RNAシークエンス解析（NGS）用ライブラリ構築 …...Percentile of Transcript (5‘ to 3‘) 図2｜カバレッジ vs. 標準化した転写物長...

RNAシークエンス解析（NGS）用ライブラリ構築キットカタログ

QuantSeq Expression Profiling Library Prep Kit

SLAMseq Metabolic RNA-Seq Kit

QuantSeq Targeted RNA Sequencing Library Prep Kit

Small RNA-Seq Library Prep Kit

SENSE Whole Transcriptome Library Prep Kit

SPLIT RNA Extraction Kit

RiboCop rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) V1.2

Poly(A) RNA Selection Kit

TeloPrime Full-Length cDNA Amplification Kit

SIRVs - Spike-In RNA Variant Controls

Mix2 RNA-Seq Data Analysis Software

次世代シークエンサーを用いた RNA解析、特にトランスクリプトーム解析に特化した会社、

それが Lexogen 社です。

Lexogen社は、2007年オーストリアにRNA研究の最先端を行く企業として設立されました。

社名は、ギリシャ語で“言葉”を意味する Lexo と gene に由来し、遺伝子を伝えるもの

“トランスクリプトーム”を表しています。

完全で詳細なトランスクリプトーム解析を可能にする Lexogen 社の技術と製品は、世界中の

研究者の皆様にご使用いただいています。一歩先を行く Lexogen 社の解析ツールで、生命の

言葉を読み解いてみませんか？

3

Sampling RNA Preparation NGS Library Prep NGS Data Analysis

SLAMseq Metabolic RNA Labeling Kit

p. 8

» Explorer Modules » Kinetics Modules


　p. 14

Expression Profiling　p. 4, 10

» QuantSeq 3’ mRNA-Seq Library Prep Kits

» QuantSeq-Flex Targeted RNA-Seq Library Prep Kit

QuantSeq Data Analysis » QuantSeq Pipeline on Bluebee®

Genomics Platform » SLAMdunk Pipeline for

QuantSeq-SLAMseq Data on Bluebee® Genomics Platform

» QuantSeq Pipeline in Partek® Flow®

RiboCop rRNA Depletion Kit

　p. 15

Whole Transcriptome p. 12

» SENSE mRNA-Seq Library Prep Kit

» SENSE Total RNA-Seq Library Prep Kit

Mix2 RNA-Seq Data Analysis Software

　p. 21

Poly(A) RNA Selection Kit　

p. 16

Small RNA-Seq Library Prep Kit　 p. 11

cDNA Preparation

TeloPrime Full-Length cDNA Amplification Kit　p. 17

NGS Controls

Spike-in RNA Controls p. 18 » SIRV-Set 1 (Iso Mix E0, E1, E2) » SIRV-Set 2 (Iso Mix E0) » SIRV-Set 3 (Iso Mix E0 / ERCC)

SIRV Suite Spike-In Analysis Software　

Products

4

アドバンテージ§ 4.5 時間で total RNAから 3' mRNA-Seq ライブラリを作製可能§ 遺伝子発現解析にお勧め§ 高感度、高再現性§ 100 pg の total RNA インプット（FWD）または 10 ng の total RNAインプット（REV）でライブラリ作製可能

§ FFPE サンプルのような RNAのクオリティが低いサンプルにも対応§ マイクロアレイ解析や従来の RNAシークエンス解析と比較し低コスト§ 無料のデータ解析パイプライン「Bluebee®」をご用意§ Globin mRNA depletion Kit やマルチプレックス解析用 i5/i7 インデックス、増幅バイアス確認用のバーコード（UMIs）と組み合わせてライブラリ作製可能

本製品は、次世代シークエンスによるポリアデニル化 RNA 3'末端解析用のcDNAライブラリを作製するキットです。イルミナ社次世代シークエンサーおよびサーモフィッシャーサイエンティフィック社イオントレントに対応したキットをご用意しています。1転写産物あたり 1分子の断片のみ逆転写されるため、シークエンス解析の際にリード数を抑えながら、mRNAの定量が可能です。

QuantSeq Expression Profi ling Library Prep Kit

ワークフローはじめに、oligo(dT) プライマーを用いて poly(A) 特異的に逆転写反応を行います。次に、RNAの鋳型を除去し、ランダムプライミングにより第二鎖を合成します。インサート長はランダムプライマーの結合部位と poly(A)tail の距離として求められます。続いて、バーコードを組み合わせて PCRを行います。イルミナ社シークエンサーの場合は最大 9,216サンプル /レーン、Ion TorrentTM システムの場合は最大 48サンプル /レーンでマルチプレックス化可能です。

イルミナ社シークエンサーに対応するキットとしてForward（FWD）キット、Reverse（REV）キットの 2種類をご用意しています。Forward（FWD）キットでは、第二鎖合成に使用するプライマーに Read 1リンカー配列を含むため（図1左）、シークエンスリードはpoly(A)tailに向かって得られます。Forward（FWD）キットは遺伝子発現解析にお勧めです。転写産物の3' 末端側を正確に解析したい場合またはペアエンドシークエンスを行う場合は、Reverse（REV）キットをお勧めしています。Reverse（REV）キットでは、Read 1リンカー配列はoligo(dT) プライマーによって付加されます（図1右）。

図 1｜ライブラリ作製のワークフロー　QuantSeq 3' mRNA-Seq FWD Kit（左）、QuantSeq 3' mRNA-Seq REV Kit（右）FWD Kit の Read 1 配列（緑）はmRNAの 3' 末端付近に対応するため、シークエンス解析時にサンプルあたりの総リード数を抑えることができる。REV Kit では、アダプター（Read 1 ならびに Read 2）の位置が FWD Kit とは反対になっており、転写終結点の正確な配列解析が可能である。REV Kit を用いてライブラリ作製した場合、REV Kit に含まれるCustom Sequencing Primer（CSP）を用いて Read 1 のシークエンス解析をする必要がある。

LIBRARY GENERATION

LIBRARY AMPLIFICATION

Reverse Transcription(oligodT priming)

RNA Removal

Purification

PCR

Purification

Poly(A) RNA

Removal of RNA template

Random priming

cDNA library with adapters for Illumina sequencing

200 min 60 min

5’

5’

5’

3’3’

3’3’

5’3’

3’

Tagged cDNA library

Double-stranded cDNA library

i7 index

(AAAAAAAA)

(AAAAAAAA)

(TTTTTTTTT)

5’

Second StrandSynthesis

SEQUENCING - Read orientation for QuantSeq FWD

70 min 45 min

5’

i5 index (optional)

NBAAAAA.....AAAAAA

i7 indexIndex 1 (i7)

Sequencing Primer

Read 2 Read 2 Sequencing Primer

Read 1 Sequencing

Primer Read 1

(not recommended)

i5 index(optional)

Index 2 (i5) Sequencing

Primer

LIBRARY GENERATION


Reverse Transcription(oligodT priming)

RNA Removal

Purification

PCR

Purification

Poly(A) RNA

Removal of RNA template

Random priming


200 min 60 min

5’

5’

5’

3’3’

3’3’

5’3’

3’

Tagged cDNA library


i7 index

(AAAAAAAA)

(AAAAAAAA)

(TTTTTTTTT)

5’


SEQUENCING - Read orientation for QuantSeq REV

70 min 45 min

5’

i5 index (optional)

Read 1

i7index

Index 1 (i7)Sequencing

Primer

Index 2 (i5)Sequencing

PrimerRead 1 Sequencing Primer (CSP, included)

Read 2

Read 2 SequencingPrimer

i5index

(optional)

NB TTTT.....TTTTTTT

5

パフォーマンスストランド特異的な 3' 末端マッピングFDA Sequencing Quality Control（SEQC）standard sample AおよびBはERCC external RNA control ExFold Mixes 1 および 2をそれぞれ添加したリファレンス RNAです。1, 2 これらのサンプルからQuantSeq ライブラリを作製し、Association of Biomolecular Resource Facilities（ABRF）より報告されているmRNA-Seq データセット 3 と比較しました。従来のmRNA-Seq では転写産物の全長に渡りシークエンス解析を行いますが、QuantSeq では主に 3'末端付近を解析します（図 2）。そのため、QuantSeq では遺伝子発現解析の高い正確性を保ちながら、シークエンス深度を 90%以上節約することが可能です。スパイクイン RNAにはセンス鎖のみ含まれますので、ゲノムアノテーションとは独立してストランド特異性を評価することが可能です。2つのmRNA-Seq SEQCデータセットではストランド特異性がそれぞれ 93.4%、97.8% でしたが 3、QuantSeq のストランド特異性は＞ 99.9%を示しました。このようにノイズを下げることにより、アンチセンス転写産物を正確に検出、定量することが可能です。

0 20 40 60 80 1000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

mRNA-Seq all genes 77.9

QuantSeq all genes 6.3

ERCC 72.2

ERCC 6.5

Nor

mal

ized

Cou

nts

Percentile of Transcript (5‘ to 3‘)

図 2｜カバレッジ vs. 標準化した転写物長 RSeQCより取得したカバレッジをプロットした。転写産物は面で、ERCC mixは線で、QuantSeq は色付きで、mRNA-Seq は灰色で表した。数字は曲線下面積を示し、シークエンスカバレッジの目安である。

QuantSeq の定量性遺伝子カウントの正確性を評価するために、ERCC spike-in転写産物の平均リードカウントをインプット分子数に対してプロットしました（図 3）。線形モデルならびに Spearmanの相関係数で評価されるように、遺伝子発現解析において、非常に高い input-output 相関と正確性が見られました。

# Molecules

Avg

. Rea

d Co

unt

図 3｜QuantSeq を用いた遺伝子発現解析において、ERCCのリードカウントはインプットと非常に良く相関した。

差次的遺伝子発現QuantSeq と従来のmRNA-Seq を、“erccdashboard”ソフトウェアを使用した差次的遺伝子発現の検出能の点で比較しました 4。リード数を 10 Mから 0.625 Mへダウンサンプルした場合、従来のmRNA-Seq では曲線下面積（AUR）の値は 0.736 ～ 0.776 と低い一方、QuantSeq では 0.860～ 0.897 と非常に高い値を維持しました（図 4）。

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

True

-Pos

itive

Rat

e (T

PR)

False-Positive Rate (FPR)

total reads

MQuantSeq mRNA-Seq

ø AUC #ERCC ø AUC #ERCC

10 0.897 65.1 0.736 63.8_5 0.878 59.9 0.760 59.3

2.5 0.836 55.2 0.771 54.0_1.25 0.836 48.4 0.771 48.9

0.625 0.860 43.2 0.776 42.5

4:11:1.51: 2

///

図 4｜QuantSeq と従来のmRNA-Seq の差次的遺伝子発現検出能の比較ERCC ExFold Spike-In Mix 1 および 2の比率を事前に検討し、陽性率（TPRs）と偽陽性率（FPRs）を評価した。曲線下面積（AUC）1を最適な検出とする。曲線下面積（AUR）は検出された ERCC RNA数（#ERCC）と併せて評価される。

6

FFPE 組織から抽出した RNAを使用する場合のパフォーマンスQuantSeq では、高クオリティ RNAと低クオリティRNAを使用した場合で収量に高い相関が見られる。RNA 分解を受けている可能性があるサンプル（例：ホルマリン固定パラフィン包埋切片 ; FFPE）について、同じ由来かつ RNA クオリティの異なる 2 種類のサンプルを使用し、QuantSeq の有用性を評価しました。MOLP-8 ヒト骨髄腫細胞株の異種移植片を 2片に分割し、新鮮凍結組織ブロックおよび FFPE ブロックを作製し、これらを RNAクオリティの異なる試料としました。RNAクオリティの評価には、Agilent 社の RIN（RNA Integrity Number）がよく用いられており、RIN 8 以上で高いクオリティの RNAであることを示します。分解が進んでいるサンプルでは RINの精度は低く、RINよりもDV200（200 ヌクレオチド以上のRNA断片の割合）の値が利用されます。DV200 の値が低いと、RNAの完全性が低いことを表します。抽出した RNAについて、RNAのクオリティを評価したところ、FFPE サンプルのDV200 は 87%（RIN：2.8）、凍結組織の RINは 8.3 でした。その後、QuantSeq 3' mRNA-Seq　FWDキットを使用して、50 ng RNA インプットにてライブラリを作製しました。QuantSeq Kit では、DV200 が 52%の FFPE 組織からもライブラリを作製することができました（data not shown）。FFPE 組織については低クオリティRNA用の推奨プロトコルに準じて、凍結組織についてはスタンダードなプロトコルに準じて操作を行いました。作製したライブラリについて、HiSeq 2500 を用いて、1× 50 bpリード長でシークエンス解析を行いました（図 5）。

図 5｜QuantSeq 3' mRNA-Seq FWD Kit を用いて作製したライブラリについて、バイオアナライザー 2100 HS で DNAを定量した。FFPE 組織を青色、凍結組織を赤色で示す。分解が進んだ試料 RNAから作製したライブラリでは、滑らかな分布となり、リンカー配列により生じる副産物のピークが見られなかった。また、DNA断片長のピークは短鎖側にシフトした。平均ライブラリサイズは204 bp（FFPE組織）、286 bp（凍結組織）であった。

標準化した転写産物長に対してカバレッジをプロットしたところ、使用した RNAのクオリティに関わらず、カバレッジは転写物の 3' 末端側に集中することが示されました（図 6）。しかしながら、QuantSeq FWDライブラリは poly(A) 鎖に向かって得られますので、カバレッジはライブラリサイズやシークエンシングの長さに依存します。FFPE 組織から作製したライブラリは、凍結組織から調製したライブラリと比較し非常に短いため、シークエンス解析の際に転写産物末端に到達する頻度が高くなります。このことはカバレッジのプロットに影響すると考えられます。

Norm

alise

d Co

vera

ge Cryo SampleFFPE Sample

図 6｜QuantSeq のリードカバレッジと転写産物長の相関性FFPE 組織（青色）、凍結組織（赤色）より抽出した試料 RNA を用いてQuantSeq ライブラリを作製し比較した。

FFPE 組織から抽出した RNAと凍結組織から抽出した RNAを用いた場合では遺伝子発現解析の相関性は高い結果となり（R2 0.86）、QuantSeq は様々なクオリティの RNAで一貫した結果が得られることが示されました（図 7）。

FFPE Sample

Cryo

Sam

ple

図 7｜FFPE 組織、凍結組織での遺伝子カウントの相関

FFPE Sample

Cryo Sample

1 readTreshold:

14913 11757 10605

377124

25

5168

5 reads 10 reads

2773

図 8｜FFPE 組織、凍結組織を用いてQuantSeq 解析し（リード数 2.5 M）、遺伝子発現をベン図に表した。

QuantSeq は、凍結した試料 RNA の場合、リード数 26.5 M で 25,842 遺伝子検出可能です（data not shown）。リード数を一律 2.5 Mにした場合、凍結組織では少なくとも 1リードで 20,081 遺伝子、FFPE 組織では 15,190 遺伝子が検出され、検出遺伝子数に 24%の差が見られました（図 8）。しかしながら、検出レベルを 5リードまたは 10リードに増やすと、サンプル間の差は 3%または 1%にまで減少しました。これは、FFPE 組織では、低発現量の遺伝子は FFPE サンプルの調製、保存、RNA抽出等の過程で分解を受けやすいこと、QuantSeq では凍結組織、FFPE 組織、両者において正確に遺伝子を検出していることを示しています。

7

References1. The External RNA Controls Consortium. (2005). The External RNA Controls Consortium: a progress report. Nature Methods 2:731-734 2. Ambion. ERCC RNA Spike-In Control Mixes. Cat. No. 4456740,

44567392. Ambion. ERCC RNA Spike-In Control Mixes. Cat. No. 4456740, 44567393. Li, S. et al. (2014). Multi-platform assessment of transcriptome pro ling using RNA-seq in the ABRF next-generation sequencing study. Nat. Biotechnol. 32, 915–9254. Munro, S.A. et al. (2014). Assessing technical performance in differential gene expression experiments with external spike-in RNA control ratio mixtures. Nat. Commun. 5, 5125

QuantSeq は、逆転写の過程で oligo(dT) プライミングを用いており、1転写産物あたり 1分子の断片を生成するため、RNAのクオリティに依存することなく、正確な遺伝子発現解析が可能です。スタンダードなmRNA-Seq のプロトコルでは転写産物全体をカバーしますが、分解が進んだ RNAをサンプルとして用いると3' 末端側にバイアスのかかった結果となる可能性があります。従って、QuantSeq 3' mRNA-Seq は、他のmRNA-Seq プロトコルと比較し、低いクオリティの RNAサンプルから効率よく次世代シークエンス解析用ライブラリを作製する非常に効果的なツールと言えます。

血液 RNA用Globin Block モジュールQuantSeq ライブラリとの併用疾患関連の研究において、血液は情報量が多く、利用しやすい検体です。Globin mRNA（HBA1、HBA2、HBB）は血液中の total RNA のうち 50-80%を占めるため、シークエンスリードの大部分をマスクしてしまい、遺伝子の検出感度や定量感度を下げてしまいます。従来のGlobin除去法では、試料RNAの前処理が必要なため、多量の RNAが必要で、追加コストも必要です。Lexogen 社の Globin Block Module は QuantSeq ライブラリを作製する際に使用することでGlobin 除去が可能です。少ないインプット量（血液由来 total RNA 50 ng 程）に対応しており、その他の前処理は不要です。

Globin Block Module はQuantSeq 3' mRNA-Seq ライブラリ作製キット（イルミナ社シークエンサー用）と併用できるようデザインされています。QuantSeq ライブラリを作製する際、スタンダードな RNA Removal Solution（RS）の代わりに modifi ed RNA Removal Solution（RS-Globin Block）を用いて Globin Blocker を導入します。Globin Blocker は Globin の第一鎖 cDNAに結合し、第二鎖合成時に二本鎖DNA生成を阻害します。Globin Block は自動化システムにも対応しており、ヒトおよびブタサンプル用を用意しています。

Globin Block は Globin にマップされるリードを0.7%まで減少させるGlobin Block を使用してライブラリを作製した場合、Globin Block を使用しなかった場合と比較し、Globin にマップされたリードの割合が顕著に減少しました（図 9）。Globin にマップされたリードの割合は、白血球リッチの血液の場合 0.7% まで、全血 +Globin Block の場合 9.7% まで減少しました。

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

Standard +Globin Block



250 ng 1 50 ng 1 50 ng 2


50 ng 3

Perc

enta

ge o

f Uni

que

Read

s M

appi

ng to

Glo

bin

mRN

As

Human (Homo sapiens)

Hs_HBB

Hs_HBA2

Hs_Minor Globins

Hs_HBA1


100 ng 4

Pig (Sus scrofa)

Ss_HBA

Ss_HBB

Ss_Minor Globins

図 9｜ヒトおよびブタのGlobin mRNAにマップされたリードの割合全血より抽出した RNAを用いて、QuantSeq FWDプロトコルでライブラリを作製した群と、QuantSeq +Globin Blockでライブラリを作製した群で比較した。1．Lexogen 社 SPLIT RNA Extraction Kit（赤血球の溶解なし）2．Qiagen 社 PAX-gene® Blood RNA Kit（赤血球の溶解あり）3．Lexogen 社 SPLIT RNA Extraction Kit（赤血球の溶解あり）4． Norgen Biotek 社 Preserved Blood RNA Purification Kit（赤血球の溶解なし）

遺伝子検出率の向上図 10 では、スタンダードな QuantSeq ライブラリとGlobin Block を併用して作製したライブラリ間でユニークに検出された遺伝子と重複して検出された遺伝子を表しています。しきい値 0.5 CPM（counts per million）では、大部分の遺伝子が同じように検出されましたが、Globin Blockを併用して作製したライブラリのみで 3,690 種類の遺伝子がユニークに検出されました。対照的に、スタンダードなQuantSeq ライブラリのみで検出された転写産物はわずか14、17、136種類でした。

Threshold >0.5 CPM

Standard only Detected in both +Globin Block only

50 ng 2 100 ng 3

13,819 6,891136

50 ng 1

10,66014

3,690 2,825

14

1,908

250 ng 1

11,20317

3,030

Human (Homo sapiens) Pig (Sus scrofa)

図 10｜ヒトおよびブタの血液サンプルにおいて、Globin Block の使用で遺伝子検出率が向上する全血より抽出した RNAを用いて、QuantSeq FWDプロトコルでライブラリを作製した群と、QuantSeq +Globin Blockでライブラリを作製した群で比較した。検出された遺伝子数はCounts Per Million（CPM）で標準化したリードカウントから算出した（しきい値＞ 0.5）。重複して検出された遺伝子は深緑色で示し、ユニークに検出された遺伝子は青色（スタンダードなQuantSeq ライブラリ）、黄緑色（QuantSeq +Globin Block ライブラリ）で示した。1．Lexogen 社 SPLIT RNA Extraction Kit（赤血球の溶解なし）2．Qiagen 社 PAX-gene® Blood RNA Kit（赤血球の溶解あり）3．Lexogen 社 SPLIT RNA Extraction Kit（赤血球の溶解あり）4． Norgen Biotek 社 Preserved Blood RNA Purification Kit（赤血球の溶解なし）

8

スタンダードな RNA-Seq の手法では total RNA量の測定が可能ですが、RNAの動態（転写や分解）を解析することはできません。Lexogen 社の SLAMseq（thiol (SH)-Linked Alkylation for the Metabolic sequencing of RNA）Kitでは、煩雑な単離作業無しで、サンプル中に元々存在している RNAと新しく合成された RNAを並行して解析可能です。

SLAMseq Metabolic RNA-Seq Kit

アドバンテージ§ トランスクリプトームワイドに RNA合成とターンオーバーを解析§ 新生 RNAの発現量と転写産物の安定性を解析§ 遺伝子発現解析にお勧め§ プルダウン法のような単離作業は不要§ QuantSeq 3' mRNA-Seq Kit や SLAMdunk データ解析ソフトウェアと併用可能

図 1｜SLAMseq のワークフロー細胞培養時に 4- チオウリジン（S4U）を添加し、新生 RNAに取り込ませる（ウラシルの代わりに取り込まれる）。Total RNAを精製後、ヨードアセトアミド（IAA）を加え、S4Uのチオール基をアルキル化する。Lexogen 社QuantSeq 3' mRNA Seq library Prep kit でライブラリ作製する際の逆転写のステップで、カルボキシアミドメチル基（アルキル化された S4U）に対し、G（赤字）が合成される。元々存在した RNAは S4Uを取り込んでおらず、逆転写の際、同部位にはA（黒字）が合成されるため、TからCへの変換を解析する事で元々存在した RNAと新生 RNAを区別する事ができる。

Labeling Sampling

Cultured Cells RNA

nascent

existing

S4U

U

RT

*S4UG

UA

PCR +Sequencing

Alkylation

+ IAA

S4U

U

*S4U GC

TA

QuantSeq 3' mRNA-Seq

O

N

N

SH

OOH

OH OH

+ O

NH2I

O

N

N

S

OOH

OH OH

O

H2N

Read Coverage

0

700+S4U

T>C mutation non-T>C mutation

ワークフローSLAMseq Kit はトランスクリプトームワイドで定量的な新規の解析法である thiol (SH)- Linked Alkylation for the Metabolic Sequencing of RNAを基にしています。1細胞培養時に 4- チオウリジン（S4U）を添加し、新生 RNAにS4Uを取り込ませます。その後、ヨードアセトアミド（IAA）により S4Uをアルキル化し、ライブラリ作製後、シークエンス解析を行います。ライブラリ作製の逆転写の過程で、ア

ルキル化された S4Uにはアデニン（A）ではなくグアニン（G）が合成されるため、チミン（T）からシトシン（C）への変換を解析することで元々存在している RNAと新しく合成された RNAをバイオインフォマティクなレベルで識別可能です（図 1）。Lexogen 社 QuantSeq Kit と併せてご使用いただけます。

SLAMseq KitSLAMseq Kit は metabolic RNA-Seq 実験のための S4U取り込み条件検討用の試薬や S4Uラベリング用の試薬が全てセットになっています（表 1）。SLAMSeq Explorer Kit では、標的細胞における S4Uの毒性評価や、S4U濃度の最適化が可能です。また、SLAMseq Kinetics Kit の Anabolic Kinetics Module では RNA 合成を、Catabolic Kinetics Module では RNA代謝を評価することが可能です。

表 1｜Lexogen 社 SLAMSeq Kit

Kit Type Module Application

SLAMseq Explorer Kit

Cell Viability Titration Module(Cat. No. 059.24)

• Assess S4U toxicity in target cell lines• Optimize S4U labeling concentrations

S4U Incorporation Module (Cat. No. 060.24)

• Measure S4U uptake and incorporation rates using HPLC analysis

SLAMseq Kinetics Kit

Anabolic Kinetics Module(Cat. No. 061.24)

• Label newly transcribed RNA with S4U• Measure RNA synthesis kinetics• Analyze nascent RNA diff erential expression

Catabolic Kinetics Module (Cat. No. 062.24)

• Label existing RNA with S4U• Assess transcript stability• Analyze RNA degradation kinetics

9

References 1. Herzog, V., et al. (2017) Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics. Nature Methods. DOI: 10.1038/nmeth.4435

アプリケーション新生RNAおよびtotal RNAの差次的遺伝子発現プロファイリング新生 RNA および total RNA の量を評価できるよう、SLAMseq では得られる情報の深度を拡大しています。検証のため、S4U添加後の培養時間を 2時間とし、タイムポイント（0 分、30 分、60 分、120 分）をとって anabolic kinetics 解析を行いました。

標識の最大効果を評価するため、コントロールで標準化したhighest treatment level（T2）を log fold changes（LFC）で表し、0分後と 120 分後の 2点で比較しました（図 2）。実験開始時（0分後）では、新生 RNAと total RNAの LFCは同様でしたが、120 分後には、新生 RNAの LFC は total RNA と比較し上昇しました（図 2、緑）。コントロールと比較した T2の新生 RNA量のダウンレギュレーションは標識により転写産生が阻害されていることを示しています。一方、total RNA については、同期間で LFC はほとんど上昇しませんでした（図 2、黒）。

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

1 10 100 1,000 10,000 100,000-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

1 10 100 1,000 10,000 100,000

t0

Mean CPM Mean CPM

Nor

mal

ized

LFC

t120

T2/Control T2/Control

Total RNA

Nascent RNA

Total RNA

Nascent RNA

図 2｜SLAMseq anabolic 解析における LFCプロットの比較HeLa 細胞を S4Uを含む培地で 120 分培養した。RNAは 4つの異なるタイムポイント（S4U処理後 0 分、30 分、60 分、120 分）で回収した。アルキル化後、QuantSeq FWDライブラリを作製し、1サンプルあたり 5-10 Mリードで配列解析を行った。データ解析は SLAMdunk データ解析パイプラインを利用した。リードカウントは計算式（CPM+0.1）×（CRgene- CRglobal-t0）を用いて標準化した。CPM：Counts Per Million、CR：Conversion Rate.

mRNA合成とターンオーバーの動態解析SLAMseq は個々の転写産物の RNA合成および分解の動態を特異的に測定することが可能です。同様に、転写産物の合成、安定性、減少をグローバルに評価可能で、転写レベルや転写後レベルで、遺伝子発現制御の観点から新たな情報が得られます。図 3に示すように、HES1 や JUNBなどの制御タンパク質をコードする遺伝子のmRNAは、通常は、高い合成率とターンオーバー率ですが、NDUFA7 や RSP9 のようなハウスキーピング遺伝子のmRNAは、よりゆっくり転写、また分解されます。

HES1

JUNB RPS9

NDUFA7

S4U Pulse U Stop S4U Pulse U Stop

Frac

tion

of T

>C R

eads

Time (hrs)0 4 8 12 16 20 24 0 4 8 12 16 20 24 0 4 8 12 16 20 24 0 4 8 12 16 20 24

0.0

0.2

0.4

0.0

0.2

0.4

図 3｜RNAの合成と分解の経時変化培地に S4Uを添加し 24 時間培養後、RNA合成量を測定した（S4U Pulse）。S4Uを培地から取り除き、非標識のウリジンを添加後さらに 24時間培養し、RNA の分解速度を測定した（U Stop）。Reproduced from Herzog et al., (2017) 1

SLAMdunk SLAMseq データ解析パイプラインLexogen 社では、SLAMseq 3' mRNA-Seq ライブラリ作製キット（イルミナ社シークエンサー用）で作製したライブラリから得られたデータを解析するためのカスタムパイプライン SLAMdunk を提供しています。SLAMdunk ソフトウェアは Bluebee® ゲノミクスプラットフォーム上で利用可能で、SLAMseq 実験で得られたシークエンスデータを簡便に解析可能です（図4）。圧縮した fastq ファイルをアップロードし、適切な種を選択します。データを処理した後、SLAMdunkは T＞ C変換率に関する統計と 3' UTR 領域に対するアラインメントをアウトプットします。結果は Bluebee® プラットフォームからダウンロード可能です。SLAMseq、QuantSeq、SLAMdunk を併せて利用することで、ハイスループットかつ時間分解の RNA-Seq実験が可能となります。

Trimming

Cutadapt removes:• low quality tails • poly(A)read-through • adapter contamination

FASTQC reports of trimmed reads in directory “trimmed”

NextGenMap: accept multiple mismatches

Read QC

Zipped FASTQ (Input)

Alignment

Retain reads with unique 3‘ UTR alignmentsAlignment

Filtering

Exclude T>C SNPs from further analysisSNP

Detection

Results in directory “filter”Output

Filtering

Results in directory “snp”Detected

SNPs

Count T>C conversion rate normalized for T content and coverage in 3‘ UTRsCounting

Results in directory “count”Output

Counting

Generate multiple statistics and visualizations

Results in directories “stats” and “multiqc”Output

Statistics

ConversionRate Statistics

図 4｜SLAMdunk データ解析パイプライン

10

QuantSeq-Flex RNA-Seq Kit は、カスタマイズしたプライマーを用いて、標的配列をシークエンス解析するためのキットです。QuantSeq の解析原理を用いて 1転写産物あたり 1分子の断片を生成しながら、標的配列にフォーカスしたシークエンス解析を行うことが可能です。

QuantSeq Targeted RNA Sequencing Library Prep Kit

アドバンテージ§ フレキシブル ‒ 標的配列のシークエンス解析や分子バーコード法に有用§ マルチプレックス化 ‒ 1 反応あたり 100種類のカスタムプライマーを用いてマルチプレックス解析可能

§ 正確な遺伝子発現解析 ‒ 1転写産物あたり1分子の断片を生成するため、正確に遺伝子を定量可能§ 融合転写産物の同定にお勧め§ 4.5 時間で total RNAからライブラリ作製可能§ イルミナ社シークエンサーの場合は、i5/i7 インデックスの組み合わせにより 9,216 サンプル、またはデュアルインデックスにより 96サンプル解析可能

ワークフローQuantSeq-Flex targeted RNA-Seq では、プライマーの組み合わせによって、4つのタイプのライブラリを作製可能です（図 1）。

A）逆転写反応時に oligo(dT) プライミング、第二鎖合成時にランダムプライミングを行う（QuantSeq 3' mRNA-Seq FWD）

B）逆転写反応時に oligo(dT) プライミング、第二鎖合成時に標的特異的なプライミングを行う（Targeted 3' mRNA-Seq）

C）逆転写反応時に標的特異的なプライミング、第二鎖合成時にランダムプライミングを行う（Targeted RNA-Seq、新規の融合転写産物の同定に有用）

D）逆転写反応時、第二鎖合成時に標的特異的なプライミングを行う（Targeted RNA-Seq、既知遺伝子の解析に有用）

図 2 では標的特異的プライミングの例を示しています。serine / threonineprotein kinase B-raf（BRAF, NM_004333.4）、receptor tyrosine-protein kinase erbB-2（ERBB2, NM_001005862.2）、KRAS proto-oncogene, GTPase（KRAS, NM_004985.4）に対してプライマーを設計し、K562細胞から調製した total RNAならびにQuantSeq-Flex Kit を用いてライブラリを作製しました。図 3では RNAインプットごとに BCR-ABL 融合転写産物を検出した結果を示しています。

LIBRARY GENERATION

Tagged double-stranded cDNA library


200 min 60 min

Reverse Transcription

RNA Removal

Purification

LIBRARY AMPLIFICATION 70 min 45 min

PCR

Purification

OligodT priming

Random or Target-specific priming

5’

5’

3’(AAAAAAAA)(TTTTTTTTT)

5’

(TTTTTTTTT)3’

Total RNA

3’

5’

3’3’

5’

Target-specific primingTotal RNA

Random or Target-specific priming

5’ 3’3’

5’

3’

5’

5’

3’3’

5’


i7 indexi5 index (optional)

図 1｜QuantSeq-Flex targeted RNA-Seq V2 のワークフローRead 1（シークエンシングは緑色の P5アダプターから開始される）は RNA配列を反映し、逆転写反応では、キット付属の oligo(dT) プライマーもしくは標的特異的なプライマー（キットには含まれません）でプライミングされる。第二鎖合成はキット付属のランダムプライマーもしくは標的特異的なプライマー（キットには含まれません）で行われる。RNA除去ステップは、ランダムプライミングにより第二鎖合成した場合のみ必要であり、標的特異的プライマーを使用する場合はこの工程は不要となる。プライミング方法の組み合わせにより、異なる 4種類のライブラリを作製することが可能である。

図 2｜QuantSeq-Flex ライブラリの Bioanalyzer トレースBRAF（NM_004333.4、赤）、ERBB2（NM_001005862.2、青）、KRAS（NM_004985.4、緑）に対するプライマーを用いて、QuantSeq-Flex ライブラリを作製し、Bioanalyzer で解析した。

[bp] ladder 100 ng K562QuantSeq-Flex

BRAF 29 cycles

100 ng K562QuantSeq-Flex

ERBB2 29 cycles


KRAS 29 cycles

図 3｜QuantSeq-Flex ライブラリの Bioanalyzer トレースBCR-ABL 融合転写産物に対するプライマーを用いてQuantSeq-Flex ライブラリを作製し、Bioanalyzer で解析した。

[bp] ladder 500 ng K562QuantSeq-Flex

BRAF 24 cycles


ERBB2 26 cycles


KRAS 28 cycles

11

Small RNA-Seq Library Prep Kit は、total RNAや豊富な small RNAからイルミナ社シークエンサー用ライブラリを、総作製時間 5時間以内で簡単に作製できます。遺伝子発現制御において重要な役割を担っているとされるmicroRNA や small interfering RNA 等の small RNA のプロファイリングが可能です。

Small RNA-Seq Library Prep Kit

アドバンテージ§ 総作製時間 5時間以内でライブラリ作製が可能§ RNA必要量は 50 pg から（適応範囲は 50 pg ‒ 1,000 ng）§ 血漿、血清、尿のような RNA含量の低い検体にも対応§ i7 インデックスにより 96サンプルまでマルチプレックス解析が可能

ワークフローライブラリ作製は、total RNAや small RNAの 3' 末端側と5' 末端側にアダプターを付ける事（ライゲーション）をベースにしています。両末端（5' 末端と 3' 末端）にアダプターを付加した RNAをもとに cDNAを合成し、PCRステップでi7 インデックスを付加します。この i7 インデックスの付加によりマルチプレックス解析が可能になります。多くの場合、特に試料 RNAにmicroRNAが多く含まれる場合、作製したライブラリはイルミナ社シークエンサーにそのままご使用いただけます。一方、リンカー同士の結合産物（ダイマー等）の除去や、total RNA ライブラリから small RNA ライブラリを分けたい場合は、Lexogen 社の磁気ビーズによる精製モジュールをご利用いただけます。

パフォーマンスSmall RNA-Seq Kit は少量の RNAで、microRNA発現解析のためのライブラリ作製が可能です（図 2）。高感度な検出により、血漿、血清、尿等のリキッドバイオプシー（エクソソーム含む）のような RNA含量の低い検体での解析に適しています。加えて、本キットは、異なるインプット量やサンプル間でも高い再現性と相関性を示します（図 3）。

R2 = 0.99921

0.01

0.1

1

10

100

1000

0.01 0.1 1 10 100 1000

RPM

RPM

60 pg

R2 = 0.97225

0.01

0.1

1

10

100

1000

0.01 0.1 1 10 100 1000

RPM

600 pg RPM

600 pg vs 60 pg

R2 = 0.95182

0.01

0.1

1

10

100

1000

0.01 0.1 1 10 100 1000

RPM

RPM

600 pg b)a)

60 p

g

図 3｜ a）サンプル間の高い相関性：精製した血漿 RNAの各濃度（60 pg、600 pg）、RPM（Reads per Million）で、サンプル間で高い相関性を示した。b）濃度間の高い相関性：精製した血漿 RNAの濃度間（60 pg、600 pg）で高い相関性を示した。


RNA Input

3‘ Adapter Ligation

PCR

Purification

cDNA Library with Adapters for Illumina Sequencing

RNA/cDNA library

i7 Index

Purification

LIBRARY GENERATION 230 min 50 min

60 min 25 min

5‘ Adapter Ligation

Reverse Transcription

3’5’3‘Adapter

(small, total, plasma, exosomal, urine, serum) RNA

3’5’3’

3’5’

3’5’

3’5’

5’ 3’5’

5’

3’5’

5’3’

3’5’

3’5’

3’5’5‘Adapter

5’

3’5’3’5’ 3’5’

3’5’

5’ 3’

3’ 3’

3’3’

5’5’

5’

5’

3’5’

図 1｜Small RNA-Seq ライブラリ作製のワークフロー

0 50

100 150 200 250 300 350

Com

petit

or B

Com

petit

or N

Com

petit

or I

Lexo

gen

Com

petit

or B

Com

petit

or N

Com

petit

or I

Lexo

gen

Com

petit

or B

Com

petit

or N

Com

petit

or I

Lexo

gen

6 pg 60 pg 600 pg

Num

ber o

f miR

NA

>5 R

aw R

eads

Total Number of miRNAs Detected (Plasma)

図 2｜Lexogen 社 Small RNA-Seq Kit は少量の RNA から多くのmicroRNAの検出が可能個別に作製した 4 つのライブラリにおいて、各ライブラリで検出されたmicroRNAの総数。精製した血漿 RNA（6 pg、60 pg、600 pg）を用いて、4社のライブラリ作製キットでライブラリを作製した。各ライブラリを等しいモル濃度、1.5 - 2 M Total Raw Reads でシークエンス解析した。Lexogen社ライブラリ作製キットは全ての試験区、5 Raw Reads 以上で、非常に多くのmicroRNAを検出した。

12

SENSE mRNA-Seq & Total RNA Seq Library Prep Kit は、5時間以内にシークエンス解析用ライブラリを作製するためにデザインされたオールインワンのライブラリ作製キットです。本キットで作製したライブラリは、ストランド特異性の維持や、ゲノム上の一致するストランドへリードのマッピングを可能にし、アンチセンス転写産物や重複遺伝子の発見や定量を可能にします。

SENSE Whole Transcriptome Library Prep Kit

アドバンテージ§ 逆転写産物を避ける事による高いストランド特異性（99%以上）§ 簡単で迅速なプロトコル ‒ 実操作時間 2.5 時間、総作製時間 5時間§ 最少限の必要量 ‒ 0.5 ng の poly(A) 選択した RNA もしくは rRNA を除去した RNA、または1 ng の total RNA

§ PE50 以下、PE250 以上のライブラリサイズにも適用§ プラットフォームに依存しない（イルミナ、イオントレント）§ 自動化で簡略なプロトコル ‒ 磁気ビーズを用いた精製

ワークフローライブラリ作製は Lexogen 社独自のストランド置換 Stop/Ligation 技術を用います。シークエンスプラットフォームに互換性のあるリンカー配列を含む Starter/Stopper ヘテロダイマーがランダムに RNAにハイブリダイズします。1つのチューブ内で逆転写とライゲーション反応を同時に行います。Starter から cDNA合成し、次の Starter/Stopper ヘテロダイマーの Stopper とライゲーションします。

増幅するインサートサイズは Starter と Stopper の結合サイトに依存するため、RNAの断片化は不要です。第二鎖合成の後、ライブラリは増幅され、最大 96バーコードが導入されます。i5 Dual Indexing Add-on Kit を用いる事で最大384バーコードの導入が可能になります。

図 1｜SENSE Total RNA-Seq ライブラリ作製（左）と SENSE mRNA-Seq ライブラリ作製（右）のワークフロー（イルミナ社シークエンサー用）

LIBRARY GENERATION


RiboCop rRNA Depletion Kit (optional)

Hybridization of Starters and Stoppers

Reverse Transcriptionand Ligation

Second Strand Synthesis

Purification

PCR

Purification

Poly(A) RNA or rRNA-depleted RNA

RNA template

RNA template


130 min 45 min

70 min 45 min

starte

r

stopp

er

5’

5’

5’

5’5’

3’

3’

3’

starte

r

stopp

er

5’

5’

3’5’ 3’

3’

5’ 3’

3’

5’

5’

3’

3’

Ligase

5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’

5’

Tagged cDNA library



AAAAAAAAT T T T T T T T T T



POLY(A) SELECTION

LIBRARY GENERATION


60 min 20 min

Aliquot and Wash Beads

Denature RNA

Hybridize mRNA

Hybridization of Starters and Stoppers

Reverse Transcriptionand Ligation

Second Strand Synthesis

Purification

PCR

Purification

Total RNA

Poly(A) RNA

Poly(A) RNA

Poly(A) RNA


Magnetic Bead

Magnetic Bead

Magnetic Bead

5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’

5’ 3’5’ 3’5’ 3’

5’ 3’ 5’ 3’5’ AAA TTTTT

145 min 85 min

70 min 45 min

starte

r

stopp

er

5’

5’

5’

5’5’

3’

3’

3’

starte

r

stopp

er

5’

5’

3’5’ 3’

3’

5’ 3’

3’

5’

5’

3’

3’

Ligase

5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’

5’

Tagged cDNA library



13

表 1｜SENSE mRNA-SeqVer.2 によるMAQCサンプルAと従来の RNA-Seq によるMAQCサンプルAを用いたシークエンス解析結果のサマリー

SENSE mRNA-Seq V2 Standard mRNA-Seq

500 ng Total RNA

Number of Reads

Strand-Specifi city1

% Uniquely Mapping

Reads

% rRNA Reads

% Protein Coding

Number of Reads

Strand-Specifi city1

% Uniquely Mapping

Reads

% rRNA Reads

% Protein Coding

FDA-A1

48,353,384 99.981 % 89.11 % 0.0004 % 94.12 % 5,303,785 93.567 % 86.96 % 0.0003 % 94.93 %

FDA-A2

38,011,481 99.989 % 89.03 % 0.0003 % 94.24 % 5,406,559 93.348 % 86.89 % 0.0003 % 94.94 %

FDA-A3

45,786,988 99.995 % 88.85 % 0.0002 % 94.26 % 5,067,031 93.505 % 86.83 % 0.0003 % 94.89 %

1 Number of reads mapping to ERCC genes in the sense direction divided by total number of reads mapped to the ERCC genome.

パフォーマンスSENSE Total RNA-Seq は、同じサンプル量を用いた場合でも、異なるサンプル量を用いた場合でも、サンプル間において非常に高い再現性を示しました（図 2）。

0,00001 0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10 100

100

ng U

HRR

- Rib

oCop

dep

lete

d

100 ng UHRR - RiboCop depleted

0,00001 0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10 100

1,00

0 ng

UHR

R - R

iboC

op d

eple

ted

10 ng UHRR - RiboCop depleted

0,00001

0,0001

0,001

0,01

0,1

1

10

100

0,00001

0,0001

0,001

0,01

0,1

1

10

100

A) Human Replicate measurements

R2 = 0.995 R2 = 0.950

B) Human Input amount correlation

図 2｜SENSE Total RNA-Seq Kit でライブラリ作製するにあたり、Universal Human Reference RNA（UHRR）サンプルを RiboCopo rRNA Depletion Kit により rRNA を除去した。A）再現性：UHRR サンプル 100 ng からRiboCopで rRNAを除去した。B）導入量の相関性：UHRR サンプル 10 ng とUHRR サンプル 1,000 ng から RiboCop Kit で rRNAを除去した。

SENSE は、標準的なmRNA-Seq データと同等なアライメント統計データを作り出しますが、SENSE の場合は高いストランド特異性を持ちます（表 1）。

FDA Sequencing Quality Control Standard sample Aを用いて SENSE mRNA-Seq ver.2 と従来の RNA-Seq を比較しました。SENSE mRNA-Seq により、個別に作製した 3つのライブラリにおいて、各々 3' 側と 5' 側で均一な蓄積のカバレッジを示しました（図 3）。

SENSE mRNA Seq V2 A1SENSE mRNA Seq V2 A2SENSE mRNA Seq V2 A3mRNA Seq A1mRNA Seq A2mRNA Seq A3

Cove

rage

0.0

0.2

0.6

0.4

0.8

1.0

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100図 3｜Gene Body のカバレッジ標準的なmRNA-Seqは3'側でバイアスがかかり、5'側で低いカバレッジを示す。SENSE mRNA-Seq は、転写産物全体的により均一なカバレッジを示す。

表 2｜ SENSE 選択ガイド

Kit Properties SENSE mRNA-Seq V2 SENSE Total RNA-Seq

Analysis of Poly(A) RNA• Poly(A) RNA

• Non-coding RNA 1

Input Material Total RNA 2

(incl. poly(A) RNA selection step)• rRNA depleted RNA 2

• Poly(A) selected RNA

Low Input RNA Material 1 ng - 2 μg 0.5 ng - 500 ng

Low Quality and FFPE Samples 3

Superior Strand-Specifi city (>99.9 %)

Easy Adjustment of Library Size

Rapid Turnaround 5 h 3.5 h

No Additional Kits / Reagents for Amplifi cation,Purifi cation, and Size Selection 4

Simple Multiplexing (up to 9,216 Index Combinations) 5 5

Compatibility with Diverse Platforms Illumina, Ion Torrent Illumina

Automation-Friendly

1 Excluding small non-coding RNA. 2 SENSE Total-Seq is available as bundle version with RiboCop rRNA Depletion Kit V1.2, poly(A) selection is already included in SENSE mRNA-Seq V2. 3 Only applicable for rRNA depleted RNA.4 24 in-line barcodes for Ion Torrent are sold separately; 96 external i7 indices for Illumina are included. 5 Using the i5 Dual Indexing Add-on Kit for QuantSeq/SENSE.

SENSE ライブラリ作製キットは 2種類用意があります。SENSE mRNA-Seq は高い特異性を持つビーズベースの Poly(A) RNA Selection Kit を含み、このキットは rRNA、tRNAと poly(A) 化されていない RNAの大部分を除去できます。SENSE Total RNA-Seq は、rRNAを除去した RNAまたは poly(A) 選択した RNAを用いる必要があり、RiboCop rRNA Depletion Kit の使用を推奨しています。

14

SPLIT RNA Extraction Kit は、RNA-Seq に使用する RNAを精製するためにデザインされたキットです。本キットでは、ゲノムDNAのコンタミネーション無く、迅速に高収量で RNAを精製可能です。加えて、本キットでは、RNAにダメージを与える可能性のあるDNase 処理が不要です。結果として、total RNAの回収や、small RNAと large RNAの分離が可能となっています。


アドバンテージ§ 17 ～ 10,000 nt の total RNAを精製§ オプション：large RNAと small RNAの分離が可能（150 nt 以下 Cutoff）§ 30 分の簡単なプロトコル（組織：最大 RIN 8、培養細胞：最大 RIN 10） ※ RIN：RNA integrity number

§ ゲノムDNAのコンタミネーション無し（DNase を使用せず、またDNase 処理不要）§ 高収量（＞ 100 μg）§ 少量の検体から抽出可能（細胞 1× 102 cells 以上、組織 0.5 mg 以上）

ワークフローSPLIT RNA extraction Kit は、ほ乳類や植物、昆虫、菌類、細菌など、各種生物から RNAを迅速、容易に抽出可能です。用いる検体を、RNase の不活性化や可溶性を高めるためのChaotropic Isolation Buff er でホモジナイズします。ホモジナイズ後、Phase Lock gel チューブを用いた酸性フェノールクロロホルム抽出を行い、水相（RNAを含む）を有機相・中間相（DNAやタンパク質を含む）から分離します。RNA画分は total RNAまたは large RNA、small RNAを回収するためのシリカカラムを通して精製されます。

cells ortissue homogenate

Isolation Buffer (IB)phenol pH 4.3,

Acidic Buffer (AB),chloroform

RNA in aqueous phase

column purification total RNA

1.75x

Wash Buffer (WB),Elution Buffer (EB) orStorage Buffer (SB)

isopropanol(volume)

column purification

large RNAfraction

0.33x

column purification

large RNA fraction

0.33x

column purification

small RNAfraction

1x volume isopropanolto flow-through

cells ortissue homogenate RNA in

aqueous phase

cells ortissue homogenate RNA in

aqueous phase

CELL/TISSUEHOMOGENIZATION

PHENOL EXTRACTION

5 min 15 min PURIFICATION OF RNA FRACTIONS

10/15 min

図 1｜SPLIT RNA extraction Kit のワークフロー

パフォーマンスSPLIT RNA extraction Kit により抽出された試料 RNAは、microRNAから 1万塩基以上と、RNA-Seq に適したサイズになります。抽出した RNAはゲノムDNAのコンタミネーションは無く、また、DNase 処理、不活性化のため熱処理、ゲノムDNA除去カラムなどによる RNAの分解や RNAサイズのバイアスがありません。total RNAや small RNA画分内の 17塩基までの siRNAやmicroRNA の回収効率は、small RNA マーカーを用いたスパイクイン実験で確認されました（図 3）。

図 2｜SPLIT RNA extraction Kit によるゲノムDNAコンタミネーション無しの RNA抽出法A）マウス肝臓から抽出した RNAを変性ホルムアルデヒドアガロースゲルで電気泳動した。TRIzol で抽出した RNAはゲノムDNAのコンタミネーションが見られたが、SPLIT RNA extraction Kit で抽出した RNA にはゲノムDNAはコンタミネーションが無かった。

B）各ゲノムDNA除去方法でゲノムDNA除去後、RNAのクオリティ（RIN）評価をAgilent 社 TapeStation で行った。SPLIT RNA extraction Kit で精製した RNA（DNase 処理無し）は、他のゲノムDNA除去手法に比べてRNAのクオリティ（完全性）、サイズ分布のバイアスの面で優れていた。

図 3｜microRNA、siRNA サイズのRNAは total RNA溶出画分や small RNA画分に効率よく回収される。マウスの肝臓から SPLIT RNA extraction Kit で RNA精製し、一本鎖 microRNA マーカーと二本鎖siRNAマーカーをスパイクインして、変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。比較のため、理論上の最大回収量（スパイクイン RNA）をレーン 1とレーン 5にロードした。

A) B)

15

Total RNA を抽出した場合、多量のリボソーム RNA（rRNA）が含まれます。Lexogen 社 RiboCop rRNA Depletion Kit は、分解の進んだ total RNAやインタクトな total RNAから rRNAを効率良く除去します。rRNA除去後の RNAは、シークエンス解析（次世代シークエンス解析）を含む各種 RNA解析にご使用いただけます。

RiboCop rRNA Depletion Kit

ワークフロープローブとターゲット配列のアクセス向上のため、アフィニティプローブと total RNAを混ぜて変性させます。その後、昇温により RNAとプローブをハイブリダイゼーションします。この間、ハイブリダイズした RNAを除去するために使用する除去ビーズを調製します。残った RNAを磁気ビーズを用いて精製し、終了です。精製に磁気ビーズを用いる事でプロトコルをオートメーション化し、また容易で短時間のプロトコルとなっています。

Condition Beads

Deplete rRNA

Purification

5’ 3’

rRNA5’ 3’

rRNA5’ 3’

5’ 3’

75 min 45 minDEPLETION

Magnetic Bead

Magnetic Bead

Magnetic Bead

Magnetic Bead

Magnetic Bead

Denature Total RNA

Probes 5’ 3’5’ 3’

5’ 3’

rRNA5’ 3’

rRNA5’ 3’

5’ 3’

45 min 15 min

Hybridize

5’ 3’ 5’ 3’

HYBRIDIZATION

図 1｜RiboCop rRNA Depletion Kit のワークフロー

パフォーマンスRiboCop rRNA Depletion Kit は、ヒト、マウス、ラット検体の total RNA から高効率で rRNA を除去します（表 1）。FFPE組織に由来する分解が進んだ試料RNAにもご使用いただけます（表 1）。用いた RNAからの標準的な回収率は 1～3%の範囲で、これは用いる RNAの状態に高く依存します。また、個別に精製したヒト RNA 100 ng を用いた場合、その再現性は R2 ＞ 99%と高い数値を示します。

表 1｜RiboCop rRNA Depletion Kit は高効率の rRNA除去を可能にするRiboCop で調製された RNAで、SENSE Total RNA-Seq Library Prep Kit を用いて、ライブラリ作製し、HiSeq でシークエンス解析を行った。得られたリードは rRNA リファレンスシークエンスにマッピングし、また、参考としてrRNA を除去していないライブラリに対して定量した。UHRR：universal human reference RNA, HBRR; human brain reference RNA, mt rRNA; mitochondria RNA

UHRR HBRR FFPE Mouse Rat

18S rRNA 99.29 % 98.98 % 89.36 % 99.60 % 98.76 %

28S rRNA 98.70 % 97.40 % 86.38 % 98.14 % 97.01 %

5.8S rRNA 99.55 % 99.51 % 99.34 % 99.85 % 98.73 %

5S rRNA 99.39 % 96.49 % 98.75 % 99.24 % 97.74 %

mt rRNA 99.79 % 99.50 % 96.49 % 99.12 % 99.55 %

Overall 99.05 % 98.22 % 88.51 % 98.77 % 97.97 %

* RiboCop has furthermore been successfully tested on hamster, mini pig, and zebrafi sh samples. rRNA removal will work on other mammalian species as well, but effi ciency has not been evaluated.

アドバンテージ§ ヒト、マウス、ラット検体の細胞質 rRNA（28S、18S、5.8S、5S、45S）ならびにミトコンドリア rRNA（mt16S、mt12S）を特異的に除去

§ インタクトな RNA、分解の進んだ RNAのいずれにも対応§ RNA量 1 ng ～ 1,000 ng（1 μg）に対応§ 磁気ビーズを用いた簡単な精製プロトコル§ 各種 RNA-Seq ライブラリ作製に適応（もちろん Lexogen 社 SENSE Total RNA-Seq に最適）

16

Lexogen 社の Poly(A) RNA Selection Kit は、total RNAサンプルからポリアデニル化 RNAを濃縮することで、短時間で、不要なリボソーム RNA（rRNA）を効率よく除去可能です。サンプルは RNA-Seq などの様々な RNA解析アプリケーションに使用可能です。

Poly(A) RNA Selection Kit

ワークフローTotal RNA を変性させ、mRNAに存在するポリアデニル化3' 末端を oligo(dT) ビーズにハイブリダイズさせます。poly(A) を持たない RNA（rRNA、tRNA）は oligo(dT) ビーズに結合しないため、次の洗浄ステップで除去されます。ポリアデニル化 RNAは、oligo(dT) から溶出後、cDNAライブラリ構築、RT-PCR、RNA-Seq に使用可能です。もしくは、oligo(dT) ビーズに結合したまま、その後の実験（cDNA合成など）に使用可能です。本製品は Lexogen 社の SENSE mRNA-Seq ライブラリ作製キットと組み合わせてご使用いただけます。

5’ AAAAA TTTTT

POLY(A) SELECTION 70 min 20 min

Aliquot and Wash Beads

Denature RNA

Hybridize poly(A) RNA

Total RNA

5’ 3’

5’ 3’ 5’ 3’5’ 3’

5’ 3’

5’ 3’

5’ 3’

5’ 3’

5’ AAAAA TTTTT

Poly(A) RNA Enrichment

Elute poly(A) RNA5’ 3’AAAAA

5’ 3’AAAAA

5’ AAAAA TTTTT

5’ AAAAA TTTTT

図 1｜Poly(A) RNA Selection Kit のワークフロー

パフォーマンスLexogen 社の poly(A) RNA Selection Kit は poly(A) RNAを特異的に濃縮し、結果として poly(A) tail を持たないrRNAが除去された状態になります。全リードのうちタンパク質をコードする遺伝子にマップされたリードは 97%を占めます。インプット RNA 1-3% のリカバリー率はインプットサンプルに依存します。

mitochondrial rRNA 1.5 %

cytoplasmic rRNA 0.0003 %

lincRNA 0.2 %

other 1.3 %

図 2｜Lexogen 社の poly(A) RNA Selection Kit は高効率で rRNAを除去するrRNA にマップされたリードは全リードのうちわずか 0.0003% であった（SENSE Total RNA-Seq にて解析）。また、ミトコンドリア rRNA のようなpoly(A) tail を持つ RNAが検出された。

図 3｜Lexogen 社の poly(A) RNA Selection Kit は特異的に poly(A) RNAを濃縮し、rRNAを除去する。poly(A) RNAを単離する前（A）の Bioanalyzer トレースと poly(A) RNAを単離した後（B）のトレース

アドバンテージ§ Total RNAから特異的に poly(A) を濃縮（＞ 97% protein coding RNA）§ フレキシブルな RNAインプット量（500 ng ‒ 100 μg total RNA）§ 500 μg（100x 5 μg）または 1,000 μg（10x 100 μg）まで poly(A) RNA精製可能§ オートメーション化しやすいプロトコル ‒ 磁気ビーズを利用した精製§ 短時間 ‒ 実操作時間はわずか 20分§ poly(A) RNAは溶出するか、ビーズに結合したまま実験に使用可能

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TeloPrime Full-Length cDNA Amplification Kit は、Lexogen 社独自の cap依存的リンカーライゲーション（Cap-Dependent Linker Ligation；CDLL）と長鎖逆転写技術を基にしており、cap 構造と poly(A) を持つ全長 RNAを選択可能です。完全なmRNA情報により、mRNAトランスクリプトームを正確に解析可能です。

TeloPrime Full-Length cDNA Amplifi cation Kit

ワークフローTotal RNA から oligo(dT) を用いた逆転写反応により全長cDNAの合成を行います。次に、5' C オーバーハングを有する二本鎖アダプターを、RNA/cDNAハイブリッド（二本鎖）の cap 構造のGと結合させます。二本鎖特異的なリガーゼを用いることで、cap 構造を持ち（インタクトな RNA）、第一鎖合成がmRNAの 5' 側に到達した場合のみライゲーションが起こります。その後、5' タグ（二本鎖アダプター）を有する産物のみ第二鎖が合成され、5' タグ、3' タグ特異的なPCR プライマーを用いて PCR を行うことで、全長の二本鎖cDNAが調製されます。

FULL-LENGTH cDNA GENERATION

FULL-LENGTH cDNA AMPLIFICATION

First Strand cDNA Synthesis(OligodT Priming)

Double-Strand Specific

Purification

PCR

Purification

Capped Poly(A) RNA

Linker Ligation

Linker-Specific Priming

Full-Length cDNA is amplified introducing longer linker sequences

300 min 60 min

160 min 25 min

5’5’3’3’

Double-Stranded Full-Length cDNA

(AAAAAAAA)

(AAAAAAAA)

(TTTTTTTTT)


5’5’3’(AAAAAAAA)

(TTTTTTTTT)

Ligation

Degraded RNA

(AAAAAAAA)

CLigation (cap provides ds structure)

No Ligation (absence of cap leaves a gap)

Purification

Purification

C

C

3’

5’3’

5’3’

5’

5’3’

5’3’

5’3’

図 1｜TeloPrime Full-Length cDNA Amplification Kit のワークフロー

パフォーマンスTeloPrime Full-Length cDNA Amplifi cation Kit はテンプレートスイッチ法やオリゴキャッピング法などの他の全長cDNA合成法と比較し 5' cap カバレッジに優れており、正確に転写開始点をマッピングすることが可能です（図 2）。

Template Switch

Oligo Capping

TeloPrime

Transcript Position [%]

Accum

ula

ted N

orm

aliz

ed T

SS

Cove

rage

図 2｜Lexogen 社の TeloPrime Full-Length cDNA Amplification Kit は転写開始点（TTS）の正確なマッピングを可能にするテンプレートスイッチ法、オリゴキャッピング法、TeloPrime Full-Length cDNA Amplification Kit を用いて、mRNAの 5' 末端をタグ付けした。マウスゲノムに対して転写開始点をマッピングした。転写開始点のリードカバレッジを標準化した転写産物長に対してプロットし、上位 500種の発現遺伝子の転写開始点をマッピングした。

アドバンテージ§ 5'-cap と poly(A) に対する高い特異性§ フレキシブルな RNAインプット量（1 ng ‒ 2 μg total RNA / prep）§ 最適化されたプロトコル§ 逆転写反応用プライマー、PCR プライマー（FWD、REV）はカスタムプライマー（例遺伝子特異的プライマー）に置き換えることが可能

§ 調製した cDNAは様々なアプリケーションに使用可能（NGSライブラリ作製、マイクロアレイプローブ作製、RACEクローニング等）

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SIRVs – Spike-In RNA Variant Controls

RNAシークエンス解析（RNA-Seq）は様々な研究プロジェクトにおいて、非常に効果的なトランスクリプトーム解析ツールのひとつであり、近年では、臨床診断や治療への応用が期待されています。このようなアプリケーションでは、再現性・信頼性の高い結果を得て、適切な情報提供が求められます。マーカーやコントロールの使用は、データの信頼性を正確に判断するための重要な要素です。Lexogen 社の Spike-In RNA Variants（SIRVs）は RNAシークエンス解析の質およびコンパラビリティの評価に有用です。

Samples Library Prep andSequencing

Evaluation Comparison

MetricsPrecisionAccuracy Concordance

RNA

SIRVs

C

B

A

C

B

A

Animals Plants

Fungi Others

X

X

X

X

=≠

≠

ワークフローSpike-In RNA Variant（SIRV）Control は、トランスクリプトームの複雑性を模した人工的な転写産物のセットで、試料（組織や細胞の溶解液、精製 RNA）に添加し使用します。SIRVs は最終的なシークエンスリードのうち 1-2%を占めます。SIRVsを使用することで、RNAシークエンス解析パイプラインや、サンプル調製毎の手技的ノイズを評価するための正確性や精度といった値が得られます（図 1、Evaluation）。実験間での整合性はこれらの値や変動係数（CoD）によって算出されます（図 1、Comparison）。

図 1｜RNAシークエンス解析におけるSpike-In RNA Variant（SIRV）Control の利用Spike-In RNA Variants（SIRVs）を試料に少量添加し、ライブラリ作製を行う。用いた試料のゲノムと SIRV にリードをマッピングした後、SIRV コントロールのデータを基準として、解析データを評価する。RNA-Seq ワークフローの評価により、バイアスや盲点が明らかになります。また、このコントロールのデータは、作製したライブラリが様々な解析に使用可能な精度か否かの判断基準となります。

アドバンテージ§ RNA シークエンス解析の質とコンパラビリティを評価するためのユニバーサルマーカーとして使用可能

§ RNAシークエンス解析のワークフローの評価、エラーの原因やバイアスの同定、ライブラリ作製からデータ解析までのワークフローの最適化にお勧め

§ 様々なシークエンスプラットフォームに対応§ アイソフォーム解析に対応した幅広いデザイン（アイソフォームモジュール、ERCCモジュール）§ 3 種類のセットをご用意（各種アイソフォームをミックスした SIRV-Set 1 および SIRV-Set 2、ERCCモジュールと組み合わせた SIRV-Set 3）

19

デザインモジュールのデザインRNA spike-in control はアイソフォームモジュール、ERCCモジュールが利用可能です。

アイソフォームモジュールSIRV アイソフォームモジュールは、ヒトの 7つのモデル遺伝子に由来する 69種類の転写バリアントから成り、トランスクリプトームの複雑性を模しています（図 2）。このモジュールは選択的スプライシング、選択的な転写開始 /転写終結、重複遺伝子、アンチセンス転写産物等を反映しています。6種類または 18種類の転写バリアントを用いることで十分なアイソフォームの複雑性を生み出し、厳密な RNAシークエンスワークフローを可能にします。1 また、SIRV アイソフォームは、異なるシークエンサーや解析パイプラインを用い

て作成したデータの整合性の評価にも利用されています。2SIRV アイソフォームは SIRV 転写産物が等モルで混合されているMix E0、異なるモル比率で混合されているMix E1（～8倍）、Mix E2（～ 128倍）で構成されています。

ERCCモジュールERCCモジュールは、外部 RNA標準コンソーシアム（ERCC）により開発された重複の無い 92種類の人工的な転写産物です。ユニークな配列特性から、ERCCコントロールはアイソフォームに関わりなく各種パラメーターの評価に最適です。ERCC Mix 1 は 220（106）のダイナミックレンジをカバーしており、幅広い転写産物濃度に対応しています。3、4 濃度既知のリードを比較することでダイナミックレンジ、用量反応、検出限界、ワークフローの効率を評価することが可能です。

• alternative first exon• cassette exon• exon splitting• A5SS• A3SS• MXE• alternative last exon• exon skipping• alternative end-site• overlapping antisense• antisense• overlapping

SIRV 1 SIRV 2 SIRV 3 SIRV 4 SIRV 5 SIRV 6 SIRV 7 ERCC-0002...

... ERCC-0171114.5 kb

88.5 kb

82.7 kb

82.7 kb69+92 SIRVs

SIRVome

500 bp

10 000 reads

(1)1.11 / 1.15(1)2.02 / 1.13

SIRVome

11(+4) SIRVs

A)

B)

C)

図 2｜SIRVs のデザインSIRV1 から SIRV7 はヒトモデル遺伝子を模倣しており、主要な選択的スプライシングや転写を表している。（A）7 種類の SIRV アイソフォーム遺伝子と 92種類のERCC遺伝子を人工的な染色体“SIRVome”として示す。（B）SIRV3 を拡大し、11種類の転写バリアントを緑色で示す。灰色で示した転写バリアントは他の評価法のための追加アノテーションである。（C）SIRV ミックス中の既知のアイソフォーム濃度より、得られたリードカバレッジ（緑色の領域）の情報と併せて、予想される遺伝子とエクソンジャンクションのカバレッジを比較することができる（青線はプラス鎖、赤線はマイナス鎖を示す）。

SIRV セット3 種類の SIRV セットをご用意しています。

表 1｜SIRV セットのセレクションガイドSIRV セット 1（品番：025.03）は Isoform Mixes E0、E1、E2を含みます。SIRV セット 2（品番：050.01、050.03）はMix E0 のみ含みます。SIRV セット 3（品番：051.01、051.03）はMix E0 と ERCCの混合物です。：適用あり、：適用なし

SIRV-Set 1 SIRV-Set 2 SIRV-Set 3Cat. No. 025.03 050.01 / 050.03 051.01 / 051.03

ModulesIsoform Mixes E0, E1, E2 Mix E0 Mix E0

ERCC Mix 1

Property

Isoform detection and quantifi cation

Dynamic range partially applicable

ApplicationsPipeline validation partially applicable partially applicable

Sample control

Format Storage -20 °C dried, storage at room temperature

20

References 1. Paul, L., et al. (2016) SIRVs: Spike-In RNA Variants as External Isoform Controls in RNA-Sequencing. bioRxiv. DOI:10.1101/080747

2. Weirather, J. L., et al. (2017) Comprehensive comparison of Pacific Biosciences and Oxford Nanopore Technologies and their applications to transcriptome analysis. F1000Res 6, 100. DOI: 10.12688/f1000research.10571.1

3. Baker, S. C., et al. (2005) The External RNA Controls Consortium: a progress report. Nature Methods 2, 731–734. DOI:10.1038/nmeth1005-731

4. The External RNA Controls Consortium. (2005) Proposed methods for testing and selecting the ERCC external RNA controls. BMC Genomics 6, 150. DOI:10.1186/1471-2164-6-150

5. Munro, S. A., et al. (2014) Assessing technical performance in differential gene expression experiments with external spike-in RNA control ratio mixtures. Nature Communications 5, 5125. DOI:10.1038/ncomms6125

6. SEQC/MAQC-III Consortium. (2014) A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology 32, 903–914.

DOI:10.1038/nbt.2957

SIRV セット 1SIRV セット 1はアイソフォームモジュールの混合物を 3種類含みます（E0、E1、E2）。また、各混合物は 7つの SIRV遺伝子に由来する 69種類の SIRV アイソフォーム転写産物から構成され、異なる比率で混合されています（図3）。E0は、69種類の転写産物が等モルで混合されており、これらの検出はリード深度と相関しないため、検出能の検証に最適です。E1は緩やかな濃度分布でバリアントを含みますが、E2はより自然に近いかたちを表現しているため、ドミナントなバリアントや量が豊富なバリアントが他の低い発現レベル（＜ 1%）のバリアントともに転写されます。このような自然に近い濃度分布は、短いリードアセンブリを基にした転写産物の定量にはあまり向きませんが、リード深度に制限があるロングリードシークエンス解析においては直線性や感度を評価することが可能です。

E1/0 E2/1 E2/0

log2-scale

16

41

E2/0

E2/1E1/0

Mix E0

Mix E1

Mix E2

1

1

1

1

1

2

4

1

1234

図 3｜3種類のアイソフォームミックス中の 4つのサブミックスの分布とその比率各 SIRV セットはサブミックスの混合品として提供される。7種類の SIRV 遺伝子由来のアイソフォームはすべてのサブミックスにまたがり分布している。（左）intra-mix の濃度比率は 3種類の異なる濃度で設定されており、相対的な濃度評価を正確に行うことが可能である。（右）予め調整されたサブミックスの濃度比率により、3つの inter-mix の比較を差次的遺伝子発現の評価に利用することができる。

SIRV セット 2各 SIRV アイソフォームが等モル濃度で含まれるアイソフォームモジュール E0の凍結乾燥品です。RNA-Seq においてリード深度より、転写量の異なる多様な転写産物の検出を重視する際にお勧めです。また、実験のフィンガープリントはインプット濃度ではなく単に SIRV アイソフォームの複雑性に依存するため、SIRV セット 2はデータの整合性の評価に最適です。

SIRV セット 3SIRV セット 3は、アイソフォームミックス E0および ERCCミックスを等量含みます。69種類の SIRV アイソフォーム転写産物と 92種類のオーバーラップのない ERCC RNAを含むことにより、高度な複雑性を有し、幅広い濃度レンジをカバーします。また、手技的な詳細情報を得ることにより個々の試料や実験を比較するフィンガープリントを引き出すことができ、RNAシークエンスのワークフロー全体において、より包括的な品質評価とモニタリングが可能です。各ERCCアイソフォームは210（106）の濃度幅をカバーし、さらに等モルの SIRV アイソフォームを加える事で補完しています（図 4）。

Input

10 - 5 - 3 10 10 3

10 10 3 10 5 10 7

[attomoles (a) ]

[molecules]

0

2 0

5

15 10

10 0.1

Abundance

single-isoform

isoforms

Isof

orm

s pe

r gen

e

図 4｜SIRV セット 3に含まれる転写産物の濃度および複雑性遺伝子あたり最大 18転写産物を含むアイソフォームモジュールは、これらに対する RNAを等モル濃度含む。シングル ERCCアイソフォームは 210(106）の濃度幅をカバーし（灰色）、自然に存在する転写産物のダイナミックレンジに相当する。アトモル（attomoles）はスパイクインした 100 ng total RNAの量を表す。

データ解析スパイクイン RNAシークエンス実験のデータは、リードがゲノムDNAのリファレンス配列や SIRVome にマッピングされる段階まで一様に処理されます。バイオインフォマティックツールは、リードマッピング（いわゆる生データ）から転写産物を同定、定量するまでの各段階において、検出されたリード分布と予想リード分布を比較するものです。

データ解析ワークフローとして、無料で利用可能な SIRV Suite がおすすめです。SIRV Suite はデータ解析プラットフォームGalaxy のツールやアルゴリズムを利用しており、実験間の比較を行うだけでなく、SIRV 実験のデザインや評価が可能です。ERCC リードの評価には、NIST が提供している“ERCC dashboard”5 と呼ばれるソフトウェアパッケージや SEQC/MAQC-III コンソーシアムが紹介している評価法 6 が利用可能です。

算出されたクオリティ値は、正確性や精度、測定されたカバレッジと予想カバレッジ間の変動係数（Coeffi cient of Deviation；CoD）を含みます（図 2）。データ比較において、決定的なパラメーターはバイアスの程度よりもバイアスの一貫性であり、実験間の差は一貫して蓄積された SIRVs を基に同定されます。このように、データセットが比較可能かは情報に基づき判断ができ、実験固有の変動に対してベースラインを設定することが可能です。

21

References 1. Tuerk, A., et al. (2017) Mixture models reveal multiple positional bias types in RNA-Seq data and lead to accurate transcript concentration estimates. PLOS Computational Biology 13(5): e1005515.

DOI:10.1371/journal.pcbi.1005515

Mix2 RNA-Seq データ解析ソフトウェア

Mix2（Mix-Square）データ解析ソフトウェアは RNAシークエンスデータにおいて領域ごとのカバレッジバイアスに合わせながら、遺伝子アイソフォーム量の推定値を算出します。Mix2 データ解析ソフトウェアによるアイソフォーム量の解析は、様々な条件に渡って繰り返し利用できるため、差次的遺伝子発現を正確に検出可能です。

原理アイソフォーム定量の正確性や再現性は、RNA-Seq データのフラグメントバイアスに影響を受けます。Mix2 はカバレッジバイアスについて仮定せず、データに混合モデルを適用します（図 1）。したがって、Cuffl inks では一様分布となる一方で（図1C）、Mix2 は 5' バイアスを正確に表します（図 1 A、B）。

図 1｜Mix2 の原理（A） Mix2 ‒ transcript coordinate

混合ガウスモデルを適用し2000 bp 転写産物に対する模範的な位置バイアスを表した。

（B） Mix2 ‒ genome coordinate2 つのアイソフォームを有する遺伝子の 5' バイアスを表した。

（C） Cufflinks ‒ genome coordinateB と同じ遺伝子について、Cufflinks ではバイアスにかかわらず一様に分布した。

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0 500 1000 1500 2000

transcript coordinate

mixture of Gaussiansweighted Gaussians

prob

abilit

y

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

5000 5500 6000 6500 7000 7500

long transcript pdfshort transcript pdf

0.3 x short+0.7 x long pdf

genome coordinate

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

5000 5500 6000 6500 7000 7500

long transcript pdfshort transcript pdf

0.3 x short+0.7 x long pdf

genome coordinate

CufflinksMix 2Mix 2

0

A) B) C)

パフォーマンスMix2 は様々な施設、ライブラリ作製、異なる分解レベルの RNA由来の RNA-Seq データセットにて試験されています。他のバイアス補正方法と比較し、Mix2 による遺伝子量の推定は、様々な条件において qPCR で評価された ground truth に良く相関します。Mix2 は高精度で発現変化の推定を行うため、より正確に遺伝子アイソフォームの差次的発現解析を行うことが可能です（図 2）。Mix2 は予想の断片分布のクラスタを可視化し、関連するクラスタ統計を抽出することでバイアスの調査が可能です。Mix2 ソフトウェアは Linux、Windows、Mac OS のコマンドラインツールとして利用可能です。

図 2｜qPCR により検出した遺伝子発現量変化とMix2（A）、Cufflinks（B）により推定した遺伝子発現量変化の相関。（C）差次的遺伝子発現解析の ROC（Receiver Operating Characteristic）曲線。Mix2 の真陽性率は顕著に高かった。

-4

-3

-2

-1

0

+1

+2

+3

-4 -3 -2 -1 0 +1 +2 +3

FPKM

fold

cha

nge

qPCR fold change

R2=0.78ρ=0.91

-4

-3

-2

-1

0

+1

+2

+3

-4 -3 -2 -1 0 +1 +2 +3

qPCR fold change

Cufflinks

R2=0.50ρ=0.78

true

posi

tive

rate

false positive rate

Differential expression ROC curves

A) B) C)

Cufflinks

PennSeq

RSEM

eXpress

Mix2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Mix 2

アドバンテージ§ 転写産物量を高精度で推測§ 異なる施設、ライブラリ作製、RNA分解タイプに渡って繰り返し発現量推定が可能§ 正確な差次的遺伝子発現の検出§ バイアスの種類を分類可能§ メモリフットプリントが小さく、解析時間が短い

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品名品番包装

Expression Profiling Library Prep Kits

3’ mRNA-Seq Library Prep Kits

Illumina™ compatible (including barcodes 7001-7096)

QuantSeq 3‘ mRNA-Seq Library Prep Kit (FWD), 24 preps 015.24 24

QuantSeq 3‘ mRNA-Seq Library Prep Kit (FWD), 96 preps 015.96 96

QuantSeq 3‘ mRNA-Seq Library Prep Kit (FWD), 2x96 preps 015.2x96 192

QuantSeq 3‘ mRNA-Seq Library Prep Kit (FWD) HT with i5 Dual Indexing Add-on Kit (5001-5004), 384 preps 015.384 384

QuantSeq 3‘ mRNA-Seq Library Prep Kit (REV) with Custom Sequencing Primer, 24 preps 016.24 24

QuantSeq 3‘ mRNA-Seq Library Prep Kit (REV) with Custom Sequencing Primer, 96 preps 016.96 96

QuantSeq 3‘ mRNA-Seq Library Prep Kit (REV) with Custom Sequencing Primer, 2x96 preps 016.2x96 192

Ion Torrent™ compatible (including barcodes 01-48)

QuantSeq 3’ mRNA-Seq Library Prep Kit, Barcode Set A (01-24) or B (25-48), 24 preps 012.24A/B 24

Targeted RNA-Seq Library Prep Kits


QuantSeq-Flex Targeted RNA-Seq Library Prep Kit V2 with First Strand Synthesis Module, 24 preps 033.24 24

QuantSeq-Flex Targeted RNA-Seq Library Prep Kit V2 with First Strand Synthesis Module, 96 preps 033.96 96

QuantSeq-Flex Targeted RNA-Seq Library Prep Kit V2 with Second Strand Synthesis Module, 24 preps 034.24 24

QuantSeq-Flex Targeted RNA-Seq Library Prep Kit V2 with Second Strand Synthesis Module, 96 preps 034.96 96

QuantSeq-Flex Targeted RNA-Seq Library Prep Kit V2 with First and Second Strand Synthesis Modules, 24 preps 035.24 24

QuantSeq-Flex Targeted RNA-Seq Library Prep Kit V2 with First and Second Strand Synthesis Modules, 96 preps 035.96 96

Whole Transcriptome Library Prep Kits

mRNA-Seq Library Prep Kits


SENSE mRNA-Seq Library Prep Kit V2, 8 preps 001.08 8



Ion Torrent™ compatible

SENSE mRNA-Seq Library Prep Kit, 8 preps 006.08 8

SENSE mRNA-Seq Library Prep Kit, 24 preps 006.24 24

SENSE mRNA-Seq Barcode Kit, Set A (01-12) or B (13-24), 8 rxn/Barcode 007.08A/B 8

SENSE mRNA-Seq Barcode Kit, Set A (01-12) or B (13-24), 24 rxn/Barcode 007.24A/B 24

Total RNA-Seq Library Prep Kits

Illumina™ compatible (with rRNA Depletion Kit, including barcodes 7001-7096)

SENSE Total RNA-Seq Library Prep Kit with RiboCop, 24 preps 042.24 24

SENSE Total RNA-Seq Library Prep Kit with RiboCop, 96 preps 042.96 96

Illumina™ compatible (without rRNA Depletion Kit, including barcodes 7001-7096)

SENSE Total RNA-Seq Library Prep Kit, 8 preps 009.08 8



Metabolic RNA Labeling

SLAMseq Explorer Kit - Cell Viability Titration Module, 24 preps 059.24 -

SLAMseq Explorer Kit - S4U Incorporation Module, 24 preps 060.24 -

SLAMseq Kinetics Kit - Anabolic Kinetics Module, 24 preps 061.24 -

SLAMseq Kinetics Kit - Catabolic Kinetics Module, 24 preps 062.24 -

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品名品番包装

SLAMdunk Data Analysis for SLAMseq

SLAMdunk Data Analysis for SLAMseq Integrated on Bluebee Platform, 0 - 2 GB 063.02 2 GB




Small RNA Profiling & Discovery


Small RNA-Seq Library Prep Kit for Illumina, 8 preps 052.08 8



Small RNA-Seq Library Prep Kit for Illumina including Purification Module with Magnetic Beads, 8 preps 058.08 8



NGS Controls

SIRV-Set 1 (Iso Mix E0, E1, E2), 1 vial/mix 025.03 -

SIRV-Set 2 (Iso Mix E0), 1 vial 050.01 1 vial

SIRV-Set 2 (Iso Mix E0), 3 vials 050.03 3 vials

SIRV-Set 3 (Iso Mix E0 / ERCC), 1 vial 051.01 1 vial

SIRV-Set 3 (Iso Mix E0 / ERCC), 3 vials 051.03 3 vials

RNA Extraction Kit

SPLIT RNA Extraction Kit, 48 extractions 008.48 48

RNA Enrichment and Depletion

RiboCop rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) V1.2, 24 preps 037.24 24

RiboCop rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) V1.2, 96 preps 037.96 96

Poly(A) RNA Selection Kit, 100 preps 039.100 100

Full-Length cDNA Amplification Kit

TeloPrime Full-Length cDNA Amplification Kit, 8 preps 013.08 8

TeloPrime Full-Length cDNA Amplification Kit, 24 preps 013.24 24

Add-ons and Modules

TeloPrime PCR Add-on Kit, 30 rxn 018.30 30

PCR Add-on Kit for Illumina, 96 rxn 020.96 96

PCR Add-on Kit for Ion Torrent, 96 rxn 021.96 96

Purification Module with Magnetic Beads, 200 rxn 022.96 200

Automation Module for SENSE mRNA-Seq V2 for Illumina, 96 preps 024.96 96

QuantSeq-Flex First Strand Synthesis Module for Illumina, 96 preps 026.96 96

QuantSeq-Flex Second Strand Synthesis Module V2 for Illumina, 96 preps 028.96 96

i7 Index Plate for QuantSeq/SENSE for Illumina (7001-7096), 1 rxn/Index 044.96 96

i5 Dual Indexing Add-on Kit for QuantSeq/SENSE (5001-5004), 24 rxn/Index 047.4x24 4x24

i5 Dual Indexing Add-on Kit for QuantSeq/SENSE (5001-5004), 96 rxn/Index 047.4x96 4x96

i5 Unique Dual Indexing Add-on Kit for QuantSeq/SENSE (5001-5096), 1 rxn/Index 047.96 96

Gel Extraction Module, 24 extractions 054.24 24

RS-Globin Block, Homo sapiens, 96 rxn 070.96 96

RS-Globin Block, Sus scrofa, 96 rxn 071.96 96

UMI Second Strand Synthesis Module for QuantSeq FWD (Illumina, Read 1), 96 rxn 081.96 96

NGS Data Analysis Software

Mix² RNA-Seq Data Analysis Software 023

お願い /注意事項

記載の希望販売価格は 2018年 7月 1日現在の価格で、予告なく改定される場合があります。また、「希望販売価格」「キャンペーン中の参考価格」は参考価格であり、販売店様からの実際の販売価格ではございません。ご注文の際には販売店様へご確認くださいますようお願い申し上げます。表示価格に消費税は含まれておりません。

希望販売価格

記載の商品およびサービスは全て、「研究用」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用等としては使用しないよう、十分ご注意ください。使用範囲

記載の社名・商品名等の名称は、弊社または各社の商標または登録商標です。

商品の価格・在庫・納期に関するお問い合わせ　TEL: 03-5632-9630（受付時間 9:00～ 17:30）　FAX: 03-5632-9623　　商品に関するお問い合わせ　TEL: 03-5632-9610（受付時間 9:00～ 17:30）　FAX: 03-5632-9619　　

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取扱店

本社所在地　〒135-0016　東京都江東区東陽 2-2-20 東陽駅前ビル

RNA-Seq kits selection criteriaSENSE

mRNA-SeqSENSE Total

RNA-SeqQuantSeq

3' mRNA-SeqQuantSeq-Flex

RNA-SeqSmall

RNA-Seq

RNA of interest

Poly(A) RNA

Non-poly(A) long RNA

Small RNA

Type of Analysis

Gene expression

Splice variants

3’ UTR

Whole transcriptome

Target-specific

Small RNA Profiling & Discovery

Sample qualityRIN <=8 Not applicable

RIN >=8 Not applicable

Sample type

Human

Animal

Plant ■Cell line

Blood

FFPE ■Virus * * ■Yeast ■Bacteria ■

PlatformIllumina

Ion Torrent

Kit size

8 rxn kit

24 rxn kit

96 rxn kit

2×96 rxn kit

384 rxn kit

Automation –

■ 未検証　　　*poly (A) tailを有する場合

RNA-Seq kit セレクションガイドLexogen GmbH　　　メーカー略号：LEX

RNAシークエンス解析（NGS）用ライブラリ構築キットカタログ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　価格表

Lexogen GmbH　　　メーカー略号：LEX

品名品番包装希望販売価格

Expression Profiling Library Prep kitsQuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit for Illumina (FWD) 015.24 24 prep. ¥148,000

015.96 96 prep. ご照会

015.2X96 192 prep. (2x96 preps) ご照会

QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit for Illumina (FWD) HT including i5 Dual Indexing Add-on Kit 015.384 384 prep. ご照会

QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit for Illumina (REV) with Custom Sequencing Primer

016.24 24 prep. ¥148,000

016.96 96 prep. ご照会

016.2X96 192 prep. (2x96 preps) ご照会

QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit for Ion Torrent, Barcode Set A 012.24A 24 prep. ¥148,000

QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit for Ion Torrent, Barcode Set B 012.24B 24 prep. ¥148,000

QuantSeq-Flex Targeted RNA-Seq Library Prep Kit with First Strand Synthesis Module

033.24 24 prep. ¥178,000

033.96 96 prep. ご照会

QuantSeq-Flex Targeted RNA-Seq Library Prep Kit with Second Strand Synthesis Module

034.24 24 prep. ¥178,000

034.96 96 prep. ご照会

QuantSeq-Flex Targeted RNA-Seq Library Prep Kit with First and Second Strand Synthesis Modules

035.24 24 prep. ¥201,000

035.96 96 prep. ご照会

Whole Transcriptome Library Prep kitsSENSE mRNA-Seq Library Prep Kit V2 for Illumina 001.08 8 rxn ¥108,000

001.24 24 rxn ¥285,000

001.96 96 rxn ご照会

SENSE mRNA-Seq Library Prep Kit for Ion Torrent 006.08 8 rxn ¥108,000

006.24 24 rxn ¥285,000

SENSE mRNA-Seq Barcode Kit for Ion Torrent (1-12), set A 007.08A 8 rxn (8 rxn/barcode) ¥32,000

007.24A 24 rxn (24 rxn/barcode) ¥86,000

SENSE mRNA-Seq Barcode Kit for Ion Torrent (13-24), set B 007.08B 8 rxn (8 rxn/barcode) ¥32,000

007.24B 24 rxn (24 rxn/barcode) ¥86,000

SENSE Total RNA-Seq Library Prep Kit for Illumina with RiboCop 042.24 24 prep. ¥318,000

042.96 96 prep. ご照会

SENSE Total RNA-Seq Library Prep Kit for Illumina 009.08 8 rxn ¥95,000

009.24 24 rxn ¥246,000

009.96 96 rxn ご照会

Metabolic RNA LabelingSLAMseq Explorer Kit - Cell Viability Titration Module 059.24 24 prep. ¥104,000

SLAMseq Explorer Kit - S4U Incorporation Module 060.24 24 prep. ¥134,000

SLAMseq Kinetics Kit - Anabolic Kinetics Module 061.24 24 prep. ¥118,000

SLAMseq Kinetics Kit - Catabolic Kinetics Module 062.24 24 prep. ¥131,000

SLAMdunk Data Analysis for SLAMseqSLAMdunk data analysis for SLAMseq integrated on Bluebee platform 063.02 1 assay (2 GB) ¥31,000

063.06 1 assay (6 GB) ¥57,000

063.12 1 assay (12 GB) ¥92,000

063.25 1 assay (25 GB) ¥170,000

Small RNA Profiling & DiscoverySmall RNA-Seq Library Prep Kit for Illumina 052.08 8 prep. ¥133,000

052.24 24 prep. ¥290,000

052.96 96 prep. ご照会

Small RNA-Seq Library Prep Kit for Illumina including Purification Module with Magnetic Beads

058.08 8 prep. ¥144,000

058.24 24 prep. ¥302,000

058.96 96 prep. ご照会

お願い /注意事項

記載の希望販売価格は 2018年 7月 1日現在の価格で、予告なく改定される場合があります。また、「希望販売価格」「キャンペーン中の参考価格」は参考価格であり、販売店様からの実際の販売価格ではございません。ご注文の際には販売店様へご確認くださいますようお願い申し上げます。表示価格に消費税は含まれておりません。

希望販売価格

記載の商品およびサービスは全て、「研究用」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用等としては使用しないよう、十分ご注意ください。使用範囲

記載の社名・商品名等の名称は、弊社または各社の商標または登録商標です。

商品の価格・在庫・納期に関するお問い合わせ　TEL: 03-5632-9630（受付時間 9:00～ 17:30）　FAX: 03-5632-9623　　商品に関するお問い合わせ　TEL: 03-5632-9610（受付時間 9:00～ 17:30）　FAX: 03-5632-9619　　

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取扱店

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RNAシークエンス解析（NGS）用ライブラリ構築キットカタログ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　価格表

Lexogen GmbH　　　メーカー略号：LEX

品名品番包装希望販売価格

NGS ControlsSIRV-Set 1 (Iso Mix E0, E1, E2) 025.03 3 rxn ¥203,000

SIRV-Set 2 (Iso Mix E0) 050.01 1 vial ¥68,000

050.03 3 vial ¥135,000

SIRV-Set 3 (Iso Mix E0/ERCC) 051.01 1 vial ¥101,000

051.03 3 vial ¥203,000

RNA Extraction kitSPLIT RNA Extraction Kit 008.48 48 rxn ¥68,000

RNA Enrichment and DepletionRiboCop rRNA Depletion Kit V1.2 037.24 24 prep. ¥202,000

037.96 96 prep. ご照会

Poly(A) RNA Selection Kit 039.100 100 rxn ¥44,000

Full-Length cDNA Amplification KitTeloPrime Full-Length cDNA Amplification Kit 013.08 8 prep. ¥113,000

013.24 24 prep. ¥285,000

Add-ons and ModulesTeloPrime PCR Add-on Kit 018.30 30 rxn ¥44,000

PCR Add-on Kit for Illumina 020.96 96 rxn ¥45,000

PCR Add-on Kit for Ion Torrent 021.96 96 rxn ¥45,000

Purification Module with Magnetic Beads 022.96 200 rxn ¥45,000

Automation Module for SENSE mRNA-Seq V2 for Illumina 024.96 96 prep. ¥45,000

QuantSeq-Flex First Strand Synthesis Module 026.96 96 prep. ¥46,000

QuantSeq-Flex Second Strand Synthesis Module V2 028.96 96 prep. ¥46,000

i7 Index Plate for QuantSeq/SENSE for Illumina, 96 Indices 044.96 1 plate (96 well) ¥11,000

i5 Dual Indexing Add-on Kit for QuantSeq/SENSE for Illumina, 4 Indices 047.4X24 24 rxn (4index x 24rxn) ¥17,000

047.4X96 96 rxn (4index x 96rxn) ¥46,000

i5 Unique Dual Indexing Add-on Kit for QuantSeq/SENSE (5001-5096), 1 rxn/Index 047.96 96 rxn ¥78,000

Gel Extraction Module 054.24 24 rxn ¥11,000

RS-Globin Block, Homo sapiens 070.96 96 rxn ¥99,000

RS-Globin Block, Sus scrofa 071.96 96 rxn ¥86,000

UMI Second Strand Synthesis Module for QuantSeq FWD for Illumina 081.96 96 rxn ¥34,000

NGS Data Analysis SoftwareMix2 RNA-Seq Data Analysis Software －－ご照会

RNAシークエンス解析（NGS）用ライブラリ構築 …...Percentile of Transcript (5‘ to 3‘) 図2｜カバレッジ vs. 標準化した転写物長...

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