Rol del microbioma intestinal en el mecanismo de la remisión ...

Universidad ORT Uruguay

Facultad de Ingeniería

Rol del microbioma intestinal en el mecanismo de la

remisión temprana de la diabetes mellitus tipo 2

inducida por los procedimientos bariátricos

Entregado como requisito para la obtención del título de Ingeniería en Biotecnología

Fernando Slamovitz – 213254

Tutor: MD. PhD. Avner Leshem

2021

2

Declaración de autoría

Yo, Fernando Slamovitz, declaro que el trabajo que se presenta en esta obra es de mi propia mano.

Puedo asegurar que:

La obra fue producida en su totalidad mientras realizaba una pasantía (en calidad de Visiting

Reserarcher) en el laboratorio de Dr. Eran Elinav en el Weizmann Institute of Science con

propósito de mi trabajo final de carrera;

Cuando he consultado el trabajo publicado por otros, lo he atribuido con claridad;

Cuando he citado obras de otros, he indicado las fuentes. Con excepción de estas citas, la

obra es enteramente nuestra;

En la obra, he acusado recibo de las ayudas recibidas;

Cuando la obra se basa en trabajo realizado conjuntamente con otros, he explicado

claramente qué fue contribuido por otros, y qué fue contribuido por mí;

Ninguna parte de este trabajo ha sido publicada previamente a su entrega, excepto donde

se han realizado las aclaraciones correspondientes.

Firma:

Aclaración: Fernando Slamovitz

Fecha: 16/06/2021

3

Dedicatoria

A mis padres por el extraordinario esfuerzo realizado para brindarnos lo mejor a mi hermano y a mí.

A mi hermano mayor Diego por ser mi guía.

4

Agradecimientos

Al Dr. Eran Elinav, por recibirme en su laboratorio.

Al Dr. Avner Leshem por enseñarme todo y convertirse en un gran amigo: Toda raba, Jefe!!!

Al Weizmann Institute of Science de Israel, por recibirme en su campus.

A todos los miembros del laboratorio Elinav por enseñarme y ayudarme en todos los aspectos de mi trabajo durante este año.

o Leviel, Denise, Rafa, Noa, Niv, Kim, Sara, Lara, Karina, Hodaya o Yotam, Uria, Sam, Danping, Ola, Lorenz, Melina, Gayatree, Suhaib, Timur o Mally y Hagit

A los correctores de la tesis: o Dr. Gregorio Iraola, referente del estudio de microbiomas en el país, por su

generosidad para corregir mi tesis y recibirme en su laboratorio para realizar una pasantía antes de irme a Israel compartiendo su sabiduría sobre el tema para prepararme de la mejor manera para el laboratorio Elinav. También por su atención para responder mis dudas y consultas sobre el tema de manera constante y dedicada.

o Dr. Marcelo Viola, cirujano referente del país, por su generosidad para corregir mi tesis y enseñarme acerca de los pacientes de procedimientos bariátricos. También por su generoso apoyo científico e increíble disponibilidad para responder dudas y consultas sobre el tema de manera constante y dedicada.

A mis amigos LDS, los del maca y los del ELF por siempre estar y hacer que todo sea más fácil y divertido.

A Florencia

A la familia y amigos de Israel por estar siempre

Al resto de mi familia: primos, tíos, abuelos.

Al gran Mr. G por, entre otras cosas, acompañarme durante el proceso de aplicación al laboratorio.

A mis compañeros de carrera

A profesores de ORT por la tremenda dedicación durante estos 5 años en los que aprendí mucho y me formé como ingeniero en biotecnología.

5

Resumen

Actualmente 422 millones de adultos padecen Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) a nivel mundial,

incluyendo unos 300.000 uruguayos. Debido al alarmante aumento de la prevalencia de

enfermedades metabólicas en el último siglo y al fracaso de los tratamientos farmacológicos

disponibles para contener esta pandemia, nuevas alternativas están siendo estudiadas hoy en día. La

cirugía bariátrica tiene como finalidad la pérdida ponderal en individuos obesos; pero estos

procedimientos bariátricos cuando se utilizan para tratar trastornos metabólicos, se denominan

cirugías metabólicas, y son considerados desde hace algunos años como el tratamiento más eficaz

para tratar la DM2 y otras enfermedades vinculadas al síndrome metabólico (Dislipemia e

Hipertensión arterial, entre otras).

Tras un año de la intervención quirúrgica, los pacientes obesos y diabéticos alcanzan un pico de

pérdida ponderal del 60% de su sobrepeso, mientras que ocho de cada diez logran disminuir la

Hemoglobina Glicosilada (HbA1c) a niveles normales, valores que se pueden mantener por al menos

algunos años. Si bien la mejora del metabolismo glucídico no sorprende por su estrecha asociación

con la obesidad, la remisión de la DM2 se da tras las primeras horas de la intervención de manera

independiente de la pérdida de peso corporal, mediante un mecanismo desconocido.

El Dr. Avner Leshem del laboratorio del Dr. Eran Elinav dentro del Weizmann Institute of Science de

Israel investiga los mecanismos detrás de la remisión temprana de la DM2 post cirugía en modelos

de ratones con intolerancia a la glucosa y durante mi tesis de grado tuve la increíble oportunidad de

sumarme a su equipo de trabajo.

En este proyecto se observa la temprana remisión de la DM2 y del hígado graso en ratones con

síndrome metabólico sometidos a una gastrectomía vertical en manga, contrario al resultado de la

intervención en sus pares tratados con una cirugía placebo.

Ya que ambos grupos reciben la misma cantidad de calorías en su dieta y mantienen igual peso

corporal, se remarca la posibilidad de la existencia de un mecanismo de mejora de la intolerancia a

la glucosa independiente de la pérdida de peso y de la restricción calórica ocasionada por la cirugía.

Por otra parte, se realizaron experimentos paralelos empleando dos dietas de diferente composición

nutritiva resultando en el mismo fenotipo, indicativo de un mecanismo independiente de la dieta.

Tras analizar las características clínicas individuales con el fin de entender el mecanismo involucrado

en la mejora metabólica, se descubrieron diferencias significativas en los niveles de moléculas

circulantes y en la expresión génica del hospedador. Pero fueron aún más notorios los cambios a

nivel de la composición y función del microbioma intestinal entre ambos grupos. Aún más

impactante, la cirugía no tiene ningún efecto metabólico en ratones estériles o “germ-free” lo que

sugeriría un mecanismo dependiente de la microbiota intestinal.

Si bien falta mucho por investigar y el proyecto no ha terminado, se ha establecido un modelo de

animales y cirugías muy estable, por lo que el camino está allanado para entender los mecanismos

detrás de la remisión temprana de la diabetes tipo 2 ocasionada por los procedimientos bariátricos y

así generar tratamientos innovadores y menos invasivos para combatir la pandemia de síndrome

metabólico mediante -por ejemplo- modificaciones del microbioma intestinal.

6

Palabras clave

Cirugía bariátrica y metabólica, diabetes mellitus tipo 2, síndrome metabólico, hígado graso,

medicina personalizada, microbioma intestinal.

7

Abreviaturas

ABX: antibióticos

Dbdb: lep db -/-

DIO: Diet-induced obesity

DM2 y T2DM: Diabetes Mellitus Tipo 2

dNTPS: deoxiribonucleotido trifosfatos

GF: Germ-free

HCD: high carbohydate diet

HFD: high fat diet

HOMA-IR: (del inglés homeostatic model assessment Insulin Resistance) modelo

homeostático para evaluar la resistencia a la insulina

Ko: knock-out

M.o.: microorganismos

MAG: Metagenome Assembled Genome

mM: milimolar

NC: normal chow

Ns: no significativo

NGS: Next Generation Sequencing

PBS: (del inglés phosphate buffered saline)Tampón fosfato salino

PFA: Parformaldehído

SBS: Sequencing By Synthesis

SCFA: Short Chain Faty Acids

SPF: Specific pathogen free

Tracto GI: Tracto Gastrointestinal

TTG: Test de tolerancia a glucosa

TTI: Test de tolerancia a insulina

WT: Wild-type

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Índice

1. Introducción .................................................................................................................................. 11

1.1 Diabetes Mellitus Tipo 2 ............................................................................................................. 11

1.1.1 Definición ............................................................................................................................. 11

1.1.2 Glucemia .............................................................................................................................. 13

1.1.3 Insulina ................................................................................................................................. 14

1.1.4 Métodos de prevención y tratamiento disponibles ............................................................. 16

1.2 Microbioma intestinal ................................................................................................................. 17

1.2.1 Definición ............................................................................................................................. 17

1.2.2 Estudio de las microbiotas ................................................................................................... 19

1.2.3 Relación con el metabolismo humano ................................................................................. 22

1.2.4 Aplicaciones biotecnológicas ............................................................................................... 23

1.3 Procedimientos bariátricos ......................................................................................................... 25

1.3.1 Definición ............................................................................................................................. 25

1.3.2 Reportes de resultados en humanos ................................................................................... 27

1.3.3 Efectos metabólicos de la cirugía ......................................................................................... 28

1.3.4 Riesgos de la cirugía ............................................................................................................. 30

2. Objetivos ....................................................................................................................................... 31

2.1 Objetivo general .......................................................................................................................... 31

2.2 Objetivos específicos................................................................................................................... 31

3. Metodología .................................................................................................................................. 32

3.1 Ratones ....................................................................................................................................... 32

3.2 Definición de dos grupos de individuos ...................................................................................... 32

3.3 Gastrectomía vertical en manga ................................................................................................. 33

3.4 Alimentación en par .................................................................................................................... 35

3.5 Prueba de la tolerancia a glucosa ............................................................................................... 36

3.6 Prueba de la tolerancia a insulina ............................................................................................... 37

3.7 HOMA-IR ..................................................................................................................................... 37

3.8 Cuantificación de moléculas de interés en el plasma sanguíneo ............................................... 37

3.9 Composición corporal ................................................................................................................. 38

3.10 Histología del hígado ................................................................................................................. 38

3.11 Análisis calorimétrico de la materia fecal ................................................................................. 38

9

3.12 Análisis transcriptómico del intestino e hígado ........................................................................ 39

3.13 Análisis de la composición del microbioma intestinal .............................................................. 39

3.14 Gráficos y análisis estadísticos .................................................................................................. 40

3.15 Esquemas explicativos .............................................................................................................. 40

3.16 Recolección de datos clínicos de pacientes humanos .............................................................. 40

3.17 Entrevistas a pacientes uruguayos sometidos a la cirugía ........................................................ 41

3.18 Trasplante de materia fecal ...................................................................................................... 41

4. Resultados Obtenidos ................................................................................................................... 42

4.1 Efectos de la gastrectomía vertical en manga sobre un modelo de ratones wild-type con

síndrome metabólico inducido por una dieta alta en grasa ............................................................. 42

4.1.1 Diseño experimental y caracterización fisicoquímica de los individuos previo al

tratamiento ................................................................................................................................... 42

4.1.2 Seguimiento de la ingesta dietética y peso corporal luego de la cirugía ............................. 44

4.1.3 Prueba de tolerancia a la glucosa ........................................................................................ 44

4.1.4 Prueba de tolerancia a la insulina ........................................................................................ 45

4.1.5 Concentración de insulina en la sangre luego de la cirugía ................................................. 46

4.1.6 Composición corporal antes y después de la cirugía ........................................................... 47

4.1.7 Histología del hígado luego de la cirugía ............................................................................. 48

4.1.8 Cuantificación de incretinas y moléculas de interés circulantes luego de la cirugía ........... 49

4.1.9 Cuantificación de ácidos biliares luego de la cirugía............................................................ 50

4.1.10 Energía cosechada de la dieta luego de la cirugía ............................................................. 51

4.1.11 Análisis transcripcional del hígado e intestino luego de la intervención ........................... 52

4.1.12 Análisis del microbioma intestinal luego de la intervención ............................................. 56

4.2 Efectos de la gastrectomía vertical en manga sobre un modelo de ratones wild-type con

síndrome metabólico inducido por una dieta alta en grasa privados de microorganismos en el

tracto gastrointestinal ....................................................................................................................... 62

4.2.1 Diseño experimental y caracterización del microbioma previo al tratamiento .................. 62

4.2.2 Prueba de tolerancia a glucosa ............................................................................................ 63

4.2.3 Confirmación del fenotipo observado en individuos Germ-Free ........................................ 64

4.3 Efectos de la gastrectomía vertical en manga sobre un modelo de ratones lep db -/- con

síndrome metabólico inducido por una deleción genética .............................................................. 66

4.3.1 Diseño experimental y caracterización fisicoquímica de los individuos previo al

tratamiento ................................................................................................................................... 66

4.3.2 Seguimiento de la ingesta dietética y peso corporal luego de la cirugía ............................. 67

4.3.3 Prueba de tolerancia a glucosa ............................................................................................ 68

10

4.3.4 Concentración de insulina en la sangre luego de la cirugía ................................................. 69

4.3.5 Cuantificación de incretinas y otras moléculas circulantes de interés luego de la cirugía .. 70

4.3.6 Cuantificación de ácidos biliares luego de la cirugía............................................................ 71

4.3.7 Energía cosechada de la dieta luego de la cirugía ............................................................... 71

5. Discusión ....................................................................................................................................... 73

5.1 Efectos de la cirugía sobre la resistencia a la glucosa ................................................................. 73

5.2 Efectos de la cirugía sobre la resistencia a la insulina ................................................................ 74

5.3 Efectos de la restricción de la ingesta calórica y de la pérdida de peso corporal luego de la VSG

.......................................................................................................................................................... 74

5.4 Efectos de la VSG sobre la reducción de grasa corporal ............................................................. 75

5.5 Cambios en los niveles de moléculas de interés circulantes en el plasma de los individuos luego

de la VSG ........................................................................................................................................... 75

5.6 Cambios en los ácidos biliares circulantes en el plasma del individuo luego de la VSG ............. 76

5.7 Cambios en la energía cosechada de la dieta luego de la VSG ................................................... 77

5.8 Cambios en la expresión génica asociada a la VSG ..................................................................... 77

5.9 Cambios en la composición del microbioma intestinal asociados a la VSG y rol en el mecanismo

de la mejora metabólica observada.................................................................................................. 78

6. Conclusiones ................................................................................................................................. 82

7. Perspectivas .................................................................................................................................. 83

8. Referencias bibliográficas ............................................................................................................. 84

9. Anexos ........................................................................................................................................... 94

11

1. Introducción

1.1 Diabetes Mellitus Tipo 2

1.1.1 Definición

La Diabetes Mellitus Tipo II (DM2) es uno de los mayores problemas para Salud Pública del siglo 21

que afecta al 8% de los adultos (1) en el Mundo incluidos unos 300 mil uruguayos (2–4). Además, 30-

40% de los adultos (lo que significa 300.000 uruguayos) sufren prediabetes, una condición que

precede la DM2 (70% de pre diabéticos desarrollan DM2) caracterizada por altos niveles de azúcar

en sangre (2,5). Así, se espera que la prevalencia de la DM2 en la población mundial continúe

creciendo de manera significativa como la ha hecho en el último siglo, estimando 700 millones de

enfermos para el 2045 (6). Todo esto representa un gasto de 850 billones de dólares por año para

tratar esta pandemia (7,8) por lo que existen enormes esfuerzos para frenarla.

Se define a la DM2 como un conjunto de trastornos metabólicos, cuya característica común principal

es la presencia de concentraciones elevadas de glucosa en la sangre de manera persistente o crónica

debido a un defecto en la producción de insulina, o a una resistencia a la acción de ella para utilizar

la glucosa (insulino resistencia), o a un aumento en la producción de glucosa o a una combinación de

todas estas (9). Así, las células del cuerpo no logran incorporar la glucosa presente en el suero y ésta

se acumula en la sangre, en el riñón y finalmente en la orina –conocido como glucosuria. El

desenlace típico de la enfermedad conlleva el desarrollo de una afectación vascular de distinta

índole y localización, así como la neuropatía diabética que deriva en trastornos neurológicos en la

parte distal de las extremidades (pies y manos), enfermedad renal, retinopatía (ceguera progresiva)

y coronariopatía (infarto agudo de miocardio) a mediano y largo plazo (10). Así, la esperanza de vida

de los pacientes que padecen esta enfermedad disminuye de cinco a diez años, lo que explica que en

la era del COVID-19 las personas con diabetes ocupan el primer lugar en la lista de muertes por

COVID-19 al entrar al hospital (11,12).

En 1980 Gerald Reaven propuso el concepto de síndrome metabólico definido como un grupo de

anormalidades metabólicas comunes a la DM2, la obesidad y las enfermedades cardiacas que

parecen ser exacerbadas por el consumo de azúcar, harina y otros carbohidratos fáciles de digerir.

Lo asoció a diversos tipos de cáncer y Alzheimer y definió su origen en los cambios bruscos del estilo

de vida y nutrición del Humano acompañado de la globalización.

Este cambio en los hábitos alimenticios se atribuye a las enormes industrias alimentarias que, para

satisfacer los requerimientos nutricionales de la población mundial, han creado la comida chatarra o

ultra procesada. Son formulaciones de insumos baratos que contienen poca comida natural,

requieren un proceso de fabricación y se caracterizan por ser hiperpalatables, baratos, llenos de sal y

sobre todo: listos para consumir (13). La facilidad que este tipo de alimento ofrece para muchas

personas y su enorme disponibilidad en cualquier góndola de supermercado ha descontrolado el

consumo de alimentos ultra procesados llenos de azúcares y sobre todo fructosa -presente en la

mayoría de bebidas azucaradas de venta libre al público. Hoy en día, es más barato consumir este

tipo de alimentos que comida no procesada (por ejemplo, sin lista de ingredientes en el paquete) lo

que también se asocia a mayor prevalencia en la población de escasos recursos (14).

12

Para poner en contexto, actualmente es más probable morir de una enfermedad metabólica que por

un acto criminal (15), como lo define el israelí Yuval Harari en su libro Homo Deus: Coca-Cola

representa un mayor riesgo que al Qaeda y hamas, existiendo hoy en día más muertes por diabetes y

obesidad que por violencia y/o terrorismo.

13

1.1.2 Glucemia

La glucemia es la medida de concentración de glucosa libre en la sangre y su valor en individuos sin

diabetes varía entre 70mg/dl y 99 mg/dl. El cerebro se alimenta principalmente de glucosa y en caso

de que el valor de la glucemia sea inferior a 70 mg/dl (hipoglucemia), este órgano no tiene suficiente

energía. Ante la hipoglicemia el organismo desarrolla una serie de respuestas de manera escalonada.

El primer mecanismo de defensa desencadenado es el cese de producción de insulina en las células

B del páncreas. En segundo lugar, el aumento de la secreción de glucagón y la producción de

epinefrina (adrenalina) ormo me g em me e o me mo

me ro e e g o me e g o eog e g oge

Disminuyen la captación periférica de glucosa. 3) Inhiben la secreción de insulina. Por otra parte,

cuando la glucemia excede los 100 mg/dl (hiperglucemia), alcanzando -en algunos casos- valores

próximos a 200 mg/dl durante muchos años consecutivos, se forman compuestos como especies

reactivas de oxígeno (ROS por sus siglas en inglés) que causan estrés oxidativo o los productos

finales de glicación (AGE por sus siglas en inglés) que se acumulan en tejidos afectados por la

diabetes y generan los problemas vasculares descritos arriba.

Se han desarrollado diversas técnicas para medir la glucemia y así conocer el estado metabólico del

individuo y –en caso de ser necesario- tomar las medidas para corregirla. En los 1970s Anthony

Ceramin y Frank Bunn de la Universidad de Rockefeller demostraron que los pacientes diabéticos

tienen una concentración dos o tres veces mayor de una forma de hemoglobina inusual en

individuos sanos denominada Hemoglobina Glicosilada o HbA1c. Esta molécula es una

heteroproteína resultante de la unión de la hemoglobina con moléculas de glucosa y es la medida

más acertada para determinar si el paciente ha manejado bien la glucemia en los últimos (tres)

meses, ya que los glóbulos rojos, que contienen la hemoglobina, tienen una vida media entre 90 y

120 días en el organismo. Por otra parte, el glucómetro permite medir la glucemia de manera

instantánea sin necesidad de personal capacitado. En la actualidad, se han desarrollado monitores

continuos de glucemia que censan el nivel de glucosa en sangre (más precisamente en el líquido

intersticial) cada 5 minutos sin necesidad de punciones.

Mientras que la glucosa de la dieta pasa a la circulación sanguínea aumentando la glucemia, otros

azúcares como la fructosa, no lo hacen, aunque también tienen un efecto diabetogénico. Estos se

almacenan directamente en el hígado y se convierten en triglicéridos aumentando las chances de

desarrollar un hígado graso y de enfermedades cardiovasculares por aumento del colesterol LDL que

los transportan. Además, la fructosa bloquea el metabolismo de glucosa en el hígado y la síntesis de

glucógeno por lo que el páncreas secreta más insulina generando insulino resistencia en el musculo

esquelético con un efecto diabetogénico al igual que la glucosa aunque sin aumentar la glucemia. Se

evidencia el impacto de la dieta moderna (basada en alimentos y bebidas llenas de fructosa

consideradas sanas por no aumentar la glucemia) sobre la salud metabólica de la población y su

relación con la pandemia de síndrome metabólico.

14

1.1.3 Insulina

El descubrimiento de la insulina se dio al final del siglo XIX, cuando se asoció el páncreas como

órgano responsable de la DM2 para, luego, en los 1920's definir a la insulina como la hormona

causante de la enfermedad. Se trata de una hormona polipeptídica producida y secretada por las

células beta de los islotes de Langerhans del páncreas cuya principal función es favorecer la

incorporación de la glucosa de la sangre hacia las células en respuesta a una glucemia elevada.

La diabetes tipo 1 es una enfermedad autoinmune en la que el organismo ataca las células beta del

páncreas eliminándolas e impidiendo así la producción de esta hormona. En el pasado un 1% de los

niños presentaban esta enfermedad de forma espontánea y morían, hasta 1921, cuando un equipo

de la Universidad de Toronto descubrió la hormona y la nombró “ ”, er v o e r íz

e br “ e o ” o q e e v e Prem o Nobe e F o ogí Me e 9 3 Por o r

parte, la DM2 implica una producción insuficiente de insulina por las células beta.

En 1960, Rosalyn Yaloe (Premio Nobel en Fisiología y Medicina en 1977) descubrió un método para

medir la insulina en sangre, que permitió demostrar la elevada concentración de esta hormona en

individuos pre diabéticos, obesos e hipertensos causada por la insulino resistencia de algunos

tejidos. Actualmente, se puede medir la insulina y su actividad en el organismo mediante diversas

técnicas como el HOMA-IR, que evalúa si existe un bloqueo o resistencia periférica a la acción de la

insulina ya que, en condiciones normales, existe un equilibrio entre la gluconeogénesis y la secreción

de insulina por las células beta del páncreas.

La resistencia a la insulina se da por una disminución de la función biológica de esta hormona que

obliga a generar un incremento en sus concentraciones plasmáticas con el fin de mantener la

homeostasis de la glucemia. Las células generan resistencia a moléculas que están presentes en el

medio en exceso por un tiempo prolongado para evitar el efecto de tan fuerte señal y equilibrar el

metabolismo celular. Es así que niveles de insulina elevados por un largo periodo de tiempo dan

lugar a resistencia a insulina. Los receptores de insulina presentes en las células son removidos de la

superficie celular o modificados químicamente generando una unión más débil. Este fenómeno se

o o e omo “ ow -reg o ” e q e b r omeo Sin embargo,

es un factor de riesgo para la DM2 por el alto nivel de glucemia consecuente ya que, de este modo,

más insulina es requerida para disminuir la glucemia. Por esto, se han desarrollado fármacos para

combatir la diabetes mediante la estimulación de la producción de insulina.

En sujetos sanos el nivel de insulina en el organismo está regulada por múltiples mecanismos que

evitan la hipoglucemia: uno de los (tantos) problemas ocasionados por niveles altos de insulina. Esta

hormona es degradada por el organismo luego de 30 minutos y los principales sitios de degradación

son el hígado y el riñón mientras que la orina su canal de salida. La IDE (del acrónimo inglés: Insulin

Degrading Enzyme) es la encargada de romper la insulina en exceso y además elimina la proteína

amiloidea. Por lo que si hay exceso de insulina en el cerebro, la IDE no logra eliminar la sustancia

amiloidea y se puede desarrollar Enfermedad de Alzheimer en el largo plazo. Ratones knock-out para

IDE desarrollan DM2 y Alzheimer de donde se conoce a esta enfermedad como la Diabetes Mellitus

Tipo 3 (16).

Mientras que se pensaba que la única función de la insulina era disminuir la glucemia, hoy en día se

conocen diversas funciones de esta hormona en el metabolismo humano y se ha asociado a diversos

15

problemas de salud, por ejemplo con la pandemia de obesidad. A pesar de que las causas de la

obesidad en humanos se desconocen, por el aumento de su prevalencia en el último siglo podría

asociarse a los cambios en los hábitos alimenticios, ya que tendemos a comer cada vez más

carbohidratos. El autor neoyorquino Gary Taubes describe una muy aceptada y probada (aunque

refutada también por otros científicos) teoría de la causa de esta enfermedad: el modelo

carbohidratos-insulina. Se basa en un aumento del nivel de grasa almacenada en el tejido adiposo

debido a la alta concentración de insulina generada por elevados picos de glucemia postprandiales

de dietas altas en carbohidratos. Al desabastecer la sangre de carbohidratos, el cerebro aumenta la

necesidad de consumir calorías generando sensación de hambre en el individuo que tiende a comer

más de lo necesario y reducir el gasto energético por la fatiga que lleva al sedentarismo. Así, las

recomendaciones médicas de comer menos y moverse más generarían un impacto adverso según

este modelo. Se cuestiona entonces el tan impuesto “efe o o vo” e gr e en

nuestra sociedad (por empresas como Coca-Cola), tornando las miradas hacia el azúcar, en su lugar

(17).

Por otra parte, la hipertensión arterial se acompaña de un elevado nivel de insulina en sangre que

genera la reabsorción del sodio (y por ende agua) en el riñón en lugar de excretarse por la orina,

aumentando la presión sanguínea por la retención hídrica. Además, la insulina se asocia al concepto

e “f or f g ” e re , or o q e o e r e ev e gre v em

nervioso, aumenta el ritmo cardiaco y por ende la presión sanguínea, de donde algunos autores

cuestionan e f mo o og “me o m v ” impuesto en todo el Mundo.

Además, la insulina juega un papel importante en el crecimiento de los tejidos y por ende también

para el desarrollo de tumores, de donde se podrían asociar la DM2 y el cáncer (18). Las células

tumorales presentan más receptores de insulina que las células normales, lo que les da la posibilidad

de absorber mayor cantidad de glucosa de la sangre y así crecer más. La IGF (del acrónimo inglés:

Insulin-like Growth Factor) es una hormona similar en estructura a la insulina que puede mimicar sus

efectos y es requerida por casi todos los tejidos del organismo para crecer. Mientras que la IGF

inhibe mecanismos de muerte celular programada (favoreciendo el desarrollo de tumores), los

tumores sobre expresan receptores de IGF y de insulina. En sangre, los IGF viajan unidos a una

proteína y así su tamaño es demasiado grande para interactuar con la célula. Sin embargo, la insulina

hace que esta unión se disuelva, creando más IGF disponible para el crecimiento tisular -y tumores

también por ende. De esta manera, tanto la IGF como la insulina son un mecanismo de defensa de la

especie humana: ante falta de comida -censado por baja insulina- se activa un modo de

supervivencia evitando generar progenie (se observa la desaparición de la menstruación) y el

crecimiento de los tejidos.

16

1.1.4 Métodos de prevención y tratamiento disponibles

Una rama de la biomedicina busca desarrollar tratamientos para combatir esta pandemia. La

potencialidad de estas metodologías se mide en base a la capacidad para regular la HbA1c y se

dividen en tres grandes categorías: modificaciones del estilo de vida, farmacoterapia y cirugía

mediante procedimiento bariátricos o cirugía metabólica (19–21).

A nivel farmacológico las inyecciones de insulina son una alternativa de tratamiento para la DM2,

aunque existen varios antidiabéticos orales cuyo nivel de administración varía de país a país y mismo

de médico a médico (22). Es posible dividirlos según su efecto en 1) las sulfonilureas o meglitinidas

que estimulan la secreción de insulina por el páncreas. 2) las biguanidas, que logran reducir la

glucemia por un mecanismo de acción desconocido. 3) Además, se desarrollaron otros fármacos

como los análogos de la incretina GLP-1 que estimulan la secreción de insulina postprandial o 4) los

inhibidores de DPP-4 que bloquean la degradación de las incretinas. Los inhibidores de SGLT2

también son un increíble descubrimiento que evita la reabsorción de la glucosa en el riñón

favoreciendo la glucosuria.

Mientras que la mayoría de los individuos con DM2 son tratados con metformina (22,23)– una

biguanida oral que es el octavo fármaco más vendido en USA (24)-, existe una corriente que opta por

métodos tradicionales como comer menos y mejor (haciendo referencia a la famosa frase de

Hipócrates “ r om omo r m e o”) o hacer más ejercicio físico. Sin embargo, debido al

fracaso de la gran mayoría de los tratamientos higiénico-dietético-alimentarios y farmacológicos

disponibles, nuevas opciones han sido estudiadas, siendo hoy en día la cirugía metabólica la de

mayor eficacia (25,26). Vale destacar que el efecto de esta cirugía no es mágico y varía según el

paciente y su disciplina luego del tratamiento (27).

Por otra parte, un alto porcentaje de los enfermos no son diagnosticados (28) y cada vez más se

aprecian enormes esfuerzos por desarrollar metodologías novedosas de prevención que combinan

datos clínicos con técnicas de aprendizaje automático para predecir el desarrollo de la enfermedad

y tratarla a tiempo (29,30). Este tipo de aproximaciones permitirá también generar predictores de la

respuesta individual a los tratamientos tanto farmacológicos como quirúrgicos disponibles,

facilitando su adecuada elección y evitando su fracaso.

17

1.2 Microbioma intestinal

1.2.1 Definición

La microbiota intestinal es el conjunto de trillones de microorganismos (bacterias, fungi, protozoos y

virus) que habitan el tracto gastrointestinal para formar el holobionte de células procariotas y

eucariotas q e m mo “ er m o” z e ger r e eme tos de la dieta que nuestra parte

eucariota no podría y sirve como un centro de señalización al generar moléculas que pasan a la

circulación sanguínea e interactúan con diversos sistemas en todo el organismo para cumplir un rol

fundamental -tanto en salud como en enfermedad- en la regulación de múltiples procesos

fisiológicos (16,31–35).

La gran diversidad de organismos y la imposibilidad de cultivarlos in vitro limitó el conocimiento de

la composición de esta flora intestinal hasta los comienzos del siglo XXI, cuando el avance de la

biología molecular y del poder de secuenciación dieron lugar a la metagenómica. Hoy en día es

posible definir cada microorganismo de una muestra, su abundancia relativa y su función, aunque el

significado sobre la salud humana no es claro y genera confusiones por lo que es un campo de

estudio nuevo con mucho por descubrir aún.

La composición y función de la microbiota intestinal se forma desde el nacimiento, tras el primer

contacto del recién nacido con los microorganismos del canal de parto de la madre, que sirven de

inóculo para su tracto gastrointestinal (36). En caso de nacimiento por cesárea (1 de 4 bebés), los

microorganismos de la piel de la madre, de los médicos y del aire del hospital (37) se encargan de

colonizar el tracto gastrointestinal aún estéril del bebé, lo que influye mucho al desarrollo de la

microbiota del adulto y se asocia con enfermedades crónicas (principalmente alergias) en la adultez.

Y q e e m rob om e “e ” em m e e beb (38) (y también del adulto

(39,40) , e e e o q e e o o o “ b o ” ( rm o o rover , ex o e e

sufran enfermedades crónicas y alergias. El mismo problema se estima en niños que pasan su

infancia encerrados en la casa durante la pandemia de COVID-19 cuya microbiota no logra

diversificar sus bacterias debido a la falta de exposición, siendo un problema secundario de este

coronavirus.

Se estima que el intestino aloja unas 10^14 células, siendo el componente principal las bacterias,

pero también otros (micro) organismos como hongos, arqueas y una cantidad desconocida de virus

ef o omo “v rom ” De e o, e aproxima a unas 10 veces el número de células eucariotas

humanas de un adulto promedio, siendo el colon humano uno de los hábitats más densamente

poblado de microorganismos del mundo con una concentración de entre 10^11 y 10^12 de

microorganismos por mL, que representan un peso total de 2.5 kg (igual al del cerebro, de dónde se

lo define como o ro “ rg o” e ro e org mo o o omo “e eg o erbero” , debido a

que su tamaño celular es 10^6 veces menor que una célula humana.

La increíble diversidad genética de 3 millones de genes que definen el metagenoma intestinal

comparado a los 25 mil del genoma humano deja en evidencia la coevolución humano-

microorganismos que suponen complementar sus funciones fisiológicas. De hecho, estudiar genética

humana involucra apenas un 1% de todo el material genético que llevamos dentro nuestro y de ahí

lo apasionante de esta área de estudio (41).

18

Si bien la composición del microbioma intestinal es bastante estable en el tiempo, varía

dependiendo de la persona, la ubicación geográfica e incluso la hora del día (42–44). Se observa en

algunos casos una composición bacteriana similar en individuos con mismo estilo de vida como los

trabajadores nocturnos o los tripulantes de avión en quienes la disrupción del reloj circadiano (jet-

lag) aparea cambios en la micro flora asociados a un mayor riesgo de padecer enfermedades

metabólicas (45–48). Ingerir alimentos y defecarlos es otra gran fuente de variaciones de la

composición microbiana. El hombre promedio ingiere alrededor de un millón de microorganismos,

simbiontes y/o patógenos, por gramo de comida ingerida. Sin embargo, no todos logran colonizar el

tracto GI ya que en el lumen intestinal deben lidiar contra el sistema inmune del hospedador pero

también con los otros microorganismos que ya colonizaron la mucosa de la lámina propia. Así, la

microbiota intestinal se moldea dependiendo de varios factores y, en consecuencia, no todos los

probióticos comerciales garantizan colonizar el intestino y ejercer la función pensada dejando sin

v or “ rob o ver ” ero ndo hacia un futuro en el que se pueda predecir

formulaciones de bacterias útiles a nivel personal (49).

En la última década se demostró una relación de causalidad del microbioma intestinal con

enfermedades metabólicas tales como Diabetes Mellitus tipo 2 y obesidad (37,50–52), marcando un

mb o e r gm obre e ferme e “ o r m b e ” (53–55) y para la nutrición. Sin

embargo, es un tema de estudio muy reciente por lo que queda definir algunos conceptos claves

como ¿qué es un m rob o “ ”? ¿C mo e e e ef r “ b o ”? A mo o e ejem o,

se observa un cambio composicional en las embarazadas cuyas especies dominantes se asemejan a

las proporciones presentes en individuos con síndrome metabólico que cosechan mayor energía de

la dieta y elevan la glucemia con el fin de otorgar la mayor cantidad de nutrientes para al feto (56).

Además, el mal uso de antibióticos tanto en humanos como en animales aparea enormes desafíos

para el área de las microbiotas creando la necesidad de contrarrestar los efectos nocivos sobre el

microbioma. A modo de ejemplo, los 58.000 años de coevolución con H. pylori parecerían estar

llegando a su fin debido al uso indiscriminado de antibióticos. No menos importante es la aparición

de bacterias multi resistentes a antibióticos o “ ú er b g” o idad patológica que se estima

podrán causar la próxima gran pandemia de la era post-antibiótico.

19

1.2.2 Estudio de las microbiotas

Debido al increíble avance del conocimiento sobre las microbiotas del cuerpo humano y su impacto

en el hospedador, el número de investigaciones aumenta año tras año. Ya que es interesante

entender qué bacterias están presentes en la muestra, el primer paso del análisis en casi todos los

casos de estudio es la asignación taxonómica para lo que se distinguen básicamente tres métodos.

La secuenciación masiva o por shotgun que permite identificar bacterias y virus a nivel de especies e

incluso cepas pero requiere acceso a bases de datos de referencia pesadas y es la más costosa; la

secuenciación del 16s del ARN ribosomal que permite la identificación -a nivel de género- de

múltiples organismos en una misma PCR pero se limita a bacterias y arqueas; y la identificación de

organismos específicos por qPCR con sus primers que requiere poner a punto el proceso para evitar

reacciones cruzadas dentro de la muestra (57–59).

Al profundizar sobre las técnicas de secuenciación masiva, los secuenciadores de la marca Ilumina

lideran el mercado siendo responsables de aproximadamente el 90% de los datos generados en el

Mundo (60). Mientras que las maquinas evolucionan mejorando la calidad de las secuencias

obtenidas, todas funcionan con el mismo principio: secuenciación por síntesis o “SBS”. Esta

metodología incluye cuatro pasos fundamentales. La preparación de la librería consiste en

fragmentar la secuencia de ADN en porciones más cortas al azar y agregarles adaptadores en los

ex remo 3’ 5’ que contienen un sitio de unión e eb or “ e e e r ” r

enganchar la secuencia al soporte del secuenciador. La librería se desnaturaliza (para obtener

secuencias de ADN simple hebra) y se carga sobre una celda de vidrio funcionalizada previamente

con secuencias de ADN complementarias a los adaptadores que se unen por ambos extremos

formando una estructura con forma de puente. Así, al agregar una ADN polimerasa se logra generar

clústeres de cada secuencia repetida alrededor de 1000 veces en un único punto de la celda de

v r o, me e “ o mer z e e e” dejando el ADN listo para secuenciar. La técnica SBS se

basa en la acción de la ADN polimerasa de incorporar dNTPs etiquetadas e e ex remo 3’ con un

fluoróforo identificatorio a las secuencias de cada clúster. Para cada ciclo se obtiene una imagen de

la luz emitida por cada clúster con la ayuda de un microscopio y así se determina la base presente en

esa posición, siendo la ventaja de secuenciar todo el clúster en paralelo el obtener una señal

lumínica más fuerte y detectable. Este proceso se repite obteniendo las secuencias de interés y los

datos obtenidos se registran en forma de archivo bcl generado a partir de las señales lumínicas que

se convierte en un archivo de texto del tipo FASTQ, conteniendo las secuencias representadas con

letras A, C, G y T para analizar.

Junto a estas técnicas se han desarrollado decenas de softwares (disponibles para diversos lenguajes

de programación) para extraer información relevante. Por ejemplo, pipelines para la asignación

taxonómica de los organismos de la muestra analizada tales como Kraken o Metaphlan que siguen

distintas metodologías para asignar la taxonomía correspondiente a cada secuencia de la muestra

obtenida por secuenciación masiva o shotgun. El resultado de la secuenciación son fragmentos de

ADN correspondiente a las bacterias (para simplificar, se adelanta que se elimina toda la información

genética de los organismos pertenecientes a otros dominios que bacteria) presentes en la muestra

denominados reads. Por un lado, Kraken busca alinear estos reads (k-mers) con el ancestro común

más bajo de todos los genomas de la base de datos que contengan ese k-mer identificando el taxón

correspondiente. Por el otro lado, la estrategia de Metaphlan es detectar secuencias de genes

20

marcadores típicos del clado para determinar la bacteria a la cual pertenece cada read analizado.

Dependiendo del objetivo del estudio es que se elige la herramienta bioinformática óptima.

Para poder entender los resultados de la secuenciación se han desarrollado algoritmos capaces de

computar la abundancia relativa de cada bacteria (a nivel de especie, género, etc.) presente en la

muestra. Mientras que Metaphlan3 incluye esta característica, Kraken se complementa con Bracken

(Bayesian Reestimation of Abundance with KrakEN) para esta actividad.

A su vez, se aplican diferentes métodos estadísticos para analizar la biodiversidad de las muestras

como la alfa y beta diversidad. Mientras que la primera es una medida de la diversidad dentro de la

muestra (qué especies están presentes y en qué abundancia relativa) la segunda es una medida de

diversidad entre dos muestras (qué tan diferentes son). A modo de ejemplo, el índice de Shannon es

una métrica para la alfa diversidad que combina riqueza y diversidad. Cuanto mayor sea este valor,

mayor es la cantidad de especies con similar (o al menos valores balanceados) abundancia relativa

en la muestra. El valor va de 1 (en caso de haber una única especie dominante) hasta el total de

especies en la muestra (en caso de que todas las especies tengan una idéntica AR). El índice de

Simpson también es usado para analizar la diversidad de una muestra y, según Wikipedia,

representa la probabilidad de que dos individuos dentro de un hábitat seleccionados al azar

pertenezcan a la misma especie. Es decir, cuanto más se acerca el valor de este índice a la unidad,

existe una mayor posibilidad de dominancia de una especie y de una población; y cuanto más se

acerque el valor de este índice a cero mayor es la biodiversidad de un hábitat. Por el otro lado, se

emplean otros índices para calcular la beta diversidad como el Bray-Curtis o el Chaos 1 que muestra

diferencias entre comunidades microbianas basadas en la información filogenética y sus

abundancias relativas.

A pesar de que la asignación taxonómica y la definición de abundancia relativa sean suficientes para

responder algunas preguntas de interés, en la mayoría de casos se requiere la regeneración de la

secuencia de ADN completa de cada bacteria presente en la muestra. Para esto existen técnicas de

binning que logran agrupar reads superpuestos en secuencias más grandes de ADN llamados contigs.

Luego, estos contigs se agrupan según su especie para formar MAGs, del inglés Metagenome-

assembled genomes, que son representaciones del cromosoma bacteriano. Así, es posible conocer la

información genética –y por ende sus funciones- de la muestra y no solo la taxonomía de las

bacterias allí presentes. A modo de ejemplo, el pipeline HUMAnN 3 para Python logra asignar la

abundancia relativa de los genes y las vías metabólicas bacterianas presentes en la muestra

secuenciada, a partir de los millones de reads obtenidos de la secuenciación masiva (61). En este

caso, los reads son alineados con bases de datos de las redes de interacciones moleculares dentro de

las células o KEGG pathways (62). De todos modos, es muy difícil lograr buenas representaciones

debido a que los reads analizados podrían no cubrir todo el genoma, de especies cuya abundancia

relativa (y por ende reads correspondientes) es baja en la muestra (63,64). De todos modos, esta

técnica es cada vez más explotada en el sector ya que debido a la rápida evolución de las bacterias

(comparado con la genética humana), ejemplares de la misma especie pueden presentar diferente

información genética otorgando distintas funciones a la comunidad bacteriana en la que se

encuentren. Además, mediante asignación taxonómica es imposible identificar los elementos

genéticos móviles (ej.: plásmidos) que se caracterizan por brindar a la célula genes de resistencia

antimicrobiana y factores de virulencia que impactan de forma directa en la salud del hospedador.

21

Por otra parte, es posible identificar bacterias o proteínas (ej.: enzimas con potencial biotecnológico)

desconocidas hasta el momento que no estén reportadas en ninguna base de datos.

Por otra parte, el cultivo de microorganismos en un laboratorio se hace necesario para responder

algunas preguntas (65–67). Así, se han realizado enormes esfuerzos en mimicar las condiciones

ambientales del intestino mediante, por ejemplo, cámaras de anaerobiosis, entre otros. La

posibilidad de generar un biobanco de bacterias con funciones metabólicas asociadas es una

oportunidad enorme para el campo de los probióticos y el objetivo de investigadores prestigiosos.

Por último, cabe destacar que el estudio del microbioma intestinal presenta otras limitaciones que

imposibilitan la explotación del conocimiento al día de hoy (68,69) aunque se estima en unos años el

campo evolucionará positivamente. Es sabido que la composición microbiana varía a lo largo de todo

el tracto gastrointestinal por lo que analizar una muestra de materia fecal no es representativo de la

microbiota intestinal. Para eso, hay grandes esfuerzos por desarrollar algoritmos de aprendizaje

automático que, a partir de muestras fecales no invasivas, logren generar un mapa del contenido

microbiano de cada región del tracto gastrointestinal para conocer esta información sin necesidad

de un muestreo invasivo. Además, no es posible conocer la cantidad exacta de cada microorganismo

(m.o.) en la muestra, solamente su abundancia relativa.

22

1.2.3 Relación con el metabolismo humano

La microbiota intestinal ha demostrado estar estrechamente ligada al metabolismo de su

hospedador humano (70). Una corriente científica liderada por Justin Sonnenburg asocia el increíble

aumento de la prevalencia de e ferme e me b ( e r omo “ e or e ombre”

el estado de inflamación crónico en los habitantes de los países denominados como WEIRD

(Westernized, Educated, Industrial, Rich and Democratic) a un común denominador: disbiosis de la

microbiota intestinal generada por el estilo de vida en estos lugares. Para respaldar el concepto,

basta con analizar los cambios de las microbiotas que acompañan la globalización al comparar

microbiomas de habitantes de áreas rurales contra las de los de ciudades, y observar los rasgos

característicos del microbioma intestinal en pacientes con un sinfín de enfermedades metabólicas

tales como enfermedad inflamatoria del intestino, Alzheimer, Parkinson, ELA, depresión, ansiedad,

asma y sobre todo en obesidad y diabetes tipo 2 entre muchas otras (16,71). De todos modos, es

imposib e ef r e m rob o omo “ b ” q e queda mucho camino por recorrer en

este campo de estudio y no se cono e o q e erí m rob o “ ” ni si será posible

universalizar este concepto.

Para profundizar, se han reportado varios estudios que asocian ciertas bacterias intestinales con el

nivel de glucosa en sangre y la insulinorresistencia (72–76) en varios escenarios tales como al 3er

mes de gestación (37) y la ingesta de edulcorantes no calóricos (51) entre otros. Además, ha

demostrado mediar los efectos anti-diabetes de varios medicamentos. Asimismo, el trasplante de

materia fecal (FMT) de un donante flaco mejora la insulino resistencia en humanos obesos, lo que

sugiere la importancia de la microbiota en los mecanismos de homeostasis de la glucemia y sugiere

que el microbioma podría ser la causa la enfermedad (y/o de la cura).

23

1.2.4 Aplicaciones biotecnológicas

La microbiota intestinal regula la patogénesis, evolución y tratamiento de diversas enfermedades

metabólicas (31,34,69,77) por lo que modificar la microbiota y su interacción con el hospedador

podría tener un increíble valor terapéutico para controlar y/o prevenir enfermedades.

A diferencia del genoma humano, la información genética de la microbiota intestinal varía

constantemente por lo que se puede asociar cada bacteria (con su respectivo ADN) a un bloque

funcional de la microbiota intestinal pudiendo moldear sus funciones al alterar su composición. Así,

diversas start-ups han surgido en estos últimos años estimando un futuro de “me a

er o z b e e o ”, en donde los médicos tengan que tratar al paciente en sí pero

también a su microbiota intestinal, entendiendo que somos un holobionte en donde coexisten

células humanas y no humanas.

Siguiendo este razonamiento, encontrar un consorcio de bacterias causantes de un fenotipo

específico sería suficiente para modificar el microbioma del sujeto como tratamiento. Sin embargo,

e o r r re e e re er o m rob o me bo mo “ o” o e

suficiente para idear un tratamiento mediante cambios composicionales: una estrategia efectiva

para modificar el microbioma es necesaria también, teniendo en cuenta que no es sencillo para las

bacterias colonizar un intestino habitado por otros microorganismos (78).

Mientras que los antibióticos atacan microorganismos no blanco poniendo en peligro la estabilidad

de la microbiota y generan bacterias resistentes, los probióticos convencionales (por ejemplo

aquellos comercializados por la multinacional BioGaia o Yakult) no tienen la capacidad de colonizar

la gran mayoría de los tractos gastrointestinales de los consumidores debido a sus propias

características (79,80). Incluso, l fr e e “ om r rob o r re r e m o e

b o” e o r dictoria debido al efecto negativo que este tiene en la recuperación de la

microbiota (78).

Debido al fracaso de los métodos actuales para modificar el microbioma, diversas startups buscan

establecer un método efectivo como es el uso de fago virus para atacar únicamente las bacterias

blanco (81) o probióticos personalizados (82) que buscan tratar cada microbiota individualmente y

no como algo común a todos. Se esperan grandes avances en la personalización de los probióticos ya

sea a partir de bacterias aisladas de la naturaleza o incluso bacterias modificadas genéticamente

para producir proteínas recombinantes de interés (49,78,79,83,84).

Para ejemplificar, se observa que la microbiota de los adultos nacidos por cesárea son similares

entre sí pero diferente a las de los nacidos de forma natural y que se asocia a diversas enfermedades

posibles de tratar alterando el microbioma intestinal. Así, en algunos casos se aprovecha un hisopo

para raspar la vagina de la madre y someterlo al bebé para evitar que el primer inóculo sean los m.o.

de la piel de la madre y del aire del hospital con el fin de prevenir los problemas en la adultez.

Además, el mismo problema ocurre en niños no amamantados del pecho directamente asociado a

diferencias en la composición microbiana intestinal con la de los niños que sí reciben (85,86). Por lo

que se están desarrollando métodos para combatir esto mediante, por ejemplo, la administración de

probióticos a estos bebés. Por último, como se menciona arriba, un gran impacto secundario del

aislamiento físico necesario para frenar la pandemia del COVID-19 es la falta de diversidad

24

bacteriana en el tracto GI de los individuos debido a la poca exposición con el exterior. Métodos para

mitigar esto serán necesarios en un futuro mediante, por ejemplo, probióticos.

Además, existe un sinfín de aplicaciones potenciales en Salud que involucran otras áreas de la

ciencia como la inteligencia artificial enfocadas en entrenar algoritmos capaces de predecir el efecto

de una intervención quirúrgica, dietética, de estilo de vida, etc. para cada persona (87).

Por otra parte, ya que el microbioma se relaciona con el exterior, es necesario cuidar el ambiente

que nos rodea para evitar cambios bruscos en nuestras microbiotas que puedan tener efectos

nocivos sobre nuestra salud. Esto es posible mediante acciones simple como ventilar una habitación

o evitar ex e v m ez o o or o q e “b rre” o m roorg mo “b e o ” (q e

mantienen una biota estable) dando la oportunidad a q e o m roorg mo “m o ” -que no

podrían establecerse originalmente por competencia- e o o z r e e o ego “ r”

nuestros intestinos. Por la pandemia del COVID-19, se estima que la sociedad tenderá hacia una

excesiva limpieza en el porvenir, de donde surgirán aplicaciones biotecnológicas para luchar contra

estas disbiosis ambientales (88).

Otra aplicación interesante es el estudio de metagenomas de muestras tomadas del transporte

público, desagües y hospitales de distintos puntos estratégicos del territorio que brindan la

posibilidad de conocer el estado de salud de los habitantes de cada zona basada en las bacterias allí

presentes. También permite generar mapas moleculares para seguir los caminos de algunos

patógenos en la ciudad posibilitando el frenado de contagios o prevenir la diseminación de bacterias

resistentes a antimicrobianos (89).

25

1.3 Procedimientos bariátricos

1.3.1 Definición

La cirugía bariátrica es el conjunto de procedimientos quirúrgicos diseñados en la década de 1950,

con el fin de tratar la obesidad modificando el sistema digestivo del paciente por lo que se la conoce

mb omo “ r gí e obe ” (90). Además, en 1982 se la asoció a una temprana mejora de

la T2DM, hipertensión, apnea de sueño, hiperlipidemia, incontinencia urinaria, disfunción sexual y

hasta celiaquía, de donde sale e ombre “ r gí me b ” (91–101).

Existen diversas técnicas quirúrgicas que logran un cambio fisiológico del tracto gastrointestinal que

se dividen en dos tipos (102). Las restrictivas, que consisten en reducir el volumen del estómago

generando una menor capacidad para ingerir alimentos. Por el otro lado, las malabsorbativas, que se

basan en cambios del tracto gastrointestinal que generan un bypass del bolo alimenticio de una

significante porción del intestino, lo que retarda la exposición de éste a las secreciones pancreáticas

y biliares disminuyendo la capacidad de absorber los nutrientes de la dieta. Algunos de los ejemplos

son la banda gástrica ajustable (AGB: adjustable gastric band) que consiste en colocar un balón

inflable alrededor del estómago del individuo que se infla y se desinfla dependiendo del peso del

paciente: si gana peso le inflan pero si sufre se desinfla. Sin embargo, hoy en día la mayoría de

operaciones son para sacar este balón porque es una técnica que está absuelta debido a su falta de

efectividad a largo plazo. Por otra parte, el bypass gástrico o RYGB por las siglas en inglés Roux-en-Y

Gastric Bypass consiste en un cambio estructural del intestino y es la segunda técnica más empleada

aunque puede ser complicada quirúrgicamente. Este procedimiento crea un reservorio gástrico de

unos pocos centímetros cúbicos (efecto restrictivo), y un puente que lleva la bilis, jugo gástrico y

pancreático a un sector más distal del tubo digestivo, donde se mezclan con el bolo alimenticio para

comenzar la digestión y absorción de nutrientes (efecto malabsortivo). Por otra parte, la

gastrectomía vertical en manga (VSG: vertical sleeve gastrectomy) es un procedimiento de similar

efectividad que el antedicho y el más realizado hoy en día. Consiste en quitar el 80% del volumen

total del estómago, dejando un estrecho tubo gástrico como resultado del mismo. Además, existen

diversas variaciones de los procedimientos tradicionales que han surgido en los últimos años y se

adaptan a las necesidades de los pacientes (103).

Dado que las enfermedades metabólicas se asocian a la obesidad, no es sorprendente que mejoren

luego de la reducción de peso corporal post quirúrgico. Mientras que seguimientos de pacientes

muestran que el pico de pérdida de peso corporal es al año de la intervención, se observa en la

clínica que la mayoría de los pacientes diabéticos reducen su glucemia a tan solo algunas horas de la

cirugía bariátrica (104). Los pacientes salen del hospital con un nivel de glucemia normal a pesar de

la disminución (o completa eliminación en algunos casos) de los fármacos antidiabéticos ingeridos

previo al tratamiento (104–106). Este fenómeno se repite en pacientes no obesos diabéticos y

también en obesos no diabéticos que mejoran su metabolismo glucídico. En todos los casos esto

precede a la pérdida de peso corporal asociada a la cirugía por lo que los mecanismos detrás de esta

mejora temprana de la DM2 luego de la cirugía bariátrica no se conocen y motivan esta tesis de

grado (93,107).

26

La indicación de realizar una cirugía bariátrica a un paciente surge del IMC (índice de masa corporal)

y de las comorbilidades que este padezca, aunque el primero por si sólo puede ser el factor que

determine la necesidad de cirugía en algunos casos (IMC mayor o igual a 40). Por su parte, existen

hoy día indicaciones para realizar una cirugía metabólica que intenta corregir, mejorar o curar,

enfermedades metabólicas como la T2DM, dislipemia e hipertensión arterial, entre otras. Estos

procedimientos son los mismos utilizados en cirugía bariátrica, pero en pacientes que no

necesariamente son obesos.

A pesar de ser más efectiva que los tratamientos convencionales para reducir el peso corporal y

mejorar otras comorbilidades asociadas a la obesidad (26,108), la cirugía tiene riesgos sobre todo

relacionados a la característica obesa de los pacientes cuyo índice de masa corporal promedio es

41.5 (109,110). Así, un tratamiento igualmente eficaz y de menor riesgo sería de gran utilidad para el

sector de la población afectada. Por otra parte, mientras que la mayoría de los pacientes

experimentan pérdida de peso corporal y remisión de la diabetes tipo 2 de manera prolongada, se

ha observado que aproximadamente un 20% recae en la enfermedad dentro de los 5 años luego de

la operación (111). Es por esto que en (112) se busca crear un algoritmo capaz de predecir el efecto

de la cirugía en un individuo de características (antropometría, microbioma intestinal, estilo de vida,

etc.) determinadas. Esto ayudaría a los pacientes a combatir el estrés y ansiedad de la

incertidumbre previo a la intervención quirúrgica y también es uno de los objetivos a largo plazo de

este proyecto de tesis de grado.

Para poner en contexto, en Uruguay la Sociedad Uruguaya de Cirugía Bariátrica y Metabólica

(SUCBM) nuclea información relevante y brinda apoyo a los pacientes. En el país hay al menos 5

equipos multidisciplinarios que realizan cirugía bariátrica y se estiman alrededor de 500 operaciones

por año (aunque 2020 y 2021 los números se vieron afectados por la pandemia del COVID-19). Si

bien el tratamiento es efectivo y permitiría ahorrar (a los pacientes pero también a seguros médicos,

etc.) mucho dinero destinado a tratar diabetes, obesidad y sus afecciones derivadas, no se logra

incluirlo en la lista de tratamientos financiados por el estado y el precio de realizarlo de manera

privada ronda los 12 mil dólares americanos.

27

1.3.2 Reportes de resultados en humanos

En 2018 se realizaron 252.000 cirugías en Estados Unidos de las cuales un 60% fue del tipo

gastrectomía vertical en manga (113–117). Además, es un tratamiento cada vez más aceptado para

tratar no solo la obesidad mórbida sino también el síndrome metabólico, por lo que se espera el

número de pacientes de DM2 tratados con esta cirugía aumente conforme médicos diabetólogos la

recomienden. Mientras que se reporta que adolescentes con obesidad mórbida tratados con cirugía

bariátrica logran una mayor pérdida de peso, mayor mejora del control glicémico y los marcadores

de riesgo de enfermedades cardiovasculares comparado a aquellos que reciben tratamiento

farmacológico, menos del 0.04% de estos pacientes son tratados con cirugía bariátrica cada año

(118).

Un estudio publicado en 2017, basado en el seguimiento por 7 años de 2348 pacientes de 10

hospitales de USA que se sometieron a la cirugía entre 2006 y 2009, reporta que los efectos

metabólicos causados por la intervención generan la remisión de la diabetes tipo 2 en el 60 % de los

diabéticos operados, mientras que un 80% mejora la hiperlipidemia, aumenta el nivel de colesterol

HDL y reduce el LDL. También más del 30% se recupera de hipertensión. Si bien algunos de los

efectos ocurren tras algunas horas de la intervención, se logra reducir la HbA1c en el largo plazo

(116,119). De todos modos, por la novedad de la eficacia de la cirugía como tratamiento para la

DM2, se precisan más datos sobre la durabilidad de la pérdida de peso corporal y la mejora de la

T2DM en el largo plazo aun.

Con el fin de ponernos en los zapatos de los pacientes, entrevistamos a siete uruguayos sometidos al

tratamiento. Si bien en todos los casos fue un tratamiento para la obesidad y no para la diabetes tipo

2, es interesante compartir sus pensamientos. La fecha de la cirugía varía dependiendo de la persona

pero destacamos que seis de ellos están conformes con los resultados obtenidos hasta ahora

indicando una mejora de su calidad de vida puntuada en nueve sobre diez debido a mejoras en los

aspectos descritos arriba (mayor agilidad, menos apneas de sueño, mayor auto estima, etc.). Por

otra parte, un paciente se operó hace cinco años y logró mantener un peso sano por apenas 24

me e q e vo v e gor r or , e mo v o or em , “ r o ” re om o

su peso corporal inicial y comorbilidades.

28

1.3.3 Efectos metabólicos de la cirugía

Debido a su novedoso efecto positivo sobre el metabolismo del paciente, se investiga mucho sobre

los mecanismos involucrados (120). Se han reportado datos de pacientes diabéticos obesos que

reducen su nivel de glucemia tras apenas algunas horas de la cirugía mientras que los diabéticos

pero no obesos (imc del entorno de 32) operados también mejoran su metabolismo glucídico antes

de la pérdida de peso. Así, conjeturan que el mecanismo de mejora es independiente de la pérdida

de peso y del ayuno pre y post operación tanto en humanos como en ratones (121,122). De todos

modos, existen investigaciones que muestran una mejora similar de la insulino resistencia tanto en

pacientes sometidos o no a la cirugía bariátrica siguiendo una ingesta isocalórica baja (500 kcal/día),

lo que indica posibles efectos benéficos similares tras la reducción de ingesta calórica y, por ejemplo,

el ayuno intermitente (123–126).

Por otra parte, existen estudios que sugieren la acción de incretinas (GLP 1, GIP, Grelina, PYY)

secretadas en mayor cantidad post cirugía por el tracto gastrointestinal proximal aumentan la

sensibilidad a la insulina (91,105,127–129). Se trata de una serie de hormonas gastrointestinales

que causan un aumento en la cantidad de insulina secretada por las células beta de los islotes de

Langerhans tras la ingesta dietética. Las dos incretinas principales son el polipéptido insulinotrópico

dependiente de glucosa (GIP, del inglés Glucose-dependent Insulinotropic Polypeptide) y el péptido

similar a glucagón tipo 1 (GLP-1, del inglés Glucose-like Peptide). Mientras que el GIP es producido

por las células K del duodeno tras la absorción de glucosa o grasa, el GLP-1 se sintetiza por las células

L del íleon y el colon. Juntas, son responsables del "efecto incretinas": una respuesta secretora de

insulina dos a tres veces mayor luego de la administración oral de glucosa, en comparación con la

administración intravenosa de esta. En sujetos con diabetes tipo 2, este fenómeno está disminuido o

ya no está presente, de donde nace el fármaco Semaglutida –agonistas del GLP-1- que lo estimula.

Además, otra teoría postula cambios en la composición de los ácidos biliares circulantes luego de la

cirugía, impactando directamente en la homeostasis de la glucosa mediante los receptores TGR-5 y

FXR (130–134). Se trata de moléculas anfipáticas producidas por el hígado a partir de colesterol.

Componen la bilis en forma de sales que actúan como detergentes en el intestino delgado para

disminuir la tensión superficial de las grasas provocando la emulsión de las mismas para su posterior

degradación por lipasas allí presentes. En el intestino, la microbiota convierte los ácidos biliares

primarios en secundarios formando un ciclo en el cual se recupera más del 95%, que se reabsorben

en el intestino y se trasladan de nuevo al hígado en donde esperan a ser liberados (135). Estos sirven

de ligandos para los receptores TGR5 y FXR con funciones (no completamente conocidas aún pero)

involucradas en la homeostasis del metabolismo glucídico. Reportes bibliográficos las asocian a

numerosas vías metabólicas y se han publicado gran cantidad de artículos asociando una elevada

concentración en sangre con la mejora metabólica que sigue a la cirugía bariátrica (136,137). Más

específicamente, se ha demostrado la falta de efecto metabólico de la cirugía bariátrica en ratones

knock-out para FXR (138).

Sumado a esto, se han reportado cambios en el microbioma intestinal inmediatos a la cirugía

bariátrica tanto en humanos como en ratones (139–141). Esto, a su vez, podría estar involucrado en

el impacto metabólico de la intervención quirúrgica ya que dos estudios independientes han

mostrado una mejora del metabolismo en ratones germ-free tras recibir un trasplante de materia

29

fecal de donantes -tanto ratones como humanos- sometidos a la operación. Sin embargo, ambos

casos emplearon materia fecal de pacientes tras un largo periodo post operatorio, lo que

imposibilita conocer el rol del microbioma en los mecanismos de remisión temprana de la diabetes.

Además, administrar probióticos a los pacientes luego de la cirugía demostró no ser efectivo (83).

También se ha observado un aumento de la sensibilidad a la insulina en el hígado y en tejidos

periféricos tras la cirugía, que derivan en la remisión de la diabetes y la disminución del contenido

lipídico hepático (142).

Por todo esto, se estima que existe una colaboración fisiológica entre el microbioma intestinal, los

ácidos biliares y las incretinas en el periodo post operatorio que resulta en la mejora metabólica de

la T2DM tras algunas horas de la cirugía. (120,142,143).

30

1.3.4 Riesgos de la cirugía

Por la naturaleza de la cirugía bariátrica que es tan invasiva, ésta presenta diversos riesgos tanto a

corto como a largo plazo, pérdida de sangre, infección, peritonitis, fístulas intestinales, reacción a la

anestesia, entre otras típicas complicaciones postoperatorias. Por la condición obesa de estos

pacientes, incluso acciones rutinarias del block quirúrgico pueden complicarse, tales como la

intubación (144) o la anestesia (110). De todos modos, la técnica de la cirugía ha evolucionado

mucho en los últimos años y actualmente se reporta una tasa de mortalidad del 0.2%.

Por otra parte, existen efectos secundarios que se repiten en pacientes sometidos al tratamiento y

que son característicos del postoperatorio como es el Síndrome de Dumping, una condición médica

por la cual el estómago vacía su contenido de forma más rápida, incluso antes de terminar de digerir

la dieta, hacia el intestino delgado lo que genera náuseas vómitos, dolor abdominal general, diarrea

e incluso hipotensión y taquicardia. Además de la pérdida de peso, a veces desmedida, debido a la

mala absorción de nutrientes. Con las entrevistas realizadas comprobamos esto de primera mano.

Además, existen problemas más específicos como una peor absorción de antibióticos y otros

fármacos administrados por vía oral tras la intervención, por ejemplo (145).

31

2. Objetivos

2.1 Objetivo general El objetivo principal de este proyecto de tesis de grado es entender los mecanismos de la remisión

temprana de la Diabetes Mellitus tipo 2 luego de los procedimientos bariátricos con el fin de apuntar

la medicina hacia tratamientos novedosos, seguros y eficaces para combatir la pandemia de

enfermedades metabólicas que azota al Mundo.

2.2 Objetivos específicos

Establecer un modelo de animales de laboratorio obesos y diabéticos sometidos a cirugía

bariátrica.

Entender la influencia de la dieta y de la restricción de la ingesta calórica postoperatoria sobre el mejoramiento metabólico.

Analizar cambios en los niveles de incretinas, ácidos biliares y otras moléculas circulantes de

interés luego de la operación.

Estudiar el impacto de la cirugía bariátrica en la composición corporal y la histología del hígado que es un órgano clave para el metabolismo glucídico.

Identificar patrones postoperatorios de la expresión génica hepática e intestinal que son

órganos claves para el metabolismo glucídico.

Determinar los cambios de composición y función del microbioma intestinal asociados a la cirugía y entender su rol en el mecanismo de mejora metabólica postoperatorio.

32

3. Metodología

3.1 Ratones

Se emplean ratones de laboratorio para estudiar los mecanismos disparados por la cirugía bariátrica.

Como se estima que involucran diferentes sistemas del organismo (gastrointestinal, endócrino,

neurológico, etc.) es necesario un modelo animal en el cual hacer la cirugía y luego monitorear

parámetros fisiológicos.

El primer modelo es una cepa C57BL/6J WT comprada en Envigo y crecida en el bioterio del

Weizmann Institute of Science. Se alimenta con una dieta alta en grasa (WT-DIO) que induce

síndrome metabólico. Por el otro lado, se emplea un segundo modelo de ratones deficientes de

leptina (Lep db -/-) cuyo síndrome metabólico es causado por una modificación genética deletérea

en el gen de la leptina. Se trata de una adipoquina producida en su mayoría por adipocitos para

inhibir (mediante señalización en el hipotálamo) el apetito y se le atribuyen diversos roles en el

metabolismo humano. Los ratones knock-out para este gen presentan apetito constante y una

ingesta dietética en exceso que deriva en obesidad y diabetes. En humanos se encontró el gen ob

(receptor de la leptina) en el cromosoma 7 asociado a un fenotipo similar al de ratones ko, aunque la

frecuencia de mutación es muy baja y, de hecho, la mayoría de humanos obesos presentan altos

niveles de leptina en sangre. Esta colonia fue criada y crecida en el bioterio del Instituto Weizmann a

partir de una jaula de ratones cedida por otro laboratorio del Instituto al laboratorio de Dr. Eran

Elinav.

A los ratones sometidos a una dieta rica en grasa se les ofrece una ración comprada en Research

Diets (D12492ii, ver anexo) con 60% de calorías de grasa (HFD) ad libitum mientras que los ratones

genéticamente diabéticos consumen una ración normal (NC). Todos los individuos beben agua ad

libitum.

Con el fin de estudiar el rol del microbioma intestinal en el mecanismo de mejora metabólica ocasionado por la cirugía, en algunos experimentos se trata a los ratones (de 8 meses de edad) con un mix de antibióticos mezclados con el agua bebible. Es una solución que contiene 0.5 gramos de Vancomicina por Litro, 1 gramo de Ampicilina por Litro, 1 gramos de Neomicina por Litro y 1 gramo de Metronidazol por Litro. Se aclara que es necesario contar con un permiso para manipular animales de laboratorio en las instalaciones del Instituto y cada protocolo es sometido a un extenso análisis y posterior aprobación por un IACUC (del acrónimo inglés: institutional animal care and use committee) del departamento de veterinarios institucional.

3.2 Definición de dos grupos de individuos

Se dividen los ratones en dos grupos cuyo promedio de peso corporal, % de grasa corporal, nivel de

glucemia en ayuno y el incremento del área debajo de la curva del test de tolerancia a glucosa (TTG)

son significativamente idénticos. El primer grupo es sometido a la cirugía bariátrica mientras que el

segundo a un tratamiento placebo.

33

Tras una calibración, se estableció una línea de base del peso corporal de los ratones en 35 gramos,

siendo obesos y diabéticos pero logrando sobrevivir los tratamientos. Al alcanzar 35 gramos, los

ratones se pesan y se someten a un test oral de tolerancia a glucosa (TTG) o insulina (TTI) y a un

análisis de la composición corporal (% grasa, % músculo, % líquidos). Así, es posible generar dos

grupos de ratones estadísticamente similares respecto a estos parámetros para partir de una misma

línea de base y luego poder analizar correctamente los efectos de la intervención en ambos grupos.

P r e o, e em e gor mo o f o e P o ( o o q e e “ ” “ ” q e

tiene en cuenta las características de todos los ratones del experimento y genera 2 grupos en los que

las diferencias estadísticas para cada parámetro son mínimas. Por ejemplo, divide dos grupos para

obtener el valor mayor de T-statistics para un test de student t. Este algoritmo se creó por la

estudiante de maestría en bioinformática del Instituto, Noa Novogroder, compañera de equipo.

Debido a que el análisis del microbioma intestinal es muy importante en el estudio, se requiere al

menos dos jaulas por grupo, con el fin de caracterizar el microbioma de ambos grupos (VSG y sham)

de manera consistente y ev r e “efe o j ” ya que podrían existir diferencias entre el

microbioma de ratones de jaulas distintas sin importar el tratamiento recibido. Además, no se puede

cambiar a los ratones de jaulas por posibles peleas y dificultades de adaptación que puedan generar

ruido en el experimento, por lo que el matcheo debe adaptarse a los grupos (5 animales por jaula).

3.3 Gastrectomía vertical en manga

La gastrectomía vertical en manga es el tipo de cirugía bariátrica más empleado en la actualidad, debido a su alta eficacia, seguridad y menos demandante técnicamente. Se remueve una porción del estómago haciendo un corte paralelo a la curvatura mayor del estómago, reduciendo el volumen gástrico en un 80%, dejando un remanente gástrico o form e “m g ” El Dr. Avner Leshem (aspirante a cirujano) me enseñó cómo realizar todo el procedimiento con el fin de brindarme libertad en el laboratorio. Él se basó en bibliografía y en consejos de otros científicos trabajando en el mismo tema para poner a punto su propio protocolo. A diferencia de los humanos, los ratones no son sometidos a ayuno pre quirúrgico ya que no es necesario por la falta de perístasis reversa, además de bajar la tasa de supervivencia. El ratón WT es anestesiado con una inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg), mientras que la dosis para el ratón db/db es 200 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilacina. Además, se aclara que no se usó anestesia inhalatoria (a priori mejor opción), para poder llevar a cabo el mismo procedimiento en el bioterio Germ Free, dónde no se puede inyectar gas en el aislador para evitar contaminaciones.

Se afeita la región abdominal y se desinfecta la zona con etanol 70%. Se hace una pequeña incisión de aproximadamente 2 centímetros en el cuadrante superior izquierdo del abdomen, en donde se ubica anatómicamente el estómago, por debajo del hígado. Como el ratón está acostado sobre el lomo es necesario mover el hígado (con extremo cuidado de no dañarlo) para poder visualizar el estómago. Se agarra el estómago con la ayuda de una pinza estéril y se exterioriza del cuerpo, con mucho cuidado de no dañar los ligamentos que lo sostienen ni de provocar sangrados, con especial atención a la unión del páncreas con el estómago: zona muy irrigada y muy difícil de detener un sangrado sin ayuda de electricidad o calor (que de nuevo, no usamos ya que no se puede insertar instrumentos electrónicos al aislador germ-free). Se coloca el estómago sobre una gasa estéril humectada con suero fisiológico a 37°C (para evitar deshidratación y pérdida de calor) y se hace un

34

pequeño orificio, empleado una tijera estéril, sobre la curvatura mayor del estómago (a una altura del estómago que luego será removido) y se aprieta el contenido del estómago con el fin de vaciar y descomprimir con la ayuda de un hisopo mojado con suero a 37°C. Se coloca todo el contenido del estómago sobre la gasa, evitando el contacto con el resto de los órganos para evitar contaminaciones (consecuencias fatales). El siguiente paso es colocar un clip de titanio de 12 mm (LigaClip Applier LC407, clip LT400; Johnson & Johnson) (ver figura 1), con el fin de poder eliminar un 80% del volumen estomacal (región compuesta entre el clip y la curvatura mayor) mediante un corte con tijera estéril, separando el fundus y la curvatura mayor.

Una vez extraída esta sección, se limpia bien el clip que podría estar contaminado con restos del bolo alimenticio y se coloca el estómago en su lugar, tratando de ordenar todos los órganos en sus respectivos lugares originales. Con el fin de prevenir infecciones por contaminaciones durante la manipulación, se cubre el estómago con la punta del tejido graso perigonadal izquierdo, que en caso de contaminación, ayudará a absorber impidiendo el desarrollo de una infección peritoneal. Se aplica dos a cuatro puntos de sutura sobre la capa muscular del ratón, empleando un hilo de sutura de nylon 4/0 y se aplica uno o dos clips de metal para cerrar la piel del animal.

La cirugía lleva unos 10 minutos y luego se inyecta optalgin (4 gotas diluidas en 50 ml de suero fisiológico) como analgésico y se deja reposar a los individuos a 36°C por unas cinco a siete horas. Se mantienen en ayuno durante 24 horas y se monitorean cada 6-8 horas, inyectando más analgésico subcutáneo en caso de notar necesidad. Por otra parte, la cirugía Sham o placebo requiere exactamente los mismos pasos excepto por la descompresión gástrica y el corte del estómago.

Figura 1 – Fotos de una gastrectomía vertical en manga realizada por Fernando durante la tesis. En orden: se hace una incisión de 1 cm en la piel y luego en la capa de tejido muscular

35

subyacente; se ubica el estómago y se coloca una gaza estéril húmeda sobre el abdomen del animal; se exterioriza el estómago sin dañar ningún tejido ni sus conexiones; se descomprime el estómago retirando su contenido de forma delicada sobre la gasa; se aplica un clip para cerrar el estómago dejando una manga que conecta el esófago y el duodeno y se corta el sobrante del tejido evitando contaminaciones; se coloca el estómago dentro de la cavidad abdominal en el lugar correspondiente y se cubre con grasa; se aplican dos o tres puntos de sutura sobre el musculo y se cierra la piel con dos clips.

Figura 2 - Foto comparativa del estómago y duodeno de un ratón sometido a gastrectomía vertical en manga (izquierda) y uno cuyo tracto gastrointestinal intacto o sometido a la cirugía placebo (derecha).

3.4 Alimentación en par

Los primeros días/semanas luego de la cirugía bariátrica, el paciente experimenta una reducción de

la ingesta dietética debida a la intervención quirúrgica. Con el fin de determinar el efecto de esta

reducción de ingesta calórica postoperatoria en la mejora de la intolerancia a la glucosa, se controla

la cantidad de comida ofrecida al grupo de ratones sometidos a la cirugía sham o placebo, para que

ambos grupos ingieran la misma cantidad de calorías en la dieta. Así, los cambios fenotípicos

detectados entre los grupos, corresponderán a otros mecanismos asociados a la intervención aparte

de la reducción de la ingesta calórica ocasionada por la restricción física de alimentos.

Este proceso requiere pesar la dieta en todas las jaulas del experimento y tratar de igualar la

cantidad de dieta ofrecida a ambos grupos (sometidos a una cirugía sham o a una cirugía VSG) por

día. Aquellos individuos sometidos a una cirugía bariátrica reciben comida ad-libitum, mientras que

los sham reciben la misma cantidad de comida consumida por el grupo VSG, con el fin de que ambos

grupos ingieran la misma cantidad de calorías diarias en promedio. Al grupo sham se le divide la

36

comida en tres fracciones durante la fase activa de los roedores (el ciclo de 12 horas de oscuridad),

con el fin de evitar que coman todo rápido apenas reciben la dieta (ya que tienen más hambre que

los operados, debido a una recuperación más rápida) y así evitar diferencias entre los grupos tales

como ayuno intermitente y sus conocidas consecuencias benéficas sobre el metabolismo que

aportaría ruido a los resultados.

Por otra parte, se aclara que el Instituto cuenta con 18 jaulas metabólicas de la marca TSE-systems,

modelo PhenoMaster system completamente equipadas con sensores capaces de medir la ingesta

dietética y de agua y así realizar el trabajo de la alimentación en par de forma automática. Sin

embargo, es necesario colocar un único ratón por jaula impidiendo experimentos con N grande y

además se observó que disminuye la tasa de supervivencia postoperatoria y estar aislados podría

tener efectos secundarios a la intervención que alteren los resultados. Por esto, se decidió hacerlo

de forma manual aunque se discuten algunos resultados previos más adelante en el manuscrito.

3.5 Prueba de la tolerancia a glucosa

Es un test que brinda una idea del estado de tolerancia a la glucosa del organismo y el protocolo se

deduce de artículos científicos que lo emplean (146) y se discute con miembros del laboratorio con

experiencia previa (147).

A groso modo, se privan de comida a los individuos durante 6 horas y luego se administra por vía

oral (gavage) 1 gramo de glucosa por kg de peso corporal mediante una solución con 20% de glucosa

diluida en buffer PBS (cuya osmolaridad es similar al líquido extracelular de mamíferos) estéril o en

suero fisiológico (ejemplo: un ratón de 30 gramos precisa 0.15 mL de la solución, o 30 mg de

glucosa). Seguido a esto, se mide la glucemia periódicamente cada quince minutos por dos horas con

un glucómetro (ContourTM blood glucose meter, Bayer) mediante un corte pequeño en la punta de

la cola. Se registra la glucemia en el tiempo t=0 (glucemia en ayuno de 6 horas) y a los 15, 30, 45, 60,

90 y 120 minutos (ver anexo). El resultado de la variación glucémica se calcula por el incremento del

área debajo de la curva y este valor se compara entre los distintos grupos de ratones, antes y

después de la intervención (cirugía o sham). En el resto del manuscrito se referencia como TTG: Test

de Tolerancia a Glucosa.

37

Figura 3 – Mesada de campana del bioterio del Weizmann Institute of Science con glucómetros,

cronómetro y formulario listos para un TTG de 30 ratones (6 jaulas).

3.6 Prueba de la tolerancia a insulina

El individuo se somete a una prueba metabólica que muestra el estado de la sensibilidad a la

insulina, espejado con el ritmo con el que la glucosa es evacuada de la circulación sanguínea. El

protocolo es similar al del TTG, pero se inyecta una solución estéril de insulina (0.1 unidades por

kilogramo de peso corporal) mediante una inyección intraperitoneal, ya que la insulina no es

absorbida por vía oral. Luego, se hace las mismas mediciones periódicas descritas para el TTG y el

mismo análisis gráfico para interpretar el resultado. Al estar los ratones en ayuno de 6 horas y

someterlos a una inyección de insulina, es posible experimentar niveles de glucemia

extremadamente bajos, por lo que es necesario contar con glucosa disponible para inyectar en caso

de emergencia. En el resto del manuscrito se referencia como TTI: Test de Tolerancia a Insulina.

3.7 HOMA-IR

El HOMA-IR es un modelo matemático propuesto en 1985 por David Matthews, de la Universidad de

Oxford. Como se explica en la introducción, requiere valores de insulina y glucemia para valorar la

resistencia a la insulina en un organismo por lo que se emplea para diagnosticar síndrome

metabólico. Se calcula me e f rm ( (μUI/m x G o o (mmo / / ,5

Para este proyecto, los datos se obtienen de la cuantificación de insulina plasmática en ayuno

mediante una prueba ELISA y la glucemia corresponde al valor del TTG en t=0.

3.8 Cuantificación de moléculas de interés en el plasma sanguíneo

Con el fin de analizar niveles de distintas moléculas en la sangre de los individuos tratados, se extrae

sangre de la vena ocular mediante su punción con una pipeta Pasteur de vidrio. Con el fin de obtener

38

los resultados más reales posibles y con el aval del IACUC del instituto, no se aplica anestesia a los

ratones para este procedimiento, evitando posibles efectos fisiológicos secundarios de la droga.

En estas muestras se cuantificaron algunas moléculas de interés mediante la técnica ELISA tales

como la adiponectina, incretinas como GLP-1 y el poli péptido inhibidor gástrico con el kit de Crystal

C em “Mo e A ve GIP LISA k ” ( atálogo #81511), el péptido YY o PYY con el kit de Crystal

C em, “Mo e PYY LISA K ” ( ogo #8 50 También se midió la concentración de ácidos

b re o e k “Mo e o b e A k ” o e “Ultra Sensitive Mouse Insulin

ELISA Kit” de Crystal Chem.

3.9 Composición corporal

Se midió el porcentaje de tejido graso, tejido magro y líquido de los ratones estudiados tanto antes

como después de la intervención para analizar la pérdida de peso post operatoria. Para esto se

empleó un micro tomógrafo computarizado, proveído por el Instituto. Cada medición se hizo por

duplicado para obtener valores estadísticamente válidos. Si bien el método representa un stress

para el ratón, permite la medición in-vivo, siendo un resultado muy útil para el experimento.

3.10 Histología del hígado

La histología estudia la estructura y características de los órganos de los seres vivos. Al haber

enfermedades directamente relacionadas con estas características tales como el hígado graso se

supone que este análisis es pertinente e interesante para el objetivo del proyecto.

Se extrae una porción del tejido y se almacena en parformaldehído (PFA) al 4% para preservar el

tejido hasta su análisis. Luego, un equipo especializado del instituto se dedica a crear los cortes

histológicos y teñirlos con hematoxilina-eosina. La hematoxilina es un colorante de pH básico que

tiñe estructuras ácidas (como el núcleo celular) de azul y púrpura, mientras que la eosina tiñe

componentes básicos (como el citoplasma celular) de tonos de color rosa. Por su parte, el tejido

graso se diferencia del resto por su color blanco ya que no se tiñe con esta técnica.

Una vez preparados, se observan los portaobjetos conteniendo la feta del tejido en un scanner de

alta definición del instituto y se obtienen directamente imágenes en la computadora que son

analizadas por el equipo de investigación. Es posible cuantificar el tejido adiposo mediante un

analizador de imágenes o incluso al ojo desnudo.

3.11 Análisis calorimétrico de la materia fecal

Con el fin de evaluar la energía presente en la materia fecal de los ratones antes y después del

tratamiento, se colecta materia fecal y se almacena a -80°C hasta su uso. Luego se analiza la

concentración de calorías (kcal/gramo de materia fecal) con la ayuda de un calorímetro. Así, es

posible comparar la energía cosechada de la dieta entre distintos individuos comparando las calorías

en las heces.

39

Las muestras se secan empleando vacío, con una máquina FreeZone 4.5-liter cascade benchtop

freeze dry system, de la marca Labconco. (Catalog #: 7386030) por 24 horas, con el fin de favorecer

la combustión completa de la muestra y pesar la materia seca antes de medir las calorías, para un

cálculo exacto. El calorímetro empleado es el modelo 6200 de la marca Parr Instrument Company. Se

siguió el manual de uso provisto por la compañía para el correcto empleo y calibrado (usando

estándares de ácido benzoico) de la máquina.

3.12 Análisis transcriptómico del intestino e hígado

Con el fin de estudiar el contexto genético en el que se dan los fenotipos observados, se analiza la

expresión génica a partir del ARN (o transcriptoma) presente en ciertos órganos interesantes de

estudiar según lo descrito en bibliografía de la fisiología animal. Mientras que es posible analizar los

cambios en los niveles de ARN correspondientes a unos pocos genes con técnicas clásicas de biología

molecular tales como Northern blot o qRT-PCR entre otras, para analizar la expresión diferencial de

múltiples genes se emplean técnicas más complejas como los microarreglos o la secuenciación de

ARN que se conoce como RNA-seq.

Con tal objetivo el hígado y el intestino (sin contenido lumínico) de los individuos fueron disecados

luego de su sacrificio y almacenados en un medio de preservación de ARN (RNA later, ThermoFisher

AM7021) a -80°C hasta su uso. Luego, las muestras fueron tratadas por la experta en secuenciación

de próxima generación, Dr. Mally Bachash: se descongelan en el laboratorio y se extrae el ARN total,

o e k omer “RNe M K ” e Q ge g e o e ro o o o re ome o or e

fabricante. Se aísla en ARN mensajero (menos del 5% del ARN total) y se obtiene ADN copia

mediante una RT-PCR con lo que se preparan librerías compatibles con Ilumina para secuenciar con

el secuenciador Illumina MiSeq del laboratorio. Con el fin de optimizar el espacio en el secuenciador

y el gasto de la secuenciación, se realizó un mix de todas las librerías preparadas para cada muestra

ya que cada una cuenta con un adaptador único y diferente al resto que cumple la función de código

de barras para identificar el origen de cada secuencia al analizar los datos obtenidos.

Los datos obtenidos fueron analizados con la estrecha colaboración del Dr. Rafael Valdés-Mas,

bioinformático del laboratorio que colabora con el proyecto. Se transforma el archivo bcl obtenido

de la secuenciación a un archivo FASTQ con bcl2fastq. Luego, se pre-procesan los datos usando el

FASTP (versión 0.20.1) para trimear los adaptadores y las bases de baja calidad que, por lo general,

son la de los extremos de cada read. Luego, se mapean los reads con la base de datos de referencia

murina del Gencode vM24 con la herramienta STAR97 (versión 2.7.3a) y la expresión diferencial se

analiza con DESeq298 (versión 1.22.2) que logra normalizar la abundancia de cada gen expresado

(representado por su ARNm) con el total de genes detectados en la muestra para comparar su

presencia relativa en otras muestras. Los resultados relevantes para la tesis fueron graficados

usando Prism 8.

3.13 Análisis de la composición del microbioma intestinal

Para analizar la composición del microbioma intestinal de los individuos se llevó a cabo la

secuenciación masiva del contenido lumínico intestinal de cada ratón, almacenado a -80°C desde el

sacrificio hasta el estudio en el laboratorio. Para eso se extrajo ADN empleando un kit de extracción

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de la marca QIAGEN y se prepararon librerías genéticas de Ilumina, nuevamente por la Dra. Mally

Bachash. Luego se secuenció con la plataforma de Illumina MiSeq reads de 100 pb con configuración

single-end y los datos obtenidos se analizaron con la estrecha colaboración del Dr. Rafael Valdés-

Mas siguiendo los primeros pasos descritos en la parte anterior para filtrar los datos de interés

únicamente. Además, los reads correspondientes a genes murinos son identificados y removidos

para poder analizar únicamente datos bacterianos. Con la herramienta bioinformática Kraken 2 y

Bracken se realizó la asignación taxonómica y los resultados se verificaron empleando Metaphlan 3

también. Así, los datos se obtienen en forma de tabla con la abundancia relativa de cada bacteria

secuenciada en cada muestra. Los resultados relevantes para la tesis fueron graficados usando Prism

8.

3.14 Gráficos y análisis estadísticos

Se realizaron distintos análisis estadísticos para cada experimento con el fin de comparar los

resultados entre grupos estudiados. Con el objetivo de realizar una elección correcta del test en cada

, í r o “S Pr e e A of Re e r D R” br o or e

instituto para sus estudiantes, que describe brevemente los principios detrás de las pruebas

estadísticas y sus usos empleando la herramienta informática R (en Rstudio). En el laboratorio, se

usa el software Prism 8 (versión 8.0), que permite realizar las mismas funciones que R (graficar,

pruebas estadísticas, etc.), sin necesidad de codificar en R, obteniendo el mismo resultado final.

En todos los casos se aclara el test estadístico empleado y se consideró como significante P< 0.05. En

los gráficos se adiciona signos correspondientes a valores del P-value (*, **, *** y ****) que son

referenciados en la leyenda de cada imagen.

3.15 Esquemas explicativos

Todas las ilustraciones realizadas con fin explicativo se realizaron con la herramienta BioRender.

3.16 Recolección de datos clínicos de pacientes humanos

Un alto porcentaje de los resultados obtenidos en estudios científicos preclínicos que emplean

modelos animales para probar aplicaciones médicas en humanos no son traducibles por lo que se

busca complementar los resultados obtenidos en ratones con datos de humanos y así validar las

conclusiones. Para eso, se logró un acuerdo con el centro médico Hospital Sheba Tel Hashomer y

algunos cirujanos del centro para colectar muestras y datos clínicos de 20 humanos candidatos a

gastrectomía vertical en manga, como TTG antes y después (7-14 días) de la intervención,

recolección de materia fecal y suero sanguíneo para análisis de metabolitos. Todo se enmarca en el

estudio clínico registrado en el National Institute of Health (NIH) clinicalTrials.gov como “G em

I ex V r o e r Per o Fo ow g B r r S rger ” (NCT04 63 68

Sin embargo, no es posible realizar cirugías placebo en humanos debido a que nadie se sometería a

la misma solo por la ciencia a diferencia de los modelos de cirugía placebo en ratones que es posible

operarlos por el bien de la humanidad. Así, el grupo control sometido a las condiciones peri

41

operatorias como hospitalización, anestesia, calmantes, etc., será un grupo de adultos candidatos a

remoción de la vesícula biliar (colecistectomía), común en pacientes obesos y cuya zona anatómica

de manipulación coincide con la de la gastrectomía. Si bien no es un placebo ya que se realiza otra

cirugía que podría estar implicada en el fenotipo observado, es similar y útil a los efectos prácticos.

Es interesante resaltar que este tipo de estudio es innovador ya que, por lo general, no se utiliza otro

tipo de cirugía en el grupo control y se compara la cirugía frente a tratamientos farmacológicos o

higiénico-dietéticos.

Si bien mi tesis de grado no incluye estos datos debido a que no se logró reclutar a ningún paciente

voluntario antes de Noviembre 2020, se estima de suma importancia agregar esta explicación, con el

fin de terminar de entender el objetivo y planeamiento del proyecto. Además, se mencionan algunos

resultados preliminares en las discusiones.

3.17 Entrevistas a pacientes uruguayos sometidos a la cirugía

Con el fin de ponerme en los zapatos de los pacientes y entender la importancia de la investigación

sobre este tratamiento, entrevisté a siete adultos uruguayos que se sometieron a la cirugía

bariátrica. Los resultados son anunciados para complementar las discusiones de los experimentos.

3.18 Trasplante de materia fecal

Es una técnica muy estudiada actualmente debido al emergente cuerpo de investigaciones

relacionando composiciones del microbioma intestinal específicas y estado de salud del individuo. Se

aprueba su uso en humanos para tratar solamente la infección por C. difficile, aunque el futuro de

esta técnica como tratamiento en humanos es prometedor.

Con el fin de estudiar la relación de causalidad entre la composición del microbioma intestinal

postoperatorio y el resultado metabólico de la cirugía, se plantea el trasplante de materia fecal de

humanos o ratones sometidos a la cirugía bariátrica hacia ratones Germ-free, para evaluar la

evolución del metabolismo glucídico posterior.

El protocolo se discute con miembros del laboratorio con experiencia previa (78) y consiste en pesar

200 miligramos de materia fecal dentro de una cámara anaeróbica para evitar la muerte de aquellos

microorganismos intolerantes al oxígeno, re suspender en PBS estéril y vortexear hasta su

disolución. Luego se filtra la solución con un filtro de poros de 70 um de diámetro con el fin de

separar los sólidos y obtener los microorganismos presentes en la muestra original. Los ratones

reciben 200 uL de la solución filtrada mediante gavage y se alojan en jaulas con filtros de aire que

mantienen la esterilidad interna con el fin de evitar contaminantes exógenos colonicen el tracto GI.

Un grupo control empleado son ratones inoculados con materia fecal recolectada previo al

tratamiento y procesada de la misma manera, mientras que el control para evaluar el efecto del

gavage sobre el metabolismo involucra el gavage de PBS estéril.

A pesar de no ser una técnica empleada en el trabajo práctico escrito abajo, se cree pertinente

explicar la metodología ya que es muy importante para entender las discusiones planteadas y las

perspectivas futuras del proyecto.

42

4. Resultados Obtenidos

4.1 Efectos de la gastrectomía vertical en manga sobre un modelo de

ratones wild-type con síndrome metabólico inducido por una dieta alta en

grasa

El primer experimento se enfocó en observar la evolución de dos grupos de individuos con síndrome

metabólico inducido por la dieta cuya composición nutricional se expone en el anexo. Un grupo se

somete a la cirugía bariátrica mientras que el otro actúa como control y es sometido a una cirugía

placebo.

Se busca observar cambios inducidos por la intervención en un periodo postoperatorio de siete días

siguiendo el objetivo del proyecto de entender los mecanismos de la remisión temprana de la DMT2.

Si bien tanto en humanos como en ratones los cambios son duraderos en el tiempo, este periodo de

una semana es suficiente para observar diferencias postoperatorias en ambas especies. De todos

modos, en (148) establecieron una relación para la edad de ratones y humanos que define siete días

de un ratón equivalente a 9 meses de un humano.

4.1.1 Diseño experimental y caracterización fisicoquímica de los individuos previo al

tratamiento

30 ratones C57BL/6 machos wild-type sometidos a una dieta alta en grasa (60% kcal de grasa) se dividieron en dos grupos metabólicamente idénticos. Se definió empíricamente un peso corporal de 35 gramos como punto de partida para obtener individuos enfermos pero capaces de sobrevivir a los tratamientos logrando una sobrevida a la cirugía de 95%.

Figura 4 - Boceto explicativo del protocolo experimental. N representa el número de individuos de la cohorte experimental.

43

Siete días antes de la operación se mide el peso corporal, la glucemia plasmática en ayuno, el incremento del área bajo la curva de glucemia del test de tolerancia a glucosa y la composición corporal. Así, con la ayuda del algoritmo creado por la estudiante de maestría del laboratorio Noa Novogroder (ver métodos), se obtienen dos grupos de individuos con características físico químicas idénti Se e om gr o “ m” e o refere r gí ebo o ro “VSG” ( e acrónimo inglés: Vertical Sleeve Gastrectomy) con referencia al grupo sometido a la gastrectomía vertical en manga (figura 5).

VSGSham

0

20

40

Pe

so

co

rpo

ral

(gr)

ns

VSGSham

0

20

40

Masa g

rasa

(%)

ns

VSGSham

0

50

100

150

200

Glu

co

sa e

n a

yu

no

(mg

/dL)

ns

VSGSham

0

10,000

20,000

30,000

Te

st

To

lera

nc

ia G

luc

os

a

(are

a b

ajo

la

cu

rva

)

ns

A B

DC

Figura 5 - Estado metabólico de los ratones previo a la intervención. Gráficos informativos del A) peso corporal de ambos grupos, B) porcentaje de masa grasa en cada grupo C) Nivel de glucosa tras 6 horas de ayuno y D) área bajo la curva del test de tolerancia a la glucosa.

44

En los 4 casos el estudio estadístico es una prueba t de student desapareada brev “ o g f vo”.

4.1.2 Seguimiento de la ingesta dietética y peso corporal luego de la cirugía

Se reporta en bibliografía estudios que el efecto metabólico ocasionado por la cirugía bariátrica es similar al obtenido tras una restricción de la ingesta dietética o ayunos intermitentes, apuntando a un mecanismo puramente restrictivo. Con el fin de estudiar esta hipótesis, se alimentó a ambos grupos con exactamente la misma dieta y cantidad de calorías en los siete días post operatorios. En la figura 6 se observa que ambos grupos consumen un promedio idéntico de comida diaria durante la semana y no hay diferencias significativas en el peso corporal de los individuos de ambos grupos.

Intervención 1 2 3 4 5 6 7

0

2

4

6

Tiempo (días)

In

ge

sta

die

teti

ca

ac

um

ula

da

(gr

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tón

)

VSGSham

Intervención 1 2 3 4 5 6 7

30

32

34

36

38

40

Tiempo (días)

Pe

so

co

rpo

ral

(gr)

VSG

Sham

Figura 6 - Monitoreo de la ingesta dietética (izquierda) y del peso corporal en el periodo postoperatorio (derecha). No se observan diferencias significativas entre los grupos mediante una prueba t de student múltiple para cada día. Como todos los individuos parten y terminan el experimento con el mismo peso corporal, se conjetura que los cambios diferenciales observados entre ambos grupos serán independientes de la pérdida de peso corporal y de la restricción de ingesta calórica ocasionada por la cirugía.

4.1.3 Prueba de tolerancia a la glucosa

Con el fin de analizar los cambios metabólicos tempranos producidos por la intervención, siete días antes y después se realiza un test de tolerancia a glucosa en ambos grupos. El objetivo es comparar la capacidad del organismo de metabolizar glucosa exógena para entender la sensibilidad a la glucosa en los diferentes tejidos del cuerpo encargados de almacenarla.

45

Previo a la intervención, la gráfica de ambos grupos se comporta de manera muy similar, asociado a la partición de ambos grupos por el algoritmo especialmente diseñado para este proyecto que logra un matcheo casi perfecto. Luego de la intervención, la glucemia en ayuno de ambos grupos disminuye aunque el TTG indica un mejor manejo de la glucosa exógena por parte del grupo VSG que presenta menor glucemia tras 30, 45 y 60 minutos de la ingesta.

0 30 60 90 1200

100

200

300

400

500

Tiempo (minutos)

Glu

co

sa (

mg

/dL

)

VSGSham

0 30 60 90 1200

100

200

300

400

500

Tiempo (minutos)G

luco

sa

(m

g/d

l)

****

****

*

Figura 7 - Prueba de tolerancia a glucosa 7 días previo (izquierda) y 7 días luego de la intervención (derecha). Se emplea el test estadístico 2way ANOVA para el cuál: ****<0.0001 y *=0.0197. La falta de aclaración representa una diferencia estadísticamente no significativa.

Al calcular el área bajo la curva del gráfico anterior se obtiene valores idénticos antes de la cirugía aunque diferentes luego del tratamiento (figura 8).

0 20,000 40,000

ns

0 20,000 40,000

**

Figura 8 - Área bajo la curva de las gráficas de la prueba de tolerancia a la glucosa. Prueba T de student desapareada para cuál ns abrevia “no significativo” **=0.0016.

Como ambos grupos coinciden en peso corporal e ingieren la misma cantidad de comida en promedio, la gastrectomía vertical en manga induce una rápida mejora de la tolerancia a la glucosa que es independiente del peso corporal y de la restricción de la ingesta calórica. Este resultado es representativo de tres repeticiones del experimento y es el puntapié inicial del proyecto que investiga los posibles mecanismos involucrados.

4.1.4 Prueba de tolerancia a la insulina

La resistencia a la insulina en el tejido muscular y hepático genera un aumento de la glucemia y por ende es un factor asociado a la DM2 por lo que el aumento de la sensibilidad a la insulina es un posible mecanismo de la mejora metabólica postoperatoria. En esta etapa se analiza el estado de la

46

insulinorresistencia en los individuos antes y después de la intervención mediante un test de tolerancia a insulina. Ya que el comité de cuidado y uso animal del instituto impide realizar un TTG seguido de un TTI por el estrés generado en el animal, los resultados presentados a continuación corresponden a un experimento paralelo en otros 30 individuos sometidos a la misma configuración experimental pero con TTI en lugar de TTG. No se observan diferencias comportamentales de las gráficas en la figura 9 y el área bajo la curva es idéntica en ambos casos (figura 10).

0 30 60 90 1200

50

100

150

200

Tiempo (minutos)

Glu

co

sa

(m

g/d

l)

0 30 60 90 1200

50

100

150

200

Tempo (minutos)G

luco

sa

(m

g/d

l)

Figura 9 - Prueba de la tolerancia a la insulina 7 días antes (izquierda) y 7 días después (derecha) de la intervención quirúrgica. No se encontraron diferencias significativas mediante la prueba 2way ANOVA.

0 7,500 15,000

ns

0 7,500 15,000

ns

Figura 10 – Área bajo la curva de las gráficas de la prueba de tolerancia a la insulina 7 días antes (izquierda) y 7 días después (derecha) de la intervención quirúrgica. No se aprecia diferencias significativas mediante una prueba t de student desapareada. Esto sugiere que la mejora del metabolismo glucídico postoperatorio no se debe a un aumento de la sensibilidad a la insulina aunque se discute más adelante.

4.1.5 Concentración de insulina en la sangre luego de la cirugía

Las células beta del páncreas producen una cantidad normal de insulina en individuos sanos, exceso en pre diabética y escasa en diabéticos tipo 2. Se midió la concentración de insulina en la sangre de los individuos para entender cómo evoluciona este parámetro asociado a la DM2 luego de la cirugía.

47

Figura 11 - Gráfico representativo del nivel de insulina en ayuno en los individuos de los respectivos grupos tras 7 días de la operación. Prueba T student desapareada. No se observan diferencias en la concentración de insulina entre ambos grupos. Además, como la glucemia en ayuno resultó similar también, es esperable valores de HOMA-IR indiferentes como se muestra en la figura 12.

VSGSham

0.0

0.1

0.2

0.3

HO

MA

-IR

ns

Figura 12 - HOMA-IR de los individuos de ambos grupos. Prueba T de student desapareada. Según la definición del HOMA-IR ambos grupos carecen de resistencia a insulina ya que se define

resistentes aquellos individuos con valores superiores al 3. Sin embargo, se propone repetir este

experimento ya que los valores de HOMA-IR son muy bajos comparado a lo habitual. Además, las

muestras de sangre fueron tomadas de ratones tras 6 horas de ayuno y se propone repetir el

experimento en la etapa postprandial, aunque todo esto es discutido más adelante.

4.1.6 Composición corporal antes y después de la cirugía

Con el fin de caracterizar la pérdida de peso corporal observada en ambos grupos (figura 6), se analizó la composición corporal de los individuos antes y después de la intervención.

48

VSGSham

20

30

40

50

60

Ma

sa

gra

sa

(%)

ns

VSGSham

20

30

40

50

60

Ma

sa

ma

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(%)

ns

VSGSham

20

30

40

50

60

Ma

sa

gra

sa

(%)

*

VSGSham

20

30

40

50

60

Ma

sa

ma

gra

(%)

ns

Figura 13 - Composición corporal de los individuos de ambos grupos antes (arriba) y después (abajo) de la intervención quirúrgica. Prueba T de student desapareada para cuál *=0.0462. En la etapa pre operatoria todos los individuos presentan las mismas características corporales. Sin embargo, luego de la intervención quirúrgica se aprecia una reducción de la masa grasa del grupo VSG comparado al Sham. Al recordar que ambos grupos mantienen un peso mediano idéntico en todo momento, esta diferencia es interesante y da lugar a diversas teorías que podrían explicar la mejora metabólica debido a la estrecha relación entre el metabolismo lipídico y glucídico. A modo de ejemplo, esta disminución de tejido adiposo podría estar vinculada con la remisión del hígado graso reportada en bibliografía y así retomar la homeostasis del metabolismo glucídico. Las discusiones están presentes en la parte correspondiente, sin embargo necesita más investigación, ya que se trató de un único experimento sin repeticiones.

4.1.7 Histología del hígado luego de la cirugía

El hígado graso no alcohólico (NAFLD) es la expresión hepática del síndrome metabólico siendo muy común en pacientes de obesidad y T2DM que genera un desmejoramiento del órgano. Tal como se describe en bibliografía y conforme a los resultados mostrados arriba, es esperable la disminución postoperatoria de la cantidad de grasa corporal y específicamente hepática. Con el fin de entender esta pérdida de tejido adiposo en el hígado, se realizó el análisis histológico del hígado en ratones de cada grupo luego de la intervención.

49

50 um 50 um

Figura 14 - Fotos del análisis histológico del hígado de un individuo del grupo Sham (izquierda) y del grupo VSG (derecha). Al ser teñidas con hematoxilina-eosina (H&E), los puntos blancos representan grasa. Estas imágenes son representativas de lo observado en los 30 individuos que participaron del experimento. Como es visible en la figura 14, se da una notoria disminución de tejido adiposo (representado como gotículas blancas) en el hígado del grupo VSG comparado al grupo Sham, que podría estar relacionado con la reducción de grasa corporal demostrada en la parte anterior. Se propone cuantificar esto mediante un algoritmo de procesamiento de imágenes puesto a punto por Noa. Existen científicos que asocian la remisión del hígado graso como la causa de la mejora del síndrome metabólico. Si bien falta mucha investigación aun, es interesante discutir esto más adelante en el texto.

4.1.8 Cuantificación de incretinas y moléculas de interés circulantes luego de la cirugía

Con el fin de seguir indagando sobre posibles diferencias que nos permitan entender el mecanismo detrás de la mejora metabólica observada tras la operación, se analiza los niveles de algunas moléculas de interés en el plasma sanguíneo de los animales. En la figura 15 se observa los resultados de las pruebas de ELISA con plasma de los individuos tras la intervención.

50

Figura 15 - Nivel de hormonas en cada grupo tras 7 días de la intervención quirúrgica. Para todos los casos se hace una prueba T de student desapareada para la cual ****<0.0001, *** (PYY) = 0.0002 y *** (Adiponectina) = 0.0003.

No se observa diferencias en los niveles de GLP-1 y se observa una mayor presencia de GIP en el grupo que mejor responde a la glucosa exógena (VSG) pero más adiponectina y PYY en el grupo Sham. Así, los resultados obtenidos en esta sección son súper contra intuitivos con lo recopilado de bibliografía por lo que se discuten más adelante.

4.1.9 Cuantificación de ácidos biliares luego de la cirugía

Se reporta en bibliografía un repentino aumento del nivel de ácidos biliares en el plasma sanguíneo

luego de la cirugía bariátrica que podría asociarse a la mejora metabólica respectiva, por lo que se

mide su concentración en ambos grupos.

51

Figura 16 - Cuantificación de ácidos biliares totales en los individuos de ambos grupos. Se realizó una prueba t de student y una prueba Mann-Whitney para cuales ns abrevia no significativo. En la figura 16 se muestra una concentración de ácidos biliares estadísticamente idéntica entre ambos grupos luego de la intervención lo que contradice la literatura científica. Se discute más adelante cómo interpretar esto.

4.1.10 Energía cosechada de la dieta luego de la cirugía

Los alimentos ingeridos en la dieta son digeridos a lo largo del tracto gastrointestinal y los nutrientes absorbidos en su mayoría en el intestino delgado dónde estructuras llamadas vili y microvili aumentan la superficie de contacto de la mucosa. Los residuos de comida no absorbidos llegan al colon en donde se absorbe el agua de la comida solidificando las heces y la microbiota intestinal digiere las fibras y otras moléculas que arriban. Los restos se acumulan en el intestino en forma de heces hasta ser excretado por el ano. Publicaciones científicas muestran una mayor habilidad para “ o e r” orí e e e v o obe o om r o f o e o o rí ex r diferencias metabólicas. Se puede medir analizando la diferencia entre la energía ingerida y la restante en las heces. En este caso, como los individuos del experimento reciben la misma ingesta dietética isocalórica los siete días del periodo postoperatorio, es posible comparar la cosecha calórica midiendo directamente la energía presente en las heces.

52

VSGSham

0

2,000

4,000

6,000

En

erg

ía e

n la m

ate

ria f

ecal

(kca

l/g

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os d

e h

eces)

ns

Figura 17 - Concentración de energía en la materia fecal de los individuos de cada grupo. Para el grupo Sham se analizaron 8 muestras ya que el resto se perdieron o se quemaron en el calorímetro sin resultado. Prueba T student desapareada para cual ns abrevia no significativo.

En la figura 17 se observa un contenido calórico similar en la materia fecal de ambos grupos, sugiriendo que la cirugía no afectó la capacidad de cosechar energía de la dieta y que a su vez, este fenómeno no estaría asociado al mejoramiento del metabolismo glucídico observado en los ratones del VSG. De todos modos se discute más abajo.

4.1.11 Análisis transcripcional del hígado e intestino luego de la intervención

El intestino delgado es un órgano clave en la absorción de sustancias del quimo alimenticio y por

ende fundamental en la nutrición y los procesos fisiológicos asociados. Por otra parte, el hígado es

definido como un regulador clave del metabolismo glucídico, al controlar el almacenamiento de

glucosa periférica y producción de glucosa endógena. Se estima que diferencias en la expresión

génica de estos órganos marcan los procesos relacionados al metabolismo dietético y por ende se

cree importante el estudio en ambos grupos de ratones con el fin de analizar diferencias que puedan

asociarse al fenotipo descrito antes. Así, el propósito principal de esta aproximación es obtener un

pantallazo general de los diferentes transcriptos de cada grupo. Si bien el proyecto no busca

profundizar en el análisis de esta sección, es un dato interesante y vale la pena aprovechar los

recursos de secuenciación masiva que presenta el laboratorio. El potencial de este enfoque es

detectar genes sobre- o sub- expresados asociados al efecto metabólico de la cirugía bariátrica y

apuntar los tratamientos hacia aplicaciones basadas en manipular la expresión génica a nivel

hepático o intestinal mediante, por ejemplo, técnicas de ingeniería genética o terapias génicas (149).

En una primera instancia, es interesante entender qué se ha secuenciado en las muestras analizadas.

Para esto, el gráfico de la figura 18 muestra la cantidad de reads (eje y) para cada muestra analizada

(eje x). Si bien para este experimento se parte de 30 animales, algunos murieron durante las 2

semanas de manipulación y en otros casos -por temas prácticos- no se logró obtener muestras útiles

para analizar, por lo que se analizan 23 muestras de hígado y 20 de yeyuno.

53

Hi1 Hi10 Hi11 Hi12 Hi16 Hi17 Hi19 Hi2 Hi20 Hi22 Hi23 Hi24 Hi25 Hi27 Hi29 Hi3 Hi30 Hi4 Hi5 Hi6 Hi7 Hi8 Hi90

5

10

15

20

Read

s(m

illones)

Reads totalesReads mapeadosReads no mapeados

Hígado

id10 id11 id12 id13 id16 id17 id18 id19 id20 id21 id22 id23 id24 id25 id27 id29 id30 id7 id8 id90

5

10

15

20

Read

s(m

illones)

Reads totalesReads mapeadosReads no mapeados

Yeyuno

Figura 18 - Profundidad de la secuenciación de ARN. “H ” ref ere m e r e íg o e “ ” e e o e g o L mer orre o e individuo del experimento, numerados de 1 a 30. En azul el total de reads obtenidos en la muestra, en verde aquellas secuencias que mapean con la base de datos de referencia murina del Gencode vM24 y en rojo las que no mapean o se dejan afuera del análisis por su corto largo. Con el fin de poder comparar entre la expresión génica de ambos grupos luego de la intervención, se cuantificó la expresión relativa de cada gen y se grafican según las componentes principales de cada muestra. De esta manera es posible entender las similitudes o diferencias en la expresión génica hepática e intestinal de cada grupo luego del tratamiento.

-10 -5 0 5 10

-20

-10

0

10

20

PC2 (8%)

PC

1(6

0%

)

Figura 19 - Distribución de los individuos según un análisis de componentes principales de la expresión génica hepática respectiva de cada grupo siete días luego de la intervención. Se grafica

54

según la componente principal 2 en el eje X y según la componente principal 1 en el eje Y. En azul sujetos del grupo VSG y en rojo del Sham. Este tipo de análisis estadístico permite entender mejor las diferencias en la expresión de los casi 30 mil genes del ratón entre los grupos estudiados al reducir la dimensionalidad del conjunto de datos. Las dos primeras componentes principales explican la varianza de mayor tamaño entre el transcriptoma del grupo VSG y del Sham. Mientras que la primera componente explica el 60% de la varianza, la segunda componente explica el 8% de la varianza que separa al transcriptoma de ambos grupos. Estas componentes son variables complejas y son conocidas pero no interesantes de mostrar. Se observa que el grupo VSG y el Sham forman clústeres muy bien separados indicando un

transcriptoma diferente. Al tener en cuenta que todos los individuos parten el experimento en

idénticas condiciones (y por ende igual expresión génica) se estima que la cirugía se asocia a un

cambio en la expresión genética del hígado que podría estar relacionado a la mejora metabólica

observada en el grupo VSG pero no en el sham.

Para ir más lejos, se comparó la expresión diferencial de los genes en cada grupo de ratones. Para

esto se grafican los datos de la secuenciación en un volcano plot en el cual cada punto representa un

ge Se e “fo - ge” omo e o e e e re e ve e ex re e ge e e gr o VSG

sobre la del grupo Sham, agrupándose hacia la derecha del gráfico aquellos más expresados en el

primer grupo y en la izquierda los menos. Se definió |x|=1 como el límite para detectar fold-change

significativo entre ambos grupos. Además, ya que el genoma del ratón se compone de 30 mil genes

(similar a la cantidad en humanos) y se compara la expresión de cada uno entre ambos grupos, se

estima que muchos genes podrían presentar una expresión diferencial significativa entre ambos

grupos aunque se trate de un falso positivo. Para evitar estos errores, se opta por emplear el q-value

que ajusta el p-value del test estadístico empleado al FDR o False Discovery Rate. De esta manera, en

el eje vertical se calcula el negativo del logaritmo del q-value, por lo que aquellos genes que se

expresen significativamente más en uno de los grupos será representado arriba en el gráfico,

definiendo el |y|=2 la línea que marca la significancia estadística.

-4 -2 0 2 40

10

20

30

40

log2(FoldChange)

-lo

g1

0(q

-va

lue

)

Figura 20 – Volcano plot de la expresión génica hepática diferencial entre ambos grupos luego de la cirugía. En azul los genes cuya expresión es mayor en el grupo VSG y en rojo los del grupo Sham.

55

De acuerdo a lo observado tras el análisis de las componentes principales del transcripto de ambos grupos, se observan muchos genes hepáticos que se expresan de manera diferente luego de la intervención. Puede ser interesante profundizar sobre cada uno de estos y sus funciones aparentes (según la bibliografía) para entender su posible rol en el mecanismo de mejora metabólica asociada a la cirugía bariátrica. En la discusión se comparte algunas reflexiones y, además, en el anexo se muestra un volcano plot realizado por el Dr. Marques-Más en donde se etiqueta algunos de los genes en cuestión. Por el otro lado, se realizó el mismo análisis con los datos del ARN-seq del intestino y se grafica a

continuación.

-20 -10 0 10 20-40

-20

0

20

PC2 (17%)

PC

1 (

51

%)

Figura 21 - Distribución de los individuos según un análisis de componentes principales de la expresión génica intestinal respectiva de cada grupo 7 días luego de la intervención. En azul sujetos del grupo VSG y en rojo del Sham. A nivel del yeyuno no se observan clúster definidos que agrupen individuos del grupo VSG y Sham

respectivamente lo que se traduce a un transcriptoma similar. A priori, no se asocia la expresión

génica intestinal con los cambios fenotípicos asociados a la cirugía bariátrica.

-2 -1 0 1 20

1

2

3

4

log2(FoldChange)

-lo

g1

0(q

-va

lue

)

56

Figura 22 – Volcano plot de la expresión génica intestinal diferencial entre ambos grupos luego de la cirugía. En azul los genes cuya expresión es mayor en el grupo VSG y en rojo los del grupo Sham. En el intestino, se observan solo dos genes expresados de manera diferencial entre ambos grupos,

en concordancia con lo observado en el análisis de la composición principal mostrado arriba. En el

grupo Sham se sobre expresa el gen Scd1 y en el VSG el 2210407C18Rik, que se discute más

adelante.

4.1.12 Análisis del microbioma intestinal luego de la intervención

Si bien es interesante estudiar los cambios en la expresión genética del individuo que puedan tener

un rol en el mejoramiento de la intolerancia a la glucosa inducido por la cirugía, la información

genética del humano representa un 1% de toda la información disponible en el holobionte, tornando

imprescindible estudiar el microbioma intestinal para un mejor entendimiento de la situación.

Por lo descrito antes, es interesante analizar el contenido microbiano en distintas alturas del

intestino por lo que se tomaron muestras del lumen de una sección de yeyuno (en representación

del intestino delgado) y una de ciego (en representación del intestino grueso). Con el fin de estudiar

las muestras secuenciadas, se hizo un primer análisis de la secuenciación en sí. Lo primero a destacar

es que debido a problemas técnicos de manipulación, el volumen de contenido lumínico extraído del

yeyuno es notoriamente menor al recuperado del ciego traducido a menos reads en total.

Mue

stra

_1

Mue

stra

_2

Mue

stra

_18

Mue

stra

_3

Mue

stra

_16

Mue

stra

_20

Mue

stra

_12

Mue

stra

_4

Mue

stra

_11

Mue

stra

_5

Mue

stra

_17

Mue

stra

_13

Mue

stra

_19

Mue

stra

_6

Mue

stra

_27

Mue

stra

_22

Mue

stra

_28

Mue

stra

_25

Mue

stra

_23

Mue

stra

_10

Mue

stra

_8

Mue

stra

_21

Mue

stra

_7

Mue

stra

_9

Mue

stra

_24

Mue

stra

_29

Mue

stra

_30

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

Read

s(m

illio

nes)

Figura 23 - Cantidad de reads obtenidos de la meta secuenciación del yeyuno para cada individuo. En azul muestras de ratones del grupo VSG y en rojo del grupo Sham.

57

Mue

stra

_2

Mue

stra

_16

Mue

stra

_4

Mue

stra

_18

Mue

stra

_1

Mue

stra

_11

Mue

stra

_17

Mue

stra

_20

Mue

stra

_5

Mue

stra

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Mue

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Mue

stra

_30

Mue

stra

_12

Mue

stra

_9

Mue

stra

_10

Mue

stra

_30

Mue

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_28

Mue

stra

_27

Mue

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Mue

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_29

Mue

stra

_7

Mue

stra

_6

Mue

stra

_24

Mue

stra

_21

Mue

stra

_22

Mue

stra

_25

Mue

stra

_23

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0R

ead

s(m

illio

nes)

Figura 24 - Cantidad de reads obtenidos de la meta secuenciación del ciego para cada individuo. En azul muestras de ratones del grupo VSG y en rojo del grupo Sham. Además, para todas las muestras de ciego se obtuvo más de 5 millones de reads aunque existen

metodologías mejores para obtener mayor profundidad. Es interesante destacar que la muestra

perteneciente al ciego del ratón número 9 no presenta ningún read, lo que supone una falla de

manipulación y por ende esta muestra no se pudo analizar.

Como la idea del análisis es comparar la composición del microbioma entre los individuos y cada

muestra ha sido secuenciada en diferente profundidad, es fundamental normalizar la abundancia de

cada bacteria con el total de bacterias de la muestra. Otro modo de normalizar los datos obtenidos

es al ratificar, es decir quitar al azar reads con el fin de que todas las muestras partan del mismo

número de reads para el análisis. A modo de ejemplo, la muestra de ciego con menor cantidad de

reads es la n°23 con un total de 2.173.892 reads, por lo que se podría igualar la cantidad de reads de

las otras 25 muestras por este método.

Luego, el primer estudio para entender qué tan diferente es la composición microbiana de las

muestras secuenciadas, se mide la beta diversidad mediante la relación del logaritmo centrado o

CLR. En Prism 8 se realiza el siguiente gráfico, con las coordenadas de cada punto o muestra.

58

-60 -40 -20 0 20 40-100

-50

0

50

100

PC2(4%)

PC

1(3

2%

)

Figura 25 - Componentes principales de los datos metagenómicos. Los círculos rojos representan muestras del yeyuno del grupo Sham, los círculos azules muestras del yeyuno del grupo VSG. Los cuadrados rojos muestras de ciego del grupo Sham y los azules muestras del ciego del VSG. Se observan 4 clusters bien diferenciados que indican que la intervención tiene un efecto diferente

en cada caso sobre el microbioma. Suponiendo que los ratones antes de la intervención tienen un

microbioma muy similar debido a que son tratados idénticos, se observan cambios muy marcados

que -a priori- se asocian a la cirugía y hacen que se agrupan en 4 regiones bien separadas del

mapa. En cuanto al segundo componente principal se separan por grupo y en cuanto al primer

componente principal entre región del intestino a la que pertenecen. Es interesante observar como

el microbioma del mismo animal pero de diferentes regiones del intestino se ubican en distintos

puntos del mapa.

Por otra parte, se mide también la alfa diversidad de las muestra de cada individuo calculando el

indicie de Simpson y el índice de Shannon para cada muestra de cada grupo. Ya que se reporta en

varios estudios que una mayor diversidad microbiana se asocia con mejor salud metabólica, se

estima ver diferencias asociadas al fenotipo metabólico de cada grupo, descrito más arriba. En Prism

8 se grafica los resultados.

VSGSham

0.6

0.8

1.0

1.2

Índ

ice d

e S

imp

so

n

*

VSGSham

0

2

4

6

Índ

ice d

e S

han

no

n

*

Figura 26 - α-diversidad de las muestras de ciego tras la intervención quirúrgica. Prueba de Mann-Whitney para la cual *= 0.0164 (para shannon) y *=0.0295 (para Simpson).

59

VSGSham

0.6

0.8

1.0

1.2

Índ

ice d

e S

imp

so

n

ns

VSGSham

0

2

4

6

Índ

ice d

e S

han

no

n

ns

Figura 27 - α-diversidad de las muestras de yeyuno tras la intervención quirúrgica.

Prueba de Mann-Whitney para la cual ns abrevia no significativo.

Se observa que la gastrectomía vertical en manga genera un aumento rápido de la alfa diversidad en

el ciego (aunque no en el yeyuno) que podría estar asociado a la mejora metabólica ocasionada.

Una vez entendido que la cirugía bariátrica se asocia con cambios en la composición de la

microbiota, se busca entender cuáles microorganismos son los involucrados. Para eso, se analizó la

abundancia relativa de las bacterias presentes en cada grupo con la herramienta DESeq2 y se

analizan las diferencias entre grupos con la ayuda de un volcano plot. Nuevamente, sería interesante

graficar un volcano plot con la información metagenómica antes y después de la intervención

aunque se estima que todos los individuos parten de la misma condición y por ende se asumen

microbiotas similares, siendo interesante comparar entre los grupos luego de la intervención.

-10 -5 0 5 10 15

20

40

60

80

log2 (FoldChange)

-lo

g1

0(p

-valu

e)

s__Lactobacillus intestinalis

s__Escherichia coli

s__Lactobacillus_H reuteris__Muribaculum sp002358615

s__Lactobacillus_H reuteri_D

s__Lactobacillus_B murinus

s__Lactobacillus johnsoniis__Ileibacterium valens

s__Akkermansia muciniphila_A

60

Figura 28 - Volcano plot del ciego a partir de datos taxonómicos obtenidos con Kraken-braken.

En azul las bacterias cuya abundancia relativa es mayor en el grupo VSG y en rojo los del grupo

Sham.

Para analizar el volcano plot es interesante enfocarse en los puntos alejados del centro. Mientras

que el eje x describe las diferencias entre ambas condiciones, el eje y indica qué tan significativo es

por lo que se etiqueta los puntos correspondientes a las bacterias de mayor interés del análisis para

interpretar mejor el resultado.

Se observa un increíble aumento de la abundancia relativa de algunas especies de Lactobacillus y de

E. coli en el grupo VSG. También se observa un aumento de la presencia de A.muciniphila y de

Ileibacterium valens en el grupo Sham luego de la intervención lo que merece una extensa discusión

más adelante.

Además, por lo explicado en la introducción, una manera de respaldar el análisis es confirmar con

otro software los descubrimientos. Así, se analizan los mismo datos con el software (muy usado

mundialmente) Metaphlan 3 que emplea un mecanismo de asignación taxonómica diferente al de

Kraken-Br ke e m er m “ko er” (e refere br ebre r “ er o”,

“ orre o” e z r e o mb o , egú e Dr Eran Elinav.

-1 0 1 2 3

5

10

15

log2 (FoldChange)

-lo

g1

0(p

-valu

e) Lactobacillus_reuteri

Lactobacillus_johnsonii

Lactobacillus_murinus

Eubacterium_plexicaudatum

Figura 29 - Volcano plot del ciego a partir de datos taxonómicos obtenidos con Metaphlan 3.

En azul las bacterias cuya abundancia relativa es mayor en el grupo VSG y en rojo los del grupo

Sham.

Los resultados obtenidos son similares a lo mostrado antes por lo que se confirma que el análisis es

sólido y confiable por lo que se puede seguir avanzando en el proyecto sobre estos resultados.

Por otra parte, se hace el mismo análisis para el meta genoma del yeyuno y el gráfico se presenta a

continuación.

61

-10 -5 0 5 10 15

10

20

30

40

log2(foldchange)

-LO

G10(p

valu

e)

s__Lactobacillus_H reuteris__Lactobacillus_H reuteri_D

s__Lactobacillus_H vaginalis_A

s__Lactobacillus taiwanensiss__Lactobacillus johnsonii

s__Escherichia coli

s__Lactobacillus_B murinus

s__Lactobacillus_B animaliss__Ileibacterium valens

s__Lactobacillus intestinalis

Figura 30 - Volcano plot del yeyuno a partir de datos taxonómicos obtenidos con Kraken-Braken.

En azul las bacterias cuya abundancia relativa es mayor en el grupo VSG y en rojo los del grupo

Sham.

Sin embargo, como la carga microbiana de las muestras obtenidas del intestino delgado es muy baja

no se pudo comparar resultados empleando Metaphlan.

62

4.2 Efectos de la gastrectomía vertical en manga sobre un modelo de

ratones wild-type con síndrome metabólico inducido por una dieta alta en

grasa privados de microorganismos en el tracto gastrointestinal

Del capítulo anterior se detecta una mejoría del metabolismo glucídico ocasionada por la

gastrectomía vertical en manga mediante un mecanismo independiente de la ingesta calórica y de la

pérdida de peso corporal. Visto las variaciones de la composición del microbioma intestinal en el

grupo VSG, se busca demostrar asociaciones de causalidad entre el microbioma intestinal y los

respectivos cambios fenotípicos observados.

Para esto, se generó un segundo modelo de animales wild-type con síndrome metabólico inducido

por una dieta alta en grasa (HFD) cuya microbiota intestinal está alterada por la ingesta de

antibióticos de amplio espectro. Así, en caso de que el efecto de la cirugía bariátrica se base en los

cambios ocasionados en la composición de la microbiota intestinal que, a su vez, causen los efectos

metabólicos descritos antes, la intervención quirúrgica no tendría efecto en este modelo de ratones.

Por el contrario, en caso de repetirse el fenotipo descrito arriba, los cambios del microbioma

intestinal luego de la cirugía serían una consecuencia de la mejora metabólica y no su causa.

4.2.1 Diseño experimental y caracterización del microbioma previo al tratamiento

30 ratones C57BL/6 WT-DIO fueron expuestos al antibiótico y a la dieta alta en grasa hasta alcanzar

los 35 gramos. En el esquema siguiente se resume la configuración del experimento cuyo principal

procedimiento es el TTG, con el fin de observar si el fenotipo descrito en los dos primeros modelos

se repite en este último privado de microbiota intestinal. Además, para conocer el estado del

microbioma intestinal se analizó la microbiota de lumen de 10 individuos sacrificados para este fin

(pasando de N=30 a N=20) y de la materia fecal de otros y se observó una muy baja carga microbiana

por lo que el antibiótico afecta la microbiota de manera exitosa.

63

Figura 31 - Boceto explicativo del protocolo experimental. N representa el número de individuos de la cohorte experimental.

Las únicas variables consideradas para la asignación grupal fueron el peso corporal y el valor de

glucemia en ayuno, por lo que se pesó y sometió a un TTG a todos los individuos siete días antes de

la intervención.

4.2.2 Prueba de tolerancia a glucosa

Los resultados del TTG antes y después del tratamiento se presentan en la figura 32.

0 30 60 90 120

0

100

200

300

400

500

Time (minutos)

Glu

co

sa

(mg

/dL)

VSG+ABX

Sham+ABX

**

0 30 60 90 120

0

100

200

300

400

500

Tiempo (minutos)

Glu

co

sa

(mg

/dL)

Figura 32 - Prueba de tolerancia a glucosa 7 días previo (izquierda) y 7 días luego de la intervención (derecha).

Se emplea el test estadístico 2way ANOVA para el cuál: ** implica un p-value = 0.0098. La falta de aclaración representa una diferencia estadísticamente no significativa.

64

Tras 30 minutos de la ingesta de glucosa en el TTG previo a la intervención, se observa menor

glucemia en el grupo Sham comparado al VSG. Si bien no es lo esperado ya que todos los individuos

reciben el mismo tratamiento hasta la cirugía, este dato fue tenido en cuenta para la asignación de

los grupos y se justifica por contar con solo 4 jaulas (20 animales en total) para el estudio. La división

de grupos debe ser dos jaulas para VSG y dos jaulas para Sham ya que se evita mezclar los individuos

de jaulas diferentes por lo explicado en la sección de los métodos y esta fue la mejor división posible.

De todos modos, el área bajo la curva es idéntica para ambos grupos (figura 33 izquierda).

0 20000 40000 60000

VSG+ABX

Sham+ABXns

0 20000 40000 60000

VSG+ABX

Sham+ABXns

Figura 33 - Área bajo la curva de las gráficas de la prueba de tolerancia a la glucosa 7 días antes (izquierda) y 7 días después (derecha) de la intervención quirúrgica. No se aprecia diferencias significativas mediante una prueba t de student desapareada.

Por otra parte, ambos grupos superan el TTG luego de una semana de la intervención de la misma

manera, sin las diferencias observadas en el primer modelo descrito arriba. Esto da un increíble giro

al proyecto al demostrar que en individuos con una microbiota intestinal alterada, la respuesta

metabólica a la cirugía es nula. Se observa que los antibióticos generan un aumento de la glucemia

en ayuno de los individuos y un pico glucémico postprandial del doble de magnitud que en ratones

sin antibióticos (figuras 7 y 8), en concordancia a reportes de bibliografía.

En todo caso, los antibióticos impiden la mejora metabólica ocasionada por la gastrectomía (a juzgar

por los resultados del grupo VSG del primer modelo) pero también por la restricción de ingesta

calórica y demás factores peri operatorios (al comparar los resultados del grupo Sham del primer

modelo).

Como ambos grupos mantienen un peso corporal y una ingesta dietética y calórica idéntica, se

conjetura un mecanismo independiente de la pérdida de peso corporal y de la restricción de la

ingesta calórica aunque dependiente del microbioma intestinal, por lo que los cambios microbianos

descritos en la primer parte podrían ser la causa del efecto metabólico de la cirugía. Esto se discute

más adelante.

4.2.3 Confirmación del fenotipo observado en individuos Germ-Free

Debido al gran impacto que podría tener lo descrito arriba, se buscó profundizar al máximo sobre

este concepto y se realizaron ensayos en condiciones de esterilidad completa dentro de las

instalaciones del bioterio Germ-Free del Instituto Weizmann. Se operan ratones completamente

65

estériles siendo el primer reporte de cirugías bariátricas realizadas en estos aisladores. Si bien los

resultados obtenidos de este último experimento son similares a lo encontrado en los animales

tratados con antibióticos, son datos no publicados aún y pertenecen al laboratorio y al Instituto, por

lo que no se muestran pero sí se comentan en la discusión.

66

4.3 Efectos de la gastrectomía vertical en manga sobre un modelo de

ratones lep db -/- con síndrome metabólico inducido por una deleción

genética

Con el fin de analizar la repetitividad de los resultados obtenidos hasta ahora, se generó un tercer

modelo de animal de experimentación, lep db -/-, cuyo síndrome metabólico se debe a una

modificación genética. Como la nutrición cumple un rol fundamental en el estado de salud del

organismo, se busca demostrar la relación entre la dieta y el mecanismo de mejora metabólica

desencadenado por la cirugía bariátrica por lo que estos individuos son alimentados con una ración

balanceada (NC), diferente a la alta en grasa (HFD) del principio.

4.3.1 Diseño experimental y caracterización fisicoquímica de los individuos previo al

tratamiento

El experimento involucra 7 ratones machos y 6 hembras que no es ideal ya que mezclar sexos en el

mismo experimento puede generar ruido en los resultados, pero fue el mayor N que se consiguió en

ese momento. Esto se debe a que es impredecible el número de ratones ko obtenidos al juntar un

macho y una hembra heterocigotos por lo que coordinar una camada ko para un experimento

requiere muchas jaulas de apareamiento.

Figura 34 - Boceto explicativo del protocolo experimental. N representa el número de individuos de

la cohorte experimental: 15 ratones (7 machos y 6 hembras) C57BL/6 deficientes del receptor de

e f ero me o o r “ orm ” e r asta alcanzar los 35 gramos y

sometidos al mismo proceso experimental. A diferencia del primer experimento, en este caso no se

analizó la composición corporal de los individuos.

67

El algoritmo recomendó la división de los grupos según el estado metabólico inicial de los individuos presentados en la figura 35.

VSG

Sham

25

30

35

40

45

50

Pe

so

co

rpo

ral

(gr)

ns

VSG

Sham

0

200

400

600

Glu

co

sa e

n a

yu

no

(mg

/dL)

**

VSG

Sha

m

0

20,000

40,000

60,000

Te

st

To

lera

nc

ia G

luc

os

a

(are

a b

ajo

la

cu

rva

)

ns

Figura 35 - Estado metabólico de los ratones previo a la intervención. Comparación del peso corporal, del nivel de glucosa tras 6 horas de ayuno (los individuos consumieron agua ad-libitum pero no comida) y del resultado del test de tolerancia a la glucosa para cada grupo. No se observan diferencias en el peso corporal ni el área bajo la curva del TTG aunque la glucemia en ayuno es estadísticamente inferior en el grupo VSG. De todos modos, el algoritmo definió que esta es la mejor división posible para obtener grupos similares.

4.3.2 Seguimiento de la ingesta dietética y peso corporal luego de la cirugía

Se realiza el seguimiento de la ingesta dietética promedio de cada individuo y del peso corporal por grupo y los resultados se muestran en la figura siguiente.

Intervención1 2 3 4 5 6 70

5

10

15

20

25

VSGSham

Ing

es

ta d

iete

tic

a a

cu

mu

lad

a

(gr

/ ra

tón

)

Tiempo (días)

0 1 2 3 4 5 6 730

35

40

45

Tiempo (días)

Pe

so

co

rpo

ral

(gr)

ShamVSG

Figura 36 - Monitoreo de la ingesta calórica y peso corporal en el periodo postoperatorio.

68

Promedio de ración ingerida por cada individuo a diario (izquierda) y seguimiento del peso corporal (derecha). Prueba t de student múltiple para cual no se aprecia diferencias significantes en cada día. En la figura 36 se observa que ambos grupos consumen un promedio idéntico de comida diaria durante la semana completa y no se observan diferencias significativas en el peso corporal de los individuos de ambos grupos. Al comparar con el primer modelo estudiado, los ratones lep db -/- consumen más del doble de comida que los WT-DIO, discutido más adelante.

4.3.3 Prueba de tolerancia a glucosa

Para entender el estado metabólico de los individuos de cada grupo, se realizó un TTG y los

resultados se muestran en el gráfico siguiente.

0 30 60 90 1200

200

400

600

800

Tiempo (minutos)

Glu

co

sa

(mg/d

l)

VSGSham

0 30 60 90 1200

200

400

600

800

Tiempo (minutos)

Glu

co

sa

(m

g/d

l)

*

****

**

Figura 37 - Prueba de la tolerancia a la glucosa 7 días antes (izquierda) y después (derecha) de la intervención. Se emplea el test estadístico 2way ANOVA para el cuál * implica un p-value = 0.0192, **** un p-value <0.0001 y ** un p-value = 0.0106. La falta de aclaración representa una diferencia estadísticamente no significativa. Los resultados obtenidos tras el TTG son similares a los obtenidos en el primer modelo estudiado arriba. Si bien en ambos casos se repite la mejora de la gestión de la ingesta de glucosa exógena logrando reducir el pico de glucemia postprandial, el grupo sometido a la VSG presenta una mayor mejora. Ambos disminuyen la glucemia plasmática en ayuno (en el gráfico representado por el valor en t=0) mientras que el VSG en mayor medida. Además, tras 30 y 45 minutos de la ingesta de glucosa los individuos del grupo Sham presentan mayor glucemia que los del grupo VSG. Además, a pesar de presentar la misma área bajo la curva en el TTG previo a la intervención, siete días luego de la cirugía el grupo VSG logra reducir este valor a diferencia del grupo Sham, como se observa en la figura 38.

69

0 25,000 50,000

ns

0 25,000 50,000

*

Figura 38 - Área bajo la curva de las gráficas de la prueba de tolerancia a la glucosa. Prueba T de

student desapareada *→ -value= 0.0137.

4.3.4 Concentración de insulina en la sangre luego de la cirugía

La escasa cantidad de ratones lep db -/- impidió realizar el TTI durante la tesis, aunque se mide el HOMA-IR a partir de la concentración de insulina en el suero de individuos tras seis horas de ayuno (figura 39). Se repite lo observado en la figura 11 para el modelo anterior: no hay diferencias significativas entre los grupos.

Figura 39 - Nivel de insulina en ayuno de los individuos de los respectivos grupos tras 7 días de la operación. Una prueba T de student desapareada no indica diferencias significativas entre los grupos. A partir de estos valores se calcula el HOMA-IR que se grafica en el siguiente gráfico.

70

VSGSham

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

HO

MA

-IR

**

Figura 40 - HOMA-IR de los individuos de ambos grupos. Una prueba T de student desapareada indica diferencias estadísticamente significativas entre los grupos para el cual ** equivale a un p-value = 0.0090. En este caso, se observa que el grupo Sham presenta un mayor HOMA-IR que el grupo VSG, aunque los valores son nuevamente muy bajos y están todos por debajo de la línea de insulinorresistencia, indicando que ningún individuo tiene esta afección. De todos modos, el gráfico de la figura 40 podría asociarse con el menor área bajo la curva del TTG del grupo VSG (figura 38) por lo que esta mejora podría deberse a un aumento en la sensibilidad a la insulina. Todo esto se discute más adelante.

4.3.5 Cuantificación de incretinas y otras moléculas circulantes de interés luego de la

cirugía

Para seguir comparando entre los modelos de ratones estudiados, se analiza la concentración de estas moléculas de interés en el plasma sanguíneo de los animales.

Figura 41 - Nivel de moléculas circulantes de interés en cada grupo tras 7 días de la intervención quirúrgica. Para cada caso se realiza una prueba T de student desapareada en la que ns abrevia no significativo y ** indica un p-value = 0.0003. Al comparar estos resultados con los obtenidos para el primer modelo (figura 15), se observan coincidencias en cuanto al valor de GLP-1, estadísticamente igual en ambos casos, y en cuanto al

71

PYY, presente en mayor concentración en el grupo Sham. Los valores obtenidos para GIP y adiponectina difieren entre ambos modelos aunque en todos los casos son contra intuitivos por la información reportada en bibliografía y requieren seguir la discusión más adelante.

4.3.6 Cuantificación de ácidos biliares luego de la cirugía

Se cuantifican los ácidos biliares y los resultados se presentan en la figura 42.

Figura 42 - Cuantificación de ácidos biliares totales en los respectivos grupos. Una prueba T de student desapareada indica la ausencia de diferencias estadísticamente significativas. Al igual que lo mostrado en la figura 16, no se observa una diferente concentración de ácidos biliares totales en ambos grupos tras una semana de la operación, lo que requiere una discusión más adelante.

4.3.7 Energía cosechada de la dieta luego de la cirugía

Por último, se analiza la energía en la materia fecal de los individuos de ambos grupos y, a pesar de observar una tendencia de mayor absorción de energía dietética por parte del grupo sham, tampoco se encuentran diferencias estadísticamente significativas a nivel grupal, según lo descrito en la figura 43.

72

VSGSham

0

2,000

4,000

6,000

En

erg

ía e

n la m

ate

ria f

ecal

(kca

l/g

ram

os d

e h

eces)

ns

Figura 43 - Concentración de energía en la materia fecal de los individuos de cada grupo. Una prueba T student desapareada indica la ausencia de diferencias significativas entre ambos grupos.

73

5. Discusión

Los resultados mostrados arriba sugieren que la gastrectomía vertical en manga conlleva un rápido efecto metabólico que mejora la intolerancia a la glucosa en pacientes con esta afección, mediante un mecanismo independiente de la ingesta calórica y de la pérdida de peso corporal, aunque dependiente de la microbiota intestinal. Como los resultados se repiten en el modelo de ratones lep db -/-, se conjetura que este mecanismo es independiente de la dieta. Además, la cirugía induce la remisión del hígado graso mediante un mecanismo también desconocido aún y que podría ser independiente del mecanismo de remisión de la DM2. Entender a fondo estos mecanismos en ratones implica posibles aplicaciones traducidas en humanos y esa es la relevancia del proyecto. En esta sección se discuten los resultados obtenidos profundizando sus implicancias en salud humana con apoyo de la extensa bibliografía científica sobre el tema.

5.1 Efectos de la cirugía sobre la resistencia a la glucosa Debido a que la resistencia a la glucosa es una de las causas de la DM2, es interesante evaluar como ésta cambia luego de la cirugía al comparar el grupo de VSG con el grupo control. Mientras que en ambos grupos se da una mejora en la capacidad de metabolizar glucosa exógena luego de la intervención al disminuir el pico de glucemia postprandial, el primer grupo lo hace de mejor manera. Se propone que la reducción de la intolerancia a la glucosa observada en el grupo Sham se asocia a las condiciones periperatorias de la cirugía placebo incluyendo la reducción de la ingesta calórica. Al cuantificar el nivel de mejora de la DM2 en cada individuo, la diferencia entre el grupo VSG y el grupo control corresponde al efecto de la gastrectomía vertical en manga por lo que es un tratamiento más efectivo que la reducción de la ingesta calórica mediante, por ejemplo, dietas de ayuno intermitente. La diferencia del área bajo la curva de la prueba de tolerancia a glucosa entre ambos grupos evidencia un efecto positivo de la cirugía vertical en manga sobre el metabolismo glucídico del individuo tanto en el modelo WT-DIO como en el lep db -/-. Las diferencias glucémicas significativas tras los primeros minutos luego de la ingesta se atribuyen a una mejora en el funcionamiento de las células beta del páncreas que conlleva una respuesta insulínica postprandial mayor. De todos modos, la prueba de tolerancia a glucosa involucra la administración de una dosis de glucosa enorme que resulta en una glucemia extrema que no necesariamente recapitula las condiciones de vida normal del individuo. Así, la mejora temprana observada en estos modelos animales podría no darse en condiciones fisiológicas normales pero si tras estos desafíos de ingesta glucídica. Para evaluar esto, se podría monitorear la glucemia del animal en distintos momentos del día y medir la glucemia promedio de los ratones de cada grupo. Por otro lado, al alterar la microbiota intestinal mediante la ingesta de antibióticos de amplio espectro, los resultados frente al TTG no recapitulan lo observado en los otros dos modelos de ratones, por lo que todo indica una importante influencia de estos microorganismos sobre la mejora post quirúrgica. Para ir más lejos, en ratones GF sometidos a idéntica configuración experimental, la cirugía tiene el mismo efecto que en los ratones con antibióticos por lo que se refuerza la importancia de las bacterias del intestino sobre el fenotipo observado. De todos modos, se requieren más pruebas para mostrar causalidad.

74

Para ir más allá, se propone medir otros parámetros clínicos de riesgo para DM2 con el fin de

entender mejor el efecto de la gastrectomía, tales como la presión arterial que se asocia al síndrome

metabólico aunque se precisaría un nuevo modelo de ratón k.o. para la apolipoproteína E ya que

ratones WT no desarrollan hipertensión en respuesta a una HFD (High Fat Diet) o una HCD (High

Carbohydrates Diet) a diferencia de los humanos (150).

5.2 Efectos de la cirugía sobre la resistencia a la insulina La secreción de insulina por parte del páncreas se divide en una primera fase rápida de 10 minutos postprandiales y una segunda fase lenta de 10 a 120 minutos postprandiales. Así, el organismo logra retomar un estado basal después de dos horas de la ingesta dietética que causa un pico glucémico. Sin embargo, la velocidad de captación de la glucosa desde la sangre hacia los tejidos depende de la sensibilidad de cada tejido a la insulina por lo que es interesante analizar este factor de riesgo para DM2 (151). La falta de diferencias fenotípicas en cuanto a la disminución de la glucemia tras el TTI y el HOMA-IR en el primer modelo de ratones WT-DIO sugiere que la sensibilidad a la insulina del hígado y músculo esquelético es similar en ambos grupos luego de la intervención. Sin embargo, se reporta en la bibliografía un aumento de la sensibilidad a la insulina tras la cirugía bariátrica (122,152,153) por lo que se plantea que el ensayo no está bien diseñado técnicamente ya que la glucemia de los individuos antes del TTI postoperatorio es hipo glucémica. Al buscar otro encare para estudiar los niveles de insulina postoperatorios, el Dr. Avner Leshem realizó un nuevo experimento con idéntica configuración que la descrita arriba (figura 4). Tras una semana de la intervención quirúrgica midió la concentración de esta hormona en el suero de ratones luego de 30 minutos de una ingesta de glucosa y se observó mayor cantidad de insulina en el grupo VSG comparado al Sham. Así, se asocia este aumento de la concentración de insulina postprandial con lo observado en el TTG indicando una mejora del funcionamiento de las células beta tras la cirugía. De este último experimento se entiende que la mejora metabólica no se observa en el estado basal del metabolismo ya que los niveles de glucemia e insulina en ayuno son similares en ambos grupos del modelo WT-DIO pero diferentes en el período postprandial (también observado tras el TTG). De todos modos, como los grupos del modelo Lep db -/- (menor N y grupos no tan bien divididos) presentan valores de insulina diferentes en el metabolismo basal no es del todo claro aún esta teoría. Por todo esto, a pesar de que en el modelo de ratones lep db -/-, el HOMA-IR mostró valores significativamente mayores en el grupo Sham acorde a lo observado en el respectivo TTG, se asume que no es un resultado consistente y se propone repetir el experimento descrito en el párrafo anterior en este modelo de animales. Además, se plantea el mismo experimento con individuos del modelo de ratones tratados con antibióticos en los cuales la gastrectomía no reduce la glucemia y no bastó el tiempo del trabajo práctico en el laboratorio para llevarlo a cabo. Si los valores de insulina postprandial en este último modelo no aumentan luego de la cirugía entonces este mecanismo es dependiente del microbioma intestinal y juega un rol clave en la consecuente remisión de la DM2.

5.3 Efectos de la restricción de la ingesta calórica y de la pérdida de peso

corporal luego de la VSG La obesidad es otro factor de riesgo para la DM2 y se sabe que la restricción de la ingesta calórica y la pérdida de peso corporal son tratamientos que logran, en algunas ocasiones, revertir la enfermedad al mejorar la primera fase de la respuesta insulínica tras disminuir el contenido graso hepático y pancreático (154,155).

75

En este trabajo se observó mayor mejora metabólica en los individuos sometidos a la gastrectomía

comparado al grupo control a pesar de recibir idéntica alimentación y perder igual peso corporal

luego de la intervención en ambos modelos respectivamente. Así, se sugiere que el mecanismo de

mejora postoperatorio es independiente de la pérdida de peso corporal y de la ingesta calórica,

contrario a lo definido en otros estudios publicados que indican un efecto similar entre la restricción

dietética y la cirugía bariátrica (124,156–159).

Es interesante destacar que la dieta alta en grasa debe el 60% de sus calorías a grasa de cerdo lo que

la vuelve súper palatable. Se sugiere que la HFD es más apetecible para el ratón y por eso come

mayor cantidad y genera síndrome metabólico. Este comportamiento se repite en nuestra sociedad

hoy en día por el aumento de la disponibilidad de comida chatarra o alimentos ultra procesados que

acarrea el aumento paralelo de la prevalencia de enfermedades metabólicas. De todos modos, se

observa que todos los individuos de ambos modelos de ratones cosechan igual cantidad de calorías

de la dieta, discutido más adelante. Además, en otro estudio se observó que la cirugía bariátrica no

genera cambios en los gustos por la comida en ratas sometidas al tratamiento quirúrgico (160).

5.4 Efectos de la VSG sobre la reducción de grasa corporal La afección hepática del síndrome metabólico es el hígado graso no alcohólico (NAFLD, del inglés

non-alcoholic fatty liver disease) y tiene una alta prevalencia en los países industrializados

representando un problema para salud pública (161). Se han reportado notorias mejoras en

pacientes luego de un año de sometidos a cirugía bariátrica (162,163) por lo que lo observado en la

figura 14 es acorde a la bibliografía. Así, se confirma que la gastrectomía vertical en manga es un

tratamiento efectivo para la NAFLD (164).

De los resultados presentados en las figuras 13 y 14 se estima que la masa grasa corporal perdida

tras la VSG corresponde a tejido adiposo hepático. Para probar esta teoría, el Dr. Avner Leshem

analizó la composición de los hígados de todos los individuos de un nuevo experimento (repetición

del WT-DIO) y observó un mayor porcentaje de grasa en los órganos del grupo sham comparado con

el VSG, acorde al análisis histológico previo. Este resultado se repite tanto en ratones convencionales

o SPF como en ratones estériles o GF, de donde se conjetura que el mecanismo de remisión del

hígado graso es independiente del microbioma intestinal y de la mejora del metabolismo glucídico

(ya que el TTG en VSG y sham es idéntico en ratones GF). En contraste, la remisión de la DM2 sí es

dependiente del microbioma intestinal pero independiente de la remisión del hígado graso. De esta

manera, ambos mecanismos inducidos por la cirugía podrían ser independientes entre sí.

Como el TTG en individuos GF no mostró mejoras en el grupo VSG ni en el Sham se podría pensar

que la cirugía no tiene ningún efecto en ausencia del microbioma. Sin embargo, se observa una

remisión del hígado graso tanto en ratones GF como en SPF por lo que se conjetura que el

mecanismo de la remisión temprana de la DM2 asociado a la cirugía es dependiente del microbioma.

5.5 Cambios en los niveles de moléculas de interés circulantes en el plasma

de los individuos luego de la VSG

76

Debido a que la comunicación entre los tejidos del organismo se da por las moléculas circulantes en

la sangre, es interesante analizar los cambios luego de la cirugía para e e r “ ” q e q e

el mecanismo involucrado detrás de la mejora observada. Se seleccionaron algunas de las moléculas

más estudiadas y reportadas en bibliografía asociadas a la cirugía bariátrica, al metabolismo

glucídico y al microbioma intestinal.

Si bien se espera que el nivel de las incretinas GIP y GLP-1 (hormonas hipoglucemiantes) aumenten

asociado a un mejor metabolismo glucídico, se observa una mayor cantidad de GIP pero idéntica

concentración de GLP-1 en el plasma de los individuos del VSG, contradiciendo lo publicado en

(142,165–168). Sin embargo, estos estudios se realizaron con muestras de ratones sometidos a seis

horas de ayuno previo lo que no significa que estos valores se repitan en el estado postprandial,

como se comentó para los cambios en los niveles de insulina. Para ir más a fondo, el Dr. Avner

Leshem (luego de mi partida del laboratorio) analizó las muestras de sangre de ratones involucrados

en la repetición del experimento con sujetos del modelo WT-DIO para conocer el estado metabólico

del periodo postprandial. En este caso la toma de sangre fue luego de 30 minutos de una ingesta de

glucosa y se observó una concentración de GLP-1 significativamente mayor en el grupo VSG, en

concordancia a este artículo publicado recientemente (169).

Por otra parte, se reporta en bibliografía que la concentración de péptido PYY y GLP-1 aumenta

rápidamente luego de la cirugía tanto en humanos como en ratones y que cumplen roles

fundamentales en la regulación del metabolismo glucídico y lipídico que podría estar en los

cimientos de la mejora observada en el grupo VSG (128,165). No obstante, las figuras 15 y 41

muestran un comportamiento inverso por lo que se propone analizar los niveles de PYY en el

período postprandial también.

También se reporta en la literatura científica que la adiponectina aumenta la sensibilidad a la

insulina y que los niveles circulantes son inversamente proporcionales al índice de masa corporal

(IMC) y el porcentaje de grasa corporal. Así, lo descrito en la figura 15 no sería coherente ya que el

nivel de adiponectina en el grupo VSG es menor que en el grupo Sham luego de la cirugía, a pesar de

tener menor grasa corporal y menor grado de intolerancia a la glucosa. Además, en (170)

demostraron que la concentración de adiponectina se correlaciona con el grado de remisión de la

DM2 siendo menor en individuos no respondedores a la cirugía metabólica.

Al igual que en humanos, los niveles de estas hormonas varían en el período postprandial pero estas

muestras fueron tomadas en ayuno. Así, se propone futuros análisis a partir de las muestras

tomadas por Dr. Avner Leshem en el período postprandial.

Por último, a pesar de analizar algunas de las moléculas de interés reportadas en bibliografía,

faltaron otras interesantes como la proteína c reactiva, leptina (171), cortisol, epinefrina, grelina, por

ejemplo, que se propone para el futuro.

5.6 Cambios en los ácidos biliares circulantes en el plasma del individuo

luego de la VSG Los ácidos biliares secundarios como el ácido glicocólico y taurocólico estimulan la secreción de

hormonas glucorreguladoras como las incretinas, PYY, glucagón y demás (33,172), por lo que se

espera diferencias entre el grupo VSG y sham debido al estado del metabolismo glucídico de los

77

individuos. Además, se ha reportado un aumento de los ácidos biliares totales circulantes asociado a

la mejora metabólica por la cirugía bariátrica (137) en contrario a lo observado en las figuras 16 y 42.

Por esto se propone profundizar mediante estudios metabolómicos que logren calificar los ácidos

biliares presentes en el plasma de ambos grupos para comparar a nivel funcional, ya que se reporta

diferentes funciones dependiendo del tipo de ácido biliar. Se propone emplear metabolómica no

apuntada del inglés “untargeted me bo om ” (173).

5.7 Cambios en la energía cosechada de la dieta luego de la VSG Los experimentos cuyos resultados se describen en las figuras 17 y 43 indican que ambos grupos

absorben la misma cantidad de energía de la dieta en ambos modelos de ratones estudiados, en

concordancia con su idéntico peso corporal. De todos modos, se ha asociado una mayor capacidad

de cosechar energía de la comida en individuos obesos con DM2 por lo que podría esperarse menor

cantidad de calorías en las heces del grupo Sham (55,174), que presentan peor metabolismo

glucídico aunque igual peso corporal que el VSG.

Además, tras un experimento piloto en jaulas metabólicas no se apreciaron diferencias en el gasto

energético, la locomoción y el índice de intercambio respiratorio (relación entre el dióxido de

carbono producido por el metabolismo y el oxígeno usado), por lo que el balance energético no

parece estar involucrado en la mejora del grupo VSG. Se propone profundizar analizando la

permeabilidad de la lámina propia de los individuos (175).

5.8 Cambios en la expresión génica asociada a la VSG

Ya que todos los individuos del experimento parten de idénticas condiciones, se estima que todos

los cambios analizados siete días luego de la intervención se asocian a la misma. De todos modos,

sería interesante comprobar esto secuenciando el ARN presente en los tejidos de interés antes de la

cirugía. Además, una gran limitante de esta aproximación es que la expresión génica no

necesariamente resulta en la traducción de proteínas y por ende se debería complementar con otras

ómicas tales como la proteómica para entender la función del transcriptoma. Además, podría ser

interesante estudiar otros aspectos regulatorios tales como la epigenética (176).

En cuánto a la configuración de la secuenciación es interesante detenerse en la figura 18 sobre los

reads no mapeados contra el genoma de referencia y por ende inútiles en nuestro experimento. Si

bien el campo de la metagenómica es nuevo y las máquinas y técnicas tienen aún mucho por

mejorar, es importante balancear, por ejemplo, el largo de los reads y el costo de la secuenciación

en función del objetivo del experimento. En este caso, debido a optar por una secuenciación barata

con reads cortos se pierde mucha información que podría comprometer el análisis de los datos. En

algunos casos para evitar esto se combina una secuenciación con reads cortos y otra con reads

largos, a pesar de ser el doble de costoso, y luego se mezclan los resultados para más especificidad.

En cuanto a los genes hepáticos expresados de forma diferencial, no se realizó una extensa

búsqueda bibliográfica sobre la función de cada uno pero se identificaron secuencias codificantes de

proteínas de la fase aguda de la inflamación, relacionado con una posible activación de un

mecanismo de defensa vinculado con el corte del estómago ya que ambos tejidos están muy

próximos anatómicamente (163). Por el otro lado, el gen Scd1, sobre expresado en el yeyuno de

78

ratones Sham, codifica la proteína stearoyl-CoA desaturasa, una coenzima involucrada en el

metabolismo de los ácidos grasos. Además, el gen 2210407C18Rik, sobre expresado en yeyuno de

ratones VSG, pertenece a la familia Ly6 cuyas funciones no se relacionan con la mejora metabólica

observada, a priori, aunque podría involucrarse con un rol desconocido.

Por último, para entender el verdadero peso de la expresión génica sobre el fenotipo observado,

sería interesante analizar el transcriptoma de los ratones privados de microorganismos (ya sea por el

tratamiento con antibióticos o por la condición de Germ-Free) en los cuales no se observa la mejora

metabólica asociada a la cirugía. En caso de encontrar un transcriptoma similar al observado en el

modelo WT-DIO se conjeturaría que la expresión diferencial de genes no sería la causa principal del

fenotipo observado.

De todos modos, a pesar de ser un enfoque útil analizar las diferencias postoperatorias en la

expresión génica de estos órganos clave en el metabolismo, decidimos profundizar sobre todo en la

especialidad del laboratorio del Dr. Elinav: la genética microbiana y no tanto en los cambios

asociados a la genética del ratón.

5.9 Cambios en la composición del microbioma intestinal asociados a la

VSG y rol en el mecanismo de la mejora metabólica observada.

Todos los individuos reciben el mismo tratamiento hasta la cirugía, ya sea VSG o Sham, por lo que se

supone que parten el experimento con similar contenido microbiano. Sin embargo, se observan

cambios en la composición del microbioma luego de la intervención, según lo descrito en la figura

25. En primer lugar, aumenta la alfa diversidad de la microbiota del intestino grueso de los

individuos VSG comparado a la de los Sham, que se asocia en diversos artículos científicos con

efectos positivos sobre el metabolismo del individuo, concordante a lo observado en este

experimento (55,73,177,178).

Además, los análisis taxonómicos muestran que el principal género que aumentó su prevalencia en

esta comunidad bacteriana es Lactobacillus con especies tales como L. intestinalis, L. reuteri, L.

johnsonii, L. murinus, L. taiwanensis, L. vaginalis y L. animalis, además de Escherichia coli. Por otra

parte, algunas bacterias aumentaron su abundancia relativa en el colon del grupo Sham tales como

A.muciniphila, Muribaculum intestinale y Ileibacterium valens, esta última en intestino delgado

también. Vale destacar que la técnica de secuenciación empleada no permite, a priori, saber si estas

últimas aumentaron su abundancia en el grupo Sham luego de la cirugía o simplemente mantuvieron

estable su concentración pero en el grupo VSG disminuyó (68). De todos modos, los cambios

parecen ser consistentes en ambas regiones del intestino analizadas.

Al recorrer la extensa bibliografía, se encuentran funciones asociadas a estas bacterias sobre- o sub-

expresadas en el grupo VSG luego de la cirugía (179) que pueden, en algunos casos, justificar lo

observado. Por ejemplo, si bien se ha reportado efectos beneficiosos de Akkermansia muciniphila

sobre individuos con síndrome metabólico, esta especie demostró no estar involucrada en el

mecanismo post cirugía bariátrica (75). A pesar de no haber mucha información acerca de

Ileibacterium valens, pertenece a Firmicutes que es uno de los tres filos más abundantes juntos con

Bacteroidetes y Proteobacteria y se ha asociado en repetidos estudios con la presencia de síndrome

metabólico y la ingesta de dietas altas en azúcares y grasa (180,181). Además, Muribaculum

79

intestinale también aumenta su abundancia relativa bajo una dieta alta en grasa y en fructosa,

asociado a síndrome metabólico, por lo que tiene sentido que ambas especies disminuyan su

abundancia en el grupo VSG (182).

Por el otro lado, los Lactobacilos han sido asociados con beneficios metabólicos para el hospedador

en varios estudios concordante con los resultados observados en las figuras 28, 29 y 30. En (183) se

asoció el síndrome metabólico a la incapacidad de la microbiota de producir un derivado del

triptófano que activa el receptor de hidrocarburos de arilos. Sin embargo, suplementar al paciente

con una cepa de Lactobacillus, caracterizada por una alta capacidad de producción del ligando en

cuestión, provoca una mejora metabólica mediante un aumento de GLP-1 circulante, entre otros.

Así, a su vez se asocia con lo discutido sobre el aumento de GLP-1 por lo que los resultados

presentados arriba son coherentes según lo ya reportado en bibliografía. En (184), reportan que

administrar una Lactobacillus reuteri mejora la sensibilidad a la insulina, en concordancia con lo

discutido sobre la mejora del grupo VSG en la respuesta insulínica al desafío con glucosa exógena

más arriba. Por otra parte, en (185) demostraron que al emplear Lactobacillus salivarius y

Lactobacillus reuteri como probiótico disminuye la expresión de transportadores de glucosa en

células del intestino, reduciendo además la glucemia en ayuno, la intolerancia a la glucosa y

mejorando el perfil lipídico logrando atenuar los problemas hepáticos y renales derivados de la DM2.

Luego, en (186) demostraron que mayor abundancia de Lactobacillus reuteri disminuye la

inflamación crónica típica del síndrome metabólico y otro estudio similar se llevó a cabo en ratas

(187). Por otra parte, se observa que L. reuteri está presente en la leche de pecho materna, por lo

que se asocia su baja abundancia en niños no amamantados de pecho (y dificultad posterior para la

cepa de colonizar el intestino ya habitado por otras bacterias competidoras) a la alta prevalencia de

enfermedades metabólicas en la edad adulta, retomando lo explicado en la introducción (188,189).

Con el fin de probar que estas bacterias estadísticamente más abundantes en el grupo VSG luego de

la gastrectomía tienen un efecto fisiológico que pueda ser la causa del efecto metabólico observado,

se empleó el modelo de ratones tratados con antibióticos y por ende privados de microbiota. Esta

aproximación permite analizar el impacto de las bacterias sobre el efecto de la cirugía y es una

técnica común en este laboratorio enfocado en entender las interacciones entre el hospedador

humano y su microbiota y el efecto de ésta en la salud del individuo. En este caso, no se observó una

disminución de la intolerancia a la glucosa en ratones sin microbiota, por lo que es posible

conjeturar que estas bacterias están en la base del mecanismo de remisión temprana de la DM2

ocasionada por el tratamiento. También se hizo el mismo procedimiento experimental en ratones

Germ-Free y los resultados –que no se muestran por pedido del Dr. Eran Elinav- son idénticos. A

futuro, se propone generar un cuarto modelo de ratones lep db-/- GF o tratados con antibióticos

para probar la reproducibilidad de los resultados en otro modelo de ratones.

De todos modos, esta evidencia no es suficiente para asegurar que los cambios microbianos

ocasionados por la cirugía bariátrica son la causa de la remisión temprana de la DM2. En las figuras 7

y 37 se observa que tanto el grupo Sham como el VSG disminuyen su glucemia en ayuno y el área

bajo la curva del TTG contrario a lo observado en la figura 32, lo que sugiere que el microbioma

intestinal está en la base de la mejora de la intolerancia a la glucosa ocasionada tanto por la cirugía

como por la restricción de la ingesta calórica. De esta manera se podría plantear que ni la cirugía

bariátrica ni la restricción calórica tienen efecto en individuos privados de microbiota y por ende los

cambios del microbioma no causarían las mejoras metabólicas observadas. Sin embargo, sí se da la

80

remisión del hígado graso en ratones GF por lo que se conjetura que el microbioma intestinal juega

un rol fundamental en la remisión de la DM2 observada.

Ahora, es necesario profundizar sobre este primer análisis para determinar la verdadera causa de la

mejora metabólica asociada a la VSG. Una aproximación típica del laboratorio es probar el efecto de

las bacterias más abundantes en el grupo VSG sobre ratones con síndrome metabólico. En ese caso,

los individuos no se someten a la cirugía bariátrica pero se les administra algunas de las bacterias de

interés con esperanza de que causen una mejora metabólica similar a la de la cirugía. Si bien el

tiempo de trabajo práctico de mi tesis de grado no fue suficiente para esto, el Dr. Avner Leshem está

planificando el próximo experimento en el cuál someterá a ratones obesos con síndrome metabólico

(tanto WT como lep db -/-) a un gavage oral de Lactobacillus. En caso de que la administración de

estas bacterias (en función de probióticos) mejore el TTG, aumente el GLP-1 circulante y mejore el

nivel de insulina postprandial en estos ratones, se podría conjeturar que son causantes de la mejora

metabólica. De ser así, se podría estar cerca de desarrollar un tratamiento menos invasivo pero igual

de eficaz para la DM2 y demás afecciones del síndrome metabólico, mediante una preparación de

bacterias como probióticos (190).

Además, hay otros encares para establecer que el efecto metabólico de la cirugía es dependiente del

microbioma intestinal. Por ejemplo, en caso de que una transferencia de materia fecal -técnica

explicada en los métodos debido a su importancia en el sector- de un donante humano luego de la

cirugía bariátrica hacia un ratón con síndrome metabólico genere un efecto positivo sería un paso

más para demostrar la causalidad tal como se demuestra en (74,191). Lo mismo, si un donador

humano con de síndrome metabólico impacta de forma negativa en el aceptor murino sano. Ya que

algunas bacterias y/o metabolitos podrían tener efectos diferentes en humanos que en ratones, será

interesante analizar si los cambios de la composición microbiana son reproducibles en ambas

especies luego de la cirugía.

De todos modos, se estima que el impacto del microbioma sobre la salud metabólica del individuo

podría darse a través de moléculas secretadas a la circulación sanguínea por la microbiota. Tal como

se explica en la introducción las bacterias del intestino funcionan como “ b” e eñ z

molecular que impacta en tejidos distantes del intestino a través de moléculas sintetizadas por estas

bacterias como los ácidos grasos de cadena corta, por ejemplo. Por esto, se sugiere un análisis

funcional del microbioma para identificar los genes codificados y las vías metabólicas presentes en

su material genético empleando, por ejemplo, el paquete HUMAnN 3.0. También se podría

complementar la metagenómica con la metabolómica. De encontrar metabolitos sobre abundantes

en la circulación del grupo VSG luego de la cirugía, se propone probar su efecto mediante su

administración por gavage o bombas osmóticas, en función de postbióticos, por ejemplo. De esta

manera, se podría estar cerca de desarrollar un tratamiento menos invasivo pero igual de eficaz para

la DM2 y demás afecciones del síndrome metabólico, mediante la administración de ciertas

moléculas, como postbióticos. Esto sería una solución más directa e inteligente al problema ya que

modificar el microbioma intestinal de manera artificial no es sencillo.

Último pero no menos importante, a pesar de que todo este análisis se realiza sobre las bacterias del

intestino, es interesante destacar los otros (micro) organismos presentes en el intestino que podrían

tener un rol sobre el metabolismo del hospedador. Mientras que los avances técnicos impiden

explotar los datos correspondientes a los virus, fungi, etc., los resultados en el modelo tratado con

81

antibiótico (de amplio espectro contra bacterias) se reproducen en Germ-Free, por lo que las

bacterias parecerían liderar el efecto del microbioma sobre el hospedador.

82

6. Conclusiones

En este proyecto se logró recapitular el efecto metabólico que tiene la cirugía bariátrica en humanos pero en dos modelos de ratones diferentes lo que da la posibilidad de estudiar los mecanismos detrás de la temprana remisión de la intolerancia a la glucosa luego de la intervención quirúrgica. Los resultados mostrados arriba sugieren que la gastrectomía vertical en manga conlleva un efecto metabólico que disminuye la intolerancia a la glucosa tras siete días de la intervención mediante un mecanismo independiente de la ingesta calórica, de la composición de la dieta y de la pérdida de peso corporal asociada a la cirugía, aunque dependiente de la microbiota intestinal. Además, genera la remisión del hígado graso mediante otro mecanismo independiente del microbioma intestinal y de la remisión de la DM2. En fin, se destaca que el microbioma intestinal juega un rol fundamental en el metabolismo de los humanos y su maleabilidad presenta un potencial enorme como tratamiento de enfermedades me b Se e er q e mejor e e m e o e e e gr “ rg o” e ro o o de los profesionales de la salud para luchar contra la pandemia del síndrome metabólico empleando -por ejemplo- la comida como medicina. Si bien será un proceso lento y requiere mucha (y buena) ciencia, el futuro es esperanzador y genera luz al final del túnel de la pandemia del síndrome metabólico.

83

7. Perspectivas Por la magnitud de lo que significan los resultados descritos arriba existen grandes expectativas para

culminar el proyecto con un mejor entendimiento del mecanismo detrás de esta mejora metabólica.

Así, se proyectan intervenciones médicas revolucionarias que logren mejorar los resultados de la

cirugía o mismo lograr sustituir el tratamiento tan invasivo por otro igual de efectivo.

Por otra parte, se planea usar los datos obtenidos de pacientes humanos descritos en la parte de

metodología. Aprovechando las herramientas informáticas actuales, se podría entrenar un algoritmo

de aprendizaje automático que logre predecir el efecto de la cirugía bariátrica en pacientes

candidatos a la operación. Así, descubrir los parámetros clínicos con valor predictivo permitiría

entender las condiciones óptimas con las cuales el paciente deberá presentarse a la cirugía para

maximizar los resultados metabólicos. Por ejemplo, con tal composición microbiana intestinal, tal

nivel de HbA1c, CRP, etc. De esta manera, aquellos sujetos “ o re o e ore ” ev someterse a

la cirugía tan invasiva y sin ningún efecto positivo a mediano/largo plazo en ellos. De todos modos,

estos individuos podrían adaptar sus parámetros clínicos para que la intervención sea exitosa.

Avances de este estilo impactan de manera directa sobre los enfermos pero también tienen un

enorme valor comercial ya que son herramientas de suma utilidad para prestadoras de salud y

seguros médicos que se benefician de prevenir cirugías innecesarias evitando los gastos posteriores

asociados y aumentando su reputación ya que todas las cirugías realizadas en su clínica podrían ser

exitosas.

Por todo esto se estima un futuro de medicina basada en hechos que integre biología e informática

para resolver problemas de salud por lo que los ingenieros en biotecnología jugarán un papel crucial

en las próximas décadas.

84

8. Referencias bibliográficas

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94

9. Anexos 9.1 Composición de la dieta alta en grasa.

Figura Anexo 1: Dieta alta en grasa. Si bien es intuitivo alimentar a los animales con exceso

de azúcares para causar un desequilibrio metabólico, por alguna razón este método no

funciona en ratones y existe un modelo bien establecido mediante la ingesta de un alto %

de grasa en la dieta.

95

9.2 Foto de la hoja de registro del TTG de un experimento.

96

9.3 Entrevistas: preguntas y resumen de respuestas.

Se realizó un formulario de google posible de encontrar en: https://forms.gle/7txxTwVpJfD4EMjz9

9.4 Identificación de genes expreados de manera diferencial mostrados en las

figuras 20 y 22.

Figura compartida por el Dr. Avner Leshem.