RLH e NLR: conoscimento citoplasmatico del per
May 02, 2015
RLH e NLR: il riconoscimento citoplasmatico del pericolo
(Alarmins)
DAMP
DAMP: Damage Associated Molecular Patterns
Come DC, Macrofagi e mastociti “sentono” il pericolo…
RLH (RIG-I like helicases)
RIG-I retinoic acid inducible gene I
MDA5 melanoma differentiation associated gene 5
LGP2 laboratory of genetics and physiology 2
Riconoscimento di virus a RNA Produzione di IFN di tipo I
Risposta immunitaria anti-virale(apoptosi di cells infettate, resistenza antivirale,
prodiuzione RLH, attivazione NK & T cells)
DExD/H-containing RNA helicases
RIG-I: riconoscimento di ssRNA 5’pppMDA5: riconoscimento di dsRNA (poly I:C)LGP2: inibitore dei RLH, funzione fisiologica?
Caspase Recruitment domain
Come si attiva RIG-I?
CTD --> C terminal domain, corrisponde a Repressor DomainCTD --> contiene il dominio di riconoscimento dell’RNAIn presenza ATP --> cambio conformazione helicasi --> rilascio di CARD --> interazioni con RIG-I/IPS
CARD dominio responsabile della cascata di trasduz.
IPS (IFN promoter stimulator 1)
o CARDIF
TRAF3 (E3 ubiquitin ligasi)
IKK-related kinasi: TBK-1 & IKKi
Fosforilaz IRFse formaz omo/etero dim
ISRE (IFN-I stimulated response element)
NLR (NOD-Like Receptors): i NOD & l’INFLAMMOSOMA
3 DOMINI: LRR --> riconoscimento ligando
NACHT -> oligomerizzazioneCARD/PYD/… --> reclutamento
NOD1 & NOD2
Cosa riconoscono…
PEPTIDOGLICANO
- PGN: componente parete batteri GRAM+ e GRAM-
- Polimero di glicani che alternaN-acetiglucosamina (NAG) eacido N-acetilmuramico (NAM)
- I polimeri NAM-NAG sonocollegati da ponti peptidici
GRAM postive:Lysina
GRAM negative:Acido meso-diapinopimelico
Come PGN entra in ocntatto coi NODs?
Batteri intracellulari con ciclo replicativo nel citosol: LISTERIA, SHIGELLA accesibilità DIRETTA
Batteri intracellulari che restano in fagosomi:SALMONELLA, MYCOBATTERIO
Batteri estracellulari
TRASOPRTATORI per muramildipeptide:CD14, PepT1, PepT2
Riconoscimento dell’Ag --> cambio conformazionale --> oligomerizzazione via NACHT --> reclutamento di RICK (RIP2) via CARD
Ubiquitinazione di RIP2 via TRAF (2/5; 6) --> reclutamento di TAK1 --> formazione del complesso TAK1/TAB1/2/3
Il complesso TAK1/TAB1/2/3 induce sia l’attivazione di AP1 che del complesso IKK,b, che porta all’attivazione di NFkB
TAK1 e RIP2 portano anche all’attivazione di CARD9 e alla conseguente attivazione di p38
Mutazioni in NODs
NOD2 --> frame-shift, induce NOD2 senza LRR terminale (no detection di PGN): MALATTIA DI CHRON, infiammazione aberrante a lvl intestinale, probabilm dovuta a mancata risposta a lvl delle mucose con conseguente induzione di risposta anti-batterica sistemica
NOD1 --> mutazioni associate a ASMA, eczema atopico, …
L’INFLAMMOSOMA
LRR --> per riconscimento ligandoNOD/NACHT --> per multimerizzazioneCARD o PYD --> reclutamento caspasi
Ruolo dell’attivazione dell’INFLAMMOSOMA
Attivazione della CASPASI-1
Trasformazione di pro-IL-1 e pro-IL-18in IL-1 e IL-18
IL-1 e IL-18
Attivazione della cascata infiammatoriaEffetto su cells immunità innata e sui tessuti
BLOCCO diffusione patogeno
IL-1 IL-1 media numerose funzioni:a) Attivazione cells endotelialib) Produzione IL-6c) Shock endotossico indotto da LPSd) Attivazione linfociti
Proprio per i sui effetti pleiotropici la produzione di IL-1 deve finemente regolata
La produzione deregolata o eccessiva di IL-1 può causare danno tissutale (tossicità a lvl isole pancreas e neuroni) e
patologie infiammatorie
Doppia regolazione per la secrezione di IL-1 attiva:1) Via PAMP e TLR viene indotta la sintesi del trascritto della
pro-IL-12) Un secondo segnale -INFLAMMOSOMA- induce il taglio
proteolitico della pro-IL-1 a IL-1
IL18: ruolo fondamentale nell’attivazione delle cellule NK
In vitro exps:
NK cells
BM-DCs
wt/KO spleen
DC-NK cell coculture
ELISA for
IFN-γ
wt/KO bone marrow
YLPS
recombinant cytokinesneutralizing Abs
O.N.
GM-CSF
ifnb-/-, il18-/-, il2-/-,tlr4-/-
B6 or WT
100% GFP-DOG
100% GFP-DOG
Double transgenic B6:Ub-GFP
DOG (CD11c promoter-DTR)
10-day DT treatment
20% 80%
Mixed BM chimera
ICS for IFN-γ
CD11chi DCs
NK cells/BM
cells
-
-
20% KO80% GFP-DOG
20% KO80% GFP-DOG
100% KO
>20% KO<80% GFP-DOG
Lethally irradiated
IL18: ruolo fondamentale nell’attivazione delle cellule NK
In vivo exps:
L’inflammosoma è una PIATTAFORMA di proteine il cui assemblaggio porta all’attivazione della CASPASI in grado di tagliare le pro-IL a dare le interleukine funzionali
La base di questa piattaforma è data dai NLR (14 NALP + Ipaf + NAIP)
NA
LP
3 IN
FL
AM
MO
SO
MA
L’attivazione dell’inflammosoma porta alla attivazione della CASPASI-1 o ICE (IL-1 Converting Enzyme).
ICE è il prototipo delle CASPASI INFIAMMATORIE.
Caspasi proinfiammatorie:CASPASI 1, 4 e 5 in uomoCASPASI 1, 11 e 12 in topo
Unico substrato noto: IL-1 e IL-18 per ICE
Quando WESTERN BLOT ha permesso di distinguere pro-IL-1 (31kD) e IL-1 (17kD) da estratti frazionati di monociti umani in grado di indurre qto processo è stata isolata ICE
Caspasi-11 (topo) e 4/5 (uomo):Topi resistenti a shock settico (Caspasi-1!!!)
Attivatore a monte di caspasi 1
Caspasi-12:Selezione positiva durante evoluzione di una
forma di caspasi-12 troncata in dominio CARDTopi ko hanno migliore clearance dei batteri e
maggiori lvl di IL-1, IL-6IPOTESI: decoy caspasi che controbilancia
effetti caspasi-1
CASPASI --> Cysteine proteasi che tagliano dopo un acido aspartico
originariamente scoperte nell’attivazione del porcesso apoptotico
Tutte le caspasi esistono come zymogeni
Le caspasi “esecutive” sono le capsasi-3, -6 e -7 che sono attivate da caspasi “iniziatrici” (2, 8, 9, 10) e che inducono l’attivazione del processo APOPTOTICO.
Per essere attivate qte caspasi devono essere assemblate su una piattaforma che utilizza la porteina Apaf che ha tre domini:
1) CARD per reclutare capsasi-92) NB-ARC per oligomerizzare3) WD repeat per sentire il rilascio del citocromo C dai
mitocondri
CASPASI INFIAMMATORIE attivate da NLR.Tre gruppi principali di INFLAMMOSOMI:
Co
sa in
du
ce l’
atti
vazi
on
e d
i NA
LP
:
Antrace LeTx --> azione su NALP1 (topi ko resistenti)Forse no Pyd (--> ASC) utilizzato MA CARD-CARDINAL
PATOLOGIE ASSOCIATE A DEREGOLAZIONE NELLA PRODUZIONE DI IL-1
CRIOPIRINOPATIE:Sottofamiglia di sindrome febbrile periodica ereitaria (SFPE), caratterizzata da ricorrenti fenomeni febbrili inspiegabili e processi infiammatori molto forti. NO segni autoimmunità (auto-Ab/T autoreative)Mutazione MISSENSO in NACHT di NALP3 --> GAIN OF FUNCTION --> alti livelli di IL-1 --> Pazienti rispondono a trattam con IL-1Ra
MALATTIE AUTOINFIAMMATORIE FMF E PAPA:2 patologie dovute ad alterazione dominio PYR di NALP3.
GOTTA:Alterazione del metabolismo delle purine --> formazione di cristalli di acido urico (MSU) nelle genture --> attivazione NALP3 --> pazienti rispondono a IL1Ra
VITILIGINE:Depigmentazione della pelle per assenza porgressiva melanociti.Associazioni genetiche a locus NALP1
Mutaz attivatoria --> maggiore IL1 --> aumentata attivazione T cells --> cloni T autoreattivi