Research Collection Doctoral Thesis Präparative und kinetische Untersuchungen an micellartigen Cobyrinsäurederivaten Author(s): Munk, Wolfgang Publication Date: 1994 Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-000971816 Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection . For more information please consult the Terms of use . ETH Library
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Rights / License: Research Collection In Copyright - Non ...39506/eth-39506-02.pdf · Ofss. ETHfiX-3 Dissertation ETH Nr. 10524 Praparative und kinetische Untersuchungen an miceiiartigen
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Research Collection
Doctoral Thesis
Präparative und kinetische Untersuchungen an micellartigenCobyrinsäurederivaten
carboxylat) (18) führende Reaktion mit Natriumborhydrid nachgewiesen werden.
3. Assoziate des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N '-
hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) mit I.NP-EthenoadenosylS'-O-tosylat (16)
wurden mit 1H-NMR-, UV/vis- und Totallumineszenzspektroskopie nachgewiesen. Wässrige
gesättigte l.f^-EthenoadenosylS'-O-tosylat-Lösungen, welche mit festen Dicyanocorrinen
24 und 17 versetzt wurden und wässrige Lösungen derselben Dicyanocorrine, die mit 1.N6-
Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigt waren, wiesen trotz gemäss UV/vis-Spektrum
unterschiedlichen Konzentrationen an 1^-EthenoadenosylS'-O-tosylat identische
Totallumineszenzintensitäten auf.
80
CONH(CH,)t£OOK
S^—-._ CH, r-CONmCHJufiOOK
KOOC(CH,)I(f{NOC—% J^jL^StlcH
CT//
KOOCiCHJxflNOC
CONH(CH,)i,COOK
VYKOOC(CH,),^INOC COHHiCHJußOOK
VYCOOK COOK
c)
CV^Jy v-i-o—
UV/vis-Spektroskopie
'H-NMR-Spektroskopie
für c. zudem :
Totallumineszenzspektroskopie
Abbildung 35: Schematische Darstellung der Experimente zu den Wirt-Gast-
Eigenschaften von Dicyano-heptakalium-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N '-hepta-(n-
decyl-10 '-carboxylat)
81
Mit den Experimenten zum Assoziationsverhalten sollte die Fähigkeit des Cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) zur Aufnahme eines
Gastmoleküles untersucht werden.
Bei der Alkylierung der Corrine mit den Alkylierungsmitteln 15 und 16 liegt das Kobalt
nicht in der Dicyanoform (Co(lll)) sondern als Co(l) vor. Für sämtliche Assoziations¬
experimente wurden dennoch die Dicyanoverbindungen eingesetzt, weil diese
erstens in aerober Lösung stabiler sind als die entsprechenden Co(l)- und Co(ll)-
Verbindungen, die z.B. bei Alkylierung in aerober Lösung keine gemäss 1H-
NMR-Spektrum einheitlichen Produkte ergaben, sodass die entsprechenden
Assoziationsexperimente unter Inertgas hätten ausgeführt werden müssen,
zweitens die Dicyanoverbindungen 24 & 17 mit1 H-NMR-Spektroskopie untersucht
werden konnten, was z.B. für die Co(ll)-verbindungen aufgrund ihrer
paramagnetischen Eigenschaften unmöglich ist, und
drittens aufgrund der relativen Grösse der Cyanidliganden keine sterischen Effekte zu
erwarten waren.
In einem orientierenden Experiment mit dem im Vergleich zum Corrin kleinen Methyltosylat
wurde zuvor abgeklärt, ob Assoziation tatsächlich beobachtbar ist.
Dazu wurden Lösungen von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,
N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) bzw. -cobyrinat (24) gleicher
Konzentration in Deuteriumoxid mit Methyltosylat versetzt, mit Ultraschall behandelt und
nach Zentrifugation der Suspensionen das 1 H-NMR-Spektrum aufgenommen.
In der Lösung von 17 (7,1 mM) war 'H-NMR-spektroskopisch eine ungefähr doppelt so
hohe Konzentration an Methyltosylat nachweisbar als in einer gleichkonzentrierten Lösung
von 24. Dieses Ergebnis ermutigte dazu, weitere Moleküle auf ihre Assoziationseigen¬
schaften genauer zu untersuchen.
3.1 Die Assoziation mit 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22)
Lösungen von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-
(n-decyl-10'-carboxylat) (17) bzw. Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) in
Deuteriumoxid wurden (a) mit festem 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22)
versetzt, oder (b) mit einer an 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen gesättigtem
Hexanlösung überschichtet oder (c) mit einer an 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen
gesättigen Lösung von Deuteromethylenchlorid versetzt und die Proben jeweils mit
Ultraschall behandelt. Die Probenlösungen wurden anschliessend zentrifugiert und mit
UV/vis- sowie 1 H-NMR-Spektroskopie analysiert. Aus diesen Spektren wurden die
82
Konzentrationen an Corrin und Anthracen 22 durch Auswertung der Absorptionsintensitäten
im UV/vis-Spektrum bzw. der Intensitätsintegrale im 1 H-NMR-Spektrum bestimmt und
sodann die mittlere Stöchiometrie postulierter Assoziate als Verhältnis der Konzentrationen
von Gastmolekül zu Corrin abgeleitet.
Während in den Experimenten (a) und (b) in der Deuteriumoxid-Phase der Dicyano-
heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-Probe weder 1H-NMR- noch UV/vis-spektroskopisch
9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen delektiert werden konnte, fand sich bei (b) in der
Probe des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N '-hepta-(n-
decyl-10'-carboxylat) UV/vis-spektroskopisch ein Gehalt an 9,10-Di-(4-brombutyl-
oxy)-anthracen in Höhe von 2,3% der Corrinkonzentration.
In Experiment (c) führte die Ultraschallbehandlung einer Lösung von Heptakalium-dicyano-
Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) in Deu¬
teriumoxid, welche mit einer an 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen gesättigen Lösung
von Deuteromethylenchlorid überschichtet worden war, zu einer D20-Phase, dessen 'H-
NMR-Spektrum in Abbildung 36 oben wiedergegeben ist. Die Auswertung der Integrale des
9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen, das in Deuteriumoxid praktisch unlöslich ist, und
des Corrins 17 zeigte ein Verhältnis der Konzentrationen an Anthracen und Corrin von
1,05:1,00. Möglicherweise liegen Assoziate vor. Dabei lassen sich aufgrund der
Stöchiometrie monomere Komplexe eines Wirtmoleküls 17 mit einem Gastmolekül 22
vermuten, doch sind auf der Basis der vorliegenden Daten weder eine Verteilung
verschiedener Assoziate unterschiedlicher Stöchiometrien mit dem zufälligen Mittelwert 1:1
noch multiple Einheiten von 1:1 Komplexen ausschliessbar. Im 1 H-NMR-Spektrum findet
sich durch die Signallage des C3 des Corrins, welches statt bei 4,06 ppm im Beschreibungs¬
spektrum nun bei 4,23 ppm beobachtet wurde, ein Hinweis auf Assoziation. Ansonsten war
das Spektrum der Probenlösung eine Superposition der Spektren der reinen Substanzen.
Die beobachteten Löslichkeiten waren bei Reduktion der Temperatur der Lösung nicht stabil.
Nach 12 Stunden bei 5 °C fiel der Gehalt der gemäss (c) hergestellten Probenlösung an 9,
10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22) unter die 1H-NMR-spektroskopische Nach¬
weisgrenze (vgl. 1 H-NMR-Spektrum in Abbildung 36 unten). Um die Löslichkeit als
Funktion der Zeit genauer zu untersuchen, wurde analog eine Lösung von 17 mit 9,10-Di-
(4-brombutyl-oxy)-anthracen gesättigt, bei konstanten 5 °C lichtgeschützt gelagert und
regelmässig UV/vis-spektroskopiert. Der beobachtete lineare Löslichkeitsrückgang von
Anthracen 22 als Funktion der Zeit ist in Abbildung 37 dargestellt.
Aufgrund der vorliegenden Daten lässt sich über die genaue Ursache für die beobachtete
Dekomplexierung nur spekulieren. Ein wesentlicher Faktor könnte eine Abnahme des Deu¬
teromethylenchlorid-Gehaltes der Probe sein, für dessen Konstanz keine Vorkehrungen ge¬
troffen wurden und dessen Anwesenheit anscheinend essentiell für die Komplexbildung war.
83
CONH(CH,)rfOOOK
^—z CH, *-CONH<CH,),fOOK
*0OC(CH,),flNOC -% /\>L-^JCH
cw/
KOOCfCHJiJWOC
CONHICH,)„fOOK
VYKOOC(CH,)JINOC CONHICHJ^OOK
(17) (22)
Ultraschall
D20 / CD2C12
'H-NMR
5°C
12 h
'H-NMR
-3 I-jJ
Abbildung 36: 1H-NMR des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",
N"",N""',N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)/9,10-Di-(4-brombutyoxy)-anthracenin Deuteriumoxid unter Anwesenheit von Deuteromethylenchlorid, unten: Spektrum nach
12 Stunden bei 5 °C, oben: zentrifugierte Lösung direkt nach Ultraschallbehandlung
84
100-1
90-
80.
70^
60-
50-
40.
30-
20-
10^0
_
50 100 150
Zeit / Stunden
200
—I—
250
—I
300
Abbildung 37: Verhältnis der Konzentrationen von 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-
anthracen (22) zu 17 (Besetzungsgrad) in Prozent des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-
cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) vs. Zeit¬
dauer der lichtgeschützten Lagerung bei 5 °C, Lösung in Deuteriumoxid, t= 0 bei Sättigung
mit Ultraschall, Konzentrationsbestimmung von 17 aus Absorption der Probenlösung bei
579 nm, Konzentrationsbestimmung des Anthracen 22 aus der Absorption bei 265 nm des
Differenzspektrums der Probenlösung mit einem UV/vis-Spektrum von 17 gleicher
Konzentration (vgl. 6.7.3.1).
85
3.2 Die Assoziation mit 5'-0-Tosyladenosin (15)
Die Assoziationseigenschaften von 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22) mit
In Analogie zu den nachfolgend beschriebenen Experimenten, in denen Dicyanocornnlösungen
mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat gesättigt wurden, waren in den 1H-NMR-Spektrenim Fall des Dicyano-heptakalium-Co(lll) cobyrinat (24) im Konzentrationsbereich 0,27-
0,66 mM die Signale die Summe der Spektren der isolierten Substanzen, während eine 1,23
mM Lösung von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -
hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) in mit 16 gesättigtem Deuteriumoxid eine
minimale Verschiebung des C-3 Signales von 4,07 nach 4,06 ppm und eine Verschiebung
dreier Signale des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat zeigte (Methylgruppe des Tosylats in
16- 1,96 statt 1,85, Phenylnng in 16 6,82 statt 6,74 und bei 7,42 statt 7,39) (Tabelle
2).
Die Änderung chemischer Verschiebungen von Verbindungen des 1 ,N6-Ethenoadenosins durch
micellare Einlagerungen oder auch durch Lösungsmitteleffekte, ist in der Literatur seit
langem bekannt [144, 145] und wurde als Indiz für Assoziation mit anderen Molekülen
aufgefasst
Die 1 ,N6-Ethenoadenosyl-5'-0 tosylat-Molekule nähern sich aber wie die Lumineszenz¬
intensitäten belegen anscheinend nicht genügend dem Metallzentrum, damit ihre
Lumineszenzintensität gelöscht wird
Abbildung 49 zeigt die Lumineszenzintensitäten in Abhängigkeit der Corrinkonzentration
Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobynnat (24) und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-
cobamido-N,N',N",N"',N"",N""',N -hepta-(n decyl 10'-carboxylat) (17) liegen auf
exakt derselben Kurve
Die Konzentrationen der Probenlösungen bezüglich 1,N6-Ethenoadenosyl 5'-0-tosylat
(16) waren identisch, da für beide Experimentreihen dieselbe mit 1,N6-Ethenoadenosyl-
5'-0-tosylat (16) gesättigte Stammlösung verwendet wurde
Die UV/vis- und Totallumineszenzspektren zeigten für die beiden Corrine identisches
Verhalten. Allem die Signalverschiebungen in den 1H-NMR-Spektren der Probe mit
Unterschiedliche absolute Lunineszemintensitäten im Vergleich zu anderen Expenmenten, vgl z B
Abb 49, sind durch verschieden lange Messzeiten, über die die Daten aufkumuliert wurden, bedingt
105
Tabelle 3 Lumineszenzeigenschaften von mit l,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-
tosylat (16) gesättigter Corrinlösung in D20, Konzentrations¬
bestimmung mit UV/vis-, 1 H-NMR- & Lumineszenzspektroskopie
Dicyano-heptakalium-
Co(lll)-cobyrinat
CH
Heptakalium-dicyano-Co
(lll)-cobamido-N,N',N'•,N•",
N"",N ,N -hepta-(n-
decyl-10'-carboxylat)
(17)
i
CK
(24)
Exmax= 323,3 ± 0,6
( 308,9 ± 3,0 sh )
322,5 ± 0,2
Emmax= 435,9 ± 2,7
( 409 ± 2 sh )
434,0 ± 0,8
( 410 ± 2 )
[Corrin]* 9.29-10"4 1.55-10-3
[16]+ 1.39-10"3 2.33-10"3
[16]" 1.40-10"3 1.82-10"3
Assoziationsverhältnis 0,1 0,6
*: aus UV/vis-Spektrum unter Verwendung von e(24 $7Snm)= 9790, e(17)S80nm)= 9'450; +: aus
1 H-NMR-Spektrum durch Auswertung der Integrale und Kalibierung mit UV/vis-spektroskopischbestimmter Corrinkonzentration; ": aus UV/vis-Spektrum, t(16)2e5nm^ 8'100; alle Konzentra¬
tionen in M; Assoziationsverhältnis auf Basis der UV/vis-Spektren
Im 1 H-NMR-Spektrum der Proben mit Hexakalium-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',
N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) Hessen sich zahlreiche
Veränderungen gegenüber den Spektren der reinen Substanzen beobachten (Tabelle 4). Die
Signalshifts waren beim 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) am ausgeprägtesten und
variierten mit der Konzentration der Hexakalium-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,
N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-Lösung. Das Hexakalium-Co(lll)-cobamido-N,N',
N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) selbst zeigte nur veränderte
chemische Verschiebungen der Signale des C-3 und des C-19, die bei 4,03 ppm und 3,67
ppm anstatt bei 4,07 ppm und 3,66 ppm auftraten.
106
Tabelle 4: Signalshifts im 1 H-NMR-Spektrum in mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5-O-tosylat (16) gesättigten Lösungen von Hexakalium-di-
carboxylat) das Tosylat eine Tendenz zur Assoziation mit den (n-Decyl-10'-carboxylat)-
Ketten aufweist. Durch ein derart vorgelagertes Gleichgewicht, ähnlich einem Enzym-
Substrat-Komplex, sollte die effektive Konzentration an 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylatin der Nähe des Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) höher sein als in einer analogen Lösung des Co(l)-cobyrinat. Demzufolge war
für die Alkylierung des Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) mit Methyltosylat bzw. 5'-0-Tosyladenosin (15) zu Hexakalium-Coa-aquo-
silber im elektrischen Kontakt über eine Platindrahtverbindung, Referenzelektrode Kalomel
(in Kontakt zur Reaktionslösung über: 0,1 M wässriges KCl/ 0,1 M KCl in Methanol-Wasser
1:1 / 0,1 M Inertelektrolyt in Methanol-Wasser 1:1). Bei der Synthese des 1,N6-
Ethenoadenosylcobalamin (4) wird zusätzlich noch ein Element 0,1 M Inertelektrolyt in
Methanol vor dem Kontakt mit der Reaktionslösung geschaltet.
130
LumineszenzmessungenDie Fluoreszenzmessungen erfolgten nach der front face Methode ([146]) Hochauflösendes
computergesteuertes Spektrometer mit Photonenzähler Bandbreite des anregenden Lichtes
einige nm
Monochromatoren SPEX Modell 1402, Steuerung der Monochromatoren SPEX Speed
Controller, Photomultiplier Emission RCA Electronic Components C31034 A, PhotomultipherReferenz Hamamatsu R 928, Counter Emission General Radio 1192 B, Counter Referenz
Seyffer Modell 150, Lampe Osram Xenon Hochdruckkurzbogenlampe XBO, 2500 W, IR
Filter Glas, Kuvetten Hellma Quartzkuvetten suprasil, dx= 0,100 cm, Datenauswertung mit
13C NMR-Spektren 75 MHz auf Vanan XL 300 oder 100 MHz auf Bruker Spectrospin AMX
400, jeweils breitbandentkoppelt und DEPT
Chemische Verschiebungen 8 in ppm Die Spektren sind auf das Lösungsmittel referenziert Die
Verwendung interner Referenzen, TMS oder DSS, ist gesondert vermerkt
Alle NMR-Messungen ohne Temperaturangabe wurden bei Umgebungstemperatur gemessen
131
H-C-COSY, H-detected, 13C-detected Spektroskopie
gemessen auf Bruker Spectrospin 400 MHz, Spectrospin, Fällanden, Schweiz.
Photolyse
Photolyseexperimente in verdunkeltem Raum mit:
A. UV-Lampe, Universal, Camag, Muttenz, Schweiz, TL-900, mit Lichtquellen: SylvaniaF8T5/ BLB, Sylvania Electric Products Inc., Danvers, Mass., USA 01923 (366 nm) und
Heisskathodenröhre sterilAir UVC-9 (254 nm).
B. Lichtquelle und Monochromator nach Neier [122] mit Xenon-Hochdrucklampe, Osram,
08840, Siemens Zündgerät Z 5203, Transistor Netzgerät, Heinzinger Typ TNX 1600 W,
Halbwertsbreite des Strahlenbündels 20 nm. Messung der Intensität mit Sciencetech 365,
power & energy meter, Sciencetech Detector, Catalogue No. 360001, Sciencetech, Boulder
Colorado.
Schmelzpunkt
Schmelzpunktapparatur Büchi, Flawil, nach Tottoli, mit offenem Probenrohr.
Thermostatisierung
Das UV/vis-Spektrometer Uvikon 860 wurde während der Messungen zur Alkylierungskinetikund das Wasserbad des Ultraschallgerätes während der Assozationsexperimente mit einem
Thermostaten Haake F3S auf ± 0,2 °C themostatisiert, wobei die thermostatisierte Flüssigkeit
(Wasser) die Küvettenhalterung des UV/vis-Gerätes bzw. eine Kühlspirale, welche in das zu
thermostatisierende Ultraschallbad eingetaucht war, durchströmte.
Trockenschrank
Memmert-Trockenschrank mit natürlicher Durchlüftung, 120 °C Innentemperatur, Memmert
H20, 5-faches Volumen MeOH, 5-faches Volumen H20. Wurde das Harz bereits verwendet
reinigte man es vorher bis zur vollständigen Entfärbung mit MeOH/2N NaOH (1:1).
3. Bei den alkylierten Cobyrinaten, die aus saurer Lösung auf das XAD aufgetragen wurden,
wusch man zuerst mit 10 %iger Phosphorsäure, eventuell mit wenigen ml Methanol zur
vollständigen Benetzung, eluierte mit 100 ml Methanol und abschliessend mit ca. 200 ml H20.
4. Bei den basisch aufzutragenden alkylierten Cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-
(n-decyl-10'-carboxylat)en wusch man zuerst mit 100 ml Methanol, dann 100 ml
gesättigter, wässriger KHCO3 und abschliessend mit ca. 200 ml H20.
Regeneration Dowex
Zur Regeneration des Dowex 50 WX 2 wurden 150 ml Harz in Folge mit 800 ml 2 N NaOH,
1'000 ml H20, 700 ml HCl und 1'000 ml H20 gewaschen. Nach wiederholtem Gebrauch für die
Hydrolyse mussten zudem zur vollständigen Entfärbung des Harzes Substanzreste mit 100 ml
4 N NaOH gewaschen werden.
Synthese
Alkylierungen
Ausführung sämtlicher Alkylierungen, d.h. Methylierungen, Adenosylierungen und 1,N6-
Ethenoadenosylierungen, in einer Mecaplex Glove-box unter minimaler Kunstlichtbeleutung.
Der Sauerstoffgehalt wurde während der Alkylierung kontrolliert und überstieg in keinem Fall
30 ppm, bei elektrochemischer Reduktion nicht 3 ppm.
Die Aufarbeitung wurde ebenfalls unter stark reduzierten Lichtverhältnissen durchgeführt.
134
Kontrolle des Reaktionsverlaufes
Die Reaktionsverlauf wurde soweit nicht anders vermerkt mit DC, bei den Reduktionen der
Corrine zu Co(ll)-corrinen oder Co(l)-corrinen mit UV/vis-Spekroskopie verifiziert.
Flash ChromatographieZur Flash-Chromatographie wurde das Kieselgel nass und entgast im Laufmittel aufgezogen.Säulendimensionen und Methodik entsprechend [117].
DC-Chromatographie
Angegeben sind das verwendete Laufmittelgemisch und eventuelle Reagentien zur Detektion.
Kristallisation
Zur Kristallisation der Cobalamine löste man das Rohprodukt jeweils in H20 und tropfte
solange Aceton zu, in der Regel das 4-fache Volumen, bis sich die Lösung zu trüben begann. Bei
Kristallisation im Kühlschrank nutschte man nach den jeweils in den einzelnen Vorschriften
angegebenen Zeiten die Kristalle ab.
Analytik
Probenvorbereitung für NMR-Messungen
Man löste die zu analysierende Substanz zuerst in 0,7 ml deuteriertem Lösungsmittel, zog am
Rotationsverdampfer das Lösungsmittel ab, trocknete anschliessend am HV und löste zur
Messung erneut in 0,7 ml deuteriertem Lösungmittel. Wässrige Lösungen wurden entsprechend
lyophilisiert.
NMR-SpektroskopieDie angegebenen Zahlenwerte der J-Kopplungskonstanten sind bei Multipletten das Mittel der
Signaldifferenzen der jeweiligen Gruppe.Die Interpretation der Spektren der Cobalamine erfolgt auf der Basis der angebenen
Vergleichssubstanz indem die Differenzen der chemischen Verschiebungen möglichst minimiert
werden und die Multiplizitäten sowie Signalintensität, im Falle der 1 H-NMR-Spektroskopieauch die Signalform, mit der Zuordnung kompatibel sind.
Test auf Alkylierung eines Corrines
Die Alkylierungsansätze wurden erst nach befriedigendem Test auf quantitive Alkylierung
aufgearbeitet. Hierzu versetzte man eine mit Methanol verdünnte Probe der Reaktionslösung
(insgesamt 0,3 ml) mit ca. 0,05 ml methanolischer 1 %iger HCN-Lösung, schüttelte kurz und
heftig um und nahm umgehend das UV/vis-Spektrum auf.
Nicht alkylierte Co(ll)-Verbindungen gehen ausgenblicklich in die Dicyanoform über, deutlich
messbar an der Intensität des Maximums bei 578 nm in Falle der Cobyrinsäure und 581 nm
im Fall des Cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)es.
135
Mikroanalyse
Analysen mit jeweils ca. 0,5 bis 0,8 mg Probensubstanz. Eichsubstanz war Acetanilid.
Hydratwasser wurde in Schritten von 0,5 H20 pro Molekül berechnet bis beste Überein¬
stimmung der theoretischen mit den experimentellen Werten herrschte.
Von den jeweils doppelt gefahrenen Messreihen ist dasjenige Resultat, welches in seiner
Gesamtheit mit den theoretischen Werten besser übereinstimmt, erwähnt.
Handling
Fällungen
Die Mutterlauge wurde durch Zentrifugation vom Niederschlag abgetrennt, der Niederschlagnochmals mit Lösungsmittel aufgeschlämmt und zentrifugiert.
Rotationsverdampfer
Soweit in der Synthesevorschrift nicht explizit formuliert wurde am Wasserstrahlvakuum bei
Raumtemperatur (20 - 25 °C) das Lösungsmittel abgezogen.
Lagerung der Substanzen
Sämtliche Substanzen wurden im Dunkeln, die alkylierten Corrine unter vollständigem
Lichtausschluss, bei 5 °C gelagert. Lediglich die Dicyanocobyrinsäure und die Tosyladenosinewurden im Tiefkühler bei -20 °C aufbewahrt.
Datenauswertung
Bestimmung isobestischer Punkte
Die isobestischen Punkte wurden graphisch aus übereinander gezeichneten, auf DIN A 3-Grösse
vergrösserten Spektren bestimmt. Die Ablesegenauigkeit lag im Bereich ± 1 nm.
FehlerrechnungDie Fehlerrechung erfolgte gemäss Standardstatistikverfahren unter Verwendung der Her¬
EGW 60 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, Ethylenglykol, 1:1 (v/v)
El Electon ImpactEM Emission
Entkopp. Entkopplung
eV Elektronenvolt
EX Excitation
FAB-MS Fast Atom Bombardment Massenspektrometrie, positiv (+)
negativ (-)
Fe fraktionale Käfigeffizienz (nach Finke [36], Fc=kc/(kc+k
ges. gesättigt
Gly Glycerin
h Stunden
1H-NMR 1 H-Kernspinresonanz
HV Hochvakuum, 10"3 Torr
Hz Hertz
IR Infrarotspektroskopie
141
J Kernspinkopplungskonstanten
k Geschwindigkeitskonstante
m Multiple»m Masse
M Molarität, mol dm-3
MHz Megahertz
ml Milliliter
mw. Molmasse (molecular weight)
mol. Eilip. molare Elliptizität in grad mol nv1
MS Massenspektrogramm
3-NOBA 3-Nitrobenzylalkohol
0. oder
rf Retentionsfaktor der DünnschichtchromatographieRef. Referenz
rel. relativ
RP-18 reversed phase Kieselgel C-18
RT Raumtemperatur
s Singlett's' singloid
SDS Sodiumdodecylsulfatesh Schulter
t TriplettT TemperaturTBAP TetrabutylammoniumperchloratTEMPO 2,2,6,6-Tetramethyl-piperidinoxidTHF Tetrahydrofuran
u.a. unter anderem
undiff. undifferenziert
Upm Umdrehungen pro Minute
UV/Vis Ultraviolett-visible Photospektrometrie
vgl. vergleiche
vs. versus
z Elementarladung
142
6.2 Synthese des 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4)
CONH, 0H
H/IOC
HJIOC
1 uX
0 0- \)H
9
CONH,
CeüHggN^O^PCo
1 uX1 "
HO^I
o'V \H
4
C74HiooOi7Ni8CoP
In einer Glove-box wurden 110,7 mg (8,22-10-5 mol) Aquocobalaminchlorid (9) in 5 ml
einer 0,1 M Lösung von Tetrabutylammoniumperchlorat (TBAP) in Methanol gelöst, sodann in
einer Elektrolyseapparatur, vgl. [105], bei einem Potential von -0,6 V innert 2 Stunden
unter Braunfärbung zu Co(ll)-cobalamin und anschliessend bei -1,00 V unter Grünfärbung zu
Co(l)-cobalamin reduziert. Nach vier Stunden gab man 116,9 mg (3,58-10"4 mol, 4,4
Äquivalente) 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin, gelöst in 0,5 ml einer 0,1 M
methanolischen TBAP-Lösung, zu und entnahm nach weiteren sechs Stunden bei einem
Potential von -1,0 V (Stromverbrauch 2,3-10-4 Faraday, 2,8 Äquivalente) die Lösung der
Glove-box.
Aus der am Rotationsverdampfer auf ca. 2 ml eingeengten Reaktionslösung fiel mit 50 ml
Aceton rotes, gemäss DC mit Alkylierungsmittel verunreinigtes 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin(4) aus (insgesamt 120,3 mg), das nach nochmaliger Fällung mit 50 ml Aceton aus 5 ml H20ein DC-einheitliches Produkt ergab.Man trocknete den Niederschlag am Rotationsverdampfer, löste in möglichst wenig (ca. 10 ml)
H20 und engte dann wiederum am Rotationsverdampfer bei RT auf ca. 1 ml ein. Nach Zugabe von
Aceton bis zur beginnenden Trübung (ca. 2,5 ml) kristallisierten bei -20 °C innert zwei Ta¬
gen 99,5 mg (75%) 1 ,N6-Ethenoadenosincobalamin (4) aus.
Die am HV während vier Tagen getrockneten Kristalle gelangten zur Charakterisierung.
143
C74H1CXA7N1SCOP
mw. 1603,639
CAS-No. 54635-00-6
DC (Kieselgel C-18 (RP-18), 0,1 M Phosphatpuffer pH 7/ Methanol, 4:5)
Die Probenlösung für das 1 H-NMR-Spektrum in 10%igem CF3COOH in Methanol wurde durch
eine SepPack-Kartusche gespült, wobei das Cobalamin 4 als braunes Adsorbat haften blieb.
Nach Waschen mit zuerst 5 ml wässriger NaHC03 Lösung (unter Farbumschlag nach rot) und
20 ml H20, eluierte die base-on Form mit 5 ml Methanol. Man trocknete am Wasserstrahl. Aus
0,1 ml H20 und 3 ml Aceton kristallisierten bei -20 °C innerhalb 2 Tagen 80% (7,5 mg)dunkelrotes 1 ,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4)aus.Die am HV während drei Tagen getrockneten Kristalle wurden Spektroskopien.
2,20-1 ,50 ca. 24 H (ohne bereits zugeordnete)1,90 s, 3H 51 oder 151
1,86 s, 3H B51 oder B61
1,81 s, 3H B51 oder B61
1,79 s, 3H 51 oder 151
1,50-0 ,80 ca,.13 H (ohne bereits zugeordnete)
1,26 s, 3H CH3, 7A
1,10 s, 3H CH3,12A
0,95 s, 3H CH3
0,88 s, 3H CH3, 17B
0,70 d, 3H J = 6,3 Hz CH3, Pr 3
0,40 s, 3H CH3, 12B
0,35 d, 1 H A5'ß
0,29 s, 3H CH3,1A- 0,25 t, 1 H J = 8,9 Hz A5'a
zugeordnet analog [106, 107]
151
6.3 Orientierende Experimente zur Synthese anderer Organocob¬alamine
6.3.1 Methylcobalamin (2)
CONH, CN
HfiOC
HflOC
1 <£K1 H H0,
o'V \h
10
C63H88N14O14PC0
HflOC
HJiOC
1 <iX1 » «VI
ö'V \h
2
C63Ha,lN13014PCO
Bi2r (3) wurde aus 925,5 mg (6,83-10-4 mol) Vitamin Bi2 (10) durch katalytischeReduktion hergestellt [148] und mit 20 ml Aceton aus 3 ml Methanol quantitativ gefällt.
Die Synthese des Methylcobalamin (2) erfolgte via Umsetzung von elektrochemisch (2,16-10"3 Faraday, 3,16 Äquivalente) erzeugtem Co(l)-cobalamin mit Methyltosylat analog der
Synthese des Ethylcobalamins (5). Es wurden 367 mg (45%) kristallines Methylcobalaminerhalten.
Das UV/vis-Spektrum der Kristalle stimmt mit den Literaturwerten überein.
CraHcjiNisOMPCo
mw. 1344,413
CAS-No. 13422-55-4
152
1 H-NMR (D20. c-1.06-10'2 M, 300,13 MHz)
7,18 s, 1H B-7
6,99 S, 1H B-2
6,30 S, 1H B-4
6,26 d, 1H J= 3,20 Hz R-1
5,94 s, 1H C-10i
unter HDO R3
4,33 q. 1H J= 2,30 Hz Pr2
4,24 t, 1H J- 3,85 Hz R2
4,06 m, 2H R4, (D-19
3,98 d, 1H J= 9,98 Hz C-3
3,89 m, 1H R5'
3,74 m, 1H J,=12,60Hz J2==3,83Hz R5"
3,55 d, 1H J=14,00 Hz Pr1"
3,35 m, 1H C-8
3,08 m, 2H C-13,,PrV
2,80-1 ,60 ingesamt 33 H
2,49 s, 3H CH3 C-51 oder 151
2,46 s, 3H CHs C-51 oder 151
2,23 s, 3H CH3 B51 oder 61
2,22 s, 3H CH3 B51 oder 61
1,78 s, 3H CH3 C-7A
1,50-0 ,80 insgesamt 16 H
1,41 s, 3H CH3 C2A/17B/12A
1,36 s, 3H CH3 C2A/17B/12A
1,33 s, 3H CH3 C2A/17B/12A
1,21 d, 3H J= 6,18 Hz CH3 Pr3
0,97 s, 3H CH3 C-12B
0,48 s, 3H CH3 C-1A
0,02 s, 3H CH3 Mfi-Co
Zugeordnet auf Basis von [118]
13C-NMR (020, c=1,21-10'2 M, 75 MHz, breitbandentkoppelt und DEPT)
6.3.2 Orientierendes Experiment zur Herstellung von Ethyl-cobalamin (5)
CONH, HJIOC
/> CH, f-CONH, J Hfi
w,.-**tr "
CONH,
1 vC
O' "o- \)o
3 5
C62H88N13O14PC0 C64H93N13O14PC0
154
Zusammen mit 350 mg (2,55-10-4 mol) B12r(krist.) (3) [148] wurden in einer Glove-box
(02< 6 ppm) 0,587 g (2,93-103 mol, 11,5 Äquivalente) Ethyltosylat in 7 ml 0,1 M UCIO4in einem 1:1 Gemisch Wasser/Methanol gelöst und in einer Apparatur gemäss [105] bei einem
Potential von -1,0 V elektrolysiert bis der Stromfluss auf weniger als 5% des Ausgangs¬wertes gefallen war (2,70-10-4 Faraday, 1,37 Äquivalente).Die Elektrolyseapparatur wurde nach UV/vis-spektroskopischer Kontrolle der Glove-box
entnommen, die nun rote Lösung abpipettiert, direkt mit 50 ml Aceton gefällt, noch zweimal
mit Aceton gewaschen und anschliessend getrocknet.
Der Niederschlag wurde in 2 ml Methanol gelöst, 20 ml Aceton zugegeben und lichtgeschütztbei 5 °C innerhalb von fünf Tagen 271,5 mg ockerfarbene Kristalle erhalten. Dieses
Kristallisat enthielt gemäss1 H-NMR-Spektrum noch 0,5 Äquivalente Ethyltosylat.
Nach einer zweiten, analog durchgeführten zwölfstündigen Kristallisation und Trocknung am
HV während 24 Stunden wurde das Produkt 5 (Ausbeute 101,1 mg, 29%) charakterisiert.
C64H93N130i4PC0
mw. 1358,440
CAS-No. 13422-56-5
UV/Vis (H20, C= 3,30-10-5 M)
266
313
447
( 17'400),
( 12'900),
( 3'820), sh
279
345
509
15'400)sh,
1V270) ,
7'920)
290
375
(14 900),
( 7'970), sh
CD (H20, c= 3,30-10-s M)
(231
288 (359 (501 (
1,89) ,256 (
3,18) ,sh 297 (
5,30) ,387 (
8,79) ,558 (
-9,24),
5,23),
5,61),
-3,86),
276 (328 (434 (
2,58),
-2,50),
-5,76),
X.o bei 225, 237, 269, 314, 374, 404, 459, 535
IR (2,0 mg in 300 mg KBr)
3360 (s) 3190 (s) ,2970 (m) 2940(m)
2870 (m)sh 2750 (w)sh 2550 (w)sh 2450(w)2410 (w)sh 2080 (w)sh 1660 (s) 1620 (s) sh',1565 (s) 1535 (m) ,
1490 (s) 1475 (S) sh,
1450 (m)sh 1390 (m) ,1350 (m) 1295(m)
1230 (s) 1210 (s) sh 1155 (m) 1135(m) sh',1105 (m) 1070(m) ,
1045 (m)sh 1020(m)
995 (m) 920 (w) ,900 (w) 865 (w)
845 (w) 810 (w) ,560 (m)
155
1H-NMR (D20, c= 2.1-102 M, 300,13 MHz)
7,17 S, 1H
7,03 S, 1H
6,28 S, 1H
6,24 d, 1H J= 3,1 Hz
6,07 s, 1H
4,45 m, 1H
4,35 m, 1H
4,26 t'oid,1H J= 1,8 Hz
4,14 m, 2H
4,05 d, 1H J= 8,6 Hz
3,90 m, 1H
3,75 m, 1H
3,53 d, 1H J= 14,0 Hz
3,39 m, 1H
3,19 m, 1H
3,16 m, 1H
2,80- 2,30 insgesamt ca. 22.5H
2,50 s, 3H
2,48 s, 3H
2,30- 1,60 insgesamt ca.24,5H
2,23 6H
2,21 12H
1,79 s, 3H
1,60-10,80 insgesamt <ca. 23H
1,46 s, 3H
1,39 s, 6H
1,20 d, 3H J= 6,3 Hz
1,08 s, 3H
0,90 d, br. 1H Ji= 3,9 Hz
0,62 t, 1H J= 3,9 Hz
0,52 s, 3H
-0,57 t, 3H J= 7,6 Hz
B-7*
B-2*
B-4*
R-1*
C-10*
R-3
Pr-2
R-2
R-4/C-19
C-3
R-5'
R-5"
Pr 1-
C-8
C-13
Pr-1"
C-51*
C-151*
B51/61*
C-7A*
C-12A*
C-17B/2A*
Pr-3*
C-12B*
Co-CH2 a*
Co-CH2 ß*C-1A*
CoCH2CHa*
[149 a]; Zuordnung der restlichen Signale analog [108]
1H-NMR (CD3OD, c= 5.89-10-3 M, 300,13 MHz)
7,14 S, 1H
7,13 S, 1H
6,39 s, 1H
6,18 d, 1H J- 3,2 Hz
6,12 s, 1H
4,69 m, 1H
4,36 q. 1H J= 7,5 Hz
4,30 d, 1H J= 8,9 Hz
4,22 t, 1H J = 3,8 Hz
4,16 m, 2H
3,88 dd, 1H Jt-3,0 Hz
B2/7
B2/7
B4
R1
C-10
R3
Pr2
C-19
R2
R4/C3
R5'
156
3,76 dd, 1H J= 4,4 Hz R5"
3,70 m, 2H C-8
3,59 d, 1H J=13,5Hz PrV
3,28 m, 1H (teilweise unter MeOH) C-13
3,05 m, 1H Pr1"
2,82 m, 1H C-18
2,63 m, 2H C-181
2,60-1,60 insgesamt ca. 38H
2,55 s, 3H C-51
2,53 s, 3H C-151
2,26 s, 3H B-51/61
2,25 S, 3H B-51/61
1,82 s, 3H C-7A
1,60-1,30 insgesamt ca. 19H
1,50 s, 3H C-12A
1,39 s, 3H C-2A/17B
1,30-1,00 insgesamt 8H1,38 s, 3H C-2A/17B
1,22 d, 3H J=6,3 Hz Pr3
1,10 S, 3H C-12A
0,73 t, 1H J=7,4 Hz Co-CHja0,55 S, 3H C-1A
-0,53 t, 3H J=7,6 Hz Co-CH2CJdaZuordnung der Signale analog Spektrum in D20
13C-NMR (D20, c= 4.03-10-2 M, 75 MHz, breitbandentkoppelt & dept)
Cyanocobalamin (10), 1,088 g (8,03-104 mol), wurde in 14 ml Wasser/Methanol, 1:1,
gelöst, in einer Glove-box mit 22,2 mg (9,78-105 mol) Platindioxid, 120 ul Essigsäurewährend drei Stunden zu Co(ll)-cobalamin (3) (UV/vis-spektroskopische Kontrolle)reduziert, anschliessend die Lösung durch Watte filtriert und am HV getrocknet.Man beschickte eine Elektrolyseapparatur [105] in der Glove-box mit dem in 5 ml 0,1 M
LiCI04, H20/MeOH, 1:1, gelösten Co(ll)-cobalamin (3), und führte nach Entnahme der bis auf
einen definierten Auslass gasdichten Apparatur aus der Box die Elektrolyse bei -1,0 V in einem
schwachen Ethinstrom durch.
158
Nachdem der Stromfluss auf weniger als 5 % des Ausgangswertes gefallen war (2,02-10"3Faraday, 2,51 Äquivalente e~), pipettierte man die Lösung ab, entfernte das Methanol am
Rotationsverdampfer und versetzte den mit 10 ml Wasser aufgenommenen Rückstand bis zur
beginnenden Trübung mit ca. 80 ml Aceton. Nach vier Tagen bei Raumtemperatur bildeten sich
0,914 g (84 %) dunkelrote Kristalle, die noch mit Aceton gewaschen und vor der
Charakterisierung vier Tage am HV getrocknet wurden.
Man löste unter Rühren bei Raumtemperatur 1,800 g Cobester (26) (1.65-10'3mol) in 20 ml Methylenchlorid und gab 0,7 ml Trifluoressigsäure (9,16-10"3 mol)zu. Sobald der Farbumschlag von violett nach hellrot stattgefunden hatte, d.h. nach ca.
15 Minuten, wurde am Rotationsverdampfer und Hausvakuum das Lösungsmittelabgezogen.
Der Rückstand wurde anschliessend in 30 ml Essigsäure gelöst. Die gelöste Substanz
adsorbierte beim ersten Durchströmen durch 400 ml Dowex 50 WX 2 quantitativ. Man
wusch nun das Dowexharz mit 500 ml H20, suspendierte es in weiteren 700 ml H20und hielt die entgaste und unter Argon gesetzte Suspension vier Stunden lichtgeschütztbei einer Ölbadtemperatur von 70 °C.
Nach Abkühlen der Reaktionsmischung auf Raumtemperatur wurde die Lösung vom
Harz abfiltriert, mit 500 ml H20 gewaschen und in 700 ml H20 suspendiert. Sodann
wurde das Reaktionsgemisch gründlichst entgast und wiederum unter Argon gesetzt.Nach 21 Stunden heftigem Rühren unter Lichtausschluss bei einer Ölbadtemperaturvon 70 °C war die Reaktion gemäss DC beendet.
Auf das von der erkalteten Lösung abfiltrierte Harz wurde festes KHCO3 gegeben bis
weitere Zugabe nicht mehr von Schaumbildung begleitet war. Das Cobyrinat 24 wurde
24 Vorschrift nach R. Stepanek [91] mit veränderter Aufarbeitung
164
dann mit 400 ml ges. KHC03-Lösung, 0,1 g KCN pro Liter enthaltend, praktischquantitativ eluiert25.
Dieses Eluat wurde zur Entsalzung auf 100 ml XAD aufgezogen indem man die
Suspension von XAD in dieser wässrigen Lösung solange vorsichtig mit conc. H3P04versetzte bis die Lösung völlig entfärbt war26. Das XAD wurde vor Elution der
Substanz auf einer Glasfilternutsche (Porengrösse 3) mit ca. 200 ml H2Ö nun solangegewaschen, bis das Cobyrinat begann, sich vom Trägerharz abzulösen und dann die
Cobyrinsäure mit 300 ml Methanol, 1% HCN/ Aceton, 1:1, eluiert27.
Man engte die Lösung am Rotationsverdampfer bei RT bis auf ca. 1 ml ein (hellroteLösung), versetzte mit 2,2 ml einer 5 M wässrigen KCN-Lösung und lyophilisierteden Rückstand am HV. Das derart isolierte Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat(24) wurde in 15 ml 1% HCN/Methanol gelöst und fiel im Kühlschrank (T= 0 °C, 24
Stunden) bei Zugabe von 300 ml Ether praktisch quantitativ aus. Die farblose
Mutterlauge wurde abpipettiert, das Präzipitat nochmals mit Ether gewaschen und der
pulvrige Niederschlag zuerst im Stickstoffstrom, dann während 24 Stunden am
Hochvakuum getrocknet.Es resultierten 2,050 g (99%, 1,63 mM) violettes, schwach hygroskopischesPulver, welches charakterisiert wurde.
Lagerung des so erhaltenen Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) unter
Stickstoff und bei Lichtausschluss bei einer Temperatur von 5 °C führte gemäss 1H-
NMR-Spektrum in Deuteromethanol nach einem Jahr zu keiner beobachtbaren
Veränderung der Substanz.
mw. 1257,592
C47H52Oi4N6CoK7
DC (Kieselgel 60, i-Propanol/H20/1% HCN in MeOH/Et3N, 70:40:10:1)
rf= 0,20
(RP-18, 1% HCN in MeOH/H20, 10:1)
rf= 0,44
UV/Vis (H20, c= 4.51-10-5 M, 0,16 g KCN h1)Abb. 16
Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lacton (25) ist ausgehend vom
Dicyanocobester-c-lacton (28) ebenso wie das Cobyrinat 24 durch Hydrolyse an
Dowex synthetisierbar.Dazu wurden 21,0 mg (1,9-10'5 mol) Dicyanocobester-c-lacton (21) mit 20 pl
Trifluoressigsäure und 1,5 ml Methylenchlorid versetzt, die Lösung eine halbe Stunde
gerührt, wobei mehrmals Hausvakuum angelegt wurde, und anschliessend am
Rotationsverdampfer das Lösungsmittel abgezogen. Der zurückbleibende hellrote Lack
wurde noch zwei Stunden am Hochvakuum getrocknet.Der Lack wurde in 0,25 ml Essigsäure gelöst und die Lösung mit Hausvakuum durch
20 g (cirka 25 ml) Dowex 50 WX2 gesogen wobei das Lacton 28 praktisch quantitativabsorbierte. Das Harz wurde mit 50 ml Wasser gewaschen, anschliessend in 30 ml
Wasser suspendiert, die Suspension dreimal gründlich entgast, unter Argon gesetzt und
lichtgeschützt im Ölbad während vier Stunden bei 70 °C gerührt.Die Suspension wurde sodann im Kühlschrank auf ca. 0 °C gekühlt, das Harz
abgenutscht, mit 200 ml Wasser gewaschen, wiederum in 30 ml Wasser suspendiert,gründlichst entgast und unter Argon gesetzt bevor es für weitere 24 Stunden
lichtgeschützt und unter Rühren im Ölbad bei 70 °C belassen wurde.
Die Suspension wurde vor dem Öffnen der Apparatur wiederum auf ca. 0 °C gekühlt,das Harz abgenutscht, das Produkt mit 35 ml gesättigter KHCO3, welche 0,1 g KCN /l
enthielt eluiert, in das Eluat 5 ml XAD gegeben und bis zur Entfärbung der Mutterlauge
tropfenweise konz. H3P04 zugefügt.Das XAD-Harz wurde sofort mit 400 ml Wasser gewaschen, das Produkt mit 10 ml
1,23-10"2 M KCN in Methanol (8 mg, 6,1 Äquivalente, 1,23-104 mol) unter
vollständiger Entfärbung des XAD eluiert und am Rotationsverdampfer das
Lösungsmittel abgezogen bevor eine halbe Stunde am HV getrocknet wurde.
Der nun tiefviolette Lack wurde in 1,0 ml Methanol gelöst und mit 100 ml Ether
gefällt. Im Verlauf von drei Stunden setzte sich im Kühlschrank bei 0 °C der feine
Niederschlag ab und die farblose Mutterlauge konnte abpipettiert werden.
Das während zwölf Stunden am HV getrocknete, violette Pulver (23,5 mg, 0,018 mM,
97%) wurde charakterisiert.
C47H550i4N6CoK6
169
Abbildung 64: UV/vis-Spektrum von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyr-inat-c-lacton (25) in Methanol, c= 9,24-105 M, dx= 0,100
cm
Abbildung 65: CD-Spektrum von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lacton (25) in Methanol, c= 9,24-10'5 M
170
mw. 1255,576
DC (Kieselgel 60, i-Propanol/H20/1% HCN in MeOH/Et3N, 70:40:10:1)
rf= 0,61
UV/Vis
Abb. 64
(CH3OH, c= 9,24-10-5 M)
278 ( 6'410), 307
352 ( 9-420), sh 366
512 ( 3'620), sh 543
( 5'540), Sh
(18'330),
( 5'480),
314 (418 (583 (
5'910),
1'690),
6'750)
CD
Abb. 65
(CH3OH, C= 9,24-10-5 M)
246 ( -5,30),sh 253
346 ( -9,31), 364
427 ( 9,31), 483
554 ( 0,87), 579
(
(
(
(
-8,01),
-5,74),
-1,30),
-0,22),
309 (392 (520 (600 (
-6,28),
13,40),
-0,33),
0,43),
Xo bei 238, 272, 279, 371, 456, 536, 573, 588
(1,0 mg in 300 mg KBr)
3420 (s), br 3250 (m), sh 2970(m), 2940(w), sh
2860 (m), sh 2170 (w), 2190(w), 1990(w),
1695 (w), 1660 (m), sh 1630(m), 1580(s),
1505 (s), 1470 (m), 1445(m), sh 1400(s),1370 (S), sh 1350 (m), sh 1310(w), 1295(w),1275 (w), sh 1220 (w), 1200(w), 1190(w), sh
Zu 1322 mg (1,06 10 3 mol) in 20 ml H20 gelöstem und zusammen mit 40 g XAD
vorgelegtem Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobynnat (24) tropfte man unter Ruhren
konz H3PO4 solange zu (ca 2 ml) bis die Farbe von violett nach karminrot umschlugund das Corrin unter vollständiger Entfärbung der Lösung an das XAD Harz
adsorbierte
Das XAD Harz wurde sodann mit 80 ml Phosphatpuffer, pH 3, 0,1 g KCN 11, und
anschliessend mit H2029 gewaschen bis Substanz begann auszutreten (ca 50 ml) Die
Cobyrinsäure liess sich nun mit 300 ml Methanol vollständig eluieren Man zog das
Lösungmittel zuerst am Rotationsverdampfer ab und trocknete den Rückstand eine
Stunde am HV (0,08 Torr)Die hellrote Substanz wurde mit 10 ml 10 % HCN haltigem Methanol gelöst, mit 0,16
ml Et3N (2,2 Äquivalente, 2,33 mmol) versetzt und vor der Trockung am HV (5 h,
0,05 Torr) das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt Es blieb ein
tiefvioletter Lack zurück
Man legte die Dicyanocobyrinsäure unter Stickstoff vor, kühlte mit Eis/NaCI auf ca
10 °C und fügte 30,0 ml Methylenchlond, dann 1,50 ml Tnethylamin (9,01 10 3
mol, 8,5 Äquivalente) und zuletzt 6,250 g (2,66 10 2 mol, 25,1 Äquivalente)Tnfluoressigsäure 4 nitrophenylester gelöst in 10,0 ml Methylenchlond dazu Das
Eisbad konnte sofort entfernt werden Zu der unter Ruhren gehaltenen Lösung gab man
nach ca 2 Stunden weitere 0,50 ml Tnethylamin Die Reaktion war gemäss Dunn-
schichtchromatogramm nach 22 h Stunden beendet
Zur Aufarbeitung verdünnte man die hellrote Lösung mit 100 ml Methylenchlond30und schüttelte mit 15 Portionen ä ca 200 ml einer gesättigten wässrigen NaHC03-
Lösung, die 0,1 g KCN I1 enthielt, aus31, filtrierte durch Watte und engte die
tiefvioletten Lösung am Rotationsverdampfer auf ca 30 ml ein Zugabe von 300 ml
Hexan führte zur quantitativen Fällung des Produktes 29, das noch zweimal mit 300
ml Hexan gewaschen wurde bevor das bläulich-violette Pulver nach 16-stundigerTrocknung bei 10 3 Torr zur Charakterisierung gelangte (1,923 g, 99,5 %)
28 Vorschrift analog R Stepanek [91] mit der freien Säure als Edukt
29 Die tiefviolette Dicyanoform verliert beim Waschen mit Wasser wieder einen
Cyanidliganden und beginnt kurz vor Beginn der Ablösung der Substanz vom Trägereine rote Farbe anzunehmen
30 Substituierbar durch Ether
31 Die letzte Portion der wässrigen Phase bleibt praktisch farblos
174
ch, r-coo-^yNo,'fCH,
°-C}xo,
Abbildung 66: UV/vis-Spektrum von Dicyano-Co(IM)-heptakalium-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(4-nitrophenyl)-cobyrinat (29)in Methylenchlorid, c= 3,78-10'5 M
Kristallisationversuche mit 29 wurden nach der Methodik der isothermischen
Diffusion durchgeführt [150, 151]Je 2 mg Dicyano-Co(lll)-heptakalium N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(4-nitro-phenyl)-cobynnat (29) in 0,2 ml Lösungsmittel [teils frisch destilliert und
absolutiert, teils puriss pa (vgl Tabelle 11)] wurden in einen Birnkolben gefülltund dieser mit durch Nadelstiche performiertem Parafilm verschlossen Den Kolben
stellte man in ein zweites Gefäss, welches das zweite Lösungsmittel, in dem der
Nitrophenylester 29 nur beschränkt löslich oder unlöslich ist, enthielt und
verschloss hermetisch Es wurden nur solche Lösungsmittelsysteme eingesetzt, aus
denen sich in einem Vorversuch Dicyano-Co(lll) heptakahum-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(4-nitrophenyl)-cobynnat (29) fällen hess
Die Knstallisationsansätze wurden lichtgeschutzt bei Raumtemperatur stehengelassenund zwei Monate beobachtet, bzw bei Systemen mit Mischlucke der Versuch nach der
Phasentrennung abgebrochen
Kristallisation wurde bei keinem der untersuchten Lösungsmittelsysteme beobachtet
In der Regel ölte der Nitrophenylester 29 aus, bildete aber bei Hexan/Acetonitril
einen Lack während das System Ether/Methylenchond immer zu einer Fällung führte
Tabelle 11 Losungsmittelsysteme der Kristallisationsversuche
für Dicyano-Co(lll)-heptakalium-N,N',N",N"',N"",N'"", N -hepta-(4-nitrophenyl)-cobyrinat(29)
Acetonitril*
Diffusion von
Aceton
Essigethylester X
1,4-Dioxan* X
Diethylether* X
Dusopropylether*Toluol X
Tetrachlorkohlenstoff X
Cyclohexan X
n-Hexan X
Heptan X
Petrolether X
Cyclohexen X
29 gelöst in
Aceton Nitrobenzol
X
X
X
Methylenchlondt
X
X
X
X
X
X
'frisch destilliert und absolutiert, ffnsch über Alox
Zu 1546 mg in einem getrockneten Kolben mit Serumstopfen unter Stickstoff vorge¬
legtem Dicyano-Co(lll)-heptakalium-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(4-nitro-phenyl)-cobyrinat (29) (8,41-10 mol-4) fügte man 20 ml THF, eine Lösung von
3,268 g 10-tert.Butyloxycarbonyl-n-decyl-ammonium-perchlorat33 (9,13-103mol, 10,9 Äquivalente) in 10 ml THF sowie zuletzt 2,1 ml Triethylamin (1,51-10"2mol, 17,9 Äquivalente) und hielt die Reaktionslösung unter Rühren auf Raum¬
temperatur. Das DC zeigte nach 3,5 Stunden Reaktionszeit vollständigen Umsatz an.
Zur Aufarbeitung wurde die Reaktionslösung in ca. 300 ml Ether aufgenommen, zuerst
gegen 200 ml Phosphatpuffer (2,3-10~3 mol, pH 4,0), dann mit gesättigter NaHC03mit 0,1 g KCN pro Liter solange ausgeschüttelt bis die Wasserphase nur noch schwach
gelb gefärbt war (ca. 4 I). Die Wasserphasen schüttelte man nach jeder Trennung
jeweils mit einigen ml Ether aus und vereinigte mit der organischen Phase der
Hauptfraktion.Man zog sodann den Ether am Rotationsverdampfer ab, dekantierte das zurückbleibende
Wasser, trocknete bei 0,03 Torr (25 h) und erhielt 1972,6 mg rot-violettes, gemässDC nicht einheitliches Rohprodukt.Dieses Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie mit Kieselgel 60 (Säulen¬durchmesser 8 cm, Füllhöhe 12 cm, Laufmittel Methylenchlorid / 1% HCN in MeOH)
gereinigt. Der Methanolgehalt des Laufmittel wurde im Verlauf der Trennung erhöht,
beginnend mit 25:1 für die ersten 2'500 ml, über 10:1 für die folgenden 1'000 ml,
bis auf 5:1 für die letzten VOOO ml. Man beobachtete eine Bandenstruktur bestehend,
in der Reihenfolge ihrer Elution, aus einer intensiven sowie einer schwachen Bande
mit kleinem rf-Wert. Das gewünschte Cobamid 27, 1882 mg (83,9 %), befand sich
in der ersten intensiven Bande.
Diese Fraktion gelangte nach zwölfstündiger Trocknung bei 3-10~4 Torr zur
Charakterisierung.
Ci 52^262021 N13CO
mw. 2666,791
32 Synthetisiert auf Basis der Vorschrift von Stepanek [91]33 Synthetisiert analog der Vorschrift von Stepanek [91]
180
4* 1
M
CpNHtCHjKCOflCH,),CH, r-CONHfCHJriCOJCH,!,
CHifiOflCH,),iirHOC~y y^JJ^\CH,
CONHICHjlufOflCH,)CH,
CH,)fiOfi(CH,)„flNOC
vy(CHJfOflCHJxflNOC CONHICH,)^:OftCH,),
Abbildung 70: UV/vis-Spektrum von Dicyano-Co(lll)-N,N',N",N'",N"",N ,
N - hepta - (10-tert.butyloxycarbonyl-n-decyl) - cobamid
(27) in Methylenchlorid, c= 3,31-10"5 M
8r*~
I
Abbildung 71: CD-Spektrum von Dicyano-Co(lll)-N,N',N",N-,N"",N ,
N -hepta- (10-tert.butyloxycarbonyl-n-decyl) - cobamid
bonyl-n-decyl)-cobamid durch ügandenaustausch am Kobalt zurückzuführen ist.
War die HCI-Entwicklung praktisch zum Stillstand gekommen, wurden dem Cobamid
10,0 ml Tnfluoressigsäure (0,131 mol, 196 Äquivalente bzgl. Co) zugeführt.35Vier Stunden nach Zugabe der Tnfluoressigsäure zeigte das einheitliche DC der Lösungdas Ende der Reaktion an.
Man entfernte das Lösungsmittel der Reaktionslösung am Rotationsverdampfer bei
einer Wasserbadtemperatur von 40 °C, und trocknete anschliessend zwölf Stunden am
Hochvakuum (p= 10 3 Torr)Der in ca. 10 ml Methanol aufgenommene hellrote Rückstand wurde mit KCN versetzt
bis sich das zuletzt zugegebene Cyanid nicht mehr löste.36 Die Fällung des
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"-,N"",N ,N -hepta-(n-dec-yl-10'-carboxylat) (17) aus dieser methanolischen Lösung mit 150 ml Ether erfolg
34 Synthese analog R. Stepanek [91] ohne XAD-Chromatographie.35 Die Reaktionslösung ist jetzt leuchtend rot.
36 Die entstehende Dicyanoform färbt die Lösung tief violett.
185
CpNH(CH,),tPOOKCH, f-CONmCH{l,fiOOK
Abbildung 74: UV/vis-Spektrum von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cob-amido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-car-
boxylat) (17) in Wasser, c= 3,23-10"5 M, 0,13 g KCN M
Abbildung 75: CD-Spektrum von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)(17) in Wasser, c= 3,23-10-5 M, 0,13 g KCN I"1
186
te quantitativ. Der Niederschlag setzte sich im Laufe von einigen Stunden bei Raum¬
temperatur ab. Die praktisch farblose Mutterlauge wurde abpipettiert, der Nieder¬
schlag mit 150 ml Ether gewaschen, zuerst im 40 °C Wasserbad am Rotations¬
verdampfer und Hausvakuum, dann bei 10-3 Torr während zwölf Stunden getrocknet.Man erhielt gemäss UV/vis-Spektrum 1,6984 g (99 %) violettes Pulver, das unter
Argon und Lichtausschluss bei 5 °C gelagert, nach einem Jahr 1H-NMR-spektro-skopisch keine Veränderungen aufwies.
In einer Glove-box wurden 15,1 mg (5,94 10 6 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) in
5,0 ml Methanol gelöst, mit 9,0 mg Platindioxid sowie 5 pl Essigsäure versetzt und
heftig gerührt Im Laufe der Reduktion legte man wiederholt Vakuum an und flutete
anschliessend das Reaktionsgefäss mit Wasserstoff Nach quantitativer Reaktion (120Minuten, UV/vis-spektroskopische Kontrolle) zum Hexakalium-Co(ll)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) wurde der Katalysatordurch Watte abfiltnert und am Rotationsverdampfer das Lösungsmittel abgezogen
Der in 5,0 ml Phosphatpuffer aufgenommene lackartige Ruckstand liess sich durch
Zugabe von 15 mg (4,0-10 4 mol, 66 Äquivalente) NaBH4 unter heftigem Schäumen
quantitativ (gemäss UV/vis-Spektrum) zum Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) reduzieren Der Farbumschlag von
braun nach grün erfolgte praktisch augenblicklichDie Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta (n-decyl-10'-carboxylat)-
lösung wurde auf 7,5 mg (4,03 10 5 mol, 6,8 Äquivalente) Methyltosylat pipettiert
und nach 30 Minuten der Glove-box entnommen
38 Synthese analog R Stepanek [91] mit veränderter Aufarbeitung
191
0,2
0,0
CONHtCHJufOOlV
-. CH,\OOC{CH,),JINOC
KOOC(CH,),flNOC
-CONH(CHJ,fiOOK
<I£H,
\ CHYKOOC(CH2)xPNOC CONH(CH2}ItJCOOK
« [-J m
Abbildung 77: UV/vis-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-Coß-methyl-cobamido- N, N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) (30) in Wasser, c= 4,06-10-s M
Abbildung 78: CD-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-Coß-methyl-cobamido- N, N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) (30) in Wasser, c= 4,06-105 M
192
Zur Aufarbeitung trug man die alkylierte Verbindung direkt aus der Reaktionslösungauf eine C-18-Kieselgelkartusche auf indem man zur Lösung solange krist KHCO3
zufugte bis das Corrin auf dem Harz adsorbierte und spulte mit 160 ml 0,01 M H3PO4Man wusch anschliessend mit 100 ml H20, 100 ml 0,01 H3PO4, wiederum mit 100
ml H20, benetzte das Harz mit 20 ml gesättigter KHC03-Lösung und entfernte vor der
Elution des Produktes mit 30 ml Methanol überschüssiges KHCO3 mit 30 ml Wasser
Nach Abziehen des organischen Lösungsmittels am Rotationsverdampfer wurde
lyophilisiert und das bräunlich-gelbe Pulver (13,9 mg, 95%) charakterisiert
Ci 23H2o202i N11C0K6
mw 2464,565
UV/Vis (H20, c= 4,06 10-eM)Abb. 77
264 (22'920), 303 (2V440), 353 ( 10-665), sh
372 ( 9'310), sh 458 ( 9'680), 495 ( 8'030),sh
(CH3OH, 190-900 nm, qualitative Messung, angegeben ist die gemessene
In einer glove-box (20 ppm 02) wurden 38,6 mg Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) (3,02-10"5 mol) in 4,0 ml Methanol gelöst und mit 10 pl (1,75-10"4mol, 5,6 Äquivalent) Essigsäure, 15,6 ml Pt02 und Wasserstoff analog 17 zum
Co(ll)-cobyrinat reduziert. Nach 70 min heftigem Rühren lag gemäss UV/vis-
spektroskopischer Kontrolle quantitativ Co(ll)-cobyrinat vor. Man filtrierte den
Katalysator mit einer mit Glaswatte gefüllten Pipette und zog das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer mit HV ab.
Zur Alkylierung wurde das erhaltene Co(ll)-hexakalium-cobyrinat in 4,0 ml
Methanol gelöst, zuerst 15,9 mg (1,37 Äquivalent) 5'-lodo-5'-deoxy-adenosin, dann
NaBH4 in Portionen zu 22, 20 und 11 mg zugefügt (insgesamt 100 Äquivalente)39.Das nach Beendigung der Gasentwicklung (ca. 7 min) bezüglich Corrinchromophor DC-
einheitliche Produkt wurde 40 Minuten nach der NaBH4-Zugabe aus der Glovebox
genommen und die Lösung am Rotationsverdampfer am Wasserstrahlvakuum bei
Raumtemperatur getrocknet.
Der in 15 ml 6%iger wässriger H3PO4 gelöste Rückstand Hess sich auf eine C-18
Kartusche unter vollständiger Entfärbung der Lösung aufziehen. Man wusch mit 30 ml
Wasser, benetzte die Kartusche mit ca. 0,1 ml gesättigter KHC03-Lösung und eluierte
vollständig mit 5,0 ml MeOH. Das Methanol wurde am Rotationsverdampfer, das
Wasser anschliessend durch Lyophilisation am HV entfernt.
Der in 1,0 ml MeOH aufgenomme Rückstand wurde durch Glaswatte filtriert und mit
50 ml Aceton gefällt. Der Niederschlag setzte sich innerhalb zwölf Stunden bei 4 °C ab.
Nach Abpipettieren der schwach gefärbten Mutterlauge (Substanzverlust gemäss
UV/vis-Spektrum < 2%) wurde zuerst am Rotationsverdampfer, dann 24 h am HV
13C-NMR (D20, c= 3,34-10-2M, 75 MHz, jedes Signal entspricht einem C, breit¬
bandentkoppelt und DEPT)17,868
19,480
22,015
29,903
35,295
37,679
43,308
49,106
55,124
61,306
78,017
90,508
110,219
151,470
167,170
178,168
181,567
184,639
185,096
(q C51 )
(t, A 5' )
(q C 12A )
(t, C31 )
(t, C 172 )
(t, 181/132
(d C 18 )
(t, C21 )
(d C 13 )
(s C 17 )
(d, A 2' )
(d, A V )
(s, C5 )
(s, A4 )
(s, C 6/14 )
(s, C 11 )
(s, COO" )
(s, COO" )
(s, COO" )
18,131
20,379
26,637
30,817
35,550
38,186
48,160
49,412
57,785
74,787
88,854
99,637
121,840
155,415
167,170
179,222
182,643
184,902
Zuordnung analog [107]
(q, C 151 )
(q. C2A )
(q, C 1A )
(t, C 131 )
(t, C 171 )
(t, 181/132
(t. C71 )
(s, C 2/12 )
(d, C3 )
(d, A 3' )
(d, A 4' )
(d, C 10 )
(s, A 5 )
(s, A2 )
(s, C 14/6 )
(s, C 4/16 )
(s, COO" )
(s, COO" )
19,325 (q C 17B )
21,645 q C7A )
29,522 t, C 81 )
33,547 q C 12B )
37,514 t, C 82 )
40,870 t, C32 )
48,362 s C 2/12 )
52,343 s, C7 )
58,339 d, CS )
74,787 d, C 19 )
89,552 s, C1 )
109,348 s, C 5' )
143,805 s, A 8 )
158,264 s, A 6 )
174,640 s, C9 )
179,553 s C 4/16 )
182,643 s, COO" )
184,966 s, COO" )
b. Versuch der präparativen Alkylierung via Wirt-Gast-KomplexZu in 5,0 ml Phosphatpuffer, pH7, gelöstem Co(ll)-cobyrinat (3,0-10e mol) wurden
ca. 25 mg 5'-0-Tosyladenosin gegeben, die Probe 15 Minuten Ultraschall ausgesetzt,anschliessend zentrifugiert, die nun klare Lösung abpipettiert und unter Lichtaus-
schluss und Stickstoff mit 15 mg NaBH4 in mehreren Portionen versetzt40.
Der Cyanidtest nach jeder NaBH4-Zugabe lieferte keinerlei Hinweis auf Alkylierung.Das UV/vis-Spektrum der Reaktionslösung zeigte nach beendeter NaBH4-Zugabe bei
>400 nm nur die Struktur des Co(ll)-cobyrinat. Im 1 H-NMR-Spektrum (Abbildung
83) der Probenlösung war praktisch nur Lösungsmittel erkennbar.
-_jJ
ppm 8 7 6 5 4 3 2 1
Abbildung 83: 1 H-NMR-Spektrum des Produktes der versuchten Adenosyl¬
ierung von Co(l)-cobyrinat in CD3OD via einen isolierten Komplex von Co(ll)-
cobyrinat mit 5'-0-Tosyladenosin (15)
40vgl. Synthese des Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N"
Es wurden 31,9 mg (1,25-10-5 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) in 4,0 ml
Methanol gelöst und in einer Glove-Box (02= 15 ppm) mit 25,7 mg P1O2, 10 ml
Essigsäure und Wasserstoff analog 24 zum Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) reduziert. Nach zwei Stunden
heftigen Rührens war der Umsatz zum Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -
hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) gemäss UV/vis-Spektrum quantitativ, und die
dunkelbraune Lösung wurde nach Entfernung des Katalysators durch Filtration durch
Glaswatte am Hochvakuum zur Trockene eingedampft.
Der Festkörper wurde in 1,0 ml Methanol gelöst, mit 73,4 mg NaBH4 (155 Äqui¬valente) versetzt41 und schliesslich 9,4 mg (2,17 Äquivalente) 5'-lodo-5'-deoxy-adenosin zugegeben. Die Reaktionslösung färbte sich augenblicklich hellbraun.
Zur Aufarbeitung entnahm man sodann die Reaktionslösung der Glove-box, versetzte
mit 7,0 ml eines 1,0 molaren Phosphatpuffers (pH 4,5) und zog am
Rotationsverdampfer das Methanol ab. Dabei bildete sich unter vollständiger
Entfärbung der Lösung ein brauner Niederschlag, welcher quantitativ abzentrifugiertwerden konnte.
Der amorphe Niederschlag Hess sich mit 10 ml ges. KHC03-Lösung langsam lösen und
derart gelöst auf ca. 10 ml XAD adsorbieren. Das XAD wurde zuerst mit 20 ml ges.
KHC03-Lösung gewaschen, dann mit 200 ml Wasser entsalzt. Die Elution mit 40 ml
Methanol führte zur vollständigen Entfärbung des XAD-Harzes. Man entfernte das
Methanol am Rotationsverdampfer, das verbleibende Wasser durch Lyophilisation.Das hellbraune Produkt fiel mit 8,0 ml Aceton aus 0,1 ml Methanol quantitativ aus42.
Nach Zentrifugation wurde der Niederschlag nochmals in 10 ml Aceton suspendiert und
zentrifugiert. Die Fällung wird wiederholt und das Produkt 24 h am Hochvakuum
getrocknet.Es verblieben 26,6 mg (89,2 %) 18 in Form eines feinen, braunen Pulvers.
41 Heftige Schaumentwicklung und Grünfärbung42 Die Mutterlauge war farblos.
Abbildung 84: CD-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-
cobamido- N, N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) (18) in Wasser, c= 1,45-10'5 M
Hz6,7J=H1t,
H1m,
H1m,
Hz9,9J=H1d,
Hz1,9J=H1d,
H1s,
H1s,
H1s,
C-3'Hz6,7J=H1t,
3,75
3,98
C-2'H1m,
4,38
4,43
C-rHz1,9J=H1d,
5,70
6,88
7,98
8,26Allg.Teil
26Abb.
MHz)300,138,26-103M,c=(CD3OD,1H-NMR
dzumppm4,26ppm5,51
kollabierteingestrahlt
Entkopplungsexperimente
aC-5'H1m,0,28
1,17&1,42Maxima,
H143ca.insgesamt,401,60-0
CH33Hs,0,67
CH33Hs,0,80
CHg3Hs,1,56
CH3H3s,1,69
2,06MaximumH,45ca.insgesamt,602,60-1
151oder513Hs,2,27
151oder51H3s,2,32
H15ca.insgesamt,603,40-2
C-3'u.a.2Hm,3,63
H1m,4,18
C-2'H1m,4,26
c-rH1d,5,51
C-10H1S,6,87
8oder2AH1S,7,88
8oder2AH1S,ppm8,13
85Abb.
MHz)300,13M,5,36.10-3c=(D20,1H-NMR
(m)720(w)800(w)1040
(m)11101155(m)(w)1205(w)1220
(m)1250sh(m),1265(m)1310(m)1350
(s)14051465(m)(m)1495(s)1570
(s)1645(w)2410(w)2480(s)2860
(s)2920(m)3080(m),sh3290(s)3425
KBr)mg300inmg(1,0
202
203
CH?
KOOC<CH,),JINOC
CONHtCH,),£00*
CH, I f-CONHfCHJxPOOfK00C(CH,)^N0C-
CONHICH
jnOCICHjtxJINOC CONH(CH,),^COOK
h£°oi
(U)
Vj^^Jczr
876543210ppm
Abbildung 85: 1 H-NMR-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido- N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carb-
oxylat) (18) in Deuteriumoxid, c= 5,36.10-3 M, 300,13 MHz
2,86 d, 1 H J = 16,1 Hz
3,40-2,80 insgesamt ca 15 H
2,44 s, 3H 51 oder 151
2,39 s, 3H 51 oder 151
2,60-2,15 insgesamt ca 33 H, Maximum 2,16
1,77 s, 3H CH3
2,15-1,70 insgesamt ca. 17 H
1,25 s, 3H CH3
1,70-1,00 insgesamt ca. 125 H, Maxima 1,60 & 1,18
0,97 s, 3H CH3
0,86 s, 3H CH3
0,78 s, 3H CH3
0,40 d, 1 H J= 7,5 Hz C-5'ß
0,30 t, 1 H J= 7,5 Hz C-5'a
Entkopplungsexpenmente
eingestrahlt kollabiert
0,25 ppm keine Veränderung sichtbar
4,28 ppm 3,76 ppm, t zu d / 5,68 ppm, d zu s
5,68 ppm 4,30 ppm, m zu d
204
13C-NMR (CD3OD, c= 1,26.10-2M, -1,0 °C, breitbandentkoppelt & DEPT)
16,37, 6,90, 17,35, 18,58, 20,00, 20,09, 20,63, (q, Je 1C )25,26 ( 1 C ) 26,29 1C ) 27,96 (t, ca 14 C )28,22 (t, ca 4C ) 28,28 ;t, ca 3 C ) 28,41 (t, ca 2C )
29,70 ( 1 C ) 29,94 1C ) 30,49 (t, ca 3C )
30,53 (t, ca 3C ) 30,61 ;t, ca4C ) 30,70 (t, ca 7C )
30,87 (t, ca 7C ) 30,91 t. ca7C ) 30,98 (t, ca 7C )31,07 (t, ca 7C ) 32,32 q, 1 C, C12B) 33,53 (t, 1 C )
In einer Glove-box löste man das Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"", N ,N -
hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7, versetzte mit
25,6 mg (6,1-10'5 mol) 5'-0-Tosyladenosin (15) und beschallte das gutverschlossene Gefäss nach Entnahme aus der Glove-box während 15 Minuten mit 50
kHz Ultraschall. Suspendiertes Material wurde abzentrifugiert. Man verbrachte das
Gefäss wieder in die Glove-box, wo 15 mg (0,41 mM) Natriumborhydrid zur
abpipettierten Lösung zugegeben wurden. Nach beendeter Reaktion (UV/vis-
spektroskopische Kontrolle) wurde die Lösung der Glove-box entnommen.
Die Aufarbeitung erfolgte analog der Synthesevariante a des Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carb-
oxylat) (18).
Das 1 H-NMR-Spektrum des Produktes (Abbildung 86) in Deuteromethanol war
identisch mit dem des 18 enthielt aber als Verunreinigung ca. 1,5 Äquivalente S'-O-
Tosyladenosin (15). Das UV/vis-Spektrum entsprach im Bereich oberhalb 300 nm
dem des Beschreibungsansatzes des Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (18).
Nach Zugabe von KCN in der Dunkelheit und Stehenlassen der Lösung, bis zur Konstanz
des UV/vis-Spektrums wiederholte man die Messung des 1H-NMR-Spektrums in
Deuteromethanol. Das 1H-NMR-Spektrums des erhaltenen Produkts war nun
abgesehen von der Verunreinigung durch 5'-0-Tosyladenosin identisch mit
Abbildung 86: Hexakalium-Coa-aquo-Coß- 5'- adenosyl- cobamido- N, N', N", N"\
N"",N'"",N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (18) in CD3OD, synthetisiert via
isolierten Komplex von Co(ll)-cobamido-N,N',N",N-,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'-carboxylat) mit 5'-0-Tosyladenosin (15) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,
verunreinigt mit ca. einem Äquivalent 5'-0-Tosyladenosin (15)
206
6.5.3 Alkylierung mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat
(15) und 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin
unter Natriumborhydridreduktion
Produkt der Umsetzung mit Co(l)-cobyrinat (31)
a) mit 5'-Chloro-1,N6-ethenoadenosin
Man reduzierte 33,8 mg (2,69-105 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat(24) mit 20,5 mg Platindioxid, 16 ui Essigsäure und Wasserstoff in einer Lösungvom 5 ml Methanol analog 1744 zum Co(ll)-cobyrinat.Die am Rotationsverdampfer getrocknete Hexakalium-Co(ll)-cobyrinsäure wurde
zusammen mit 121,9 mg (3.74-10"4 mol, 13,9 Äquivalente) 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin-H20 in 5 ml Methanol gelöst und in Abständen von ca. 20
Minuten 412 mg (1,09-102 mol, 404 Äquivalente) NaBH4 in ungefähr fünf
gleichgrossen Portionen zugegeben. Die Reaktion war gemäss UV/vis-Spektrum und
Cyanidtest nach zwei Stunden quantitativ abgelaufen (konstantes Spektrum).
Zur Aufarbeitung versetzte man zuerst mit 3 ml 1M wässrigem Phosphatpuffer, pH 3,
sowie 5 ml Phosphatpuffer pH 4,5 und zog das Methanol nach Beendigung der
Gasentwicklung bei Raumtemperatur ab.
Die wässrige Lösung wurde durch eine SEP-Pack C-18 Kartusche geführt und solange1 M Phosphatpuffer pH 4,5 zugegeben (ca. 10 ml) bis die Substanz auf dem Trägerhaften blieb.
Der C-18 Träger Hess sich gemäss UV/vis-Spektrum der Waschflüssigkeit ohne
Substanzverlust mit 10 ml Wasser waschen und das Produkt 31 mit 8 ml Methanol
vollständig eluieren. Die Kapazität der verwendeten SEP-Pack Kartuschen lag bei ca.
40 % der hier verwendeten Substanzmenge, sodass der Adsorptions- und
Elutionsvorgang zweimal zu wiederholen war.
44 Siehe 7.5.1
207
Von den vereinigten Eluate wurden zuerst am Wasserstrahl das organische Lösungs¬mittel abgezogen, anschliessend die zurückbleibende wässrige Lösung lyophilisiert.Das Rohprodukt enthielt nach viermaliger Fällung (anfangs gelöst in jeweils 5 ml
Methanol mit 100 ml Aceton gefällt, dann dreimal gelöst in 0,2 ml Methanol und mit
10 ml Aceton gefällt) und 12 stündiger Trocknung am Hochvakuum noch ca. 10 % 5'-
Chloro-5'-deoxy-l,N6-etheno-adenosin.Die praparative Dünnschichtchromatographie des Rohproduktes auf einer RP-18
Platte 10 x 20 cm, Methanol:H20 , 6,5:5, lieferte drei Banden (rf= 0,07 fluoreszier¬
end, rf= 0,41 dunkelbraun, rf= 0,45-0,64 hellbraun). Die Letzteren enthielten die
als Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat (21) ver¬
mutete Substanz wobei nur die Bande mit rf= 0,41 gemäss 1 H-NMR-Spektrum frei
von Verunreinigungen durch Alkylierungsmittel war. Das methanolische Eluat dieser
Fraktion wurde nach Einengen am Rotationsverdampfer auf ca. 0,1 ml mit 8 ml Ether
gefällt, der feine Niederschlag bei 4'000 Upm während fünf Minuten abzentrifugiert,die farblose Mutterlauge dekantiert und der braune, pulvrige Rückstand (3,8 mg, 10
%) 48 Stunden am Hochvakuum getrocknet.
C56H660i8N8CoNae
mw. 1335,465
DC (RP-18, CH3OH:H20, 10:2)
rf= 0,20
1 H-NMR (CD3OD, C= 3,72-103M, 300,13 MHz)
7,33 ppm s, 1 H Alkylrest7,16 S, 3H Alkylrest6,83 S, 1 H C-10
5,36 d, 1 H J = 3,8 Hz C-1-
4,98 d, 1 H J- 9,8 Hz C-19*
4,27 d, 1 H J = 8,6 Hz C-3*
4,00 m, 2H C-2', C-8*
3,47 t, 1 H J = 6,2 Hz C-3'
3,00 t, 1 H J = ca. 9 Hz C-18*
2,47 s, 3H 51 oder 151
2,45 s, 3H 51 oder 151
2,24-2,90 m, insgesamt ca. 25 H
1,80 s, 3H CH3
1,90-2,24 m, insgesamt ca. 14 H
1,60 s, 3H CH3
1,57 s, 3H CH3
1,50-1,70 m, insgesamt ca. 9H
1,34 s, 3H CH3
0,97 s, 3H CH3
0,89 s, 3H CH3
0,50 d, 1 H J = 9,0 Hz C-5'a
0,20 t, 1 H J = 7,6 Hz C-5'ß*
Zuordnung analog [107]
208
abs
2.0
0,0
Abbildung 87: UV/vis-Spektrum von 31 in Wasser, c= 4,66-10'5 M
—dcAÄ
ppm 7
M^iJLAJ_J I L-
5 4 3
Abbildung 88: 1 H-NMR-Spektrum von 31 in Deuteromethanol, c= 3,72-103
Man reduzierte 19,8 mg (1,56.10"5 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobynnat(24) mit 22,0 mg Platindioxid, 16 ul Essigsäure und Wasserstoff in einer Lösungvom 5 ml Methanol analog 17 zum Co(ll)-cobynnat
Zur Adenosylierung wurde das Co(lt)-cobynnat in 5 ml Methanol gelöst, mit 9,3 mg
(2,09 10 s mol, 1,33 Äquivalente) 1,N6-Ethenoadenosyl-5--0-tosylat45 (16)versetzt und nacheinander 649 mg NaBH4 in vier etwa gleichgrossen Portionen
zugegeben Der Cyanidtest zeigte nach einer Stunde das Ende der Reaktion an
Zur Aufarbeitung versetzte man die Reaktionslösung mit 25 ml 1 M Phosphatpuffer,
pH 4,5, zog das Methanol am Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur ab, und
adsorbierte das Produkt durch Spülen der klaren Lösung durch drei SEP-Pack
Kartuschen unter praktisch vollständiger Entfärbung der Lösung Die Kartuschen
wurden daraufhin jeweils mit 5 ml H20 gewaschen, anschliessend mit 5 ml Methanol
das Produkt vollständig eluiert Das Produkt 31 liess sich nach Abziehen des
Lösungsmittels am Rotationsverdampfer und am HV mit 50 ml Aceton aus 1,4 ml
Deuteromethanol fällen Nach zwei Stunden bei 5 °C konnte die nur schwach gefärbte
Mutterlauge vom Bodensatz abpipettiert werden Das nach dieser ersten Fällung gemäss
DC noch als Verunreinigung enthaltene Tosylat 16 trennte bei einer zweiten, analogen
Fällung ab
Das am HV während 48 Stunden getrocknete, hellbraune Pulver (11,5 mg, 50,0 %)
gelangte zur Charakterisierung
aus Beschreibungsansatz
210
UV/Vis (H20, C» 4,66-10-5 M)Abb. 87
263 ( 32-900) 293 ( 25'300), sh 301 ( 25'200),374 ( 8'180),sh 393 ( 7'260), Sh 454 ( 8'650)
N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (17) in einer Lösung vom 5 ml Methanol mit
33,0 mg Platindioxid, 100 ml Essigsäure und Wasserstoff.
Das am HV getrocknete Hexakalium-Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -
hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) wurde zusammen mit 194,1 mg (5,96-10-4 mol,
21,7 Äquivalente) 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin-H20 in 5 ml Methanol
gelöst und in Abständen von einigen Stunden 652 mg (1,79-10"2 mol, 237
Äquivalente) NaBH4 in vier ungefähr gleichgrossen Portionen zugegeben. Die
Reaktionslösung, die gemäss UV/vis-Spektrum und Cyanidtest nach 18 Stunden weder
Co(l)- noch Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) enthielt, wurde mit 7 ml 1 M Phosphatpuffer pH 9 versetzt und das
Methanol noch in der Glove-Box am HV47 entfernt.
Die Lösung wurde solange mit kristallinem KHCO3 versetzt bis der Chromophorquantitativ an 5 ml XAD adsorbierte. Nach Waschen mit 10 ml Wasser und Elution mit
10 ml Methanol wurde das Lösungsmittel entfernt.
Das in ca. 10 ml Wasser gelöste Rohprodukt wurde mit ca. 200 mg kristallinem KHCO3versetzt und die Substanz auf drei SEP-Pack Kartuschen aufgezogen. Man wusch
anfangs jeweils mit 120 ml MeOH:H20,1:2, und erhöhte dann für die nächsten 200 ml
den Methanolanteil auf 80 %. Die durch anschliessende Elution mit 20 ml Methanol
erhaltene hellbraune Lösung trocknete man am Rotationsverdampfer und anschliessend
am HV. Der derart erhaltene Lack wurde in 0,1 ml Methanol aufgenommen und mit 5
ml Ether gefällt. Der während fünf Minuten bei 4000 Upm abzentrifugierteNiederschlag 32 gelangte nach 48 Stunden am HV als hellbraunes Pulver zur
a1. Zugabe des Alkylierungsmittels nach elektrochemischer Erzeugungdes Co(l)-cobyrinat
32,4 mg (2,58-10'5 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) wurden mit
13,3 mg Pt02, 10 ml Essigsäure und Wasserstoff analog (17) zu Co(ll)-cobyrinat in
einer Glove-box reduziert, in 7 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7, Methanol/Wasser,
1:1, gelöst und in eine Elektrolyseapparatur gemäss (105] gefüllt. Nach vier Stunden
bei einem Potential von -1,2 V, nachdem der Strom auf unter 5% des Anfangswertes
gefallen war, fügte man 62,5 mg (1,92-10-4 mol, 7,4 Äquivalente) kristallines 5'-
Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin zu (7,6.10-5 Faraday, 3,0 Äquivalente).
Zur Aufarbeitung entfernte man 40 Minuten später am Rotationsverdampfer das
Methanol und versetzte die verbleibende wässrige Lösung solange mit 1 molarem
Phosphatpuffer, pH 4,5, bis das Produkt auf SEP-Pack C-18 (4 ml Kartusche)adsorbierte. Das Adsorbat wurde mit 80 ml Wasser gewaschen, mit 5 ml Methanol das
Corrin vom C18-Träger eluiert, das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei RT
abgezogen, der Rückstand mit ca. 1 ml Wasser versetzt und NaHC03 kristallweise
dazugegeben bis der Festkörper vollständig in Lösung ging.
Aus der am Rotationsverdampfer bei RT auf ca. 0,4 ml eingeengten Lösung wurde das
Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat (21) mit 8 ml
Aceton quantitativ gefällt. Nach Wiederholung der Fällung war das Präzipitat DC-
einheitlich und Hess sich nach Lyophilisation (Ausbeute gemäss UV/vis-Spektrum
Zur Aufarbeitung entfernte man am Rotationsverdampfer das Methanol und versetzte
die verbleibende wässrige Lösung solange mit 1 molarem Phosphatpuffer, pH 4,5, bis
das Produkt auf eine 4 ml SEP-Pack C-18-Kartusche adsorbierte. Das Adsorbat wurde
mit 80 ml Wasser gewaschen und mit Methanol eluiert.
Mit der am Rotationsverdampfer auf ca. 0,1 ml eingeengten Lösung des Rohprodukteswurde eine praparative Dünnschichtchromatographie auf zwei RP-18 Platten, 10 x
20 cm, mit Methanol:H20 (6,5:5) als Laufmittel durchgeführt. Die Hauptfraktion49(rf= 0,77) wurde mit Methanol eluiert, das Eluat mit NaHC03 neutralisiert, das
Produkt 21 nach Einengen der Lösung am Rotationsverdampfer auf ca. 0,1 ml mit 8 ml
Ether gefällt, der feine Niederschlag bei 4'000 Upm während fünf Minuten
abzentrifugiert, die farblose Mutterlauge dekantiert und der braune, pulvrigeRückstand (3,8 mg, 10 %) 30 Stunden am Hochvakuum getrocknet.
Man erhielt 29,7 mg (61%) Produkt 21 in Form eines braunen Pulvers mit
0,45 d, 1 H J = 8,02 Hz C-5' ß0,07 t, 1 H J = 8,79 Hz C-5' a
"
zugeordnet mit Entkopplungsexperiment
Entkopplungsexperiment (300,13 MHz)
eingestrahlt bei Änderungen im Spektrum
0,04 ppm 0,48 ppm, d zu s
2,18 ppm, m zu d, J= ca. 5,8 Hz
222
2,72 ppm 2,19 ppm, neuer Peak
4,55 ppm, d zu s
3,75 ppm 2,17 ppm, m zu d, J= ca. 7,0 Hz
4,48 ppm, t zu d, J- ca. 4,0 Hz
MS (FAB(-), Glycerin, m/z 50-1'50)
1087,4 (7; M'-eAdo) 1024,3 (10) 980,3 (10)
958,3 (21) 936,3 (100) 921,5 (22)
898,5 (25) 876,2 (30) 385,9 (6)
361,8 (140;(M-EAdo)3')
Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobyrinsäure
Ca. 12,1 mg (8,91 -10-6 mol) Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobyrinat(21) aus Synthese a1. wurden in wenig Wasser gelöst, aus dieser Lösung auf SEP-
Pack C-18 adsorbiert, mit 30 ml Wasser gewaschen, die Substanz mit Methanol
eluiert und der am Rotationsverdampfer getrocknete Rückstand mit 10 ml Ether aus
0,1 ml Methanol gefällt.
Nach zweitägiger Trocknung am Hochvakuum wurden 10,8 mg (8,82-10-6 mol, 99%)eines braunen Pulvers mit folgenden spektroskopischen Eigenschaften erhalten.
mw. 1230,192
1 H-NMR (CD3OD, c= 1,26W2M, 300,13 MHz)
9,11 (breit) s, 1 H A-2 +
8,24(breit) S, 1 H A-8/A 10 oder 11
8,13(breit) s, 1 H A-8/A 10 oder 11
7,92(breit) s, 1 H A 10 oder 11
6,91 s, 1 H C-10
5,80(breit) s, 1 H C-1'
4,30 m, 1 H
4,16 d'oid, 1 H J= 7,7 Hz
3,89 m, 1 H
3,78 m, 1 H
3,66 m, 2H
3,38 m, 1 H
3,10-0,60 insgesamt ca. 96 H mit Signalmaximabei 1,99/1 ,97/1,94/1,72/1,71 ppm
2,90 s, 3H CH3
1,83 s, 3H CH3
223
1,61 S, 3H
1,48 S, 3H
1,04 S, 3H
0,90 S, 6H
0,72 d, 1 H
0,37 t, 1 H
CH3
CH3
CH3
CH3J= 8,0 Hz A5'a
A5'ß
1 H-NMR (D2O, c= 3,22 10-2M, 300,13 MHz)
9,00(breit) S, 1 H A2
8,13(breit) s, 1 H A-8/A 10 oder 11
7,96(breit) s, 1 H A-8/A 10 oder 11
7,56(breit) s, 1 H A 10 oder 11
6,79 S, 1 H C-10
5,64(breit) s, 1 H C-1'
4,56 d, 1 H J= 10,2 Hz C-19
4,43 m, 1 H C-2'
4,10 m, 1H C-3
3,75 t, 1 H J= 5,9 Hz C-3'
3.68 m, 1 H C-8/13
3,21 m, 1 H C-8/13
3,00-0,30 insgesamt 51 H
2,71 t'oid C-18
2,30 s, 3 H 51 oder 151
2,24 s, 3 H 51 oder 151
1.69 S, 3H CH3
1,42 s, 3H CH3
1,35 s, 3H CH3
0,94 s, 3H CH3
0,72 s, 3H CH3
0,57 s, 3H CH3
0,50 d, 1 H J= 8,5 Hz A5'ß
0,12 t, 1 H J= 8,8 Hz A5'a
Zuordnung analog Synthese a1 von 21
224
Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cob-amido- N, N\ N-.N'-.N'-.N ,N -hepta-tn-decyl-IO'-carboxylat) (19)
1 7
Ci 24Higg02i N13C0K7
1 9
Ci34H2n024NieCoNa6
a1. Zugabe des Alkylierungsmittels nach elektrochemischer Erzeugungdes Co(l)-cobamido-N,N',N"1N,",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)
Es wurden 54,4 mg (2,22-10-5 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) in 5 ml
Methanol gelöst und analog der bereits beschriebenen Reduktion50 mit 9,7 mg Pt02,15 pl Essigsäure und Wasserstoff in einer Glove-box zum Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) reduziert. Nach
Beendigung der Reaktion gemäss UV/vis-spektroskopischer Kontrolle wurde die
Lösung durch Watte filtriert und am Rotationsverdampfer mit HV das Lösungsmittel
abgezogen.Der Rückstand wurde wiederum in ca. 0,3 ml Methanol gelöst, mit 3 ml 0,1 M
Phosphatpuffer, pH 7, Methanol/Wasser, 1:1, verdünnt und in eine Elektrolyse¬apparatur gemäss [105] gefüllt.Nach 50 Minuten bei einem Potential von -1,000 V war die Reduktion zu Co(l)-cobamidat gemäss UV/Vis-Spektrum quantitativ und 75,6 mg (2,33-10"4 mol, 10,5
Äquivalente) krist. 5'-Chloro-5'-desoxy-1,N6-ethenoadenosin wurden zugefügt. Nach
weiteren 100 Minuten, der Strom war auf unter zwei Prozent des Anfangswertesgefallen, wurde die Reaktionslösung abpipettiert und der Glove-box entnommen
(7,3-10° Faraday, 3,3 Äquivalente).Zur Aufarbeitung entfernte man am Rotationsverdampfer das Methanol und versetzte
die verbleibende wässrige Lösung solange mit 1 molarem Natriumphosphatpuffer, pH
50 Siehe 7.5.1
225
9 bis das Produkt auf drei SEP-Pack C-18 (Kartusche ä 4 ml) adsorbierte51. Das
Adsorbat wurde je Kartusche mit 10 ml H20 gewaschen, das Alkylierungsmittelvollständig mit 25 ml Methanol /H20, 7:3, eluiert und das nachfolgend mit 5 ml
Methanol eluierte Produkt am Rotationsverdampfer getrocknet.
Der braune Lack Hess sich aus ca. 0,5 ml Methanol mit 5 ml Ether quantitativ fällen.
Man dekantierte die farblose Mutterlauge nach 15 Minuten von dem bei 4'000 Upmabzentrifugierten, feinen Niederschlag, der am Hochvakuum während zwanzig Stunden
getrocknet (47,1 mg, 81%), zur Charakterisierung gelangte.
Ci 34H211024Ni6CoNa6
mw. 2626,540
DC (RP-18, CH3OH/Phosphatpuffer 0,1 M, pH 3, 95:5)
rf= 0,51
UV/vis
Abb. 30
Allg. Teil
(H20, c= 1,90-10-5 M)
224 ( 42'840), sh
303 ( 22-735),456 ( 8-370).
265
313
(
(
26'815),
20'750),sh
274
375
(20'315), sh
( 7-920), sh
UV/vis
Abb. 96
(CH3OH, c= 1,14-10-5
225 ( 4V130), sh
303 ( 2V630),457 ( 8'100).
M)
265
313
(
(
25'350),
19'800),sh
274
375
(18'710), sh
( 7'370), Sh
CD
Abb. 31
Allg. Teil
(H20, 0=1,90-10-5 M)
223 ( -22,10),306 ( 19,50), Sh
402 ( 1,05),565 ( 7,89),
262 (329 (433 (
-41,60),
52,60),
-16,80),
280 (380 (503 (
-11,60), sh
-4,74),-10,00),
X0 bei 235, 239, 291, 361, 395, 407, 523 nm
Die Adsorption erfolgte nicht ganz quantitativ.
226
Abbildung 96: UV/vis-Spektrum von Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)-adenosyl-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (19) in Methanol, c= 1,14-10"° M
VA
.ÄZs
V
Abbildung 97: CD-Spektrum von Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (19) in Methanol, c= 1,14-10-° M
Es wurden 84,8 mg (3,34-10"4 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) wie bereits
beschrieben (6.5.1) mit 13,7 mg Pt02, 8 pl Essigsäure und Wasserstoff in Methanol
zum Co(N)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)reduziert, in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7 in Methanol/Wasser, 1:1, gelöst, mit
111,3 mg (3,42-10-4 mol, 10,3 Äquivalenten) 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin versetzt und während elf Stunden bei -1,20 V elektrolysiert bis der
Stromfluss praktisch zum Erliegen kam (1.45-10-3 Faraday, 4,5 Äquivalente).Nach Aufarbeitung analog der Synthesevariante a1. erhielt man 69,5 mg braunes
Pulver, das gemäss 1 H-NMR-Spektrum ca. 65% Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (19) enthielt.
Die praparative Dünnschichtchromatographie auf RP-18 (3 Platten) mit 0,1 M
Phosphatpuffer pH 7/Methanol, 8:92, Elution der braunen Hauptfraktion mit 100 ml
Methanol mit anschliessender quantitativer Fällung der am Rotationsverdampfer bei
RT auf ca. 0,1 ml eingeengten Lösung mit Ether ergab nach zwanzigstündiger
Trocknung am HV 27,6 mg (30%) braunes Pulver mit folgenden spektroskopischenEigenschaften:
1H-NMR (CD3OD, c= 5,10-10-2 M, 300,13 MHz)
9,12 s, 1 H A 2 oder 7
8,06 s, 1 H A 2 oder 7
8,04 d, 1 H J = 1,5 Hz A10 oder 11
7,59 d, 1 H J = 1,5 Hz A10 oder 11
6,87 s, 1 H C-10
7,01/8i ,63/6,,35/6,32 insgesamt 1 H
5,72 d, 1 H J = 2,4 Hz C-1'*
4,80 d, 1 H J = 11,7 Hz
4,48 d, 1 H J = 8,9 Hz
4,25 m, 1 H C-2'*
4,03 t'oid, 1 H
3,90 d'oid, 1 H
3,82 t, 1 H J = 6,5 Hz C-3'*
3,52 m, 1 H
3,39 m, 2H
3,35-2 ,80 insgesamt 12 H
2,80-2 ,00 insgesamt 36 H u.a. C-4'*
Maxima 2,61/2,48/2,44/2,42/2,39/2,25
2,00-1 ,00 insgesamt 148 H
Maxima 1,90/1,73/1,58/1,32/1,20/1 ,13
0,96 d, 1 H J = 7,6 Hz C-5' ߻0,88 s, 3H CH3
0,82 s, 3H CH30,75 s, ca. 1 H
0,45 t, 1 H J = 8,4 Hz C-5' a*
'Zuordnung der Riboseprotonen mit Entkopplungsexperimenten
Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (19), 10 mg (2,33-1 0'4 mol),wurden mit 1,0 ml 1% methanolischem HCN sowie 3 mg KCN versetzt und bis zur
Konstanz des UV/vis-Spektrums dem Sonnenlicht ausgesetzt.Nach Entfernen des Methanols am Wasserstrahl und Lösen des Rückstandes in ca. 1,0
ml Wasser zog die Substanz direkt auf SEP-Pack auf. Mit 30 ml H20/MeOH, 1:9,
eluierte eine fluoreszierende, farblose Lösung.Die verbleibende auf SEP-Pack adsorbierte Substanz wurde mit 3 ml Methanol
eluiert, die Lösung am Wasserstrahl getrocknet, der Rückstand in 0,1 ml 1 %
methanolischem HCN aufgenommen und mit 5 ml Ether gefällt.Der am Hochvakuum getrocknete violette Niederschlag zeigte mit Heptakalium-
dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxy-lat) (17) identische 1H-NMR-(D20) und UV/vis-Spektren.
231
6.6 Synthese der Gastmoleküle
6.6.1 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22)
Br
O 0'
o
Bf
33 22
Ci4Hs02 C22H2402Br2
In eine Vorlage mit 30 ml H20 und 20 ml Aceton gab man unter Stickstoff 2,0 g
(9,61-10-3 mol) Anthrachinon (33), 3,0 g NaOH-Plätzchen (7,5-10"2 mol) sowie
2,0 g Natriumdithionit (1,04-10"2 mol) und erhitzte am Rückfluss. Der Kolbeninhalt
färbte sich im Verlauf von ca. 15 Minuten tiefrot. Nach 30 Minuten wurden 10,0 ml
(8,3-10'2 mol) 1,4-Dibrombutan eingespritzt und weitere neun Stunden am Rück¬
fluss erhitzt.
Aus der unteren, der sich bei Abkühlung trennenden Phasen, Hess sich mit 100 ml
Hexan ein weisser Niederschlag ausfällen. Die abfiltrierte Lösung wurde mit insgesamt400 ml Dithionit-Lösung in drei Portionen ausgeschüttelt, die Hexanphase über MgSO.»
getrocknet und am Rotationsverdampfer bei 40 °C Badtemperatur das Lösungsmittel
abgezogen.Man erhielt ca. 2 g Rohprodukt, das zum grössten Teil aus 1,4-Dibrombutan bestand.
Die Wasserphase enthielt gemäss DC kein Produkt mehr.
Das Gemisch der Produkte wurde in einigen ml Hexan gelöst und auf eine mit Hexan
aufgezogene Kieselgelsäule aufgetragen. Die Säule wurde mit 21 Hexan gespült, um das
1,4-Dibrombutan auszuwaschen, dann mit Lösungsmittel wie folgt die Trennung
durchgeführt: 2,1 I Hexan/MeCI2 6:1, 1,2 I Hexan/MeCI2 5:1, 0,5 I Hexan/MeCI2
4:1, 0,4 I Hexan/MeCI2 0,8 I (2. fluoreszierende Bande, 366 nm). Die nächsten mit
der zweiten fluoreszierenden Bande beginnenden 1,5 I Hexan/MeCI2 3:1, beinhalteten
das 9,10-Di-(brombutyloxy)-anthracen (22). Der Elutionsprozess war mit
UV/vis-Spektroskopie (366 nm) gut zu verfolgen.
Das Produkt wurde am Rotationsverdampfer getrocknet, in 5 ml Hexan/Methylen¬chlorid (1:1) gelöst und kristallisierte bei Zugabe von 10 ml Methanol innerhalb
232
weniger Stunden aus. Die anfangs am Rotationsverdampfer, dann am HV (0,08 Torr,90 min) getrockneten nadeiförmigen Kristalle 22, Ausbeute 0,440 g (9,5 %),wurden charakterisiert.
C^H^O^^
mw. 480,243
Schmelzpunkt 102,5 °C
DC (Kieselgel, Hexan:MeCI2, 3:1, Detektion mit l2 und 366 nm)
250 mg (5,4-10"4 mol) 5'-0-Tosyladenosin (15) wurden in 10 ml MeOH und 10 ml
1 molarem Phosphatpuffer, pH 7, suspendiert und mit 0,5 ml 1,2-Dibrom-
ethylacetat versetzt. In der ständig gerührten, vor Lichteinwirkung geschützten
Reaktionslösung war im Laufe weniger Stunden ein markanter pH-Abfall zu
verzeichnen, der durch Zugabe von 1M wässriger KOH ausgeglichen wurde bis der pHwieder den Bereich 4 bis 6 erreichte. Nach zwei Tagen fügte man weitere 0,2 ml 1,2-
Dibromethyl-essigsäureester hinzu und glich die pH-Änderung entsprechend aus. Das
Produkt war mit DC bereits ab dem zweiten Tag als einzige stark fluoreszierende
Substanz identifizierbar. Nach ca. 10 Tagen begann Phosphat auszukristallisieren.
Nach insgesamt zwanzig Tagen extrahierte man die mit 200 ml H20 verdünnte
Reaktionslösung mit 10 Portionen Methylenchlorid ä 100 ml, zog das Lösungsmittel
ab, und fällte mit 100 ml Ether aus 5 ml Methanol.
Das Rohprodukt (149,6 mg) bestand gemäss 1 H-NMR-Spektrum aus zwei
Komponenten, davon etwa 60 % 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16).
Die Komponenten wurden mittels Säulenchromatographie (Laufmittel CH2CI2:Methanol, 85:15) aufgetrennt. Die Produktfraktion war die zweite fluoreszierende
Bande. Der Vorlauf bis nach dem Austritt der Fraktionen einer ersten schwachen,
fluoreszierenden Bande wurde verworfen. Die vereinigten, am Rotationsverdampfer
getrockneten Produktfraktionen wurden in wenigen ml Methanol aufgenommen und
nach Auffüllen mit ca. 100 ml H20 gegen zehn Portionen CH2CI2 ä 100 ml
ausgeschüttelt. Nach Entfernung des CH2CI2 am Rotationsverdampfer blieb das
Hauptprodukt 16 als farbloses Öl zurück.
Nach Fällung des Öls aus 0,3 ml Methanol mit 8 ml Ether und Trocknen am HV während
fünf Stunden erhielt man 91,2 mg (34,5 %) eines weissen Niederschlages. Aus einer
ca. 2-10-2 molaren Lösung dieses Niederschlages in Chloroform fielen beim Zutropfenunter heftigem Rühren in die 20-fache Menge Petrolether (50-70 °C) farblose
Mikrokristalle aus, die sich beim Altern in der Mutterlauge eintrübten und Flocken
bildeten. Die Kristalle wurden abzentrifugiert (4000 UpM, 5 min) und während 24
Stunden am Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 79,3 mg (30 %) 16 in Form
weisser Kristalle, die charakterisiert wurden.
Ci9H1906N5S (• 2,5 H20)mw. 445,453 (490,492)
235
Schmelzpunkt
schmilzt nicht unversetzt, sichtbare Verkohlung ab ca. 180 °C
DC (Kieselgel 60, ohne Fluoreszenzindikator, CH&I&CH3OH, 85:15)
rf = 0,59
Mikroanalyse
C H N
berechnet
gefunden
51,23 %
46,53 %
46,85 %
4,30 %
4,93 %
4,23 %
15,72 %
14,28 % mit 2,5 H2014,20 %
UV/Vis (CH3OH, c= 1,01-10"i M)
227 (35-900),275 ( 4'470),
258
296
( 4'030),
( 2'410)
265 ( 4'720),
CD (CH3OH, c:= 1,01-1 O^M)
222 (266 (
-5,47),
1,09),
234
276
( 11,10),
( 1,28),
258 ( 0,81),295 ( 0,19).
1 H-NMR (CD3OD, c= 3,93-10-2M, 200 MHz)
9,12 S, 1 H A-2 (oder 8)*8,33 S, 1 H A-8 (oder 2)*8,08 d, 1 H J= 1,57 Hz A-10*
7,75/7,70 2H CH3-C6Ü4-S7,64 d, 1 H J= 1,52 Hz A-11*
7,24/7,20 2H CH3-C6H4-S6,13 d, 1 H J= 4,43 Hz C-1
4,78 t, 1 H J= 4,78 Hz C-2 +
4,51 t, 1 H J= 5,15 Hz C-3 +
4,44-4,42 m,2H C-5
4,30 t, 1 H J= 4,04 Hz C--4
2,31 s, 3H CÜ3-C$H4*
zugeordnet analog [97]; + zugeordnet aufgrund Vergleich mit 400 MHz 1H-
NMR-Spektrum unterschiedlicher Konzentration
236
1 H-NMR (CD3OD, gesättigte Lösung, c= 6,24-10'2 M, 400 MHz)
Zur experimentellen Analyse der Reaktionskinetik wurden vier Ansätze durchgeführt.Sie bestanden wie oben beschrieben je aus 250 mg 5'-0-Tosyladenosin (15), 0,5 ml
1,2-Dibromethyl-essigsäureester (4 Äquivalente) und 40 ml Lösungsmittel. Für die
Reaktionsdauer 766 Stunden wurde das Dreifache, für die von 67 Stunden ein Drittel
sämtlicher Mengen gewählt.Die Zusammensetzung des Rohproduktes, welches nur aus den beiden beschriebenen
Komponenten besteht, wurde analysiert.Die Mutterlaugen der Fällungen waren gemäss DC praktisch frei von diesen beiden
Substanzen.
Abbildung 98 zeigt die Zusammensetzung des Rohproduktes in Funktion der
Reaktionsdauer.
t Rohprod /% AHauptprod /%rel Nebenprod /%rel
300 400 500
Reaktionzeit / Stunden
Abbildung 98: Tosylat 15 und 1,2-Dibrom-ethylacetat, Reaktionskinetik in wäss-
rig-methanolischer Lösung, 1 M Phosphatpuffer, T= ca. 23 °C, Anteil Rohprodukt als
isolierte Ausbeuten bezogen auf das Gewicht in % des Eduktes, Prozentangaben Haupt-und Nebenprodukt bezogen auf isolierte Ausbeuten des Rohprodukt (Gew.% des Edukt)
6.7.1 Bestimmung der Löslichkeiten der Alkylierungsmittel in
Deuteriumoxid
Löslichkeit von Methyltosylat in Deuteriumoxid
Eine Lösung von 1,185 mg DSS in 1,0 ml Deuteriumoxid wurde im auf 20 ± 1 °C
thermostatisierten Wasserbad mit Methyltosylat im Uberschuss während 30 Minuten
mit 50 kHz Ultraschall beschallt, die Probe zentrifugiert und die klare Mutterlauge
1H-NMR-spektroskopisch (80 MHz) untersucht. Die Operationen wurden nach 20
bzw. 190 Stunden mit derselben Probenlösung wiederholt.
Die relativen Konzentrationen von DSS und Methyltosylat wurde aus den 1 H-NMR-
Spektrum entnommen, indem die Integrale sämtlicher Signale ausgewertet wurden,
und mit der Einwaage an DSS kalibriert.
Die Konzentrationen an gelöstem Methyltosylat lagen bei 7,7-10'3 M (sofortige
Messung), 1,6-10"2 M (nach 20 h) bzw. 2,9-10-2 M (190 h nach erstem Kontakt mit
Deuteriumoxid). Nach 20 Stunden schlug sich Hydrolyse (ca. 10%) in Signalen im
1 H-NMR-Spektrum bei 7,67/7,63 ppm (C3/5), 7,35/7,31 (C3/5) sowie 2,35
ppm (Methyl des Tosylates) nieder.
Aufgrund einer möglichen Tensidwirkung des DSS sind diese Löslichkeitswerte als
Obergrenze zu betrachten. Bei den nachfolgend durchgeführten Experimenten mit
Methyltosylat, vgl. 6.7.3.3, war der Löslichkeitswert nicht kritisch für die
Interpretation.
Löslichkeit von 5'-0-Tosyladenosin (15) in Deuteriumoxid
a) Eine Lösung von 0,785 mg Trimethyl-silyl-propansulfonsäure (8,1-lO6 mol)
in 1,2 ml Deuteriumoxid wurde im auf 20 °C ± 1 °C thermostatisierten Wasserbad
mit im Uberschuss vorliegenden 5'-0-Tosyladenosin (15) während 30 Minuten mit
50 kHz Ultraschall beschallt, zentrifugiert und die Lösung 1H-NMR-spektroskopisch(300,13 MHz) untersucht.
Die Konzentration an gelöstem S'-O-Tosyladenosin lag in allen Fällen unterhalb der
Nachweisgrenze, d.h. unterhalb cirka 6,76-10"4 M entsprechend 10 % der
Konzentration der Trimethyl-silyl-propansulfonsäure. Bei Sättigung einer Lösung von
6,495 mg Trimethyl-silyl-propansulfonsäure in 1,0 ml Deuteriumoxid (28,1 mM)
bei RT mit 5'-0-Tosyladenosin ergab sich 1H-NMR-spektrometrisch (300 MHz) die
Konzentration an 5'-0-Tosyladenosin zu 4,5-10-4 M.
Die relative Konzentration des 5'-0-Tosyladenosins (15) wurde dabei aus der Summe
den Integrale zwischen 7,00 & 8,20 ppm (Phenylring und Purinring) und des
anomeren H bei 5,92/5,94 ppm auf der einen Seite und jenen der Trimethyl-silyl-
propansulfonsäure zwischen 0,60 und 3,00 ppm auf der anderen Seite erhalten. Über
die Einwaage an Trimethyl-silyl-propansulfonsäure ergab sich die absolute
Konzentration von 15.
240
Aufgrund der potentiellen Tensideigenschaften der Trimethyl-silyl-propansulfonsäurekonnte dieser Wert ebenfalls nur als Obergrenze dienen und da die dermassen
bestimmte Löslichkeit in der Grössenordnung der Corrinkonzentrationen lag, musste
mit UV/vis-Spektroskopie die Löslichkeit genauer bestimmt werden.
b) Die Löslichkeitsbestimmung von 5'-0-Tosyladenosin (15) durch eine UV/vis-
spektroskopische Messreihe bestehend aus 2x10 Messungen mit von 5 bis zu 50
Minuten zunehmenden Beschallungszeiten lieferte die für die Sättigung des
Deutriumoxides mit Tosylat 15 notwendige Mindestdauer der Ultraschallexposition.
Deuteriumoxid wurde mit einem Uberschuss 5'-0-Tosyladenosin versetzt, im auf
35,0 ± 0,1 °C thermostatisierten Bad beschallt, die Suspension zentrifugiert (4000
UpM, 5 min) und die erhaltene Lösung UV/vis-spektroskopisch untersucht. Das
Experiment wurde mit Beschallungszeiten von 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 und
50 Minuten wiederholt.
Nach 10 Minuten waren praktisch keine Änderungen im UV/vis-Spektrum mehr
M. Messungen bei T- 15 °C, lieferten als durchschnittliche Absorption, abs(0)26o nm=
0,443, o= 0,02, dx= 0,100 cm, entsprechend 2,22-10"4 M (6 Messungen); bei T=
20-23 °C, abs26o nm= 0,609, entsprechend 3,05-10-4 M (1 Messung), dx= 0,100
cm und die Bestimmung bei 30 °C abs26o nm= 0,745 (1 Messung), dx= 0,100 cm,
entsprechend 3,73-10-4 M.
1 H-NMR-Spektren der Gastmoleküle in Deuteriumoxid
Jeweils 2,4 mg 5'-Chloro-5'-deoxy-adenosin, 5,5 mg 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-
ethenoadenosin, 1,0 mg 5'-0-Tosyladenosin (15) und 13,8 mg Methyltosylat wurden
mit 1,4 ml Deuteriumoxid versetzt und im auf 35,0 °C thermostatisierten Wasserbad
während 30 Minuten mit 50 kHz Ultraschall beschallt, zentrifugiert und die Lösung
1H-NMR-spektroskopisch (80 MHz) untersucht. Nach Sättigung enthielten sämtliche
Lösungen noch ungelöste Substanz.
Die Signale der Verbindungen erschienen in den 1 H-NMR-Spektren (200 MHz) wie
folgt:
5'-0-Tosyladenosin (15)
8,14/8,17* s, 2H J= 9Hz Purin-H
7,52/7,55 d, 2H J= 9 Hz CH3-C6Ü4-
7,10/7,13* J= 9 Hz CH3-CeU4-
5,92/5,94* d, 1 H J= 6 Hz anomeres H
4,32 m, 3H C2-5
4,48 m, 1 H
2,28 s, 3 H (breit) C±b-C6H4-
5 '-ChloroS'-deoxy-1,Ne-etheno-adenosin
9,05* s, 1 H C-2 Purin
8,40* s, 1 H C-8 Purin
7,92* d, 1 H C-10 Purin
241
7,52 d, 1 H
6,20* d, 1 H
4,90 t, 1 H
4,52/4,40 t+t,,2H
3,93 m, 2H
C-11 Purin
anomeres H
C4'-Ribose
3'&2'-Ribose
5'-Ribose
Methyltosylat
7,83/7,79* 2H
7,49/7,45* 2H
3,78 S, 3H
2,43 S, 3H
7,67/7,63 2H
7,35/7,31 2H
2,35 s, 3H
1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)
siehe Charakterisierung im synthetischen Teil (7.6.2)
C-3/5
C-2/6
er
C-7
C-3/5"
C-2/6"
C-7"
Anteil Hydrolyseprodukt" bzgl. Methyltosylat ca. 30%
5'-Chloro-5'-deoxy-adenosin
8,32* s, 1H
8,19* s, 1H
6,06/6,08* d, 1 H
4,35-4,50 m, 2H
3,85-3,92 m, 2H
Relative Löslichkeiten der Gastmoleküle
Die relativen Löslichkeiten der als Gastmoleküle verwendeten Akylierungsmittel
wurden durch gleichzeitige Sättigung von Deuteriumoxid mit 5'-Chloro-5'-deoxy-1 ,N6-ethenoadenosin, 5'-0-Tosyladenosin (15), Methyltosylat und 5'-Chloro-5'-
deoxy-adenosin oder 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16), experimentell
bestimmt.
Für jede Temperatur (15,2; 18,2; 23,0; 33,0 °C, jeweils ± 0,1 °C) wurde separat
eine Mischung aus mindestens 2,4 mg 5'-Chloro-5'-deoxy-adenosin oder 1,N6-
Ethenoadenosyl-5"-0-tosylat (16), 5,5 mg 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin, 1,0 mg 5'-0-Tosyladenosin (15) und 13,8 mg Methyltosylat mit 1,4 ml
Deuteriumoxid versetzt, umgehend während 10 Minuten Ultraschall (50 kHz)
ausgesetzt, in vorangehend thermostatisierten Zentrifugeneinsätzen während 10
Minuten suspendiertes Alkylierungsmittel abzentrifugiert und die überstehende klare
10'-carboxylat) (20,4 mg) (17) wurden in 5 ml H20 gelöst, die Lösungen in zwei
Portionen aufgeteilt, eine Hälfte mit 7,0 resp. 5,6 mg 9,10-Di-(brombutyloxy)-
anthracen (22) versetzt und während zehn Minuten ultrabeschallt.
52 6.7.1 & 6.8.1.3
244
Die Konzentration an 9,10-Di-(brombutyloxy)-anthracen (22) wurde bestimmt,
indem man von dem UV/vis-Spektrum der Probenlösung das UV/vis-Spektrum
entsprechend 6.7.2.aß gegen eine gleichkonzentrierte Lösung des reinen Corrins 17
aufnahm und aus der Absorption des resultierenden Differenzspektrum bei 265 nm die
Konzentration von 22 berechnete.
In der Lösung von 24 wurde UV/vis-spektroskopisch kein 22 detektiert, in der
Lösung von 17 lag der Gehalt an 22 bei 2,3 % der Corrinkonzentration.
Assoziation mit Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und Heptakalium-di-
cyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxy-lat) (17) in wässriger Lösung unter Phasentransfer Hexan/Wasser
Je 0,4 ml 1,37-10'3 molare, wässrige Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat(24) bzw. Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N-",N"",N ,N -
hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-Lösung wurde zusammen mit 0,4 ml 5,42-10'3 M
9,10-Di-(brombutyloxy)-anthracen (22) in Hexan mit einem Magnetrührerwährend 12 Stunden gerührt und nachfolgend UV/vis-spektroskopisch mit der
Stammlösung als Referenz gemäss der unter 6.7.2aß beschriebenen Methode
untersucht. Die Lösung von 17 wurde nach der Messung vier Stunden auf 5 °C gekühltund nochmals gemessen.
Die frisch bereitete Lösung von 17 wies einen Gehalt an 9,10-Di-(brombutyloxy)-anthracen (22) von 2 ± 0,4 % auf (Methodik der Konzentrationsbestimmung siehe
6.7.2aß). In der Probe mit Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat und der auf 5 °C
gekühlten Lösung von 17 lag der Gehalt an gelöstem 9,10-Di-(brombutyloxy)-anthracen unterhalb der Nachweisgrenze.
Assoziation mit Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und Heptakalium-di-
cyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxy-lat) (17) in wässriger Lösung unter Phasentransfer Deuteromethylenchlorid/Deuteriumoxid
A.
10,1 mg (3,98-10"6 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) wurden in 1,0 ml D20 gelöst,
zuerst 0,5 ml Deuteromethylenchlorid, dann 10,1 mg (2,10-10'5 mol) 9,10-Di-(4-
brombutyloxy)-anthracen (22) zugefügt und bei einer Badtemperatur von 40 °C 15
Minuten lang 50 kHz Ultraschall ausgesetzt. Das überschüssige 9,10-Di-(4-
brombutyloxy)-anthracen, das die Lösung deutlich eintrübte, liess sich durch
Zentrifugation (2500 Upm, 30 Min) abtrennen. 1 H-NMR- und UV/vis-Spektren
wurden sofort gemessen und aus den UV/vis-Spektren durch Subtraktion eines
Referenzspektrums das Spektrum für 9,10-Di-(4-brom-butyloxy)-anthracen
245
berechnet (Methode 6.7.2aß). Das 1H-NMR-53 (Abbildung 36 oben) und das UV/vis-
Spektrum zeigten übereinstimmend ein Verhältnis der Konzentrationen von 17 zu 22
von 1,0:1,0 (± 0,1) an.
Nach Lagerung während 12 Stunden bei 5 °C war die Probe stark eingetrübt und Hess
sich nach Lyophilisation, auch unter Zugabe KCN nicht in eine homogene Lösung
überführen. Das 1 H-NMR-Spektrum dieser, nach Zentrifugation (2500 Upm, 10
Minuten) homogenen Lösung wies keine Signale des 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22) mehr auf (Abbildung 36 unten). Das UV/vis-Spektrum (Auswertung
gemäss 6.7.2aa) verifizierte einen Gastanteil von <5% und war mit dem des reinen
Bei Durchführung des obigen Experimentes bei einer Badtemperatur während der Be¬
schallung von 20 °C war die Assoziatbildung innerhalb der Fehlergrenze von ca. 10%
gemäss UV/vis-Spektrum reproduzierbar. Wurde dabei jedoch auf Deuteromethylen¬chlorid während der Beschallung verzichtet, waren im 1 H-NMR-Spektrum keine
Signale des 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22) beobachtbar.
B.
Zu A. analoge Versuche mit einer Beschallungsdauer von 20 min führten mit 1,09-10*3 M wässrigem Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) zu keinem UV/vis-
oder 1H-NMR-spektroskopisch nachweisbarem Gehalt an Anthracen 22.
C
Es wurden 0,3 ml einer 1.15-10'3 M wässrigen Lösung von Heptakalium-dicyano-Co-
(lll)-cobamido-N,N',N",N"-,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17)mit 0,3 ml (1,1 MO'2 M) Anthracenlösung (22) in Methylenchlorid versetzt, zwei
Stunden mit 50 kHz bei einer Badtemperatur von 40 °C beschallt und mit 2500 Upmfünf Minuten zentrifugiert. Die nun klare Lösung wurde abpipettiert und ihr UV/vis-
Spektrum gemessen. Das Differenzspektrum zur Bestimmung der Konzentration von
22 und des Assoziationsgrades wurde nach der unter 6.7.2aa beschriebenen Methode
erhalten.
Man Hess die Probe anschliessend im Dunkeln und bei 5 °C stehen und wiederholte in
Intervallen die UV/vis-Messung sowie die Auswertung über das Differenzspektrumnach dem in 6.7.2aa beschriebenen Verfahren. Abbildung 37 zeigt den über die
UV/vis-Spektren ermittelten Assoziationsgrad des Cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)es mit 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen als Funktion der Zeit.
Berechnung gemäss der unter 6.7.2b beschriebenen Methode
246
6.7.3.2 5'-Tosyladenosin (15)
Dicyanocobyrinat (24) und Co(ll)-cobyrinat
Assoziation der Dicyanoform (24)
Man versetzte 2,1 mg (1,68-10'6 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat
(24) und 12,6 mg (6,17-1 0"6 mol) 5'-0-Tosyladenosin (15) mit 0,75 ml
Deuteriumoxid, beschallte 30 Minuten mit 50 kHz in einem auf 21,0 ± 0,1 °C
thermostatisierten Ultraschallbecken, zentrifugierte bei 4*000 UpM während 15
Minuten und untersuchte die klare Lösung umgehend UV/vis- und 1H-NMR-
spektroskopisch. Der Besetzungsgrad wurde gemäss 6.7.2a<x ermittelt.
Nachfolgende schrittweise Verdünnung der Probenlösung mit jeweils ca. 0,15 bis 0,20
ml Deuteriumoxid unter Wiederholung des Sättigungsvorganges lieferte folgende
Ergebnisse:
[24]/mM Cobyrinat: Adotosylat
(24.15)
gemäss1 H-NMR
Besetzungsgrad
gemäss
UV/vis-Spektrum
2,18 6,5 : 1 0
1,76 nicht gemessen 0
1,43 4,0 : 1 0
0,91 nicht gemessen 0
Die 'H-NMR-Signale des Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und des S'-
O-Tosyladenosin (15) waren bis auf die nachfolgend aufgeführten Ausnahmen
identisch mit jenen der reinen Vergleichssubstanzen (Angaben in Klammern reine
10'-carboxylat) (17) in 1,4 ml D20 (2,81 -10"* M) wurde während 15 Minuten
Ultraschall ausgesetzt, die Lösung während fünf Minuten mit 4'000 UpM zentrifugiert
und von der nun klaren Lösung das 1 H-NMR-Spektrum aufgenommen.
Die Integrale des Signale des S'-O-Tosyladenosin zwischen 7,00-8,00 ppm (vier
Protonen des Phenylringes) zum Integral des H(C-10)-Signales des Corrins bei 5,78
ppm ergaben ein absolutes Verhältnis der Konzentrationen des Corrins 17 zur
Konzentration des Tosylates 15 von 1,00 zu 0,45.
Auf der Basis dieses Konzentrationsverhältnisses berechnet sich aus dem 'H-NMR-
Spektrum gemäss 6.7.2b der Besetzungsgrad des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-
cobamido-N,N-,N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (17) mit S'-
O-Tosyladenosin (15) zu 16%.
2. Experiment
Analog Experiment 1 wurden 7,7 mg S'-O-Tosyladenosin (15) zu einer Lösung von
ca. 16 mg Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N"""-
hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) in 1,0 ml D20 gegeben (4,88-103 M), 15
min mit 50 kHz beschallt, zentrifugiert und die überstehende klare Lösung
schnellstmöglich mittels 'H-NMR- und UV/vis-Spektroskopie analysiert.
Für die nachfolgenden Messungen verdünnte man die jeweils mit der Stammlösung
vereinigten Proben mit D20 um ca. 1/4 und bestimmte UV/vis-spektroskopisch die
248
Konzentration an Cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) 17. Von jeder zweiten Verdünnung wurde zudem das 1H-NMR-Spektrumgemessen.
Aus den UV/vis-Spektren errechnete man der unter 6.7.2 aa beschriebenen Methode
folgend den Besetzungsgrad.
Unter Venvendung der unter 6.7.2b beschriebenen Vorgehensweise entnahm man den
1 H-NMR-Spektren die relative Konzentration an 5'-0-Tosyladenosin (15) und
berechnete erneut den Besetzungsgrad. Tabelle 13 fasst die Ergebnisse zusammen.
Tabelle 13 Assoziationsgrad in Prozent der Corrinkonzen¬
tration von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cob-
amido-N.N-.N-'.N-.N'-.N ,N -hepta-(n-
decyMO'-carboxylat) (17) und 5'-0-Tosyl-adenosin (15) in Deuteriumoxid
[17]/mM •15-,o,a|/•17-,o,a,gemäss
'H-NMR-
Spektrum
•»-.ou.in mM
gemässUV/vis-
Spektrum
Besetzungsgrad gemäss
'H-NMR- UV/vis-
Spektrum Spektum
4,88 0,16 0,84 7% 8%
3,81 - 1,02 nicht gemessen 15%
2,78 0,30 1,00 15% 20%
2,61 - 0,84 nicht gemessen 15%
1,50 0,46 0,69 16 % 16%
3. Experiment
Mit 4,2 mg 5'-0-Tosyladenosin (15) in einer Lösung von ca. 8,4 mg Heptakalium-
10'-carboxylat) (17) identisch mit dem Beschreibungsspektrum (vgl. 6.4.5).
252
Die chemischen Verschiebungen der Signale des 5'-0-Tosyladenosin (15)unterschieden sich in den 'H-NMR-Messungen von jenen der Beschreibungspektrenwie folgt (Werte der Beschreibungsspektren der reinen Substanzen in Klammern, vgl.
6.7.1):
Im Experiment mit [17]= 2,28 mM: 8,07/8,04 (8,14/8,17); 7,49/7,46
(7,52/7,55); 7,08/7,05 (7,13/7,10); im Experiment mit [17]» 1,47 mM:
10'-carboxylat) (17) verglichen mit Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24)
die Lösung von ca. zwei zusätzlichen Molekülen Methyltosylat ermöglicht.
55 annähernde Löslichkeit 7,7 mM (6.7.1)
254
6.8 Assoziationsexperimente mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-O-tosylat (16) als Gast
6.8.1 Total-Lumineszenzexperimente
Allgemeines zur Total-Lumineszenzspektroskopie
Die Totallumineszenz, d.h. die Summe aus Fluoreszenz und Phosphoreszenz, wurde nach der
Front-face Methode mit einer Apparatur entsprechend Abbildung 101 gemessen. Exitation im
UV-Bereich war wegen des als IR-Filter vor den Exitationsmonochromator vorgeschaltetenWasserfilters aus Fensterglas nicht möglich. Mit zwei Photomultipliern wurde die Emissionund der durch den semidurchlässigen Spiegel reflektierte Teil des Exitationsstrahles als
Referenzstrahl delektiert. Die Exitationsspektren wurden durch Division der
Emissionsspektren durch die Referenzdaten um die Wellenlängenabhängigkeit der Intensität der
als Lichtquelle verwendeten Xenonlampe korrigiert.Monochromatoren: SPEX: Model 1402; Steuerung der Monochromatoren: SPEX: Speed Con-
troler; Photomultiplier Emission: RCA Electronic Components: C 31034 A; PhotomultiplierReferenz: Hamamtsu: R 928; Counter Emission: General Radio: 1192-B; Counter Referenz:
Seyffer: Modell 150; Lampe: Osram Xenon-Hochdruckkurzbogenlampe XBO, 2500 W, T=296K.Die Apparatur wurde freundlicherweise von Prof. U. Wild, Laboratorium für physikalischeChemie der ETH Zürich zur Verfügung gestellt.
Als Schrittweite zwischen zwei Messpunkten wurde jeweils ein Drittel der durch die
Schlitzöffnungen bestimmten Spektralauflösung gewählt.Für jede Experimentserie kalibrierte man mit einer gesättigten 1,Ne-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat-Lösung neu. Die Fluoreszenzmessungen einer Versuchsreihe wurden direkt
hintereinander ausgeführt und sind in ihren absoluten Werten vergleichbar. Bei allen anderen
Messungen, auch wenn sie unter Optimierung des Lichtweges durchgeführt wurden, ist die
numerische Vergleichbarkeit der delektierten Impulse nicht mehr gegeben.Die mangelnde Vergleichbarkeit von mit unterschiedlichen Küvetten durchgeführten Experi¬mentserien war insbesondere durch die Spiegelpositionierung begründet, die für jede Probe
neu optimiert werden musste.
Eine ungenaue Küvettenpositionierung beeinflusst bei der verwendeten Messmethode den
Messwert um weniger als 1 %.
Die Verschiebung des Exitationsmaximums von ca. 4 nm in Abhängigkeit der Konzentration an
1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat ist bei der beschriebenen Versuchsdurchführungbedeutungslos. Der Shift im Emissionsmaximum als Funktion der Konzentration des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) störte ebenfalls die Messungen nicht, da die
Lumineszenzmessungen durch Emissionsscans bei konstanter Exitationswellenlänge erfolgtenund jeweils das Emissionsmaximum ausgewertet werden konnte.
Die extreme Empfindlichkeit des Photomultipliers bedingte strikten Ausschluss von Streulicht.
Das Hintergrundrauschen bei ausgeschalteter Lampe und maximaler Öffnung sämtlicher
Blenden konnte auf maximal 460 counts/sec reduziert werden.
Der Messfehler der Lumineszenzintensität, bestimmt durch die Wurzel aus der Anzahl
Lumineszenzcounts, lag bei den vorliegenden Messungen zwischen 0,2 % und 2 % bezogen auf
6.8.1.1 Totallumineszenz-Spektren von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat(16) in D20: Vergleich sauerstofffreier und sauerstoffhaltigerLösungen
In einer Glove-box wurden von je 1,0 mg mikrokristallinem 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) über je 1,4 ml Deuteriumoxid durch Beschallung mit Ultraschall der Frequenz50 kHz bei 23 °C zwei gesättigte Lösungen hergestellt, die entstehenden Suspensionen bei
4'000 UpM ausserhalb der Glove-box während fünf Minuten zentrifugiert, die Proben wieder
in die Glove-box geführt und die überstehenden, klaren Lösungen zur weiteren Verwendungabpipettiert.Eine Probe dieser sauerstofffreien Lösung wurde in der Glove-box mit Deuteriumoxid auf ca.
1/10 der Sättigungskonzentration verdünnt.
Zur Spektroskopie wurden die Lösungen in Küvetten mit einer Schichtdicke vom 0,100 cm
gefüllt, jeweils mit einem Teflonstopfen und Parafilm gasdicht verschlossen und sodann der
Glove-box entnommen.
Analog, jedoch in normaler Laboratmosphäre wurde ohne Verwendung einer Glove-box eine
sauerstoffgesättigte Lösung von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) in Deuteriumoxid
hergestellt.Die UV/vis- und 2D-Totallumineszenz-Spektren (Messdauer je 12 h) der drei Lösungen im
Bereich 250-380 nm (Exitation) und 305-560 nm (Emission) (Abbildung 39-42) wurden
gemessen.
Die Fluoreszenzintensitäten sauerstoffgesättigter und entgaster gesättigter Lösungen des 1 ,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) waren praktisch identisch: 02 < 15 ppm, abs26s nm=
Eindimensionale Emissions- und Exitationsscans im Bereich des Exitations/Emissionsmaxi-
mums (EM 340-520 nm, EX 300/320/340 nm & EX 280-360 nm, EM 410/430/450 nm)wurden jeweils von analog frisch hergestellten Lösungen mit erhöhter Sensitivität des
Spektrometers gefahren und die Lage des Emissionsmaximums aus je drei Exitationsscans
bestimmt. In Tabelle 1 sind die Lagen der Maxima der EM/EX-Matrix zusammengestellt.
Die'H-NMR-Spektren der Probenlösungen im Anschluss an die Fluoreszenzmessungen waren
mit dem Spektrum des reinen Eduktes 16 identisch.
6.8.1.2 Konzentrationsreihe von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)in D20
Zur Messung der Konzentrationsabhängigkeit der Fluoreszenzintensität wurde eine Serie von
Totallumineszenzmessungen durchgeführt.Ca. 1,4 ml Deuteriumoxid über ca. 10 mg 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) wurden
durch 15-minütige Ultraschallexposition (50 kHz) mit 16 gesättigt. Von der nach
Zentrifugation (4'000 UpM, 5 min) partikelfreien überstehenden Lösung wurde das UV/vis-
Spektrum und die Totallumineszenzspektren (Anregung 320 nm, Emissonsdetektion 340-520
nm) gemessen.
Ausgehend von diesen 1,4 ml mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigtenDeuteriumoxid wurden durch sukzessives Verdünnen mit jeweils frischen Deuteriumoxid-
Ampullen Verdünnungen von '/2,1/s, '/10,1/so der gesättigten Lösung hergestellt und analog
257
Spektroskopien. Das Hintergrundrauschen wurde für die gewählten Apparaturparameter zu
883 counts/sec bestimmt.
Abbildung 43 zeigt die Lumineszenzintensitäten dieser Lösungen als Funktion der
Konzentration. Die Zahl gemessener Impulse im Photomultiplier war bis zu abs265 nm- 0,60,
entsprechend einer halbgesättigten Lösung, lineare Funktion der Konzentration (Gerade in
Abbildung 43) und wich für höhere Konzentrationen erheblich von der Linearität ab. Die
Abweichung von der Linearität lag für die gesättigte Lösung 21% unter dem Wert, der sich aus
der Extrapolation der Lumineszenzintensitäten als Funktion der Konzentration für weniger als
halbgesättigte Lösungen ergibt.
6.8.1.3 Bestimmung der Löslichkeit von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat(16) in D20
Deuteriumoxid wurde mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigt indem 1,4 ml
D20 mit ca. 10 mg 16 im auf 23,0 + 0,1 °C thermostatisierten Ultraschallbad während 15
Minuten Ultraschall der Frequenz 50 kHz ausgesetzt wurden. Nach Zentrifugation während fünf
Minuten bei 4'000 UpM war die Lösung über dem Festkörper partikelfrei und wurde UV/vis-
spektroskopisch untersucht.
Mit sechs weiteren, analogen Experimenten bestimmte sich die Löslichkeit von 16 zu 1,29-10"4 M ± ca. 4,5 % [e(1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16), D20, 265 nm)= 8'100].
6.8.1.4 Hydrolyse & Stabilität von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat(16) in D20
Eine analog56 gesättigte Lösung von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) in
Deuteriumoxid wurde a) sofort nach ihrer Bereitung und nach lichtgeschützter Lagerungwährend b> 24 Stunden bei 5 °C sowie c> anschliessenden sieben Tagen bei 23 ± 1 °C 'H-NMR-
(200 MHz) und UV/vis-spektroskopisch untersucht.
Innerhalb der üblichen Messfehler waren sämtliche 'H-NMR- und UV/vis-Spektren mit den
Spektren von reinem 16 identisch und wiesen auch keine Signale hydrolysierter Substanz auf.
6.8.1.5 Totallumineszenz von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat und
Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat(24 & 21) und Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17 & 19)
a BlindprobeDie Exitationsspektren einer mit Deuteriumoxid gefüllten Messküvette57, Anregung 250-400
nm, Emission delektiert bei 410, 430, 450 nm, und die Emissionsspektren, Anregung 300
und 340 nm, Emissionsbereich 340-520 nm, waren mit max. ca. 330 counts/sec praktischKonstanten und identisch mit dem Hintergrundrauschen.Im UV/vis-Spektrum begann die Absorption entsprechend den Materiaieigenschaften der
eingesetzten Küvette unterhalb 300 nm, auf Werte über 0,001 zu steigen.
56 analog 6.8.1.3
57 Hellma suprasil, dx= 0,100 cm, gereinigt mit Methanol, puriss. und anschliessend mit
Aceton puriss.
258
b. Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat/Hexanatnum-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobynnat (24 & 21)
Ca 0,7 mg (5,82 10 7 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) wurden in 0,7 ml
Deuteriumoxid gelöst (abss7g nm= 0,814, 8,31 10'4 M), in eine 0,100 cm Quartzkuvette
gefüllt, das UV/vis Spektrum und das Totaiiumineszenzspektrum (Exitation 250-450,Emission 430 & 570 nm, Emission 250-800, Exitation 285 nm) gemessen, die
Totallumineszenzmessung als zweidimensionales Exitations-Emissions-Spektrum wiederholt
und zum Schluss das 1 H-NMR-Spektrum (300 MHz) aufgenommen.Mit einer aus 0,4 mg Hexanatnum-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat(21) und Deuteriumoxid bereiteten 1,20 10 5 M Lösung wurde bis auf den Verzicht auf das
zweidimensionale Totaiiumineszenzspektrum analog verfahren
Die Emissionsspektren der Lösungen (EM 250-750, EX 250-400) (Abbildungen 44 & 45)
zeigten bei konstanter Exitation ab 500 nm minimale, aber signifikante Zunahme der Emission
mit steigender Wellenlänge; bei konstanter Emission in den Exitationsspektren unterhalb 300
nm eine Zunahme der Counts mit fallender WellenlängeDie Fluoreszenzcounts des Probenphotomultiphers lagen mit maximal 400 counts/sec in der
Grössenordnung des Hintergrundrauschens Die UV/vis- und 'H-NMR-Spektren waren
identisch mit den Beschreibungsspektren von 24 und 21
c Heptakalium-dicyano Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)/Hexanatnum-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobamido-N,N',N",N-,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17 & 19)
Ca. 3,0 mg (1,18 10"3 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,
N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)(17) wurden in 0,7 ml Deuteriumoxid gelöst und 'H-
NMR- sowie UV/vis-spektroskopiert (abssso nm« 1,227, 1,30 10 3 M). Der Bereich EX
320, EM 250-700 nm und EM 430, EX 250-450 nm wurde auf Lumineszenz geprüftMit einer aus 1,0 mg Hexanatnum-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (19) und Deuteriumoxid
bereiteten 1,95 10'5 molaren Lösung wurde analog verfahren
Die UV/vis-Spektren waren identisch mit den entsprechenden Beschreibungsspektren von 17
respektive 19.
Die gemessenen Fluoreszenzintensitäten der Dicyano- und 1,N6-Ethenoadenosylverbindung
gingen nicht über das Rauschen, d h ca 400 Counts/sec,hinaus und wiesen keine Maxima auf
(Abbildung 46 & 47) Die ' H-NMR-Spektren waren mit jenen aus den Beschreibungsansätzenbis auf durch Konzentrationsunterschiede bedingte, geringfügige Signalverschiebungenidentisch
259
6.8.1.6 Konzentrationsreihe von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat
(24) und -cobamido-N,N-,N",N-,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'-carboxylat) (17) mit gesättigter, wässriger 1,N6-Etheno-
adenosyl-5'-0-tosylat-Lösung
3,5 ml Deuteriumoxid mit 5,1 mg (1,04-10'4 mol) 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)wurden während 15 Minuten Ultraschall ausgesetzt (50 kHz), die Suspension zentrifugiert(4'000 UpM, 5 min) und die partikelfreie Lösung vom Niederschlag abpipettiert.Man löste sodann 2,3 mg (1.91-10'6 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24)bzw. 5,2 mg (2,04-106 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) in jeweils 0,5 ml der mit 1,N6-
Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigten Deuteriumoxidlösung und verdünnte für die
nachfolgenden Messungen die Probe jeweils mit dergleichen 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat-Stammlösung, sodass Lösungen der approximativen Konzentration '/2, V3, V5,1/7,5,1'io, 1'20,1/30,1'5o, 1'75,1'ioo der anfänglichen Corrinkonzentration resultierten.
Von jeder Verdünnung wurde ein UV/vis-Spektrum und ein Totallumineszenz-Emissions¬
spektrum (Emissionsscan: 340 bis 520 nm, Exitation: 320 nm) aufgenommen sowie je zwei
Abbildung 48 zeigt die UV/vis-Spektren der untersuchten gesättigten 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat-Lösungen mit jeweils unterschiedlichem Gehalt an Dicyano-heptakalium-
Co(lll)-cobyrinat (24).
'H-NMR-Spektroskopie
Die Signale der 1 H-NMR-Spektren der Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-Versuchs¬reihe waren die Summe der Signale aus den Spektren der reinen Substanzen 24 und 16.
Im Falle des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-
decyMO'-carboxylat) (17) fand man das Signal von 4,07 ppm nach 4,06 ppm und von den
Signalen des 1 ,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) jene von 1,90 ppm nach 1,96 ppm und
die des Aromaten von 6,75 ppm und 7,39 ppm nach 6,82 ppm respektive 7,42 ppm geshiftet
(Tabelle 2).Hydrolyse während der Zeitdauer der Versuchsdurchführung trat nicht in 'H-NMR-spektro¬skopisch detektierbarem Ausmasse auf.
Totallumineszenzspektroskopie
Abbildung 49 zeigt die Totallumineszenzintensitäten der Emissionsspektren obiger Lösungenals Funktion der Corrinkonzentration. Die ermittelten Funktionen für Dicyano-heptakalium-
Co(lll)-cobyrinat (24) und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,
N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) waren ebenso wie die Emissionsspektren der
Stammlösungen identisch. Die Emissionsspektren der corrinhaltigen Proben zeigten im
untersuchten Bereich zwei gut erkennbare Maxima, ca. 410 und 430 nm, und entsprachendamit den Literaturdaten [142, 145, 152]. Neben den Maxima bei 430 und 410 wurde in den
Totallumineszenzspektren der Lösungen von 17 zudem eine Schulter bei ca. 380 nm
beobachtet, welche in Lösungen mit abssao nm> 2 au< 360 nm fiel. Die Breite der
Lumineszenzbanden auf halbmaximaler Höhe schwankte zwischen 90 und 75 nm.
260
6.8.1.7 Sättigung von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) &
Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobamido- N, N', N", N"-,N"",N ,
N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (17) in Deuteriumoxid mit
1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)
A. orientierende Messung von Lösungen vergleichbarer Konzentration
1,6 mg (1,26.10-6 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) bzw. 3,3 mg
hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) wurden mit 0,8 bzw. 1,6 mg 1,N6-Etheno-5'-0-tosyladenosin (16) (1,63-10"6 mol bzw. 3.26.10"6 mol) sowie je 0,7 ml Deuteriumoxid
versetzt (9,29-10-4 M bzw. 1,55-103 M) und während zehn Minuten mit 50 kHz Ultraschall
unter Temperaturkontrolle, T= 23,0 ±0,1 °C, beschallt. Nach Zentrifugation (4'000 Upm, 10
min) liess sich eine klare Lösung vom verbleibenden, farblosen Festkörperanteilabpipettieren.Zur Bestimmung der Lumineszenzeigenschaften wurden bei 300 °K Exitationscans (Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24): von 280 bis 360 nm; Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"-,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17): von 250 bis
400 nm) mit Detektion bei 410/430/450 nm und Emissionsscans (Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24): von 340 bis 520 nm; Heptakalium-dicyano-Co(!ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat): von 300 bis 520 nm) mit
Exitation bei 300/320/340 nm gemessen. Zuletzt wurden die 'H-NMR- und UV/vis-Spektrender Proben aufgenommen. Im Falle von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) wurde ca. 0,1 mg KCN in die
Probe gegeben und erneut das ' H-NMR-Spektrum gemessen.
Aus den Absorptionswerten der UV/vis-Spektren berechnete man gemäss der unter 6.6.2aa
beschriebenen Methode die Konzentration an 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) für die
Lösung von 24 zu 1,40 mM, für die Lösung von 17 zu 1,83 mM.
Die Auswertung der 'H-NMR-Spektren erfolgte entsprechend Methode 6.6.2b. Aus den
Integralen der 'H-NMR-Signale des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16), die oberhalb
5,0 ppm lagen und dem C-10 Signal des Corrinteiles, beim Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) zusätzlich C-3, 19 und 8 bzw. C-3 und 19 bzw. beim Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N'-,N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17),wurden die relativen Konzentrationen der beiden Substanzen bestimmt. Die Konzentration von
[16] betrug mit 2,33 mM das 1,5-fache der Konzentration von 17, und mit 1,39 mM
ebenfalls das 1,5-fache der Konzentration von 24. Gemäss 6.6.2 ergeben sich die
Besetzungsgrade zu 10% für das Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und 60% für
das Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'-carboxylat) (17).
Die 'H-NMR-Spektren lieferten die aufgrund der Charakterisierung der reinen Substanzen
(vgl. 6.4.1, 6.4.5, 6.6.2) erwarteten Signale. Tabelle 4 dokumentiert die Abweichungen der
beobachteten chemischen Verschiebungen im 1H-NMR-Shifts von der Lage der chemischen
Verschiebungen der reinen Substanzen. Hydrolyse des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)wurde im Zeitraum der Experimentsdurchführung im 'H-NMR-Spektrum nicht beobachtet.
Die Lösung von 16 mit Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -
hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) opaleszierte leicht, doch klarte sie sich bei Zugabevon 0,1 mg KCN sofort auf. Die 1 H-NMR-Signale des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-
261
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17), die zuerst schmal
waren, verbreiterten sich auffallend. Bei den Signalen des Gastes verhielt es sich genau
umgekehrt.
Das Exitationsmaximum beider Probenlösungen lag bei ca. 323 nm. Während das
Emissionsmaximum in der Lösung mit 24 bei 435,9 ± 2,7 nm lag und eine Schulter bei 409 ±
2 nm zeigte, befand sich in der Lösung von 17 das Emissionsmaximum bei 434,0 ± 0,8 nm mit
einer Schulter bei 410 ± 2 nm. Die Fehlergrenze der Lage der Maxima wurde graphisch aus
den Lumineszenzspektren abgeschätzt.
Tabelle 3 (Allgemeiner Teil) zeigt die Ergebnisse der Spektrenanalyse in der Übersicht.
B. Konzentrationsreihe der Dicyanocorrine 17 & 24
2,2 mg Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und 5,0 mg Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N",,N,"-,N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17)wurden in je 1,4 ml Deuteriumoxid gelöst, auf ca. 2,8 mM eingestellt, mit je ca. 10 mg 1,N6-
Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) versetzt, während 15 Minuten Ultraschall ausgesetzt (50kHz, Wasserbad 23 °C), zentrifugiert (4'000 UpM, 5 min) und von den partikelfreienLösungen die Fluoreszenz-, die UV/vis- sowie die 'H-NMR-Spektren aufgenommen.Anschliessend verdünnte man die Proben dreimal je auf die Hälfte und wiederholte die Sättigungmit anschliessender spektroskopischer Untersuchung, abgesehen vom 'H-NMR-Spektrum,welches nur für die letzte Verdünnung einer Konzentrationsreihe wieder gemessen wurde.
UV/vis-Spektren
Die 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat-Konzentrationen wurden analog der unter 6.6.2aa
beschriebenen Methode aus den UV/vis-Spektren bei 265 nm berechnet. Tabelle 17 fasst die
Absorptionswerte der Probenlösung bei 578 bzw. 580 nm sowie die Konzentrationen an 16
zusammen (Küvettendicke dx= 0,100 cm).
Tabelle 17 i
1
(
Auswertung der UV/vis-Spektren der mit
,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)»sättigten Corrinlösunaen in D?0
I 24 [16]/mM abs 576 nm
0,210 2,408
0,198 1,263
0,271 0,820
0,285 0,604
0,265 0,413
1 7 [16]/mM abs 580 nm
1,504 2,431
1,234 1,630
0,900 0,824
0,372 0,431
262
Lumineszenz
Die Lumineszenzspektren wiesen jeweils zwei Emissionsmaxima auf, eines bei cirka 427 nm,
das zweite bei 408,5 ± 0,5 nm (Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24)) bzw. 410,5
± 0,3 nm (Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"-,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat (17)) (Abbildung 102 und 103). Die Fehlergrenzen wurden wiederum
aus den Spektren graphisch abgeschätzt.
Der Verlauf der Luminszenzintensitäten als Funktion der Corrinkonzentration war identisch
mit jenem bei Verdünnung von Corrinlösungen mit an 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat(16) gesättigtem Deuteriumoxid (vgl. 6.8.1.6). Abbildung 52 (Allg. Teil) stellt die Total¬
lumineszenzintensitäten der Lösungen als Funktion der Corrinkonzentrationen graphisch dar.
Dem innerhalb der Fehlergrenzen identischen Verlauf der Lumineszenzwerte (Abbildung 52)standen deutlich erhöhte Konzentrationen an 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)
gegenüber (Abbildung 51). Die Lumineszenz des durch das Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) zusätzlich
gelösten 1 ,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat war somit praktisch vollständig gequencht.
H-NMR-Spektroskopie
Die 1 H-NMR-Spektren der Lösungen aus Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und
1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) waren betreffend Lage und Integralintensität bei
allen untersuchten Konzentrationen die Summe der Signale der Spektren der reinen Substanzen
(vgl. z.B. Abbildung 104 sowie Kapitel 6.4.1 & 6.6.2).
Beim Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'-carboxylat) (17) hingegen war neben minimalen Signalshifts (Tabelle 4) sowohl des
gesättigt mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) in Deuteriumoxid, Exitation: 320'nm,
Emissionsscan 350-500 nm
264
EQ.O.
LO
COOK
KOOC KOOC
Abbildung 104: Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24), 1,32 mM, in
Deuteriumoxid, gesättigt mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16), 300,13 MHz, 300 K,
Vergleichspektren der reinen Substanzen Abbildung 20 (24) und 6.6.2 (16)
265
6.8.2 UV/vis-Experimente
a) mit Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat
2,1 mg Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobynnat (24) wurden in 0,7 ml Deuteriumoxid
gelöst und mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigt indem die Lösung mit ca. 10
mg 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) versetzt und während 15 Minuten Ultraschall
der Frequenz 50 kHz ausgesetzt wurde. Von der nach Zentrifugation (4'000 UpM, 5 min)
partikelfreien Lösung über dem am Gefässboden niedergeschlagenen Festkörper wurde das 'H-
NMR- sowie das UV/vis -Spektrum aufgenommen.
Die Lösung wurde nach der Spektroskopie wieder mit dem Festkörper vereinigt, einige Zehntel
eines Milliliters Deutenumoxid zugegeben und die Sättigung sowie die spektroskopische
Analyse wiederholt Die Stammlösung wurde derart insgesamt dreimal verdünnt
Die 'H-NMR-Spektren der von suspendiertem Material durch Zentrifugation befreiten
Lösungen waren jeweils identisch mit der Summe der Spektren der reinen
Vergleichssubstanzen
In Tabelle 18 ist das gemäss 6 6.2b aus den 'H-NMR-Spektren berechnete Verhältnis der
Konzentrationen des Cobynnates 24 zum 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat dargestellt
Ebenso enthält Tabelle 18 den aus den UV/vis-Spektren gemäss der unter 6 6 2 beschriebenen
Vorgehensweise bestimmten Besetzungsgrad der Corrine
Tabelle 18 Assoziationsgrad in Prozent der Corrinkonzentration von
Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) in wässriger Lösung,bestimmt mit 'H-NMR- und UV/vis-Spektroskopie
[24]/mM Cobyrinat e-Adotosylat
(24-16)
aemäss'H-NMRb
Besetzungsgrad
gemäss
UV/vis-SDektruma
2,42 1,00 . 0,67 0
1,89 - 6
1,54 1,00 1,00 5
1,22 - 1 1
a berechnet gemäss der unter 6 6.2aa beschriebenen Methode; b
berechnet gemäss der unter 6 6 2b beschriebenen Methode
266
b) mit Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-
(n-decyl-10'-carboxylat)
Mit 4,2 mg Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-
decyl-10'-carboxylat) (17) wurde eine dem Experiment 6.8.2a analoge Experimentreihe
durchgeführt.
Die Ergebnisse der ebenfalls analog zu a) erfolgten Auswertung sind in Tabelle 19
zusammengestellt.
Tabelle 19 Assoziationsgrad von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cob-amido-N,N-,N',,N-,,,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-lO'-carboxylat) (17) mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat(16) in wässriger Lösung, bestimmt mit 'H-NMR- und
UV/vis-Spektroskopie
[17]/mM Cobamidat:e-Adotosylat
(17:16)
aemäss'H-NMRb
Besetzungsgrad
gemäss
UV/vis-Spektrum8
2,10 1,12 : 1,00 43
1,70 - 135
1,32 1,00 : 1,82 125
1,11 150
a: berechnet gemäss der unter 6.6.2aa beschriebenen Methode; b:
berechnet gemäss der unter 6.6.2b beschriebenen Methode
267
6.9 Reduktionskinetik von Co(ll)-cobyrinat und Co(ll)-cobamidoN,N',N",N";N"';N""',N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)
Herstellung von Co(ll)-cobyrinat und Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",
N"--,N'"",N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat)
Ausgehend von den Dicyanoverbindungen 17 und 24 wurden die Co(ll)-corrine
Co(ll)-cobyrinat und Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N"'",N -hepta-(n-decyl-lO'-carboxylat) wie folgt synthetisiert:
Hexakalium-Co(ll)-cobyrinat
In einer Glove-box wurden 20,0 mg (1,59-10-5 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat58 (24) in 10 ml Methanol gelöst, mit 10,4 mg Pt02 sowie 15 pl
Essigsäure versetzt und ein Wasserstoffgasballon aufgesetzt. Nachdem gemäss UV/vis-
Spektroskopie innerhalb 3,5 Stunden das Edukt quantitativ zu Co(ll)-cobyrinatreduziert war, filtrierte man die Lösung, trocknete am HV und löste den festen
Rückstand wieder in 10 ml Methanol.
UV/Vis (CH3OH, c= 2,82-10-* M)
465 ( 7'160), 398 ( 5'180), sh 358 ( 6'200), sh
314 (17'560), 266 ( 13'960)
Hexakalium-Co(ll)-cobamido- N, N', N", N"\ N"", N'"",N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat)
Analog 24 wurden 55,5 mg (2,20-10"5 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)59 (17) mit
41,0 mg Pt02, 10 pl Essigsäure in 4 ml Methanol innerhalb 1,5 Stunden in Wasser¬
stoffatmosphäre zu Hexakalium-Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N'-,N ,N -
hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) reduziert (UV/vis-spektroskopische Kontrolle),die Lösung filtriert, am HV getrocknet und der Rückstand in 10 ml Methanol gelöst.
UV/Vis (CH3OH, c= 1,80-10-* M)
469 ( 7'310), 403 ( 4'510),sh 365 ( 6'330), sh
315 ( 17'710), 267 ( 13'200)
Die UV/vis-Spektren bei Reaktionsende zeigten keine Absorptionsmaxima oder
Schultern oberhalb 469 nm. Die erhaltenen methanolischen Lösungen der Co(ll)-corrine wurden als Stammlösungen für die nachfolgend beschriebenen
Alkylierungsexperimente eingesetzt.
Material des BeschreibungsansatzesMaterial des Beschreibungsansatzes
Zur Bestimmung der Reduktionskinetik wurde von einer 0,625 ml-Portion der
methanolischen Co(ll)-cobyrinat-Stammlösung am Rotationsverdampfer das
Lösungsmittel abgezogen und der braune Rückstand zwei Stunden am HV getrocknet.Dieser wurde anschliessend in 2,0 ml 1M Phosphatpuffer, pH 9, gelöst, in die
Messapparatur gemäss Abbildung 56 pipettiert, in den oberen Teil der Messapparatur11,4 mg (3,02-10'4M) Natriumborhydrid eingefüllt, die Apparatur unter
Verwendung von Schliffett gut verschlossen, der Schliff durch Umwickeln mit
Parafilm gesichert und die Apparatur der Glove-box entnommen.
Die Apparatur wurde in die Küvettenhalterung eines UV/vis-Spektrophotometers, das
auf 23,0 ± 0,2 °C thermostatisiert war, verbracht und nach einigen Minuten der
Temperaturangleichung ein Übersichtsspektrum der Probe gefahren:
UV/Vis (Hexanatrium-Co(ll)-cobyrinat, Phosphatpuffer, c= 1,80-10-* M)
468 ( 7-390), 403 ( 4'760), Sh 360 ( 6'200), Sh
316 ( 17'500), 267 ( 13'200)
Die Apparatur wurde dann dem Probenraum wieder entnommen, mit der Co(ll)-cobyrinat Lösung das Natriumborhydrid aus dem oberen, abgebogenen Kolben gespültund die optische Dichte der Lösung bei X= 388 nm als Zeitreihe gemessen.
Die Auswertung der experimentellen Daten (Methodik vgl. nächsten Abschnitt) ergabfür die Regression über ca. fünf Halbwertzeiten einen Wert von y=-0,019+1,706xmit R2= 0,998 aus dem sich k zu k= 11,34 min-1 M-1 errechnete.
Variierte man den Auswertungszeitraum um eine approximative Halbwertzeit
(Verlängerung bzw. Verkürzung) so änderte sich k ca. ± 1%.
Analog dem ersten Experiment (Cofllj-cobyrinat/NaBH^Phosphatpuffer) wurden
0,625 ml der methanolischen Stammlösung von Hexakalium-Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) am Hochvakuum
getrocknet und nach Lösen in 2,5 ml 1M Phosphatpuffer, pH 9 in die Apparatur von
Abbildung 56 (Allgemeiner Teil) transferiert. In das Reservoir füllte man 15,8 mg
(4,16.10"4 mol) Natriumborhydrid.Die Eduktlösung wurde vor Beginn der Reaktion einige Minuten im auf 23 °C
thermostatisierten UV/vis-Spektrophotometer belassen bevor das UV/vis-Spektrumgemessen wurde.
Die Reaktion wurde analog dem Experiment 1 initiiert und die Absorption bei 388 nm
verfolgt.Die Auswertung der experimentellen Daten (Methodik vgl. nächsten Abschnitt) ergabmit dem Datensatz der ersten vier Halbwertzeiten ein k von k= 35,6 min-'M-'.
Variierte man den Auswertungszeitraum um eine approximative Halbwertzeit
(Verlängerung bzw. Verkürzung) so änderte sich k um ca. ± 5%.
269
Auch hier zeigte sich, dass während der Experimentsdauer anscheinend keine
Rückoxidation stattfindet. Das UV/vis-Spektrum des Produktes wies nämlich selbst
eine Stunde nach Konstanz des Absorptionswertes bei 388 während einiger Minuten
Das Experiment 2 wurde noch zweimal wiederholt (3. Experiment: 0,625 ml
Stammlösung, 2,5 ml Phosphatpuffer, 30,7 mg (8,1 MO4 mol) Natriumborhydrid;4. Experiment: 0,625 ml Stammlösung, 2,5 ml Phosphatpuffer, 15,0 mg (4,01 -10-4
mol) Natriumborhydrid).Die den ersten beiden Experimenten analog ausgewerteten experimentellen Daten der
Absorption bei 388 nm lieferte für das 4. Experiment k= 36,4 min-'M'1. Aus dem 3.
Experiment konnte k nur zu grösser als 21,4 min'M'1 abgeschätzt werden, da zu spätmit der Datenakkumulation begonnen wurde.
5. Experiment (Co(ll)-cobyrinat/NaBH4/Methanol)
Es wurde wiederum eine 0,625 ml-Portion aus der Co(ll)-cobyrinat Stammlösungabpipettiert, direkt mit 1,875 ml Methanol verdünnt in die Apparatur gemäss
Abbildung 56 gefüllt und das obere Reservoir mit 29,0 mg Natriumborhydrid beladen.
Nach dem Start der Reaktion analog den übrigen Reduktionsexperimenten wurde
wiederum die Absorption bei 388 nm beobachtet. Sie war lineare Funktion der Zeit mit
einer Steigung von 360 min'1.
Auch bei diesem Experiment war die Kinetikapparatur in der beschriebenen Form
über den Zeitraum der Kinetikmessungen anscheinend genügend dicht; selbst nach
einigen Stunden blieb das UV/vis-Spektrum der Co(l)-Lösungen der
Reduktionsexperimente unverändert:
UV/Vis (Pentanatrium-Co(l)-cobyrinat, CH3OH, c= 2,82-10-* M)
Tabelle 5 zeigt die isobestischen Punkte der untersuchten Reaktionen. Die
Wellenlängen der maximalen Differenzen der Extinktionskoeffizienten zwischen Edukt
und Produkt sind in Tabelle 6 aufgeführt (Tabellen im Allgemeinen Teil).
270
Zur Berechnung der Geschwindigkeitskonstanten wurde, da angesichts der
Reaktionsgeschwindigkeiten nur eine Wellenlänge gemessen werden konnte, die
Wellenlänge absolut grösster Differenz der Extinktionskoeffizienten, 388 nme°,gewählt. Das Zeitintervall zwischen zwei Messungen betrug 1 sec. Sekundäre Faktoren
wie die starke Blasenentwicklung bei der Reduktion der Co(ll)-corrine streuen
statistisch und störten aufgrund der grossen Anzahl Messwerte nicht.
Die Berechnung der Geschwindigkeitskonstante k erfolgte auf der Basis des Modells
einer Reaktion pseudo-erster Ordnung. Der natürliche Logarhythmus des Quotienten
von Eduktkonzentration und Gesamtcorrinkonzentration entspricht dabei k\ der
Geschwindigkeitskonstanten pseudo-1.Ordnung, multipliziert mit der Zeit und ist'überdie Differenzen der momentanen optischen Dichte mit den optischen Dichten bei t= 0
und t= ~ zugänglich.
[Edukt]t-t-k'x t = In ( )
[Edukt]'-0
abst.o- abst-k'x t = In (1+ l 1)
abst-abst.°o
Als Werte für t= 0 und t= ~ wurden die experimentellen Daten vor Beginn und nach
Abschluss der Reaktion eingesetzt. Aus den derart erhaltenen Datensatz wurden für die
ersten vier approximativen Halbwertzeiten x1/2 lineare Regressionen berechnet.
Abbildung 105: Reduktionskinetik von Co(ll)-cobyrinat mit Natriumborhydrid in
Phosphatpuffer, 1M, pH 9; [Co(ll)-cobyrinat]= 1,08 mM, T= 23,0±0,2 °C, dx=
0,100 cm
(a) UV/vis-Spektren von Produkt und Edukt
60 Im Falle des Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat)
271
(b) optische Dichte bei 388 nm
4 5 6
Zeit / min
(c) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte bei 388 nm gemäss Ansatz
pseudo-erster-Ordnung
O
o o
00 orao/o oo
0° o ^OooQo <fc
4 5
Zeit / min
10
272
Abbildung 106: Reduktionskinetik von Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N
-hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) mit Natriumborhydrid in Phosphatpuffer, 1M, pH9; [Co(ll)-cobyrinat]= 0,91 mM, T= 23,0 ± 0,2 °C, dx= 0,100 cm
(a)
(b)
UV/vis-Spektren von Produkt und Edukt;
optische Dichte bei 388 nm
(c) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte bei 390 nm gemäss Ansatz
pseudo-erster-Ordnung
4Zeit / min
273
6.10 Alkylierungskinetik von in situ hergestelltem
Co(l)-cobyrinat und Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)
In situ Herstellung der Co(l)-corrine und Durchführung der Alkyl¬
ierungskinetik
Experiment 1 a
In einer Glove-box wurden 0,625 ml der (22,0 mM) Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-Stammlösung61 mit
1,67 ml Methanol verdünnt in den unteren Birnkolben der Kinetikapparatur(Abbildung 56) eingefüllt und durch Zugabe von 39,4 mg (1,04 mmol)
Natriumborhydrid unter heftiger Blasenentwicklung die nun 6,0 mM Lösung des
Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) zu
duziert62. Nach dem Abklingen der Gasentwicklung wurde die Apparatur mit dem
abgebogenen Kolben, der 4,60 mg 5'-0-Tosyladenosin63 (15) als Alkylierungsmittelenthielt, verschlossen, der Schliff durch Umwickeln mit Parafilm gesichert,anschliessend die Apparatur der Glove-Box entnommen und die Lösung durch ihr
UV/vis-Spektrum im Bereich von 190 bis 850 nm charakterisiert.
Zur Initialisierung der Umsetzung des Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -
hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) mit dem festen S'-O-Tosyladenosin (15) spülteman durch Umschwenken das Alkylierungsmittel 15 mit der Corrinlösung aus dem
oberen Teil der Kinetikapparatur und rührte während 15 sec mit dem Magnetrührerbevor die UV-Küvette mit der Lösung gefüllt und mit der Messung begonnen wurde. Zu
Beginn der Messung war das 5'-0-Tosyladenosin (15) bereits gelöst.
Der Reaktionsforlschritt wurde während 90 Minuten anhand der Absorption bei einer
fixen Wellenlänge, derjenigen des Absorptionsmaximums des jeweiligen Co(l)-cobamido-N,N',N",N'", N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (388 nm)dokumentiert und anschliessend das Produkt aufgearbeitet (siehe unten). Nach 6, 17
und 90 Minuten wurde nochmals ein vollständiges UV/vis-Spektrum aufgenommen(Abbildung 57). Die Küvettenhalterung des UV/vis-Spektrophotometers wurde über
die ganze Experimentdauer auf 23,0 ± 0,5 °C thermostatisiert.
Das UV/vis-Spektrum bei Abschluss der Alkylierungskinetik war identisch mit dem
UV/vis-Spektrum des Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'", N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) aus dem Beschreibungsansatz.
61 Material aus 7.9
62 Farbumschlag nach grün63 Gewaschen analog Assoziationsexperimenten
274
Experiment 1 b
Ca. 0,5 ml der (15,9 mM) Co(ll)-cobynnat-Stammlösung64 wurden in einer Glove-
box mit 3,1 ml Methanol auf 3,6 ml einer 2,1 mM Lösung verdünnt und mit 40,6 mg
(1,08 mmol) Natriumborhydrid in der Kinetikapparatur (Abbildung 56) reduziert
Nach Abklingen der zunächst heftigen Gasentwicklung (drei Minuten) wurde der
Schliff gefettet, der mit 21,5 mg (0,051 mmol) 5'-0-Tosyladenosm (15) gefüllteobere Kolben aufgesetzt und mit Parafilm umwickelt
Das Eduktspektrum wurde in dem auf 23,0 ± 0,5 °C thermostatisierten
Spektrophotometer gemessen und nach Vermischung der Lösung mit dem
Alkylierungsmittel, welches sofort vollständig in Lösung ging, mit der
Absorptionsmessung bei 384 nm begonnen Nach 3, 9, 21, 95, 138 und 987 Minuten
wurde nochmals ein vollständiges UV/vis-Spektrum aufgenommen (Abbildung 107)Nach 1000 Minuten brach man die Messung ab und wertete aus. Dieser Ansatz wurde
aufgrund der geringen absoluten Substanzmenge nicht aufgearbeitet
Experiment 2 a
Ca 0,650 ml Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-Stammlösung65 wurden in der Glove-box am Hochvakuum bei
Umgebungstemperatur während drei Stunden getrocknet, der Ruckstand in 2,2 ml
Phosphatpuffer (0,1 M, pH 9) aufgenommen, mit 39,4 mg Natriumborhydrid(1,04-103 mol) reduziert und mit 4,60 mg (1,09 10 5 mol) 5'-0-Tosyladenosin(15) im auf 28,0 ± 0,5 °C thermostatisierten Spektrophotometer die Absorption bei
388 nm beobachtet Nach 13, 27, 41, 54, 69 und 150 Minuten wurde nochmals ein
vollständiges UV/vis-Spektrum aufgenommen (Abbildung 108)Nach drei Stunden wurde aufgearbeitet und das Produkt 18 1H-NMR-spektroskopischidentifiziert
Die übrigen beiden Kinetikmessungen wurden analog mit sehr ähnlichen
Konzentrationen und absoluten Substanzmengen durchgeführt
Experiment 2 b
0,625 ml Co(ll)-cobynnat in Methanol (1,103-10'6 mol) wurden in einer Glove-
box am Hochvakuum während 4 Stunden bei Umgebungstemperatur getrocknet Der
braune Lack wurde in 2,0 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 9) aufgenommen und mit
9,2 mg (2,43 10'4 mol) Natriumborhydrid reduziert Sobald die heftige
Blasenentwicklung nachhess wurde die Kinetikapparatur mit einem 4,03 mg
(9,56 10-6 mol) 5'-Tosyladenosin (15) enthaltenden abgebogenen, am Schliff
gefetteten Birnkolben verschlossen Den Schliff umwickelte man noch mit Parafilm
Die Apparatur wurde in ein auf 23,0 ± 0,5 °C thermostatisiertes Spektrophotometerverbracht und das UV/vis-Spektrum der Lösung aufgenommen Die Reaktion wurde
sodann initialisiert, indem man mit der Lösung das Reservoir rasch durchspülteDie Absorption bei 384 nm wurde beobachtet, nach 3, 17, 68, 132, 225 und 3617
Minuten zudem ein vollständiges UV/vis-Spektrum aufgenommen (Abbildung 109)Nach sechs Stunden brach man die Messung ab. Dieser Ansatz wurde sodann analog dem
Beschreibungsansatz aufgearbeitet
64 Material aus 7 9
65 Material aus 7 9
275
Experiment 3
In einer Glove-box wurde ca. 0,2 ml Co(ll)-cobyrinat (Material aus 6.9) während
vier Stunden am Hochvakuum bei Raumtemperatur getrocknet und der dunkelbraune
Rückstandin 5,0 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 9) aufgenommen. Die Co(ll)-cobyrinat-Lösung (1,0 mM gemäss UV/vis-Spektrum) wurde mit ca. 25 mg 5'-0-
Tosyladenosin (15) versetzt, die Probe 15 Minuten lang mit Ultraschall beschallt,
zentrifugiert und die klare Lösung abpipettiert, um sie in die Kinetikapparatur zu
füllen.
In das obere Reservoir gab man 4,6 mg (1,22-10 4 mol) Natriumborhydrid und
verschloss die Apparatur, die dann der Box entnommen wurde, mit Schliffe« und
Parafilm.
Nach der Charakterisierung des Eduktes durch ein UV/vis-Spektrum im auf 23,0 ±
0,5 °C thermostatisierten Spektrophotometer wurde das Natriumborhydrid durch
einmaliges Schwenken der Glasgefässes gelöst und sofort mit der Messung der
Absorption bei 388 nm begonnen, da die sofort einsetzende heftige Blasenentwicklungeine mechanische Durchmischung erübrigte.Nach sechs Stunden wurde das Gefäss geöffnet und das Produkt aufgearbeitet. Das 'H-
NMR-Spektrum in Deuteromethanol wurde gemessen.
Ein zweites Experiment führte man analog mit den gleichen Substanzmengen durch.
Experiment 4
In einer Glove-box wurde 0,650 ml der Co(ll)-cobyrinat-Stammlösung66 während
vier Stunden am Hochvakuum bei Raumtemperatur getrocknet, der Rückstand in 2,00
ml Phosphatpuffer (pH 9, 1 M) aufgenommen, in die Kinetikapparatur gemäss
Abbildung 56 eingefüllt und mit 54,8 mg (1,45 mmol) Natriumborhydrid zu Co(l)-cobyrinat reduziert. Nach ca. einer Minute, nachdem die Gasentwicklung nur noch sehr
schwach war, wurde die Apparatur mit dem abgebogenen Birnkolben, in dem sich 17,0
mg (0,056 mmol) 5'-Chloro-5'-desoxyadenosin befanden, verschlossen. Der Schliff
wurde nochmals mit Parafilm umwickelt.
Die Eduktlösung wurde durch sein UV/vis-Spektrum charakterisiert und die im auf 18
± 2 °C thermostatisierten Spektrophotometer nach 30 Sekunden langer
Durchmischung der vorgelegten Lösung mit dem 5'-Chloro-5'-desoxyadenosin die
Absorption bei 388 nm als Zeitreihe gemessen. Nach 6, 15, 22, 29, 45 und 180
Minuten wurde zudem nochmals ein vollständiges UV/vis-Spektrum aufgenommen
(Abbildung 110).Nachdem sich die Absorption nicht mehr änderte wurde noch ein letztes vollständiges
UV/vis-Spektrum aufgenommen und sofort anschliessend der Ansatz wie nachfolgendbeschrieben aufgearbeitet.
Experiment 5
In einer Glove-box wurden 0,625 ml einer 2,64 mM Lösung von Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) in Methanol während
vier Stunden am Hochvakuum bei Raumtemperatur getrocknet, mit 2,00 ml
Phosphatpuffer (pH 9, 1 M) aufgenommen und in die Kinetikapparatur gefüllt
66 6.9
276
(Endkonzentration gemäss UV/vis-Spektrum 0,72 mM). Nach Zugabe von 44,2 mg
(1.16.10-3 mol) Natriumborhydrid wurde heftige Blasenentwicklung beobachtet, die
nach zwei bis drei Minuten weitestgehend abgeklungen war und das Aufsetzen des mit
21,7 mg (1.16.10-4 mol) Methyltosylat gefüllten Reservoirs ermöglichte.Der Schliff wurde noch mit Parafilm gesichert und die Apparatur der Glove-box zur
sofortigen Messung entnommen.
Nach Aufnahme des UV/vis-Spektrums im auf 23,0 ± 0,5 °C thermostatisierten
Spektrophotometer wurde die Probenlösung in das Reservoir gespült und das
Alkylierungsmittel augenblicklich gelöst. Die Absorption bei 388 nm wurde
beobachtet. Nach 20 Minuten wurde zudem nochmals ein vollständiges UV/vis-
Spektrum aufgenommen (Abbildung 111).Ob das Methyltosylat sich bei Beginn der Reaktion homogen in Lösung befand Hess sich
aufgrund der immer noch leichten Blasenentwicklung und dem Übergang des
Methyltosylates in die flüssige Phase nicht abschätzen.
Die Reaktion war auf jeden Fall so schnell, dass zum Zeitpunkt der Erfassung des
ersten Messpunktes nach der Vermischung die Methylierung schon weitestgehendabgeschlossen war. Es wurde nur noch die Ervdphase der Alkylierung beobachtet, deren
Geschwindigkeitskonstante, wie sich aus dem grossen Achsenabschnitt der Auswertungder Daten gemäss einem Ansatz pseudo-erster Ordnung ergibt, wesentlich geringerwar als die Geschwindigkeitskonstante zu Beginn der Alkylierung.Nach fünf Stunden wurde das Gefäss geöffnet und zur Aufarbeitung des Produktes die
Lösung am Rotationsverdampfer lichtgeschützt getrocknet. Nachdem der braune
Rückstand in Phosphatpufler (1M, pH 4,5) aufgenommen worden war wurde er wie
weiter unten beschrieben aufgearbeitet und zum Schluss mit 'H-NMR Spektroskopien.
In einem zweiten Experiment wurden in einer Glove-box 0,625 ml derselben Co(ll)-
cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-Stammlös-ung analog getrocknet, in Phosphatpuffer (pH 9, 1 M) aufgenommen und in die
Kintikapparatur gefüllt, jedoch mit 8,3 mg (1,28-10-3 mol) Natriumborhydrid und
9,8 mg (5,26-10'5 mol) Methyltosylat umgesetzt. Ansonsten führte man diese zweite
Messung mit anschliessender Aufarbeitung völlig analog durch.
Experiment 6
Man trocknete in einer Glove-box 0,625 ml der 2,64 mM Stammlösung von Co(lt)-
cobamido-N,N',N",N"',N"",N"'",N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) in Methanol
aus Experiment 5 während vier Stunden am Hochvakuum, nahm den braunen Rückstand
in Phosphatpuffer (0,1 M, pH 9) auf, pipettierte ihn in die Kinetikapparatur und
reduzierte mit 8,4 mg (1.30-10"3 mol) Natriumborhydrid.Nach Beendigung der Blasenentwicklung (zwei bis drei Minuten) verschloss man die
Apparatur mit dem Reservoir, in dem sich 2,40 mg (1,29-10"B mol) Methyltosylatbefanden, und sicherte den gefetteten Schliff zusätzlich mit Parafilm.
Das UV/vis-Spektrum der Edukt-Probenlösung wurde im auf 23,0 ± 0,5 °C
thermostatisierten Spektrophotometer gemessen und die Reaktion durch möglichstrasche Durchmischung der vorgelegten Lösung mit dem Methyltosylat eingeleitet. Man
beobachtete die Absorption bei 388 nm. Das Methyltosylat wurde anscheinend sofort
vollständig gelöst.Auch in diesem Experiment war die Reaktion so schnell, dass zum Zeitpunkt der
Erfassung des ersten Messpunktes nach der Vermischung die Methylierung schon
weitestgehend abgeschlossen war und nur noch die Endphase der Alkylierung beobachtet
wurde. Analog wurde ein beträchtlicher Achsenabschnitt der Auswertung der Daten
gemäss einem Ansatz pseudo-erster Ordnung erhalten (Abbildung 112).
Die Reaktionslösung konnte bereits nach einer Stunde aufgearbeitet werden.
277
Aufarbeitung und Isolation der Alkylierungsprodukte
Tabelle 8 zeigt die isobestischen Punkte der untersuchten Reaktionen. Die
Wellenlängen der maximalen Differenzen der Extinktionskoeffizienten zwischen Edukt
und Produkt sind in Tabelle 9 aufgeführt (Tabellen im Allgemeinen Teil).
Überschüssiges NaBH4 wurde mit 2,0 ml Phosphatpuffer, 1M, pH 4,5, hydrolysiertund im Falle der Reaktionsführung in Methanol das organische Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer abgezogen. Die verbleibende Lösung wurde mit kristallinem
KHC03 gesättigt und solange durch 3 ml XAD geleitet bis das Eluat vollständig entfärbt
war (ca. 2 bis 3 Durchläufe). Man wusch mit 10 ml gesättigtem KHCO3 in Wasser, 50
ml H20 und eluierte die Substanz vollständig mit 30 ml MeOH.
Das Alkylierungsprodukt wurde mit 8,0 ml Aceton aus 0,05 ml MeOH gefällt. Nach
fünfminütiger Zentrifugation bei 4000 Upm konnte die farblose Mutterlauge
abpipettiert werden. Der Niederschlag wurde mit 8 ml Aceton gewaschen und analog
abzentrifugiert. Man wiederholte die Fällung dreimal. Der Niederschlag erfolgte bei
der dritten Fällung oft nicht mehr quantitativ und hinterliess eine braune Mutterlauge.Das Produkt wurde in 0,5 ml Deuteromethanol gelöst und mit 'H-NMR (300 MHz)
Spektroskopien.Sämtliche 'H-NMR-Spektren wiesen die Signale der alkylierten Corrine entsprechendden Lagen in den Beschreibungsansätzen auf. Zusätzlich erschienen die Signale des
jeweiligen Alkylierungsmittels zu verschiedenen Anteilen, maximal jedoch in zwei
Äquivalenten.Die UV/vis-Spektren waren identisch mit den Spektren der Substanzen aus den
Beschreibungsansätzen.
Auswertung
Zur Berechnung der Geschwindigkeitskonstanten wurde, da angesichts der Reaktions¬
geschwindigkeiten nur eine Wellenlänge gemessen werden konnte, analog den
Experimenten zur Reduktionskinetik der Co(ll)- zu Co(l)-corrinen, die Wellenlängeabsolut grösster Differenz der Extinktionskoeffizienten, 388 nm67, gewählt.Nur jene Datensätze wurden ausgewertet, die nicht von einer vor zehn Minuten nach
Beginn des Experimentes einsetzten Trübung oder von Reoxidation68 begleitet waren.
Halbwertzeiten wurden als halbe Differenzen zwischen den Extremwerten der UV/vis-
Spektren vor und nach der Reaktion abgeschätzt. Ausgewertet wurden die Datensätze
für die ersten 4,5 approximativen Halbwertzeiten t1/2 bei Methylierungen und eine
bis sechs approximative Halbwertzeiten bei Adenosylierungen.
67 Im Falle des Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat)68 Beim KCN-Test nach Stabilisierung des UV/vis-Spektrums erscheint ein Maximum
bei 367 nm (Heptakalium-dicyano-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-
decyi-lO'-carboxylat) (17) oder -cobyrinat (24)).
278
Die Messintervalle für die in der Regel über 100 Datenpunkte wurden der
Reaktionsgeschwindigkeit angepasst. Zu Reaktionsbeginn betrug das Zeitintervall
zwischen zwei Messungen jeweils 1 sec.
Die Berechnung der Geschwindigkeitskonstante k erfolgte auf der Basis des Modells
einer Reaktion pseudo-erster Ordnung analog der Bestimmung der Geschwindigkeits¬konstanten der Reduktion (vgl. 6.9).Die Berechnung der Geschwindigkeitskonstante k erfolgte auf der Basis des Modells
einer Reaktion pseudo-erster Ordnung. Analog der Auswertung der Reduktionskinetik
entsprach der natürliche Logarhythmus des Quotienten von Eduktkonzentration und
Gesamtcorrinkonzentration k', der Geschwindigkeitskonstanten pseudo-1.Ordnung,
multipliziert mit der Zeit und ist über die Differenzen der momentanen optischenDichte mit den optischen Dichten bei t= 0 und t= °° zugänglich.
[Edukt]1-* I
-k'x t = In ( ) = In (—)
[Edukt]1-0 b
abs«)- abst-kx t = In (1+ I 1)
abst-abst^o
Als Werte für t= 0 und t= °° wurden die experimentellen Daten vor Beginn und nach
Abschluss der Reaktion eingesetzt.
Die Korrelationen der linearen Regressionen betrugen bei Wirt-Gast-Alkylierungenmindestens 0,953; bei Adenosylierungen des Pentanatrium-Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) in Wasser mindestens
0,976; bei den sonstigen Alkylierungen mindestens 0,992. Der Linearitätsbereich
erstreckte sich mit Ausnahme der Methylierung in Methanol und Posphatpuffer des
Cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat), bei denen
aufgrund der hohen Alkylierungsgeschwindigkeit nur die Endphase der Alkylierunggemessen werden konnte, auf praktisch den gesamten Reaktionsverlauf.
Die Fehlergrenzen ergaben sich durch Vergleich der ausgewählen Regressionsgeradenmit jenen, welche aufgrund 1,5 x längerer Stichprobenzeiten berechnet wurden.
Bei den extrem schnellen Methylierungen wird die Geschwindigkeitskonstante aus dem
Umsatzanteil und der Zeit bis zum erstem Messwert approximiert. Die Angabe eines
Regressionskoeffizienten ist dementsprechend nicht möglich.
279
Abbildung 107: Experiment 1b: Alkylierungskinetik von Co(l)-cobynnat mit S'-
O-Tosyladenosin (15) in Methanol
(a) Overlay der UV/vis-Scans 350-750 nm bei t= 0, 3, 9, 21, 95, 138 und
987 mm, dx= 0,100 cm
abs
1 o
05
optische Dichte bei 388 nm
2 8,
2 6.
2 4,
1
3
2 2,
2.
1 8.
1 6.
O
o
1 4.
1 2.
8.
6,
oo
4.
1500
Zelt / min
2000
Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte gemäss Ansatz pseudo-erster-Ordnung
500 1000 1500Zeit / min
2000 2500 3000
280
Abbildung 108: Experiment 2a: Alkylierungskinetik von Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) mit 5'-0-Tosyladenosin (15)in Phosphatpuffer, pH 9
(a) Overlay der UV/vis-Spektren bei t= 0, 13, 27, 41, 54, 69, 100 Minuten
(b) optische Dichte bei 388 nm
-T-
60 80 100
Zelt / min120 140 160
c) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte gemäss Ansatz pseudo-erster-Ordnung
40 60 80 100 120 140 160Zeit / mm
281
Abbildung 109: Experiment 2b: Alkylierungskinetik von Co(l)-cobyrinat mit S'-
O-Tosyladenosin (15) in Phosphatpuffer, 1M, pH 9
(a) Overlay der UV/vis-Spektren bei t= 0, 13, 17, 68, 132, 225, 317
Minuten
(b) optische Dichte bei 388 nm
(c) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte gemäss Ansatz pseudo-erster-Ordnung
200'
3Ö0Zert/min
4Ö0' '""ilo
282
Abbildung 110: Experiment 4: Alkylierungskinetik von Co(l)-cobyrinat mit 5'-
Chloro-5'-deoxy-adenosin in Methanol
(a)
-9.teaJ—
Overlay der UV/vis-Spektren bei t= 0, 6, 16, 22, 29, 45 & 180 Minuten
(b) (b) optische Dichte bei 388 nm
—i——i—i i 1 i—i 1 1 i—i 1 1 i
40 60 80 100 120 140 160 180
Zeit / min
(c) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte gemäss Ansatz pseudo-
erster-Ordnung
i i i— i—i i — • i— i—i i—< i
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180Zeit / min
283
Abbildung 111: Experiment 5: Alkylierungskinetik von Co(l)-cobamido-N,N',N",N'", N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) mit Methyltosylat in
Phosphatpuffer, 1M, pH 9
(a) UV/vis-Spektren bei t= 0 und 35 Minuten
(b) optische Dichte bei 388 nm
~JsnsMp o o o o
6 8 10
Zeit / min
(c) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte gemäss Ansatz pseudo-
erster-Ordnung
Zeit / min
284
Abbildung 112: Experiment 6: Alkylierungkmetik von Co(l)-cobamido-N,N',N",
N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) mit Methyltosylat in Methanol
(a) (a) optische Dichte bei 388 nm
44,
42
38
36.
34.
32
20 40 60
Zert/min
80 100 120
(b) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte gemäss Ansatz pseudo-
erster-Ordnung
7 5.
7.
6 5.
6
5 5.
5
4 5.
4
3 5
3
2 5
20 40 60
Zeit/min
80 100 120
285
7. Literaturverzeichnis
[ 1 ] "Handbook of Vitamins", Hrsg.: L.J. Machlin, Dekker, New York/Basel, Seite 520
(1991)
[2] "Vitamin Bi2" in "The Vitamins", G.F. Combs, Academic Press, London, Seite 385
(1992)
[3] W. Friedrich, J.P. Nordmeyer, Z.Naturforsch.,24b, 588, (1969)
[4] J. Halpern, Science, 227, 869, (1985)
[5] M. Moskophidis, W. Friedrich, Z.Naturforsch., 30c, 460, (1975)
[6] T. Toraya, T. Matsumoto, M. Ichikawa, T. Itah, T. Sugawara, Y. Mizuno,
J.Biol.Chem., 261, 9289, (1989)
[7] D.W. Jacobson, R.J. Holland, Y. Montejano, F.M. Huennekens, J.lnorg.Biochem.,