รรรรรรร รรรรรรรรรรรร 2557
Jan 04, 2016
รั�ชนี�กรั ก�ลลปรัะวิ ทธ์2557
Gene : ส่�วนของ DNA ที่� transcribe ไปเป�น RNA หรื�อ protein
Central DogmaDNA RNA protein
RNA synthesis (transcription) เป�นีขั้��นีตอนีแรักในีการัแสดงออกขั้องยี�นีโดยีการัแปลรัหั�สจากเบสบนีสายี DNA มาเป�นีล"าด�บเบสขั้อง RNA
2
Transcription : ถู�กควบค�มในที่�กเซลล�
ใน prokaryotes 3% ของยีนจะม transcription ในขณะที่�ยีนของ differentiated eukaryotic cells 0.01% เที่�าน#$นที่�จะถู�ก transcribed ณ เวลาใดเวลาหน&�ง
3
RNA synthesis (transcription)
Size RNA < DNA
Largest RNA mol = 50,000
nucleotides
Smallest DNA mol = 45,000,000
bp.
RNA single strand
(mRNA, tRNA, rRNA)snRNA
scRNA
snoRNA
miRNA
4
RNA synthesis ต้(องการื1. DNA template
2. ribonucleoside triphosphate
(ATP, GTP, CTP, UTP)
3. DNA dependent RNA polymerase
4. Mg2+, Mn2+ ไม�ต้(องการื primer
5
Transcription is initiated at promoter sites
on the DNA template
กรืะบวนการื transcription เรื)�มโดยี RNA
polymerase มาจ#บบนส่ายีของ DNA ที่�บรื)เวณ promoter ซ&�งเป�นต้+าแหน�งที่�มล+าด#บ nucleotide
ค�อนข(างจ+าเพาะแน�นอน เรืยีกว�า consensus หรื�อ conserved sequence
6
ท�# promoter อาจเป�นี palindrome sequence คื%อ nt สายีหันี&#ง จะเหัม%อนีก�บ nt อ�กสายีหันี&#ง แต'อยี('ในีท ศทางตรังก�นีขั้*าม
G G A T C CC C T A G G
7
DNA TTGACA TATAAT
Prokaryotic promoter site
template PRIBNOW BOXSTART OF RNA
5' -35 -10 +1
Eukaryotic promoter site
DNA GGNCAATCT GC
TATA5' -75 -25 +1
templateCAAT BOX
TATABOX(HOGNESS BOX)
8
9
RNA polymerase ใน eukaryote ไม�ส่ามารืถูจ#บบรื)เวณ promoter และเรื)�มการืส่#งเครืาะห� RNA ได(ด(วยีต้#วเอง ต้(องอาศั#ยีโปรืต้นที่�เรืยีกว�า transcription factor
มาจ#บที่� promoter ก�อน
10
Transcription factors ขั้อง RNA polymerase II ท�#ส�งเคืรัาะหั mRNA ในีคืนีแบ'งเป�นี 2 ปรัะเภท1. TF ขั้อง gene ท�#ท"าหันี*าท�#เหัม%อนีก�นีในีแต'ละ cell และท"า
หันี*าท�#ปรัะจ"าในีแต'ละ cell (housekeeping gene) gene เหัล'านี��จะถู(ก transcribed ตลอดเวิลา เรั�ยีกวิ'าconstitutive genes e.g. enzyme ในี glycolysis, Krebs cycle, ETS etc.
2. TF ขั้อง gene ท�#ท"าหันี*าท�#จ"าเพาะต'อ cells, tissues gene เหัล'านี��จะถู(ก transcribed ในี cells และ tissues บางชนี ดเฉพาะเวิลาท�#จ"าเป�นี และในีบางเวิลาขั้องการัพ�ฒนีาการัเท'านี��นี
11
- Transcription factors interact with
eukaryotic promoters : TF I , II
Sp 1- 95 Kd or 105 Kd protein from mammalian cells- required for transcription of genes whose
promoters contain GC boxes
ต�วิอยี'าง
12
CTF
- CCAAT binding transcription factor
- 60 Kd- bind to the CAAT Box
B-protein - bind to TATA boxHeat-shock transcription factor
gal 4 protein : - bind ก�บ upstream sequence ขั้อง promoter ขั้อง gene ท�# encode enzyme ในีการั
metabolize galactose13
14
นีอกจาก promoter แล*วิ DNA ขั้อง eukaryotes ช��นีส(ง ม�ส'วินีท�#ท"าหันี*าท�#คืวิบคื0ม transcription ท�#เรั�ยีกวิ'า transcription elements e.g. enhancer,silencer และ response element
enhancer : - DNA sequence ท�#เพ #ม rate ขั้อง initiation ขั้อง transcription โดยี RNA pol II
- อาจอยี('ท�# upstream, downstream หัรั%อ กลาง gene ท�#ถู(กtranscribed
15
silencer : DNA sequence ท�#ลด หัรั%อยี�บยี��ง transcription
response elements : DNA sequence ส"าหัรั�บ
จ�บก�บ transcription factor ท�#ถู(กคื0มโดยี signaling molecule เช'นี cyclic AMP response elements
16
Hormonal action of glucocorticoids
enhancerpromoter
Inactive gene
hormone-receptorcomplex
mRNA synthesis
promoter
activatedenhancer
+active gene
17
RNA polymerase
upstream sense strand (+) downstream
DNA5-ATG-TCC-GCA-CGG-CCT-33-TAC-AGG-CGT-GCC-GGA-5
antisense (template) strand (-)
transcription
RNA5 -AUG-UCC-GCA-CGG-CCU-3translation
Protein NH3-Met-Ser-Ala-Arg-Pro-CO2
+ -
aminoterminus
carboxylterminus
18
RNA polymerase
Prokaryotic cell ม� 1 ชนี ดEukaryotic cell ม� 3 ชนี ด
RNA polymerase Location Product
I, A nucleolus rRNA II, B nucleoplasm mRNA III, C nucleoplasm tRNA
(5S rRNA)sn RNA, sc RNA
mitochondria RNAs in mito.
REMOTE19
DNA dependent RNA polymerase
- form phosphodiester bond
ท ศทาง 5 3
- ม� 6 subunits α2 ββ σω
α2 ββ = core enzyme
σ sigma factor
20
เป�นีต�วิก"าหันีดจ0ดเรั #มต*นีส�งเคืรัาะหับนี DNA template และจะเขั้*ามารัวิมก�บ core enzyme เม%#อเรั #มต*นีการัส�งเคืรัาะหั RNA
เม%#อ ส�งเคืรัาะหั ได* RNA strand ยีาวิ 10 nucleotides ก3จะแยีกจาก core enzyme
α - binds regulatory sequencesβ - forms phosphodiester bondβ' - binds DNA templates - recognizes promoter and initiates
synthesisω - unknown
σ
21
DNA
2
first nucleotides ATP, GTP5' 2 (core enzyme)
RNA synthesis1. initiation2. elongation3. termination rho factor[]4. release 22
23
Stem-loop structure
Termination of transcription24
Rho protein
ATP +
H2O
ADP +
H2O
ppp5
RNA polymerase
Termination of transcription
25
Sequences in DNA
1. unique - nonrepetitive code ส"าหัรั�บ protein 2% ขั้อง genome
2. moderately repetitive <106 copies/haploid กรัะจายีอยี('ในี unique sequence
3. highly repetitive 5-500 bp, 1-107 copies/haploid
26
Coding region
Intervening sequence
translation
5
3
RNA transcript
DNA strand
mRNA
Spliced mRNA
Polypeptide chain
CapPoly A
H2N COOH 27
mRNA ท�#ส�งเคืรัาะหัจาก DNA เป�นี primary
transcriptเรั�ยีกวิ'า heterogeneous nuclear
RNA (hnRNA) ต'อมาจ&งม� posttranscriptional
processing ก'อนีผ่'านีออกจาก nucleus
28
PPPA
(G)
5 3poly A 200
guanosineM7 M6 M
1. nucleotide ต�วิแรักม� base เป�นี A หัรั%อ G
2 . ม� poly A (200 AMP) มาต'อทาง 3 –OH
3. ทาง 5 –P จะม� guanosine มา capped
4. ม� methylation ท�# M7G และ M6A และ methylate
ribose-2 ขั้อง A (or G) (& อาจท�# nucleotide ต�วิถู�ดไปด*วิยี)
5. ต�ดส'วินีท�#เป�นี intron ออก และเช%#อม exon เขั้*าด*วิยีก�นี (splicing)
29
Posttranscriptional processing of mRNA
30Posttranscriptional processing
Splicing ต*องอาศ�ยีโมเลก0ลขั้อง RNA ขั้นีาดเล3กท�#อยี('ในี nucleus และ cytosol
- small nuclear RNA (snRNA) และ - small cytoplasmic RNA (scRNA)
ซ&�ง RNA เหล�าน$ม#กจะอยี��รืวมก#บโปรืต้นเป�น - small nuclear ribonucleoprotein particles
(snRNPs, snurps) และ - small cytoplasmic ribonucleoprotein
particles (scRNPs, scurps)
31
snRNP (size) Role
U1 (165nt) binds the 5 splice site and then the 3 splicesite
U2 (185nt) binds the branch site and forms part of the catalytic center
U5 (116nt) binds the 3 splice siteU4 (145nt) masks the catalytic activity of U6U6 (106nt) catalyzes splicing
complex U1, U2 + mRNA precursor + U4-U5-U6 complex
spliceosome (60S complexes)
32
ApG***
*** ApG
*** ApG
pGpUp pGpUpRpApYp ApG
pGpUpRpApYp ApG
pG
pU
p
pGpUpRpApYp
pG
pU
p
OH 2′
OH 3′
OH
3′ApG
5
5
5 3
3
3
5′splice site
3′splice site
exon1 intron exon2
Pre-mRNA
1
2
Intron
exon1 exon2
exon2exon1
(2,5)
(2,5)
spliced junction
+
+
+excised intron in lariat form
spliced exons
U1 U5U2
U4/6
AG GU AG
Complex U1 ,U2 + mRNA precursor + U4 –U6-U5 complex
Spliceosome (60s complex)33
Splice sites in mRNA precursor are specified by sequences atthe end of introns.
5 AGGUAAGU A CAGG 3Branch site
intron
Splicing : snRNPsATP
spliceosome
SLE : systemic lupus erythematosus
results from autoimmune response in which patientsproduces Ab against snRNPs
34
1 2 543 hn RNA
Constitutive Splicing
1 2 3 4 5 AAAAAAAAll splicesites used
1 2 543
1 2 4 5 AAAAAA
Segment 3 deleted by Alternative Splicing
35
1 2 543 hn RNAa b
Poly A addition signals
1 2 3 4 AAAAAA Site a used
1 2 3 4 5 AAAAAASite b used
Alternative tailing
36
Thalassemia บางชนี ดmutation G A (19nt away from normal 3 splice site of first intron)
new 3 acceptor site (splice site)
Aberrant protein
37
Aberrant splicing
Normal
5 CCTATTGGTCTATTTTCCACCGTTAGGCTGCTG 3
Normal 3 end of intron
-thal
5 CCTATTAGTCTATTTTCCACCGTTAGGCTGCTG 3
38
e.g. apolipoprotein B mRNA editing protein
human plasma : apo B 2 isoproteinsapo B 100, apo B 48
synthesized from a single gene by mRNA editingmechanism
39
Posttranscriptional RNA editing
apo B100 in liver is translated from a full-length 14.1 kb mRNA
apo B 48 in intestine is synthesized from
an apo B mRNA containing
premature inframe
translational stop codonCAA UAA
40
14536512kd
Lipoprotein assembly LDL receptor binding
Apo B 100Translation
CAA5 3Unedited mRNA
NH4RNA editing by deamination
UAA5 3Edited mRNA
Translation
1 2152240 kd
Apo B 48
41
Posttranscriptional RNA editing
5S ได(จาก 5S rRNA precursor
5.8S, 18S, 28S ได(จาก 45S rRNA precursor
5 3
121 nucleotides
5S rRNAprecursor
18S 5.8S 28S
45S rRNAprecursor
42
rRNA in eukaryotic cell
Eukaryotic ribosome
23 S RNA 5S RNA ~34 proteins
16 S RNA
~21 proteins
28S RNA 5.8S RNA5S RNA ~50 proteins
18S RNA
~30 proteins
70S
50S
30S
80S
60S
40S43
Prokaryotic ribosome
: The discovery of catalytic RNAThomas Cech
26S rRNA precursor from Tetrahymena
self splicing5'
3exon
intron
exon5
3
GOH
5
3
spliced exon
+
OH
G
5
3
5
3
L19RNA
catalytically active
L-19 IVS – nuclease and polymerase
OH
G
G
44
Self-splicing RNA
t RNARNA ท�#ม�อณู(เล3กท�#ส0ด 4S (73-93 nucleotides) ม� 50+ ชนี ด (for 20 aâ)
ม modified base เช่�น methylation, deamination
tRNA ที่�ที่+าหน(าที่�จ#บก#บ amino acid ช่น)ดเดยีวก#นเรืยีกว�า isoaccepting tRNA
5 3ribonuclease P exonuclease
5 G C-C-A 3
CTP, CTP, ATP
5 3G
ACC
anticodon จ�บก�บ codon บนี mRNA45
46
ส่ารืที่�ยี#บยี#$ง RNA synthesis1 . รัวิมก�บ DNA template2. ยี�บยี��ง RNA polymerase
1. รัวิมก�บ DNA template
1.1 Intercalation
Actinomycin D (between 2G-C base pairs)
inhibit transcription > replication : daunomycin,
doxorubicin, mithramycin, ethidium bromide
1.2 Cross-link
Alkylating agents – nitrogen mustard,
mechoethamine etc. form cross link รัะหัวิ'าง 2
guanines (N7) ท�#อยี('คืนีละสายี47
2. ยี�บยี��ง RNA polymerase
2.1 Rifamycin, rifampicin
inhibit RNA polymerase (initiation) ขั้อง prokaryote,
inhibit only mitochondrial RNA polymerase ขั้อง eukaryote
2.2 -Amanitin
Amanita phalloides
inhibit mammalian nuclear RNA polymerase II
2.3 Streptolydigin
inhibit RNA elongation
48