RIP-Assay Kit for microRNA - MBLruo.mbl.co.jp/catalog/images/pdf/142219rip_assay_kit...研究用試薬 TM RiboCluster RIP-Assay Kit for microRNAAAAAA AGO RISC 60S elFs A遺伝子 mR

研究用試薬

https://ruo.mbl.co.jp/

TM

RiboCluster

RIP-Assay Kit for microRNA

AAAAA

AGO

RISC

60S

elFsA遺伝子

mRNA

B遺伝子mRNA

特定の疾患や機能に関連した mRNA や miRNA な

どは RNA 結合タンパク質 (RBP) を介してクラス

ター（RiboCluster）を形成していると考えられて

います。

　本キットでは RBP に対する抗体を用いてリボ

ヌクレオタンパク質（RNP）を免疫沈降し、その

RNPからRNAを抽出する手法、すなわちRIPアッ

セイにより、RiboCluster ごとの mRNA および

miRNA を分離・濃縮することができます。これに

より各クラスターごとの mRNA と miRNA を同定

することが可能になります。

miRNA

miRNA とそのターゲットmRNAの同定に！

miRNAの成熟メカニズムの解明に！

RISC構成因子の同定と機能解析に！

新規miRNA同定及びライブラリー構築に！

Approach: 1

Approach: 2

特定のクラスターに分類されるmRNA、

miRNA群を特異的に回収

Microarray RT-PCR Sequencing

mRNA-miRNAのマッチング

同定

～RBP-mRNA-miRNAクラスターの網羅的解析ツール誕生～

mRNA及びその翻訳産物の機能解析へRIP-Chip技術はRibonomics, Inc. の特許技術 (USP# 6,635,422、USP# 7,504,210 ) です。

MBLはRibonomics, Inc.からワールドワイドな通常実施権を得てキットを開発しています。

40SRBP-Y

AAAAA

RBP-X

RBP-Z

RISC 構成因子以外でのRIP

RISC 構成因子でのRIP

実施例1

RNA intensity

2. 分離された large RNA画分をバイオアナライザーで解析しました。

Nucleotide length

1. 免疫沈降後のビーズにAGO2が結合していることをWBで確認しました。

Lane 1: Input sample (Jurkat cell lysate)

Lane 2: post-IP beads of Control IgG

Lane 3: post-IP beads of Anti-ElF2C2/AGO2 monoclonal antibody (Code No. RN003M)

75

50

37

100EIF2C2/AGO2

(kDa)

RISCの中心的役割を担うAGO2に対する抗体によるRIPアッセイ。(Approach: 1)

21 3

Light chain

Heavy chain

Control IgG EIF2C2/AGO2 Total RNA

3. 分離された large RNA画分をRT-PCRで解析しました。 4. 分離された small RNA画分を銀染色で確認しました。

Anti-AGO2Control IgG Total RNA

RIP sample

IRF2BP2

EIF5

c-Myc

40

30

20

50

21Lane 1: Control IgG

Lane 2: Anti-ElF2C2/AGO2 monoclonal antibody

small RNA画分

5. 精製した small RNAをシークエンス解析しました。

miRNA: coverage>90%, identity>90%

Similar to miRNA: coverage>80%, identity>80%

Artificial error: PCR等のクローニング過程に起因すると考えられるエラー

Sequencing error: シークエンスが起因と考えられるエラー

AGO2を含むクラスターから large RNA が濃縮分離されたことが確認できました。

AGO2を含むクラスターからsmall RNAが

濃縮分離された事が確認できました。

small RNA 画分から多くのmiRNAが同定されました。

(解析：96クローン )

c-Myc, EIF5, IRF2BP2のmRNAが同定されました。

18S rRNA

28S rRNA

(nt)

IB: Anti-ElF2C2/AGO2 monoclonal antibody (Code No. RN003M)

Similar to miRNA

Artificial error

Sequencing error

miRNA(70.8%)

実施例2

1. 免疫沈降後のビーズにRBPが結合していることをWBで確認しました。

Lane 1, 2: Input sample (K562 cell lysate)

Lane 3, 4: post-IP beads of Control IgG

Lane 5, 6: post-IP beads of Anti-IGF2BP1/IMP1 polyclonal antibody 　　　　　(Code No. RN007P)

75

50

100EIF2C2/AGO2

(kDa)

RISCの構成因子ではないIGF2BP1/IMP1＊(Approach: 2)と

RISCの構成因子であるTNRC6A/GW182 (Approach: 1)に対する抗体によるRIPアッセイ。

＊IGF2BP1/IMP1は細胞内にてmRNAの輸送や局在化、翻訳制御の役割を担うという報告があります。

21 3

IGF2BP1/IMP1

IgG Heavy chain

654

250

150

(kDa)21 3

TNRC6A/GW182

Lane 1: Input sample (K562 cell lysate)

Lane 2: post-IP beads of Control IgG

Lane 3: post-IP beads of Anti-TNRC6A/GW182 polyclonal antibody (Code No. RN033P)

2. 分離された large RNA画分をバイオアナライザーにて解析しました。

3. 分離された small RNA画分を銀染色で確認しました。

RNA intensity

Nucleotide length

IGF2BP1/IMP1Control IgG Total RNATNRC6A/GW182

4030

20

50

(nt)

21 3 54

small RNA画分

Lane 1: Control IgG

Lane 2: Anti-EIF2C2/AGO2 monoclonal antibody (Code No. RN003M)

Lane 3: Control IgG

Lane 4: Anti-IGF2BP1/IMP1 polyclonal antibody (Code No. RN007P)

Lane 5: Anti-TNRC6A/GW182 polyclonal antibody (Code No. RN033P)

4. 精製した small RNAをシークエンス解析しました。

miRNA: (coverage>90%, identity>90%)

Non-Identification: 同定できなかった配列 (新規miRNAの可能性を含む)

Artificial error: PCR等のクローニング過程に起因すると考えられるエラー

Sequencing error: シークエンスが起因と考えられるエラー

IMP1に対する抗体で IMP1関連クラスターの1成分として

AGO2も共免疫沈降されていることが確認されました。

それぞれの抗体を用いて得られたRIP サンプルから large RNA が濃縮分離されたことが確認できました。

それぞれの抗体を用いて得られたRIP サンプルから

small RNA が濃縮分離されたことが確認できました。

RISC 構成因子でない IMP1の RIP サンプルからも

多くのmiRNAが同定されました。(解析：各48クローン )

TNRC6A/GW182IGF2BP1/IMP1

IB: Anti-ElF2C2/AGO2 monoclonal antibody (Code No. RN003M)

IB: Anti-IGF2BP1/IMP1 polyclonal antibody (Code No. RN007P) IB: Anti-TNRC6A/GW182 polyclonal antibody (Code No. RN033P)

18S rRNA

28S rRNA

Non-Identification

Artificial error Sequencing error

Non-Identification

Artificial error Sequencing error

miRNA(60.4%)

miRNA (85.4%)

Dicer

ds RNAsiRNA経路miRNA経路

piRNA経路

AAAAAA

AAAAAA

siRNA は、ウイルス感染などの様々な要因で生じる長い 2 本鎖

RNA (dsRNA) が由来とされています。Dicer により、長い

dsRNA から 21-25 nt の 2 本鎖 RNA (siRNA duplex) が切り出

され、siRNA duplex のうち、guide 鎖が RISC 中の AGOに取り

込まれ、silencer として機能します。RISC に取り込まれなかっ

た passenger 鎖は分解されます。

AGO

AAAAAA

Target mRNA

TRBP

TRBP

Dicer

PIWI-interacting RNA (piRNA) は、トランスポゾンの転写産物

の 1 本鎖 RNA が由来とされています。Dicer などの RNase III

活性を持つタンパク質によるプロセシングを必要としない、

Primary processing pathway を介して生合成されます。生殖細

胞特異的な発現が認められている PIWI タンパク質にローディン

グされることにより、トランスポゾンの silencing に寄与してい

ると考えられています。

Target mRNA

miRNA は、核内でステムループ構造を保ったまま Drosha など

によって切り出され、precursor miRNA (pre-miRNA) として

細胞質へと輸送されます。pre-miRNA は、RNase III 活性を有

する Dicer により 21-25 nt の 2 本鎖 RNA へとプロセシング

された後、Argonaute タンパク質（AGO）に取り込まれます。

2 本鎖 RNA のうち passenger 鎖が分解され、guide 鎖が標的

mRNA の 3’ 非翻訳領域に結合する事により、翻訳抑制機構が

働くと考えられています。

deadenylation

リボソーム

AAAAAADrosha

DGCR8

sense transposontranscript

Piwi and/or Aub

guide鎖

Antisense piRNA

小さなRNA

RNA interference (RNAi) の発見により、

配列特異的な遺伝子発現制御機構の存在が

明らかになり、21-25 塩基程度の小さな

RNA が RNA-induced silencing complex

(RISC) に取り込まれ、mRNA の翻訳を制

御していることがわかってきました。小さ

な RNA には mRNA の翻訳調節に関わる

miRNA や siRNA、さらにはトランスポゾ

ンのサイレンシングに関与する piRNA な

どが知られています。

近年 miRNA は細胞増殖、発生・分化、ア

ポトーシスに関連していることが報告され

ています。miRNA の発現量の増減が、癌

を含む様々な疾患と関連していることか

ら、そのターゲット mRNA の同定が、疾

患メカニズムの解明に重要とされていま

す。

RISC

AGO

AGO

発売元

142219-10081030N 2010.08

Copyright 2010 Medical & Biological Laboratories, All Rights Reserved.

● RIP-Assay Kit for microRNA

RIP-Assay Kit for microRNAは、RIP-Assay により機能的

に関連するmRNA及びmiRNAを回収するために、最適化さ

れたキットです。実験デザインに合わせて、

・small RNA、large RNA を同時に回収 (2-step method)

・large RNA、small RNA を分離回収 (Separation method)

・主に small RNA を迅速に回収 (1-step method)

を選択することができます。

コードNo. 包装製品名 希望納入価格

RN1005 RIP-Assay Kit for microRNA 10 assays ¥60,000

試薬

キット構成品

免疫沈降試薬

mi-Lysis Buffer

mi-Wash Buffer

Normal Rabbit IgG

High-Salt Solution

RNA抽出試薬

mi-Solution I

mi-Solution II

mi-Solution III

mi-Solution IV

small RNA画分調製試薬

Gel Extraction Buffer

3 M NaOAc

miSPIKETM

26 mL × 1 bottle

35 mL × 2 bottles

0.33 mL × 1 vial

6 mL × 1 vial

0.26 mL × 1 vial

6 mL × 1 vial

4 mL × 1 vial

0.2 mL × 1 vial

25 mL × 1 vial

1 mL × 2 vials

100 pmoles × 1 vial

容量

RNA抽出ステップ

small RNA と largeRNAを同時回収

Separation method1-step method＊ 2-step method

large RNA と small RNA を分離回収

＊さらに＊ RNA抽出ステップではフェノール溶液を使用しないため、

　　　　　 廃液処理の手間も省けます。

主に small RNA を迅速に回収

＊他2法に比較すると large RNA の回収率は低いですが、少ないステップでアッセイが完了します。

◎学術部 基礎試薬グループ〒460-0008　名古屋市中区栄4丁目5番3号 KDX名古屋栄ビル10階TEL :（052）238-1904　FAX :（052）238-1441E-mail : [email protected]

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