RNAi-Mediated Action of Biostimulants on Increase of Resistance of Sugar Beet and Rape Plants to Parasitic Nematode Heterodera schachtii

Third International Conference of CIS IHSS on Humic Innovative Technologies Tenth International Conference daRostim

«Humic Substances and Other Biologically Active Compounds in Agriculture» HIT-daRostim-2014

November 19 - 23, 2014, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia

Третья международная конференция СНГ МГО по гуминовым инновационным технологиям

Десятая международная конференция daRostim «Гуминовые вещества и другие биологически активные соединения

в сельском хозяйстве» HIT-daRostim-2014

19 - 23 ноября 2014 г., МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва, Россия

Book of Abstracts Сборник тезисов

Edited by Irina V. Perminova, Natalia A. Kulikova, and Olga S. Yakimenko

Под редакцией И.В. Перминовой, Н.А. Куликовой и О.С. Якименко

Desktop publishing by Alexey V. Kudryavtsev Верстка оригинал-макета А.В. Кудрявцев

Cover design by Alexander Yu. Polyakov Дизайн обложки А.Ю. Полякова

NP “CBR “Humus Sapiens” НП «ЭАЦПОС «Гумус Сапиенс»

ISBN 978-5-98181-096-1

Moscow – 2014 Москва – 2014

www.humus.ru/hit-2014

RNAi-Mediated Action of Biostimulants on Increase of Resistance of Sugar Beet and Rape Plants to Parasitic Nematode Heterodera schachtii

Sergey Ponomarenko1, Victoria Tsygankova2, Tatyana Stefanovska3, Anatoly Galkin4, Yaroslav Blume4 1National Enterprise Interdepartmental Science & Technology Center "Agrobiotech" of NAS and MES of Ukraine, Kiev; e-mail: "МНТЦ Агробіотех" <[email protected]> 2Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry, NAS of Ukraine, Kiev 3National University of Life and Environmental Science of Ukraine, Kiev 4Institute of food biotechnology and genomics, NAAS of Ukraine, Kiev

Parasitic cyst root nematode Heterodera schachtii Schmidt is dangerous pest that damages sugar beet and oilseed rape plants in world’s developed countries. The annual and cumulative damage of world agricultural production due to nematode infestations are estimated at over 125 billion USD. The currently existing methods for controlling the distribution of nematodes and the reduction in the yield of important crops are soil fumigants, nematicides and insecticides of synthetic origin. Their use is practically restricted in most countries because of their high toxicity to humans and contamination of the environment. Traditional methods include genetic engineering and breeding methods, and various biocontrol technologies, i.e. application of various organic soil fertilisers and industrial waste of vegetable or animal origin, compost, the changes in the soil pH, introduction of antagonistic and competitive microorganisms in the soil, the crop rotation with the development of cultures resistant to nematodes, application of essential oils of various herbs with an anti-nematodic effect. Unfortunately, a combination of the above listed methods can only depress the high viability of this pest class.

The discovery of small regulatory RNAs (si/miRNAs) that play a key role in Posttranscriptional Gene Silencing (PTGS) has allowed to realize gene expression control and to increase of plant resistance to this parasitic nematode. In our researches we elaborated and proposed new alternative strategy for nematode disease management that is based on application of new ecologically safe polycomponent biostimulants Biogen, Regoplant and Stimpo for increase of resistance of sugar beet and oilseed rape plants to nematode Heterodera schachtii through the inducing of synthesis of immune-protective si/miRNAs in the plant cells. The main components of these biostimulants are: antiparasitic antibiotic aversectine C produced by soil streptomycete Streptomyces avermitilis and metabolism products (i.e. aminoacids, fatty acids, polysaccharides, phytohormones, and microelements) produced by micromycete Cylindrocarpon оbtusiuscuilum 680 that is isolated from Panax ginseng root system and cultivated in vitro. In the experiments conducted in the field and greenhouse conditions we found that these biostimulants considerably increase resistance (up to 74-98 %) of sugar beet and rape plants to the parasitic nematode Heterodera schachtii. The maximal reduction (~on 75-80 %) of amount Heterodera schachtii larvae in the sugar beet and rape roots occurred at application of these biostimulants at concentrations of biostimulants: Biogen - 1 μg/ml, Regoplant - 1 μg/ml and Stimpo - 5 μg/ml.

In the laboratory molecular-biological experiments we studied genetic indexes of increasing of resistance of sugar beet and rape plants to parasitic nematode Heterodera schachtii Schmidt under impact of biostimulants Biogen, Regoplant and Stimpo. Using Dot-blot hybridization method we revealed considerable increase of difference in the percent of homology (up to 23-27 %) between the populations of cytoplasmic mRNA isolated from control uninfected and untreated plants and small regulatory si/miRNA isolated from experimental infected by nematode and treated with biostimulants plants. Testing inhibitory activity of isolated si/miRNA preparations on the templates of own plant mRNA and nematode mRNA in the wheat embryo cell free system of protein synthesis we found increasing of silencing activity (up to 58-65 %) of si/miRNA preparations that were

62

isolated from experimental infected by nematode and treated with biostimulants plants. The lowest silencing activity (up to 10-15 %) was observed for si/miRNA isolated from experimental infected by nematode and untreated with biostimulants plants as compared to activity of si/miRNA isolated from control uninfected and untreated plants. Obtained results testify that polycompositional biostimulants induce synthesis in the sugar beet and rape plants of small regulatory si/miRNA with specific anti-nematodic activity; as a result plant resistance against parasitic nematode Heterodera schachtii considerably increases.

Using method Northern-blot hybridization of si/miRNA isolated from rape plants with the amplificated by PCR cDNA fragment of conservative region 8H07 gene Heterodera shcachtii we revealed the presence of high homology between si/miRNA isolated from the plants and this cDNA fragment. Today it is known that 8H07 gene codes one important secretory protein of esophageal glands of this parasitic nematode. We showed that compositional regulator Regoplant increase resistance of rape plants to nematode Heterodera shcachtii by inducing synthesis of si/miRNA, specific to the cDNA fragment of conservative region 8H07 gene Heterodera shcachtii. This amplificated cDNA fragment was used for creation of recombinant gene with complementary antisense dsRNA sequence with further Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of rape plants and increasing of their resistance to parasitic nematodes.

63

Эффект применения биостимулянта «Регоплант» в виноградарстве Южного региона Украины

С.П. Пономаренко1, Г.М. Кучер2 1ГП «МНТЦ Агробиотех» НАН и МОН Украины, д.б.н., Киев, Украина 2ННЦ «ИВиВ им. В.Е. Таирова», Одесса, Украина

На современное экологическое состояние агросистем Украины в значительной мере влияют антропогенные факторы: использование химических удобрений, значительного количества химических средств защиты в борьбе с болезнями и вредителями и др.

Целью исследований было: изучить влияние нового биорегулятора «Регоплант» (разработчик и автор ГП «МНТЦ Агробиотех» НАН и МОН Украины) на степень развития растений винограда, повышения устойчивости к болезням, стрессовым факторам окружающей среды как в период вегетации, так и в осенне-зимний период, а также возможность повышения урожая винограда и его качественных показателей.

Исследования выполняли в 2013 году специалисты лаборатории физиологии отдела размножения ННЦ «ИВиВ им. В.Е. Таирова» и ГП «ОПХ «Таировское». Исследования проводили на техническом сорте Каберне Совиньон, столовых сортах – Мускат жемчужный и Загадка. Формирование кустов – двухштамбовый кордон, схема посадки – 2,5*1,5 м2, культура винограда – неукрывная и неполивная.

Учетные кусты в опытах отбирали равные по силе роста и элементам плодоношения. Для этого весной путем агробиологических учетов кусты нагружались одинаковым количеством глазков, побегов, соцветий в соответствии с биологическими особенностями опытных сортов винограда.

Кусты опрыскивали водными растворами препарата «Регоплант» из расчета 100 мл/1000 л воды на 1 га (т.е. 0,01% раствор) в сроки: за 7-10 дней до цветения (І срок), сразу после цветения (ІІ срок), в фазу роста ягод (ІІІ срок) и в начале созревания ягод (IV срок).

На сорте Одесский черный в плане производственных испытаний проводили опрыскивание на площади 5 га раствором «Регопланта» из расчета 50 мл препарата на 1 га площади при каждой химической обработке по принятой системе защиты, и 5 га без препарата «Регоплант» – контроль.

Результаты исследований. Полученные результаты по всем вопросам положительные. Опрыскивание растений винограда раствором препарата «Регоплант» было эффективно. Обработки приводили к стимуляции роста побегов и развитию листовой поверхности. При этом рост побегов стимулировался в основном в направлении боковой меристемы, т.е. увеличивался диаметр побегов. Так, у сорта Каберне Совиньон диаметр побегов повышался на 10,7%, у сорта Загадка на 11,4%, у сорта Мускат жемчужный – на 11,7%. При этом линейный рост побегов был практически на уровне контроля, хотя отмечалось среднее увеличение длины междоузлий, которая повышалась в опытных вариантах на 10-12%, что давало возможность кустам лучше проветриваться, благодаря чему отмечалось ингибирование развития грибных заболеваний.

Опрыскивания «Регоплантом» стимулировали развитие листьев на кустах, поэтому площадь листовой поверхности кустов увеличивалась на 10-12%. Известно, что усиление процессов роста и развития растений происходит благодаря интенсивности фотосинтетической деятельности в тканях листьев. Полученный экспериментальный материал по содержанию пигментов в тканях листьев показал более высокое их содержание в опытных вариантах всех изучаемых сортов (на 10-20%), отличаясь лишь в абсолютных величинах в силу их биологических особенностей (толщина и плотность листовой пластинки). При этом до конца

64

вегетации (конец августа) содержание пигментов в опытных вариантах было на более высоком уровне, по сравнению с контрольными. Кроме того, отмечено, что оводненность тканей листьев была выше в опытных вариантах, особенно у сорта Каберне Совиньон, как в период интенсивного рота, так и в конце вегетации. При этом при увеличении общей оводненности тканей содержание легкоудерживаемой воды было ниже, чем в контрольных вариантах. Известно, что этот показатель является сигналом реакции растений на неблагоприятные факторы окружающей среды, а лето этого года отличалось высокими температурами воздуха и засухой в июле-августе. Можно предположить, что опрыскивания кустов препаратом «Регоплант» способствовало повышению защитных функций на действие неблагоприятных факторов, повышая водоудерживающую способность тканей листьев, которая была по вариантах выше на 4-9% (в абсолютных величинах) по сравнению с контролем. Такое улучшение водообеспечения тканей листьев и более интенсивных процессов метаболизма (дыхание и накопление пигментов) не могло не повлиять на показатели урожая. Так на всех опытных сортах было отмечено увеличение урожая на обработанных «Регоплантом» участках. Повышение урожая с куста рассчитывали по массе гроздей, так как их количество мы оставляли на учетных кустах одинаковым в зависимости от сорта. Увеличение массы гроздей отмечено на всех исследованных сортах как за счет увеличения массы и объема ягод в грозди, так и за счет увеличения их количества в грозди.

В период сбора урожая в сентябре шли дожди, что способствовало развитию гнилей на ягодах, особенно на сорте Загадка, но на обработанных «Регоплантом» кустах этого сорта процент гнилей был на 50% ниже, чем в контроле. Также было отмечено уменьшение поражения ягод оидиумом (который в этом году был значительно распространен) под влиянием обработок «Регоплантом».

У столового сорта Загадка отмечена также более высокая прочность кожицы ягод. Так, прочность ее раздавливания повысилась на 11,6% по сравнению с контролем, что очень важно как для транспортировки столовых сортов винограда, так и для более длительного их потребления в свежем виде.

Но самое главное то, что после обработок «Регоплантом» улучшаются кондиции сока ягод, что особенно важно для технических сортов. Так у сорта Каберне Совиньон содержание сахаров в соке увеличилось на 1,2 г/100 см3, у сорта Одесский черный – на 1,6 г/100 см3.

Кроме исследований на учетных участках были проведены производственные испытания препарата «Регоплант» в условиях опытного хозяйства Таировское на виноградниках сорта Одесский черный на площади 10 га. На площади 5 га опрыскивания проводили смесью ядохимикатов против болезней вредителей винограда + препарат «Регоплант» из расчета 50 мл/га (опыт). На другом участке площадью 5 га опрыскивание проводили теми же химикатами без препарата «Регоплант» (контроль) в те же сроки, что и на учетных участках. Кусты нормально функционировали, зараженных на оидиум было в пределах 2-3%, на контрольном участке 12-14%. Урожай на опытном участке составил 87,6 ц/га, на контрольном – 81,08 ц/га при сахаристости сока на опытном участке 17,8 г/100 см3 при 16,2 г/100 см3 на контрольном участке, кислотность сока, соответственно, составила 6,4 г/дм3 и 6,8 г/дм3.

Дегустации виноматериалов сортов Каберне Совиньон и Одесский черный, изготовленных с урожая винограда опытных участков, обработанных растворами препарата «Регоплант», показали более высокое качество этих образцов по сравнению с контролями. Отмечено, что они имеют более интенсивный аромат, вкус, экстрактивность, особенно сорт Одесский черный, который получил оценку 7,99 балла при 7,97 балла у контрольного образца. Химический анализ опытных и контрольных образцов показал, что содержание спирта в контролях было на уровне

65

10,7% (Каберне Совиньон) и 8,7% (Одесский черный), в опытных образцах, соответственно, 11 и 10%, т е. было на 0,3-1,3% выше. Показатели титруемой кислотности и аминного азота в опытных образцах, наоборот, было ниже, особенно в образцах сорта Одесский черный. Показатели экстрактивности вина – фенолов, в опытных образцах было выше, чем в контроле, особенно при обработках сорта Каберне Совиньон. Виноматериалы обеих сортов отличались также более высокой концентрацией красящих веществ, хотя эти сорта по своим биологическим особенностям вообще отличаются интенсивным окрашиванием вина, но в опытных образцах их было выше на 20 мг/дм3. Эти факты задают направление для расширения исследований в области создания биологических или органических виноградных виноматериалов.

Количество живых глазков после зимовки, %,% Вариант

центральных замещающих Сорт Каберне Совиньон

Регоплант 62,50 80,00 Контроль 47,00 55,30

Сорт Загадка Регоплант 73,00 83,80 Контроль 48,70 47,30

66