapachona, -I-lapachona e seus derivados
nitrogenados obtidos por semisíntese: 2-amino-1,4-naftalenodiona (L-01), 2-(2,2-
e Caldo Mueller-Hinton (CMH) para bactérias; e Agar e caldo Sabouraud Dextrose –
ASD para fungos. Os meios de cultura (difco), foram preparados conforme as
instruções do fabricante.
4.6. Metodologia
4.6.1. Determinação da atividade antimicrobiana – triagem
Com relação a determinação da sensibilidade dos microrgansmos frente ao
lapachol e seus derivados sobre microrganismos, foi realizado inicialmente a triagem
da atividade antimicrobiana pelo método de difusão em meio sólido, processo
cavidade-placa (BAUER et al., 1966; CLEELAND; SQUIRES, 1991; NCCLS, 2002).
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Quanto a realização do teste de difusão, foram utilizadas placas de Petri (90 x
15 mm) descartáveis, estéreis, contendo 20mL de Agar Müeller-Hinton, que foram
inoculadas pela técnica de espalhamento em superfície (Figura 11). Com auxílio de
"swabs" estéreis, mergulhados na suspensão, foi retirado o inóculo, eliminando-se o
excesso do líquido por pressão nas paredes do tubo. O inóculo foi semeado em toda
a superfície do agar, de modo a se obter um crescimento uniforme e semi-
confluente.
As placas foram colocadas para secar, durante 3 a 5 minutos, antes de se
fazer as cavidades de 6 mm de diâmetro, com o auxílio de perfuradores descartáveis
estéreis. Em cada cavidade foi adicionado 50 l da solução de cada produto testado
nas concentrações de 200g/mL, 100g/mL, 50g/mL e 25g/mL, a fim de verificar
a presença ou não de atividade antimicrobiana. Foi utilizado como controle em uma
das cavidades, 50L da solução de DMSO a 2% usada como solvente. As placas
foram incubadas a 37°C por 24 horas e após este período, foram medidas, em
milímetros, as zonas (halos) de inibição de crescimento bacteriano. Os ensaios
foram realizados em triplicata e o resultado final foi determinado pela média
aritmética do tamanho dos halos de inibição (mm) dos valores obtidos nos ensaios.
Na triagem para a avaliação da atividade antimicrobiana, foi considerado como teste
positivo quando a média dos halos foi igual ou superior a 10 mm de diâmetro
(DROUHET; DUPONT, 1978; GUNDIDZA, 1986). E no caso das leveduras, 1 mL do
inoculo foi colocado nas placas de Petri (90x15 mm) estéreis e, em seguida, foi
adicionado 20 mL do agar Sabouraud dextrose liquefeito à 50°C. As placas foram
homogeneizadas e deixadas em repouso até a solidificação (WONG-LEUNG, 1988;
SAKAR, 1988).
Figura 11. Técnica de difusão em meio sólido, processo cavidade-placa.
Placa contendo meio de cultura Placa contendo
cavidades de 6mm de diâmetro +
50l dos produtos incubadas 24h/37°C "Swab" com o inóculo: 10
6 UFC/mL -
tubo 0,5 da escala de Mac Farland
Zonas de inibição indicam atividade
antimicrobiana
59
4.6.2. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM), Concentração
Bactericida Mínima (CBM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM)
Os testes para a determinação da CIM, da CBM e CFM foram realizados por
difusão em meio sólido, processo cavidade-placa conforme os protocolos de Bauer
et al (1966); CLEELAND; SQUIRES, 1991; HADACEK; GREGER (2000); NCCLS
(2002).
As placas de Petri (90x15 mm), contendo 20mL do meio de cultura ágar
Müeller-Hinton, foram inoculadas pela técnica de espalhamento em superfície, com
auxílio de "swabs" estéreis mergulhados na suspensão bacteriana para retirar o
inóculo. E no caso das leveduras, utilizou-se o meio de cultura agar Sabouraud
dextrose. Em cada placa foram feitas cavidades, de 6mm de diâmetro, com o auxílio
de perfuradores descartáveis estéreis. Nesses orifícios foram colocados 50l dos
produtos, para verificar a presença ou não de atividade antimicrobiana. As placas
foram incubadas à 35°C por 24 horas e após este período, foram medidas, as zonas
de inibição, em milímetros. Cada ensaio foi realizado em triplicata, para cada cepa
selecionada. O resultado final foi determinado pela média aritmética do tamanho dos
halos de inibição (mm) dos valores obtidos nos três ensaios.
A CIM foi considerada como a menor concentração do produto que inibiu o
crescimento visível dos microrganismos após 24h/37°C de incubação para bactérias
e 24-48h/35ºC, para as leveduras. A CBM e CFM foram consideradas como a
concentração do produto imediatamente superior à da CIM (NCCLS, 2002).
4.6.3. Determinação da cinética do crescimento bacteriano
Foram determinadas as curvas de crescimento do lapachol e seus derivados
sobre amostras selecionadas de S. aureus, estabelecendo-se a concentração
relacionada à CIM, em diferentes tempos de incubação, segundo o método proposto
por Peyret et al, (1990). As amostras foram inoculadas em caldo nutritivo (BHI),
incubadas a 37ºC por 18 à 24h. Após este período, foram cultivadas, transferindo-se
50 µL do inóculo inicial para 50 mL de caldo Mueller-Hinton, e incubando-o à
37ºC/1h de modo a produzir uma leve turvação, de densidade visualmente
equivalente ao tubo 0,5 da escala de McFarland, com concentração final de 10-6
UFC/mL. Transferiu-se 9,0mL desta cultura bacteriana e adicionou-se 1,0 mL do
produto a ser testado e no tubo controle foi adicionado 1,0 mL de água destilada
60
estéril. Os tubos foram mantidos na estufa a 37ºC por 24 horas, e alíquotas foram
retiradas após 2, 4, 6, 8, 10, 24 e 48 horas de incubação e semeadas em BAB. A
leitura das placas foi efetuada após incubação por 24/48 horas, pelo método padrão
de contagem em placas (Figura 12).
Figura 12. Fluxograma da cinética bacteriana
Amostra microbiana (cepa estoque)
Caldo BHI (5,0 mL)
Sub-cultivo (50 mL de caldo M. Hinton + 50 µL da suspensão bacteriana após 24h de incubação)
Transferir 9,0 mL do sub-cultivo para 2 tubos (C = Controle e T = Teste)
Adicionar 1,0 mL de H2O destilada estéril
Fazer diluições seriadas em NaCl 0,85%
(10-1 ...... 10-6)
Fazer diluições seriadas em NaCl 0,85% (10-1 ...... 10-6)
Semear 100 µL de cada diluição em placas agar M.Hinton
(T0 = Tempo 0 e a cada 2h)
Leitura e contagem do N° de UFC/mL
Semear 100 µL de cada diluição em placas agar M.Hinton
(T0 = Tempo 0) e a cada 2h
Leitura e contagem do N° de UFC/mL
Adicionar 1,0 mL do produto a ser testado [MIC]
Incubação (18 - 24h/37°C)
Tubo C
Repique
Incubação (1h/37°C)
Tubo T Controle de crescimento
Incubação (24h/37°C)
61
4.6.4. Determinação da cinética fúngica
Foram determinadas as curvas de morte microbiana após adição dos
produtos sobre a amostra selecionada, Candida albicans ATCC 76643,
estabelecendo-se concentração relacionada à concentração inibitória mínima (CIM),
em diferentes tempos de incubação, segundo o método proposto por Peyret et al,
(1990).
As amostras foram inoculadas em caldo Sabouraud e incubadas a
35ºC/24h. Após este período, foram subcultivadas, transferindo-se 50 µL do inóculo
inicial para 50 mL de caldo Sabouraud, incubando-o à 35ºC/1h de modo a produzir
uma leve turvação, de densidade visualmente equivalente ao tubo 0,5 da escala de
McFarland, com concentração final de 106 UFC/mL. Transferiu-se 9,0 mL desta
cultura fúngica para um tubo teste (T) e um tubo controle (C), adicionando-se 1.0mL
do produto a ser testado no tubo T e 1,0 mL de água destilada estéril, no tubo C.
Placas de agar Sabouraud dextrose (ASD), foram imediatamente semeadas com
0,1 mL dessas suspensões fúngicas, usando-se alças calibradas estéreis. As placas,
previamente identificadas em T e C (Tempo Oh) foram incubadas a 35ºC/24-48h. Os
tubos T e C foram mantidos na estufa a 35ºC por até 48 horas, e alíquotas foram
retiradas após 2, 4, 6, 8, 10, 24 e 48 horas de inoculação das substâncias e
semeadas em placas de ASD, as quais foram lidas após incubação por 35ºC/24-48
horas, pelo método padrão de contagem em placas (Figura 13).
62
Figura 13. Fluxograma da cinética fungica
Amostra microbiana (cepa estoque)
Caldo Sabouraud
(5,0 mL)
Sub-cultivo (50 mL de caldo Sabouraud + 50 µL da suspensão bacteriana após 24h de incubação)
Transferir 9,0 mL do sub-cultivo para cada tubo (C = Controle e T = Teste)
Adicionar 1,0 mL de H2O destilada estéril
Fazer diluições seriadas em NaCl 0,85%
(10-1 ...... 10-6) Fazer diluições seriadas em NaCl 0,85%
(10-1 ...... 10-6)
Semear 100 µL de cada diluição em placas ASD
(T0 = Tempo 0 e a cada 2h)
Leitura e contagem do N° de UFC/mL
Semear 100 µL de cada diluição em placas ASD
(T0 = Tempo 0) e a cada 2h
Leitura e contagem do N° de UFC/mL
Adicionar 1,0 mL do produto a ser testado [CIM]
Incubação (24h/35°C)
Tubo C
Repique
Incubação (1h/35°C)
Tubo T Controle de crescimento
Incubação (24h – 48h/35°C)
63
4.6.5. Caracterização fenotípica dos padrões de resistência aos antimicrobianos
A determinação do teste de sensibilidade aos antimicrobianos (Antibiograma)
foi realizada pelo método de disco-difusão (BAUER et al., 1966) usando-se discos
de antibióticos da Cefar, seguindo-se as recomendações do fabricante e do NCCLS
(2002).
4.6.6. Tratamento por substratos sintéticos obtidos a partir do lapachol e seus
derivados sintéticos – avaliação da atividade curagênica
A avaliação da atividade curagênica dos substratos sintéticos obtidos a partir
dos produtos testados sobre S.aureus resistentes a drogas foi determinada
utilizando-se o valor da metade da CIM. Todas as amostras bacterianas foram
inoculadas em caldo BHI (Brain Heart Infusion, DIFCO) a 37ºC por 18-24 horas e
diluídas 100 vezes no mesmo meio adicionado da concentração subinibitória (1/2
CIM) de cada produto ensaiado. Após incubação a 37ºC/24horas, sob agitação, as
culturas foram convenientemente diluídas em solução salina esterilizada (NaCl
0,85%) e alíquotas de 0,1mL semeadas em BAB (Blood Agar Base, difco) para
determinação do título (concentração em que cresceram nas placas 30 a 300
colônias). A perda da resistência a drogas foi determinada por réplica para meios de
cultura, acrescidos de cada antibiótico estudado (LEDEBERG; LEDEBERG, 1952;
PEREIRA, 2000). As confirmações da ocorrência de eliminação de plasmídios nas
variantes possivelmente curadas foram em placas com meio sólido (BAB) contendo
os antibióticos selecionados: Penicilina e Eritromicina.
Observa-se a cura quando a placa contendo o antibiótico apresenta a
ausência de colônias variantes anteriormente resistentes presentes na placa matriz,
sem antibiótico, indicando que as mesmas possivelmente perderam a característica
fenotípica de resistência quando tratada com os produtos testados (Figura 14).
64
Figura 14. Fluxograma da Avaliação da Atividade Curagênica
Incubação (24h/37°C)
Incubação (24h/37°C)
Preparo do Inóculo
18 – 24h/37°C
Incubação 24h/37°C em BM com agitação
INÓCULO BACTERIANO (10,0 mL de caldo M.Hinton + 1,0mL do produto [1/2CIM]
à ser testado +0,1 ml da Suspensão bacteriana )
Diluição do inóculo em NaCl 0,85% (10-1 ...... 10-6)
Plaqueamento em BAB das diluições, usando 50µl e 100 µl do cultivo bacteriano
Escolher a melhor diluição pra leitura e contar N° de UFC/mL. Determinar a placa matriz
“Imprint” (a partir da placa matriz em BAB + antibiótico)
Leitura da placa “Imprint” (comparar com a placa matriz e observar se houve cura)
Determinar o % de colônias curadas
AMOSTRA MICROBIANA (Cepa estoque)
Repique
Caldo BHI (5,0 mL)
Suspensão bacteriana
65
Os experimentos controles para a determinação de eliminação espontânea de
plasmídios foram realizados anteriormente por Pereira & Siqueira (1995), utilizando
o método da diluição em placas caldo e por eletroforese em gel de agarose após lise
com lisostafina (GOERING; RUFF, 1983).
4.6.7. Relação estrutura-atividade
O estudo da estrutura-atividade foi realizado observando-se a relação da
mudança na cadeia do lapachol e a variação da sua atividade antimicrobiana, em
detrimento das mudanças estruturais (ANTUNES et al., 2006).
R E S U L T A D O S E D I S C U S S Ã O
67
5.0. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Resistência Antimicrobiana
A resistência antimicrobiana é um dos principais problemas de saúde pública
mundial, despertando preocupação na busca contínua por novos antimicrobianos. A
potência efetiva dos antimicrobianos existentes vem sendo gradativamente reduzida
ou mesmo anulada pela emergência de cepas que se apresentam resistentes aos
mesmos. Essas cepas são freqüentemente envolvidas na etiologia de infecções
humanas e animais, além de serem também comumente encontradas em infecções
hospitalares (XU; LEE, 2001).
A versatilidade e flexibilidade genética das bactérias são fatores que
contribuem para eficiência do fenômeno de resistência que tem se disseminado
entre diferentes gêneros e espécies de bactérias (PONTES et al., 2004). É sobre
essa variabilidade genética que o homem vem, paradoxalmente, exercendo alta
pressão seletiva (hospital, comunidade, agropecuária, meio ambiente) favorecendo
os genótipos resistentes (CHARTONE-SOUZA, 2004). De modo que, os estudos de
produtos naturais e sintéticos bioativos têm-se mostrado como uma alternativa
terapêutica e várias pesquisas estão sendo realizadas no intuito de avaliar as
propriedades de atividade antimicrobianas de substâncias de origem vegetal e
sintéticas. Dentro dessa perspectiva, o interesse em produtos vegetais com
propriedades medicamentosas tem evoluído bastante em todo o mundo. Vários
trabalhos descritos na literatura buscam avaliar produtos de plantas que possuam
atividade antimicrobiana (THUILLE; FILLE; NAGL, 2003; VASCONCELOS, et al.,
2004; BRAGA et al., 2005).
Na Tabela 2 observa-se o perfil de sensibilidade das cepas de S. aureus
frente a 15 antimicrobianos usados rotineiramente na clínica médica humana e
veterinária. Observou-se ainda nesse estudo, que a maioria (15/22) das cepas
apresentou resistência a penicilina G e a ampicilina e que as cepas 129FN, 233FN,
322FN (origem animal) e as cepas 8 e 18 (origem humana) foram sensíveis a todos
os antimicrobianos testados. Apenas duas cepas 171c (humana) e 2A (ambiental)
apresentaram resistência a oxacilina, sendo classificadas como MRSA. Todas as
cepas foram sensíveis a vancomicina, cloranfenicol, ciprofloxacina e
amplicilina/sulbactan. Esse estudo prévio de avaliação do perfil de sensibilidade
68
permitiu mostrar que a diversidade fenotípica das cepas em relação aos
antimicrobianos tradicionais, independe da sua origem.
Das 22 cepas ensaiadas, 7 foram sensíveis a todos os antimicrobianos
testados, as demais apresentaram multirresistência que variou de 2 a 7
antimicrobianos, sendo 6 cepas resistentes apenas à penicilina e à ampicilina. As
cepas mais resistentes foram 171c, 46 e 2A, respectivamente, resistentes a 7, 6 e 5
tipos de antimicrobianos. As cepas resistentes à penicilina foram consideradas como
produtoras de plasmídio penicilinase (TRABULSI, 2006).
Tabela 2. Perfil de sensibilidade das cepas de S. aureus Frente a Antimicrobianos
ANTIMICROBIANOS TESTADOS RM
C
epas
PEN
ERI
TET
AM
P
VAN
OXA
AM
I
GEN
SFT
AM
P/S
UL
CIP
CLI
CLO
AZI
EST
n° a
ntib
iótic
os
122 U R R S R S S S S S S S S S I S 3 146 U R I S R S S S S S S S S S S S 2 223 U R S S R S S S S S S S S S S S 2 312 U R S S R S S S S S S S S S S S 2 319 U R I S R S S S S S S S S S S S 2
129 FN S S S S S S S S S S S S S S S 0 233 FN S S S S S S S S S S S S S S S 0 322 FN S S S S S S S S S S S S S S S 0
171c R R R R S R I S R S S S S R S 7 8 S S S S S S S S S S S S S S S 0
18 S S S S S S S S S S S S S S S 0 43 R S S R S S S S S S S S S S S 2 44 R I R R S S S S R S S S S S S 4 45 R I R R S S S S S S S R S S S 4 46 R I R R S S R R S S S S S S R 6 47 R I R R S S S S S S S S S S S 3 48 R S S R S S S S S S S S S S S 2 49 R R S R S S S S R S S S S S S 4 50 R R S R S S S S R S S S S S S 4
ATCC S S S S S S S S S S S S S S S 0 1A S S S S S S S S S S S S S S S 0 2 A R R R R S R S S S S S S S S S 5
Os resultados demonstraram que o lapachol e seus derivados foram mais
ativos para S. aureus ATCC 25923 (Figura 15) e P. aeruginosa ATCC 27853,
corroborando as afirmações de Fonseca, Braga e Santana (2003). Estes autores
verificaram a predominância do lapachol com atividade antimicrobiana para
microrganismos G(+) e baixa atuação para os G(-), aqui confirmado com o teste para
70
a E. coli, onde os resultados dos ensaios foram negativos, ou seja, sem atividade
antimicrobiana.
Figura 15. Atividade antimicrobiana do lapachol (1), α-nor-lapachona(2); β-
lapachona (3); α-lapachona (4); β-nor-lapachona (5), frente a S. aureus ATCC 25923
A maioria das substâncias derivadas do lapachol mostrou potencial
antimicrobiano diante das cepas testadas. Para os derivados nitrogenados obtidos a
partir do lapachol, observou-se halos de inibição de crescimento apenas para L-04
(12 mm) e para L-08 (15 mm), frente a S. aureus ATCC 25923. As demais
substâncias desse grupo não apresentaram atividade antimicrobiana para nenhuma
das cepas testadas. Com relação às cepas de S. aureus 319U e S. aureus 122U,
apenas a -lapachona, -lapachona e -lapachona formaram halo de inibição.
Quanto às leveduras, apenas o -nor-lapachona e o ß-lapachona
apresentaram halo de inibição de crescimento respectivamente de 13 mm e 10 mm,
evidenciando atividade antifúngica frente a uma cepa de Saccharomices cerevisae.
De acordo com Fonseca, Braga e Santana (2003), esses resultados também se
mostram compatíveis uma vez que os autores supracitados afirmam ser a ß-
lapachona mais ativa que o próprio lapachol, dados também observados neste
ensaio. Os resultados dos testes preliminares realizados com as leveduras (Tabela
3) apontaram baixa atividade. Por esta razão, foram selecionadas apenas as
bactérias para os testes seguintes. Na Tabela 3, pode se observar que as cepas P.
aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC 25923, S. aureus 319U, S. aureus 122U e
71
S. cerevisae apresentaram-se sensíveis ao lapachol e derivados semi-sintéticos
(200g/ mL) cujos halos de inibição medem de 10 a 26 mm de diâmetro.
O lapachol e seus derivados semi-sintéticos apresentaram atividade
antimicrobiana significativa para as cepas S. aureus testadas. Uma possibilidade da
elucidação desse mecanismo, é a capacidade que essas substâncias possuem de
causar estresse oxidativo e apoptose. Segundo da Silva, Ferreira e Sousa (2003),
alguns microrganismos patogênicos são muito mais sensíveis ao estresse oxidativo
que os hospedeiros humanos. Da Silva, Ferreira e Sousa (2003) e Barbosa (2006),
afirmaram que lapachol e -lapachona podem danificar alguns componentes
celulares importantes por induzirem a formação deletéria endógena de ânion radical
superóxido (O2-), radical hidroxila (HO) e peróxido de hidrogênio (H2O2), os
chamados radicais livres, bem como a apoptose ao inibirem o complexo das
topoisomerases (lapachol e β-lapachona). Estes estudos podem direcionar novos
caminhos para continuidade das pesquisas nos alvos intracelulares que elucidariam
os mecanismos de ação dessas substâncias nas células microbianas.
5.3. Determinação da CIM e CBM
A CIM é a maior diluição do produto que conseguiu inibir o crescimento
microbiano, enquanto que a CBM é a diluição imediatamente anterior à CIM
representando a diluição bacteriostática do produto. Em relação à avaliação da
concentração inibitória mínima (CIM), foram utilizadas apenas as substâncias mais
ativas, que foram testadas frente a S. aureus ATCC 25923, conforme a Figura 16, E.
coli ATCC 25922 e P. aeruginosa ATCC 27853, cepas recomendadas pelo NCCLS
(2002), quando se avalia o perfil de atividade de antibióticos. Incluiu-se também uma
cepa de S. aureus multirresistente (S. aureus 171c MRSA) de origem humana, bem
como cepas com perfil plasmidial de resistência à antibióticos conhecido (S. aureus
319U e 122U) de origem animal.
72
Figura 16. Avaliação da CIM e CBM do lapachol (A), α-lapachona (B), β-lapachona (C) e β-nor-lapachona (D) nas concentrações de 200 (1), 100 (2), 50 (3) e 25g/ mL (4) frente à cepa MSSA ATCC 25923.
Conforme se observa na Tabela 4, dos produtos derivados nitrogenados
obtidos a partir do lapachol por semi-síntese, apenas o L-08 e L-04 apresentaram
atividade antimicrobiana, sendo estas limitadas as cepas S. aureus. A CIM destes
produtos foi de respectivamente 50 µg/mL e 200 µg/mL.
Observou-se que a substância lapachol teve CIM de 100 µg/mL para as cepas
analisadas, excetuando a E. coli e 319U. A concentração de 50 µg/mL pode ser
considerada como a CIM para os produtos -lapachona, -nor-lapachona, -nor-
lapachona, -I-lapachona e -lapachona, quando estudados apenas para S. aureus.
É importante ressaltar que os produtos -lapachona e -nor-lapachona
apresentaram a menor CIM (50 µg/mL) para todos os microrganismos testados,
exceto a E. coli. Provavelmente esses derivados do lapachol podem ser o mais
eficazes da série, ressaltando os registros similares existentes na literatura
(FONSECA; BRAGA; SANTANA, 2003; LIRA et al., 2004) sobre a atividade
antimicrobiana conhecida para a -lapachona o que corrobora os dados encontrados
nesta pesquisa.
73
Tabela 4. Avaliação da CIM e da CBM do lapachol e derivados frente a microrganismos.
Microrganismos testados/Halos de inibição em mm
S. a
ureu
s A
TCC
25
923
S. a
ureu
s 17
1c
(MR
SA)
P.
aeru
gino
sa
ATC
C
2785
3
E. c
oli
ATC
C
9592
5
S.au
reus
31
9U
S.au
reus
12
2U Produtos Testados
g/mL
Halos de inibição 200 11 11 11 0 0 24
100 10 10 9 0 0 18
50 0 0 0 0 0 11 lapachol
25 0 0 0 0 0 0
200 15 12 15 0 12 25
100 12 10 13 0 11 18
50 10 0 0 0 0 13 α-lapachona
25 0 0 0 0 0 0
200 18 20 14 0 17 22
100 16 16 10 0 13 19
50 13 12 9 0 10 13 β-lapachona
25 0 0 0 0 0 0
200 20 20 20 0 15 18
100 17 16 18 0 13 15
50 11 11 11 0 10 11 β-nor-lapachona
25 0 0 0 0 0 0
200 13 13 0 0 0 0
100 11 11 0 0 0 0
50 10 9 0 0 0 0 α-nor-lapachona
25 0 0 0 0 0 0
200 18 18 11 0 12 20
100 15 15 0 0 9 16
50 10 12 0 0 0 9 β-I-lapachona
25 0 0 0 0 0 0
200 14 14 14 0 0 0
100 12 12 8 0 0 0
50 0 10 0 0 0 0 α-I-lapachona
25 0 0 0 0 0 0
200 11 NT 0 0 0 0
100 0 NT 0 0 0 0
50 0 NT 0 0 0 0 L-04
25 0 0 0 0 0 0
200 16 16 0 NT 0 0
100 15 13 0 NT 0 0
50 11 10 0 NT 0 0 L-08
25 0 0 0 0 0 0
Legenda: NT – Não testado
74
Na Tabela 5, observam-se os testes com oito cepas de MSSA de origem
animal, uma cepa MRSA de origem humana, dez cepas de MSSA de origem
humana (amostras clínicas), uma cepa de S. aureus ATCC e duas amostras de
origem ambiental (1A e 2A).
Tabela 5. Atividade antimicrobiana do lapachol e derivados frente as cepas de S.
aureus de origem humana, animal e ambiental x estrutura química.
5.4. Cinética bacteriana das cepas de S. aureus ATCC 25923, S. aureus 319U e
S. aureus 122U, frente aos produtos derivados do lapachol
A cinética bacteriana avalia a ação de um produto sobre um microrganismo
mostrando se o mesmo tem ação bactericida ou bacteriostática.
Considerando-se que o lapachol e derivados, praticamente, não
apresentaram atividade antimicrobiana frente as cepas de leveduras testadas, não
foram realizados os testes da determinação da curva de morte sobre estes
microrganismos. A atividade bactericida e bacteriostática in vitro foi avaliada apenas
em amostras de S. aureus. As linhagens escolhidas foram S. aureus ATCC 25923,
S. aureus 319U e S. aureus 122U. As duas últimas cepas foram selecionadas para
este estudo por terem o perfil plasmidial de resistência a antimicrobianos e metais
pesados conhecidos sendo previamente determinados por Pereira e Siqueira-Júnior
78
(1995), utilizadas neste experimento para a realização da cura de plasmídios. Os
resultados dos testes mostram que todos os compostos influenciaram o crescimento
bacteriano, pois todos os testes se mantiveram abaixo da curva de controle de
crescimento bacteriano.
O Quadro 1 mostra a cinética bacteriana de S. aureus ATCC 25923 frente aos
derivados do lapachol. Nota-se que todos os produtos até 24 horas apresentaram
uma ação bacteriostática, pois após seis horas praticamente, se mantiveram no
mesmo Log até 48 horas em relação ao Log inicial (Figura 18). Apenas -nor-
lapachona apresentou uma queda mais acentuada em relação aos demais
compostos após 10 horas, no entanto continua com ação bacteriostática, pois de
acordo com Jones; Anderegg; Deshpande (2002) e Shelburne et al. (2004), para
uma substância ter ação bactericida seu Log precisa cair pelo menos três vezes em
relação ao inóculo do Log inicial, o que não se observa em nenhum evento
registrado na Figura 18 até 24 horas.
79
Quadro 1. Cinética bacteriana de S. aureus ATCC 25923 frente a lapachol, α-lapachona, β-lapachona, α-nor-lapachona, β-nor-lapachona, α-I-lapachona, β-I-lapachona.
Produtos Testados/100mg/dl
Tempo (h)
Controle de Crescimento
Lapa
chol
α-la
pach
ona
β-la
pach
ona
α-no
r-la
pach
ona
β-no
r-la
pach
ona
α-I-
lapa
chon
a
β-I-
lapa
chon
a
0 2,57 x 106 2,57 x 106 2,57 x 106 2,57 x 106 2,57 x 106 2,57 x 106 2,57 x 106 2,57 x 106
2 6,00 x 106 6,72 x 106 5,60 x 106 3,00 x 106 4,88 x 106 5,09 x 106 5,20 x 106 3,32 x 106
4 2,10 x 107 3,00 x 108 8,41 x 107 7,93 x 107 9,27 x 106 8,43 x 106 9,20 x 106 1,80 x 105
6 4,00 x 108 2,80 x 107 1,07 x 107 1,90 x 107 1,20 x 107 1,20 x 107 4,00 x 106 1,08 x 106
8 2,00 x 1010 2,80 x 108 6,00 x 108 1,23 x 107 1,11 x 107 1,29 x 107 3,00 x 108 2,80 x 108
10 1,00 x 1012 1,00 x 108 5,00 x 108 1,33 x 107 1,09 x 107 1,40 x 107 2,60 x 108 2,40 x 108
24 2,40 x 1012 1,20 x 107 4,80 x 108 1,00 x 108 5,80 x 106 1,00 x 108 2,00 x 108 1,80 x 108
48 2,80 x 109 7,00 x 106 7,33 x 106 1,00 x 108 1,50 x 104 1,00 x 108 1,80 x 108 1,50 x 108
1,0E+00
1,0E+01
1,0E+02
1,0E+03
1,0E+04
1,0E+05
1,0E+06
1,0E+07
1,0E+08
1,0E+09
1,0E+10
1,0E+11
1,0E+12
0h 2h 4h 6h 8h 10h 24h 48h
Tempo (horas)
Log(
UFC
/ml)
Controle de Crescimento Lapachol α-Lapachona β-Lapachonaα-nor-Lapachona β-Nor-Lapachona α-I-Lapachona β-I-Lapachona
Figura 18. Cinética bacteriana de S. aureus ATCC 25923 frente a lapachol, α-
No Quadro 2 e Figura 19, observa-se a curva de morte do S. aureus 319U
frente ao lapachol e seus derivados. Nota-se também que, todos os compostos
tiveram ação bacteriostática frente a esse microrganismo até 24 horas. O Log do
lapachol caiu em quatro horas, se manteve estável até 48 horas e foi o mais baixo
do conjunto, sendo superado apenas após 24 horas pelo -lapachona que declina
após este horário e apresenta ação bactericida em 48 horas. Pode-se verificar que,
em oito horas, todas as substâncias apresentaram atividade antimicrobiana em
relação ao controle, caindo apenas após esta hora o Log do -lapachona e do -
lapachona. O Log dos demais compostos se manteve estável até 48 horas.
81
Quadro 2. Cinética bacteriana de S. aureus 319U frente ao lapachol, α-lapachona, β-lapachona, α-nor-lapachona, β-nor-lapachona, α-I-lapachona, β-I-lapachona.
Produtos Testados/100mg/dl
Tempo (h)
Controle de Crescimento
Lapa
chol
α-la
pach
ona
β-la
pach
ona
α-no
r-la
pach
ona
β-no
r-la
pach
ona
α-I-
lapa
chon
a
β-I-
lapa
chon
a
0 2,27 x 106 2,27 x 106 2,27 x 106 2,27 x 106 2,27 x 106 2,27 x 106 2,27 x 106 2,27 x 106
2 1,60 x 108 2,70 x 108 8,00 x 107 6,50 x 106 1,60 x 108 2,76 x 106 2,42 x 106 3,00 x 106
4 4,00 x 108 1,00 x 107 7,00 x 108 8,10 x 108 2,40 x 108 6,40 x 106 5,60 x 106 4,80 x 106
6 7,00 x 108 1,80 x 106 6,00 x 108 7,60 x 108 3,00 x 108 7,20 x 107 6,70 x 106 5,70 x 107
8 2,40 x 1012 2,10 x 106 5,10 x 108 7,10 x 108 2,90 x 108 8,10 x 107 7,70 x 108 7,90 x 107
10 2,00 x 1011 3,20 x 106 4,80 x 108 3,80 x 105 2,70 x 108 9,20 x 107 8,10 x 108 8,90 x 108
24 1,00 x 1010 3,40 x 106 3,20 x 108 1,00 x 108 1,00 x 108 8,70 x 108 9,20 x 108 8,90 x 108
48 2,20 x 109 2,10 x 106 3,20 x 103 1,00 x 108 1,00 x 107 8,60 x 108 9,80 x 108 9,30 x 108
1,0E+00
1,0E+01
1,0E+02
1,0E+03
1,0E+04
1,0E+05
1,0E+06
1,0E+07
1,0E+08
1,0E+09
1,0E+10
1,0E+11
1,0E+12
1,0E+13
0h 2h 4h 6h 8h 10h 24h 48hTempo (horas)
Log
(UFC
/ml)
Controle de Crescimento Lapachol α-Lapachona β-Lapachonaα-nor-Lapachona β-Nor-Lapachona α-I-Lapachona β-I-Lapachona
Figura 19. Cinética bacteriana de S. aureus 319U frente aos produtos Lapachol, α-
No Quadro 3, está registrado os resultados da cinética bacteriana do S.
aureus 122U frente aos derivados do lapachol. Também frente a esta cepa estes
produtos tiveram ação bacteriostática até 24 horas, apresentando em média pico
máximo de crescimento em oito horas. Após esta hora o Log de todos os compostos
declina.
Manteve-se estável até 48 horas apenas a α-nor-lapachona em Log de 108. O
Log das demais substâncias declina até 48 horas e o Log do lapachol mantém-se
estável a partir de quatro horas, horário em que cai. A α-lapachona mantém um
comportamento parecido com o teste da cepa 319U, quando após 24 horas é o
produto que apresenta queda de três Log, sendo bactericida (Figura 20).
83
Quadro 3. Cinética bacteriana de S. aureus 122U frente ao lapachol, α-lachona, β-lapachona, α-nor-lapachona, β-nor-lapachona, α-I-lapachona, β-I-lapachona.
Produtos Testados/100mg/dl
Tempo (h)
Controle de Crescimento
lapa
chol
α-la
chon
a
β-la
pach
ona
α-no
r-la
pach
ona
β-no
r-la
pach
ona
α-I-
lapa
chon
a
β-I-
lapa
chon
a
0 1,90 x 106 1,90 x 106 1,90 x 106 1,90 x 106 1,90 x 106 1,90 x 106 1,90 x 106 1,90 x 106
2 3,00 x 107 4,00 x 106 1,40 x 108 1,30 x 106 4,00 x 107 3,50 x 106 2,20 x 106 2,45 x 106
4 1,00 x 108 1,00 x 105 6,00 x 107 7,00 x 107 4,00 x 107 4,20 x 106 3,10 x 107 2,80 x 107
6 5,00 x 108 1,00 x 105 3,00 x 106 1,00 x 106 4,10 x 108 5,40 x 107 4,20 x 107 4,80 x 107
8 3,00 x 1010 1,20 x 105 2,20 x 106 4,50 x 105 4,60 x 108 6,10 x 107 5,60 x 108 7,80 x 106
10 1,00 x 1011 1,40 x 105 2,00 x 105 3,80 x 105 7,00 x 108 8,80 x 108 6,90 x 108 6,00 x 105
24 9,10 x 109 1,20 x 105 1,80 x 104 3,80 x 104 9,00 x 108 9,10 x 108 7,60 x 108 1,00 x 104
48 8,00 x 109 1,00 x 105 1,50 x 103 3,30 x 104 9,00 x 108 9,60 x 108 9,00 x 108 1,00 x 104
1,0E+00
1,0E+01
1,0E+02
1,0E+03
1,0E+04
1,0E+05
1,0E+06
1,0E+07
1,0E+08
1,0E+09
1,0E+10
1,0E+11
0h 2h 4h 6h 8h 10h 24h 48h
Tempo (horas)
Log
(UFC
/ml)
Controle de Crescimento Lapachol α-Lapachona β-Lapachonaα-nor-Lapachona β-Nor-Lapachona α-I-Lapachona β-I-Lapachona
Figura 20. Cinética bacteriana de S. aureus 122U frente ao lapachol, α-lachona, β-
O lapachol não apresentou halo de inibição frente à cepa 319U, porém
apresentou freqüência de cura de 0,78% para a marca de resistência à penicilina
(Figuras 23 e 25), dados que corroboram as afirmações de Pereira (2000) quando
diz que uma substância não precisa ter necessariamente atividade antimicrobiana
para apresentar atividade curagênica, pois o produto pode interferir, possivelmente,
apenas na replicação plasmidial e não exercer uma ação antimicrobiana sobre a
cepa estudada.
Tabela 9. Freqüência de cura da marca de resistência plasmidial à penicilina pelo
lapachol e seus derivados semi-sintéticos em linhagens de S. aureus.
N° de colônias ensaiadas/Nº de variantes sensíveis Freqüência de cura % Produtos
319U 122U 319U 122U lapachol 384/3 299/0 0,78 0,0
-lapachona 433/1 90/0 0,23 0,0
-I-lapachona 163/0 101/0 0,0 0,0
-lapachona 515/0 162/0 0,0 0,0
-I-lapachona 748/0 254/0 0,0 0,0
Figura 22. Colônias possilvelmente curadas pelo β-I-lapachona para a marca de resistência plasmidial à eritromicina para a cepa S. aureus 319U.
a) b)
88
a) Placa matriz sem antibiótico; b) Placa “imprint” com antibiótico (ausência de colônias possilvelmente
curadas) Tabela 10. Freqüência de cura da marca de resistência plasmidial à eritromicina
pelo lapachol e seus derivados semi-sintéticos em linhagens de S. aureus.
N° de colônias ensaiadas/Nº de variantes sensíveis Freqüência de cura %
Produtos 319U 122U 319U 122U
lapachol 384/0 299/0 0,0 0,0
-lapachona 433/7 90/0 0,61 0,0
-I-lapachona 163/4 101/0 2,45 0,0
-lapachona 515/0 162/0 0,0 0,0
-I-lapachona 748/8 254/1 1,06 0,39
Figura 23. Colônias possilvelmente curadas pelo lapachol para a marca de
resistência plamidial à penicilina para a cepa S. aureus 319U. a) Placa matriz sem antibiótico; b) Placa “imprint” com antibiótico (ausência de colônias possilvelmente
Substâncias Figura 24. Freqüência de cura da marca de resistência plasmidial à penicilina pelo
lapachol e derivados em S. aureus 319U (a) e S. aureus 122U (b)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Freq
üênc
ia d
e cu
ra
Lapachol a -lapachona ß-lapachona ß-I-lapachona a-I-lapachona
Substâncias
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
Freq
üênc
ia d
e cu
raLapachol a -lapachona ß-lapachona ß-I-lapachona a-I-lapachona
Substâncias Figura 25. Freqüência de cura da marca de resistência plasmidial à eritromicina pelo
lapachol e derivados em S. aureus 319U (a) e S. aureus 122U (b)
A transferência de material genético entre organismos da mesma ou
diferentes espécies desempenha um papel crucial na evolução de resistência a
drogas em bactérias. Embora a existência de plasmídios em S. aureus de origem
bovina já tenha sido demonstrada por Pereira (2000), o seu papel na determinação
de resistência à drogas continua sendo de extrema importância, pois sendo este
apenas um dos mecanismos utilizados dentre outros, que os microrganismos lançam
maõs para se defenderem a exemplo dos mecanismos de defesa cromossomiais é
importante a pesquisa de novos compostos para a prevenção e/ou controle de
linhagens multiresistentes. Os resultados obtidos neste trabalho mostram a
importância do estudo de agentes com atividade antimicrobiana ou não na
eliminação de plasmídios, o que poderá contribuir quando associados a outros
estudos, para a prevenção dessas linhagens multiresistentes, notadamente
enfatizada em Pereira (2000) e Ferreira et al., (2006), quando afirmam que em geral
a capacidade de compostos para eliminar plasmídios tais como SDS (dodecil sulfato
de sódio), acriflavina ou acridina laranja, é muito tóxica para uso terapêutico.
Pesquisas de compostos não tóxicos têm sido realizadas a exemplo do ácido
ascórbico que elimina plasmídio penicilinase em S. aureus. Certamente, os estudos
a b
a b
90
de estrutura-atividade que estão sendo desenvolvidos na atualidade com as
modificações na estrutura molecular dos compostos com atividades biológicas já
conhecidas, a exemplo do lapachol e seus derivados, vem se tornando cada vez
mais significativos quando tentam diminuir a toxicidade destes compostos.
Os resultados dessa investigação sugerem que, posteriormente, se investigue
outras possibilidades de atividades biológicas, devido ao potencial promissor das
moléculas obtidas a partir das modificações estruturais do lapachol, pois tanto o
lapachol como as lapachonas têm sido alvo de constante interesse farmacológico,
devido a variedade de atividades biológicas que essas naftoquinonas apresentam.
C O N C L U S Õ E S
92
6. CONCLUSÕES
No estudo sobre a ação antimicrobiana e antiplasmidial do lapachol e
derivados sobre bactérias e fungos leveduriformes, conclui-se que:
As substâncias lapachol e seus derivados semi-sintéticos -lapachona, -nor-
lapachona, -I-lapachona, -lapachona, -nor-lapachona e -I-lapachona, foram
as mais ativas frente a S. aureus ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853,
MRSA 171C, S. aureus 319U e S. aureus 122U.
As substâncias lapachol e derivados não apresentaram atividade antimicrobiana
sobre as cepas de E. coli ATCC 95925 e Candida spp.
Somente S. aureus ATCC 25923, foi sensível frente as substâncias L04 e L08,
derivados nitrogenados do lapachol.
Todos os derivados semi-sintéticos obtidos a partir do lapachol tiveram atividade
antimicrobiana significativa frente as cepas de S. aureus inclusive a MRSA.
Os produtos -lapachona e -nor-lapachona apresentaram a menor CIM
(50g/mL) e menor CBM (100g/mL) para todos os microrganismos testados,
com exceção da E. coli, podendo ser considerados os mais eficazes da série.
Nos testes de estrutura-atividade, observa-se que as cepas MRSA 171C e 2ª
(com exceção do lapachol), foram inibidas por todas as substâncias testadas
mostrando o potencial antimicrobiano do lapachol e seus derivados semi-
sintéticos.
Os produtos mais ativos frente as cepas de Staphylococcus testadas foram -
lapachona e -I-lapachona, apresentando ambos os percentuais de inibição de
90,9%.
As mudanças na estrutura química do lapachol aumentaram consideravelmente
sua atividade antimicrobiana frente às cepas de Staphylococcus aureus.
93
As curvas de morte (cinética bacteriana) mostram que o lapachol e seus
derivados semi-sintéticos têm ação bacteriostática, com exceção dos produtos α-
lapachona e α-nor-lapachona que após 48h tem ação bactericida.
Apenas o produto -lapachona apresentou ação simultânea para a eliminação
das marcas de resistência à penicilina e à eritromicina.
O produto mais eficaz para eliminação da marca de resistência à eritromicina foi
o -I-lapachona.
O lapachol não apresentou atividade antimicrobiana frente a cepa de S. aureus
319U, porém apresentou uma freqüência de cura de 0,78% para a marca de
resistência à penicilina.
R E F E R Ê N C I A S
95
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