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RING TEST FOR A WHOLE-SEDIMENT TOXICITY ASSAY WITH THE RING TEST FOR A WHOLE-SEDIMENT TOXICITY ASSAY WITH THE
BENTHIC MARINE DIATOM BENTHIC MARINE DIATOM Cylindrotheca closteriumCylindrotheca closterium
Instituto de Ciencias Instituto de Ciencias
Marinas de Andalucía Marinas de Andalucía
(ICMAN)(ICMAN)
Cristiano V.M. AraújoCristiano V.M. Araújo
Julián BlascoJulián Blasco
Ignacio Moreno-GarridoIgnacio Moreno-Garrido
EXERCICIO INTERLABORATORIO DUN ENSAIO DE TOXICIDADE CON EXERCICIO INTERLABORATORIO DUN ENSAIO DE TOXICIDADE CON
SEDIMENTO USANDO A DIATOMEA SEDIMENTO USANDO A DIATOMEA Cylindrotheca closteriumCylindrotheca closterium
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destino final de contaminantes: impacto urbano e industrialdestino final de contaminantes: impacto urbano e industrial
sumidero / fuente de contaminantes y nutrientessumidero / fuente de contaminantes y nutrientes
biodiversidad biodiversidad funcionamientofuncionamiento
Sedimentos estuarinosSedimentos estuarinos
elutriatos y agua intersticialelutriatos y agua intersticial
sedimentosedimento
Calidad ambiental del sedimentoCalidad ambiental del sedimento
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Representante del Representante del
microfitobentosmicrofitobentos
Relevancia elevada: productor Relevancia elevada: productor
primarioprimario
Importante en el ciclo de materia Importante en el ciclo de materia
y energía, producción de oxígeno, y energía, producción de oxígeno,
estabilización del sedimentoestabilización del sedimento
Alta sensibilidadAlta sensibilidad
Cylindrotheca closterium (diatomea)
ORGANISMO DE ENSAYOORGANISMO DE ENSAYO
Microalgas - organismos de ensayoMicroalgas - organismos de ensayo
Selenastrum Selenastrum capricornutumcapricornutum
Phaeodactylum Phaeodactylum tricornutum tricornutum
Sedimento - organismos bentónicos
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OBJETIVOS
Evaluar y optimizar el ensayo de toxicidad en sedimento usando
Cylindrotheca closterium para aplicación en programas de calidad
ambiental de sedimentos marinos y costeros.
Evaluar la viabilidad y variabilidad (intra e interlaboratorial) del
método.
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La draga es hundida en el sedimento
Sedimento superficial aislado por la tapa
Ría de HuelvaRía de Huelva
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Muestras de sedimentoMuestras de sedimento
Cepa de microalgaCepa de microalgaSoluciones: cultivo y ensayoSoluciones: cultivo y ensayo
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Cepa de microalgas Medio de cultivo
Añadir agua Milli-Q, NaCl,
NaSO4, solución stock 01 y
02, medio f/2 y silicato
Aclimatarlas a
temperatura
ambiente
Renovar el cultivo después de la
1ª (cultivo 02) y 2ª (cultivo 03)
semanas.
Cultivo 01: IncubarVerte el contenido de las pipetas
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Medio del ensayo Frascos del ensayo
Añadir agua Milli-Q, NaCl, NaSO4,
solución stock 01 y 02, solución
nutritiva y silicato
Añadir 2 g de peso seco
sedimento y 48 mL de
medio
El día siguienteEl día siguiente
Cultivo 03(crecimiento exponencial)
Centrifugar y lavar
el cultivo con el
medio de ensayo
Inóculo concentrado
Añadir las algas
Incubar - al final de 72 h, hacer
el recuento celular
Frascos del ensayo
Ensayo de toxicidad
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RESULTADOSRESULTADOS
Densidad celular final de poblaciones de Cylindrotheca closterium tras 72h de exposición a
cuatro muestras de sedimento. Los ensayos representan diferentes laboratorios.
Ds: nº de células en el control al final del ensayo
Dc: nº de células en la muestra test
Di: nº de células inicial (1x104 cels mL-1)
Den
sid
ad c
elu
lar
tras
72
h (
cel
s m
L-1)
x 10
4
Ensayos
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RESULTADOSRESULTADOS
Sample A
Assays
1 2 3 4 5 6 7
Gro
wth
inhi
bitio
n (%
)
-50
-25
0
25
50
75
100
125
Intervalo entre el 2º y Intervalo entre el 2º y
3º cuartiles3º cuartiles
Inhibición de crecimiento (%) de células de Cylindrotheca
closterium expuestas al sedimento A.
MedianaMediana
SD de los 3 valores SD de los 3 valores
centralescentrales
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RESULTADOSRESULTADOS
Sample B
Assays
1 2 3 4 5 6 7
Gro
wth
inhi
bitio
n (%
)
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
125
Intervalo entre el 2º y Intervalo entre el 2º y
3º cuartiles3º cuartiles
Inhibición de crecimiento (%) de células de Cylindrotheca
closterium expuestas al sedimento B.
MedianaMediana
SD de los 3 valores SD de los 3 valores
centralescentrales
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RESULTADOSRESULTADOS
Sample C
Assays
1 2 3 4 5 6 7
Gro
wth
inhi
bitio
n (%
)
50
60
70
80
90
100
110
Intervalo entre el 2º y Intervalo entre el 2º y
3º cuartiles3º cuartiles
Inhibición de crecimiento (%) de células de Cylindrotheca
closterium expuestas al sedimento C.
MedianaMediana
SD de los 3 valores SD de los 3 valores
centralescentrales
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RESULTADOSRESULTADOS
Replicabilidad y reproducibilidad (en %) del porcentaje de inhibición de crecimiento
obtenido para cada laboratorio y muestra.
Muestras
Ensayo Ra R’b
1 2 3 4 5 67
(CV en %)
A -c 4.28 >100 5.47 0.67 16.71 7.29 63 19
B 5.41 35.03 67.53 16.68 0.46 6.98 >100 73 31
C 20.15 0.64 27.22 5.99 0.87 0.85 3.70 17 17
a: R representa la reproducibilidad calculada con todos los datos.a: R representa la reproducibilidad calculada con todos los datos.
b: R’ representa la reproducibilidad calculada sin el datos del ensayo #3.b: R’ representa la reproducibilidad calculada sin el datos del ensayo #3.
c: No hubo crecimiento celular en ninguna de las réplicas.c: No hubo crecimiento celular en ninguna de las réplicas.
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RESULTADOSRESULTADOS
Xlab: resultado de un laboratorio.
X: mediana de los resultados de todos los laboratorios (excepto ensayo #3).
IQR(n): rango intercuartil (diferencia entre los cuartiles superiores (75%) e inferiores (25%)
normalizado (multiplicado por 0.7413 - factor sacado a partir de la distribución normal de los datos).
Z ≤ 2: satisfactorioZ ≤ 2: satisfactorio
2 < Z 2 < Z ≤≤ 3 aceptable (cuestionable) 3 aceptable (cuestionable)
Z > 3 insatisfactorioZ > 3 insatisfactorio
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CONCLUSIONESCONCLUSIONES
El ensayo propuesto ha sido valorado positivamente por todos los El ensayo propuesto ha sido valorado positivamente por todos los
laboratorios pese la falta de experiencia con el organismo usado;laboratorios pese la falta de experiencia con el organismo usado;
Alrededor del 80% de los ensayos (17 de 21) presentaron resultados Alrededor del 80% de los ensayos (17 de 21) presentaron resultados
considerados satisfactorios (Z score ≤ 2);considerados satisfactorios (Z score ≤ 2);
La practicidad y relevancia del ensayo, y la buena reproducibilidad La practicidad y relevancia del ensayo, y la buena reproducibilidad
(pequeña variabilidad) de los resultados favorece a la implementación (pequeña variabilidad) de los resultados favorece a la implementación
del ensayo con del ensayo con Cylindrotheca closterium Cylindrotheca closterium expuesta a todo el expuesta a todo el
sedimento como método estándar para evaluar la calidad del sedimento como método estándar para evaluar la calidad del
sedimento estuarino. sedimento estuarino.
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A G R A D E C I M I E N T A G R A D E C I M I E N T O SO S
PROYECTOPROYECTO
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Instituto de Ciencias Instituto de Ciencias
Marinas de Andalucía Marinas de Andalucía
(ICMAN)(ICMAN)
Cristiano V.M. AraújoCristiano V.M. Araújo
Julián BlascoJulián Blasco
Ignacio Moreno-GarridoIgnacio Moreno-Garrido
RING TEST FOR A WHOLE-SEDIMENT TOXICITY ASSAY WITH THE RING TEST FOR A WHOLE-SEDIMENT TOXICITY ASSAY WITH THE
BENTHIC MARINE DIATOM BENTHIC MARINE DIATOM Cylindrotheca closteriumCylindrotheca closterium
EXERCICIO INTERLABORATORIO DUN ENSAIO DE TOXICIDADE CON EXERCICIO INTERLABORATORIO DUN ENSAIO DE TOXICIDADE CON
SEDIMENTO USANDO A DIATOMEA SEDIMENTO USANDO A DIATOMEA Cylindrotheca closteriumCylindrotheca closterium