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Emesso da Standards Unit, Microbiology Services, PHE
Bactteriologia | B 40 | Emissione no: 7 | Data emissione: 10.01.17 | Pagina: 1 di 53
Batteriologia | B 40 | Emissione no: 7 | Data emissione: 10.01.17 | Pagina: 2 di 53
UK Standards for Microbiology Investigations | Emesso da Standards Unit, Public Health England
Ringraziamenti
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida della Public Health England (PHE) in collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS - National Health Service), la Sanità Pubblica del Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul sito web https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories. Le SMI sono sviluppate, revisionate e controllate da diversi gruppi di lavoro che sono supervisionati da un comitato direttivo (consultare https://www.gov.uk/government/groups/standards-for-microbiology-investigations-steering-committee).
Si ringraziano per contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i laboratori di riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento. Si ringraziano i Revisori Medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici.
Per ulteriori informazioni contattare:
Standards Unit National Infection Service Public Health England 61 Colindale Avenue London NW9 5EQ
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Tabella modifiche
Ciascun metodo SMI possiede una registrazione separata delle correzioni. Quelle attuali sono specificate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la E-mail: [email protected].
I documenti nuovi o revisionati devono essere controllati in ciascun laboratorio in accordo con il sistema locale di gestione della qualità.
Modifica numero/data. 6/10.01.17
Emissione eliminata. no 6.1
Emissione inserita no. 7
Anticipata prossima data di revisione*
10.01.20
Sezione(i) interessate Modifica
Intero documento
Bibliografia aggiornata.
Aggiunta sezione sequenziamento del’intero genoma e MALDI-TOF MS.
Diagramma di flusso aggiornato per riportare le informazioni della tabella al sottotitolo 4.5.5.
Sezione 4.5.1 aggiornata per riportare le procedure di decontaminazione utilizzate nei laboratori di microbiologia.
Aggiornata sezione limitazioni tecniche.
Sezione 4.9 aggiornata per menzionare i laboratori di riferimento ai quali possano essere inviati i campioni.
Considerazioni sulla sicurezza . Questa sezione è stata aggiornata in conformità alle informazioni sul requisiti minimi per la processazione di campioni nelle cabine microbiologiche
Procedure di refertazione. Questa sezione è stata aggiornata di conseguenza.
Le revisioni possono essere protratte a cinque anni in funzione delle risorse disponibili
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attività tutti i laboratori di microbiologia clinica e di sanità pubblica del Regno Unito. Le SMI accreditate dal NICE e rappresentano gli standard minimi di attività, e neppure il più alto livello di complesse indagini di laboratorio. Utilizzando le SMI, i laboratori dovranno tenere conto delle esigenze locali e intraprendere ricerche addizionali qualora opportune. Le SMI aiutano i laboratori a soddisfare i requisiti dell’accreditamento con la promozione di procedure d’elevata qualità che possono essere verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo. Le prestazioni della SMI dipendono da personale ben addestrato e dalla qualità dei reagenti e delle attrezzature utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo commerciale e quelli messi a punto in laboratorio siano stati validati e che i risultati siano idonei allo scopo. I laboratori devono partecipare a programmi di valutazione di qualità esterni ed eseguire le relative procedure del controllo di qualità interno.
Convolgimento del paziente e della comunità
Nello sviluppo delle SMI i rispettivi Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il coinvolgimento dei pazienti e dell’opinione pubblica. Grazie al coinvolgendo pubblico, di operatori sanitari, ricercatori e organizzazioni di volontariato, la SMI risultante sarà strutturalmente valida e atta a soddisfare le esigenze dell'utente. L’opportunità di partecipazione per contribuire alla consultazione è estesa al pubblico con l’accesso libero al nostro sito web.
Informazione della gestione dei dati sensibili
La PHE è un’organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza. Lo sviluppo di metodi SMI è assoggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza.lhttps://www.gov.uk/ government/organisations/public-health-england/about/equality-and-diversity.
I Gruppi di Lavoro SMI sono impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità di consultazione efficace con gli appartenenti al pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialistici coinvolti.
Dichiarazione legale Mentre ogni cura è stata intrapresa per la preparazione delle SMI, PHE e ogni altra organizzazione di sostegno, deve, per quanto possibile in base a qualunque legge vigente, escludere la responsabilità per tutte le perdite, costi, reclami, danni o spese derivanti da o connessi all'uso di una SMI o con qualsiasi informazione ivi contenuta. Se si apportano modifiche a una SMI, si deve porre in evidenza dove e da chi sono state effettuate tali modifiche e avere la consapevolezza che la PHE e le altre organizzazioni non si fanno carico di queste modifiche. Per evitare ulteriori dubbi si precisa che le SMI sono state sviluppate per essere applicate nel RU, e qualsiasi uso al di fuori di questa sede è a rischio dell’utilizzatore.
Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate nel corso della prossima revisione. Queste procedure standard (SMI) possono essere sostituite solo da revisioni dello standard, azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da parte dell’ente accreditato NICE.
I diritti d’autore delle SMI sono della “Crown” e questi dovrebbero essere riconosciuti ove appropriato.
Citazione suggerita per questo
Public Health England. (2017). Investigation of specimens for Mycobacterium species. UK Standards for Microbiology Investigations. B 40 Issue 7. https://www.gov.uk/uk-
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diretto, così da ridurre i tempi di diagnosi, accelerare l'inizio del trattamento, nonché ridurre il
carico di lavoro dove le risorse di laboratorio sono limitate,1,2,6,11,13,16,18,19.
Tubercolosi extra-polmonare
Linfoadenite
La linfadenite è la più frequente forma d’infezione extra-polmonare da micobatteri che,
quando causata da bacilli tubercolari, era nota come scrofola. I linfonodi cervicali sono quelli
più frequentemente infettati, sebbene ne possano esserne interessati altri20,22. Gli ascessi
possono sviluppare formazioni cavitarie. La linfadenite cervicofacciale nei bambini in tenera
età può spesso essere sostenuta da micobatteri non tubercolari, di solito da Mycobacterium
avium23,24.
Tubercolosi miliare
Tubercolosi miliare è la definizione che è stata introdotta per descrivere l’aspetto a semi di
miglio (nella radiografia del torace) delle lesioni infette, ma attualmente è utilizzata
genericamente per descrivere tutte le manifestazioni ematogene progressive di tubercolosi
disseminata25. Il numero dei casi è in aumento per l’incremento di pazienti con
immunocopromissione correlata a HIV.
Neurotubercolosi – Tubercolosi meningea
La meningite tubercolare TBM,(tuberculous meningitis) è di solito causata dalla rottura di un
tubercolo nello spazio sub-aracnoidale, piuttosto che da una diffusione ematogena alle
meningi. Le manifestazioni cliniche iniziano in genere con malessere, cefalea intermittente e
febbricola, seguite entro 2-3 settimane da cefalea persistente, vomito, confusione,
meningismo e sintomi neurologici di tipo focale25. La mortalità è superiore nei soggetti con <
di 5 e > di 50 anni o in quelli in cui la malattia ha durata superiore a due mesi. La diagnosi di
TBM si avvale di un fondato sospetto clinico. Sebbene in questi casi il quadro del LCR
presenti tipicamente un aumento del numero dei leucociti (GB) con predominanza dei linfociti,
queste cellule possono essere assenti, mentre in alcuni casi, si osserva una prevalenza di
granulociti polimorfonucleati. Le proteine del LCR sono di solito aumentate. E’ stato sviluppato
un algoritmo diagnostico per favorire un’identificazione precoce nei pazienti a maggior rischio
di TBM26. In questi casi le possibilità di ottenere uno striscio e un risultato colturale positivo
sono aumentate con il prelievo di un consistente volume di LCR (> 6mL) o da accertamenti
ripetuti su questo tipo di campione26.
Tubercolosi gastrointestinale
La tubercolosi gastrointestinale era comunemente riscontrata nell’era pre-antibiotica in
pazienti con forma polmonare diffusa che si manifestava a causa dell’ingestione delle
secrezioni polmonari infette27. Può anche essere causata dal M, tuberculosis o da M. bovis
(dopo alimentazione con latte infetto non pastorizzato28). La diagnosi di TB gastrointestinale è
spesso ottenuta con l’endoscopia. La biopsia tissutale prelevata nell’organo coinvolto fornisce
il maggior numero di microrganismi per strisci e colture per ricerca di AFB1.
TB peritoneale
La TB peritoneale si manifesta in forma di ascite (essudativa) o adesiva (asciutta). La forma
ascitica è caratterizzata dalla presenza di liquido fluttuante, quella adesiva da aderenze
fibrotiche e frequentemente con presenza di rigonfiamento addominale28.
Indagine nei campioni di specie Mycobacterium
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Tubercolosi genitourinaria
La tubercolosi genitourinaria è infrequente prima della pubertà ed è più frequente nei maschi29. L’intervallo fra esordio dell’infezione e sviluppo di malattia renale attiva è di solito molto lungo (anni o decenni). Con il progredire dell’infezione, le lesioni del rene possono divenire caseose, con conseguente eliminazione di AFB vitali nella pelvi renale e nell’uretere, e l’infezione può diffondersi poi alla vescica30. Il paziente può presentare frequente nicturia associata a disuria ed ematuria, e l’analisi delle urine può rilevare proteinuria, ematuria (in più del 50% dei casi) e piuria ‘sterile’ (in più dell’80%)12,31.
Tubercolosi ossea articolare e della colonna vertebrale
La tubercolosi ossea articolare, che comprende quella della colonna vertebrale, di solito è espressione di un’infezione polmonare primaria che si diffonde all’osso per via ematogena32. I fattori predisponesti comprendono, deficit immunitari e uso di droghe per via endovenosa. La TB della colonna vertebrale è la più frequente manifestazione ossea e delle articolazioni, seguita dal coinvolgimento delle articolazioni che sostengono il peso come il ginocchio e l’anca. La diagnosi di TB ossea e articolare è di solito posta su base clinica e radiologica associata a disponibilità di campione bioptico per l’esame istologico e allo striscio e coltura per AFB. La TB della colonna vertebrale (morbo di Pott) si localizza più frequentemente nella parte toracica inferiore e nelle aree lombari superiori33. Si manifesta principalmente nella tarda infanzia, nei giovani adulti e nell’età avanzata, producendo un collasso vertebrale con conseguente deformazione della colonna. L’ascesso tubercolare dello psoas origina da infezioni toraciche e della colonna vertebrale lombare e diffonde all’interno della guaina del muscolo psoas, talvolta estendendosi fino alla coscia.
Batteriemia
Batteriemia a bassa concentrazione batterica si manifesta spesso con i micobatteri e fa parte della storia naturale di un soggetto infetto contribuendo alla comparsa della TB in altri organi34. Tuttavia, la micobatteraemia rilevabile è relativamente rara, tranne che nei pazienti che sono spiccatamente immunocompromessi, come quelli con HIV-AIDS35-38. Nei pazienti affetti da AIDS dei paesi sviluppati questa è stata il più delle volte sostenuta da Mycobacterium avium complex, in quelli dell'Africa sub-sahariana può essere causata da MTBC37-39. L'incidenza di queste infezioni micobatteriemiche diffuse ora è molto meno frequente grazie alla disponibilità di una efficace terapia antiretrovirale40. Le specie Mycobacterium sono state isolate dal sangue di altri pazienti immunocompromessi, come quelli con leucemia, e occasionalmente da pazienti che non sono gravemente immunodepressi35.
Tubercolosi multi-resistente ai farmaci (MDR-TB - multi drug resistant TB) Negli anni recenti, sono stati segnalati in aumento in tutto il mondo i casi di TB resistenti a uno
o a più farmaci41,42. M. tuberculosis diviene resistente ai farmaci per mutazione spontanea
occasionale43. I fattori associati alla resistenza ai farmaci sono conseguenti a trattamento
incompleto e insufficiente, e alla mancata adesione al programma di trattamento prescritto.
Resistenza primaria è definita come la manifestazione che si verifica nei pazienti infettati da
un ceppo già resistente. Resistenza secondaria si presenta quando i mutanti resistenti di un
organismo inizialmente farmaco sensibile emergono nel corso di una infezione, di solito a
causa di chemioterapia inadeguata. Ceppi di TBC multi-resistenti ai farmaci (MDR) sono
resistenti in vitro a isoniazide e rifampicina. Oltre ai metodi convenzionali di sensibilità
fenotipica, una parte delle mutazioni genetiche associate a resistenza può essere identificata
da vari metodi molecolari. Tali metodi possono essere applicati a un battere isolato o in modo
diretto sul campione; fornendo in tal modo una precoce identificazione della presenza di
resistenza ai farmaci. I regimi del trattamento per i MDR-TB tendono a essere meno efficaci e
più prolungati rispetto alla terapia per la TB farmaco-sensibile. I ceppi di tubercolosi
diffusamente resistenti ai farmaci (XDR-TB) stanno diventando più frequenti in alcune regioni
Indagine nei campioni di specie Mycobacterium
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geografiche44. Questi microrganismi, oltre ad essere MDR, sono anche resistenti a qualsiasi
fluorochinolone e ad almeno un composto iniettabile di seconda linea”, vale a dire amikacina,
kanamicina o capreomycin45. Sono ora stati segnalati casi di tubercolosi totalmente resistenti
ai farmaci46.
Micobatteri non Tubercolari (NTM - Non Tuberculous Mycobatteria)
Queste specie Mycobacterium sono state variamente definite 'micobatteri non tubercolari',
'micobatteri ambientali', 'micobatteri anonimi', 'micobatteri atipici' .e 'micobatteri opportunisti'. I.
NTM in natura sono ubiquitari, hanno uno spettro variegato di patogenicità per l'uomo, non si
trasmettono da persona a persona (tranne Mycobacterium abscessus, per il quale esistono
prove che suggeriscono che è possibile l'infezione crociata tra i pazienti) e sono spesso
resistenti alla chemioterapia anti-tubercolare classica47-51. Tuttavia, la correlazione della
resistenza in vitro e l’efficacia in vivo rimangono molto meno definite per i NTM a lenta
crescita che per i MTBC50. Sono state descritte oltre 100 specie di micobatteri e molte di loro
sono state riconosciute patogene obbligate o opportuniste per l'uomo o per gli animali50,52. A
differenza di M. tuberculosis, l'isolamento di una specie NTM da campioni quali l’espettorato
non equivale a malattia -- i risultati microbiologici devono essere interpretati in collaborazione
con i riscontri clinici e radiologici50. La tassonomia di questo gruppo è in continua evoluzione
con la diffusione di nuove tecniche, come il sequenziamento comparativo del 16S rDNA52.. La
tradizionale distinzione tra'' rapida crescita” e ''specie lenta crescita” (in funzione della
capacità dei ceppi di sviluppare colonie visibili nella subcoltura su un mezzo solido in 7 giorni
o meno di incubazione), rimane di valore clinico e tassonomico50,,52.
Specie a crescita lenta
Mycobacterium avium - intracellulare gruppo (MAI)
Il termine M. avium complex (MAC) è spesso usato per comodità in micobatteriologia clinica
per etichettare temporaneamente ceppi fenotipicamente simili a M. avium50. La separazione di
molte specie in precedenza assegnate a questo complesso (compreso M. intracellulare) è ora
facilmente possibile. Ora sono note tre sottospecie appartenenti al MAC con il nome di M.
avium: M. intracellulare e M. chimaera53,54. Inoltre, sono ora note tre valide sottospecie di M.
avium: M. avium subsp. avium: M. avium subsp. paratuberculosis; e M. avium subsp.
silvaticum50,52,55. Nei pazienti immunocompetenti, i microrganismi MAI, di solito M.
intracellulare, possono invadere l'albero bronchiale, pre-esistendo nelle aree
bronchiectasiche, o in vecchie cavità50. Nei pazienti immunodepressi M. avium e i
microrganismi correlati possono causare infezione diffusa40,50. Le infezioni da M. avium
possono causare linfoadenite cervicale nei bambini in tenera età23,24,50. Questi microrganismi
sono spesso presenti nell’acqua e possono contaminare i campioni.
M. chimera, un NTM a crescita lenta riscontrato nell'ambiente è stato recentemente implicato
in diversi casi di endocardite o infezione profonda dopo intervento di cardiochirurgia mediante
l'uso strumentazione per bypass56,57.
Mycobacterium gordonae
Questa è una specie acquatica comune che raramente ha causato dubbia malattia in pazienti
immunosoppressi50.. È un comune contaminante dei campioni clinici.
Mycobacterium kansasii
Indagine nei campioni di specie Mycobacterium
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L’infezione polmonare è la forma più frequente di malattia causata da M. kansasii, di solito in
pazienti con preesistente malattia polmonare cronica o pneumoconiosi, sebbene le infezioni
possono verificarsi in altre parti del corpo50. È un fotocromogeno, cioè è richiesta la luce per
pigmentare le colonie.
Mycobacterium malmoense
M. malmoense di solito causa malattie polmonari e ai linfonodi, ma sono state segnalate altre
malattie disseminate in sede extrapolmonare50. La diagnosi di infezione da M. malmoense è
ottenuta come per gli altri micobatteri, anche se il tempo di incubazione richiesto può essere
di 12 settimane prima che le colonie siano visibili sui terreni solidi58.
Mycobacterium marinum
M. marinum è l’agente causale che si trova 'nella vasca dei pesci' o che provoca il granuloma
'da piscina’, lesione cutanea localizzata successiva alla contaminazione di una ferita aperta o
da abrasione con acqua di acquari, piscine e acqua dolce o salata di aree naturali. Questa
specie ha una capacità intermedia di crescita con una temperatura ottimale di 28-30° C50.
Mycobacterium ulcerans
Il M. ulcerans causa lesioni cutanee in diverse parti del mondo, tra le quali, l'Australia (ulcera
Bairnsdale") e nel Sud-Est asiatico, in Uganda e in altre parti dell'Africa ("ulcera di Buruli"), e
nel Centro/Sud America50,59. L’infezione può portare alla formazione di un’ulcera progressiva
cronica indolore, che occasionalmente si può manifestare in viaggiatori provenienti da aree
endemiche50,59. Il microrganismo può essere difficile da isolare in laboratorio - è più sensibile
ai metodi di decontaminazione standard rispetto ad altri micobatteri, la crescita è lenta (6-12
settimane) e necessita di incubazione a 30-33° C50,59. I Metodi molecolari possono essere utili
per confermare la diagnosi clinica.
Mycobacterium xenopi
M. xenopi è un'altra causa relativamente frequente di malattia polmonare NTM in alcune aree
geografiche50,60. È termofilo, con una temperatura di crescita ottimale di 45°C, e, come M.
malmoense, si sviluppa lentamente a 37°C. Può essere isolato da varie fonti ambientali,
inclusi i rubinetti dell’acqua calda, e quindi può anche essere causa di contaminazione dei
campione50.
Specie particolarmente esigenti
Alcune altre specie micobatteriche richiedono specifici supplementi addizionali o condizioni
per essere coltivate con successo in laboratorio. Queste includono Mycobacterium genevense
(ad esempio mycobactin J) e Mycobacterium haemophilum (emina o altri composti contenenti
ferro), ed entrambe le specie hanno dimostrato di essere associate principalmente a pazienti
immunocompromessi, compresi quelli infettati da HIV50. Tuttavia, M. haemophilum, che ha
una temperatura ottimale di crescita di 28-30 ° C, può anche causare linfadenite in pazienti
pediatrici sani24,50. Mycobacterium. leprae, agente eziologico della lebbra, non può
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per identificare le persone che sono a rischio maggiore di sviluppare la TB e dove il
trattamento dell'infezione latente può essere utile. Esempi includono: operatori sanitari,
persone che hanno avuto contatti recenti con un paziente con tubercolosi attiva e quelli con
condizioni mediche soggiacenti, come HIV, leucemia o linfoma1.
I saggi rilevano la risposta dell'ospite all'infezione usando antigeni micobatterici presenti nel M. tuberculosis ma non nel BCG; sebbene questi siano trovati in alcuni micobatteri diversi,
compresi Mycobacterium szulgai, M. marinum e M. kansasii. In questo modo non sono influenzati da una precedente vaccinazione con BCG o dall'esposizione a più micobatteri non
tubercolari. Tuttavia, queste analisi non sono in grado di distinguere l'infezione latente della
tubercolosi dalla malattia attiva o da quella precedentemente trattata con successo. Entrambi i test possono fornire un risultato entro 24 ore e rilevare un'infezione latente di TB con un
elevato livello di sensibilità e specificità. Nessuno di questi test dovrebbe essere utilizzato in
modo isolato per diagnosticare o definire una malattia attiva da TB73,74. Le raccomandazioni
per quanto riguarda il ruolo di queste prove nella diagnosi di LTBI sono state revisionate e pubblicate dal NICE, e anche dai Centers for Disease Control and Prevention degli Stati Uniti
riguardo al loro uso appropriato per rilevare l’infezione da M. tuberculosis1,73.
Test di amplificazione dell'acido nucleico La PCR Real-time ha il potenziale per cambiare significativamente l'attuale modello di
riferimento per l'identificazione dei micobatteri diminuendo i tempi di consegna per
l'identificazione da settimane a ore, mantenendo o migliorando la sensibilità e specificità diagnostica.
l test di amplificazione degli acidi nucleici (NAAT, nucleic acid amplification tests) per la
rilevazione di MTBC, quando applicati direttamente a un campione primario possono essere utili in determinate situazioni, per esempio, la rapida conferma della diagnosi di meningite
tubercolare26,75. Sebbene, la precisione di tali NAAT sia stata riscontrata essere superiore se applicata a campioni respiratori rispetto a quelli ottenuti da altre sedi, attualmente, la
sensibilità (e in minor misura specificità) continua a limitare il valore di questi saggi. Per la malattia TB, in appropriate condizioni cliniche, sia in sede polmonare sia extra-polmonare, il
risultato positivo NAAT potrebbe essere utilizzato per emettere la diagnosi, ma un risultato
negativo non può escluderla1,11,26. La tecnologia continua a svilupparsi, e un ampio studio
internazionale ha dimostrato una sensibilità del 98% (per una piattaforma) su microscopia positiva di espettorato, e il 73% su microscopia negativa, la coltura MTBC è stata confermata
nei pazienti con una NAAT per paziente. Alla luce di questo e di altri studi, il WHO ha
espresso raccomandazioni per quanto riguarda l'applicazione di questo metodo - in particolare
per essere utilizzato come test diagnostico iniziale per la tubercolosi su almeno un espettorato per gli individui sospetti di essere affetti da HIV associati a TB o a MDR -TB. E’ riconosciuta la
necessità di continuare ad eseguire la microscopia convenzionale e la coltura. Negli Stati
Uniti, il test di amplificazione dell'acido nucleico per la tubercolosi è raccomandato come standard di cura dal CDC e dall'Association of Public Health Laboratories76. La prova è stata
recentemente rivista dal NICE, e raccomandazioni aggiornate sono state emesse per il Regno
Unito1. Nel caso in cui la tubercolosi polmonare sia clinicamente sospetta, una NAAT
dovrebbe essere eseguita su un campione primario idoneo nei soggetti di 16 anni o di età maggiore nei casi di: HIV, dove l’informazioni rapida sulla presenza (o l'assenza) di MTBC
DNA può influenzare la cura del paziente, o dove si renda necessaria di una diffusa ricerca di
eventuali contatti1. Una NAAT dovrebbe essere considerata di routine nel contesto di sospetta
tubercolosi polmonare nei bambini di con meno di 15 anni1. Nella situazione di malattia extra-polmonare, una NAAT su alcuni tipi di campioni primari, in particolare LCR, liquido pericardico e materiale da linfonodo, dovrebbe essere considerata come test "aggiuntivo" - se il risultato
ottenuto è in grado di modificare la gestione del caso1.
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Informazione Tecnica/Limitazioni
Limitazioni tecniche delle SMI del RU Le raccomandazioni formulate nelle SMI del RU sono basate su prove (ad esempio sensibilità
e specificità), se disponibili, opinioni degli esperti e pragmatismo, tenendo in considerazione
anche le risorse disponibili. I laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e
intraprendere ricerche addizionali, se appropriato. Prima del loro uso, i laboratori devono
assicurare che tutti i saggi commerciali e in-house sono stati validati e sono idonei allo scopo
Terreni selettivi nelle procedure di screening
I terreni selettivi che non consentono la crescita di tutti i ceppi dei microrganismi circolanti
possono essere raccomandati sulla base delle evidenze disponibili. Un equilibrio deve
pertanto essere ricercato tra evidenze disponibili e risorse necessarie quando si usa più di
una piastra di terreno.
Contenitori per campioni101,102
Le SMI usano Il termine '' contenitore a chiusura ermetica con marchiatura CE ” per
descrivere quelli contrassegnati con la marchiatura CE per la raccolta e il trasporto dei
campioni clinici. I requisiti per i contenitori dei campioni sono riportati nella Direttiva UE per i
Dispositivi Sanitari Diagnostici in vitro (98/79/CE allegato 1 B 2.1) in cui si stabilisce:'' La
progettazione deve consentire un'agevole manipolazione e, se necessario, ridurre per quanto
possibile la contaminazione dei, e perdite dal dispositivo durante l'uso e, nel caso di recipienti
per campioni, il rischio di contaminazione degli stessi. Le procedure di fabbricazione devono
essere adatte a questi scopi''.
Coltura dei campioni
I campioni inviati per l’esame colturale dei micobatteri appartengono a due categorie: quelli
normalmente contaminati con flora residente e quelli provenienti da aree normalmente sterili. I
campioni contaminati richiedono, prima della coltura, una fase di decontaminazione per
ridurre la possibilità di crescita eccessiva di microrganismi diversi dai micobatteri. L’eccessiva
decontaminazione dei campioni deve essere evitata in quanto, sebbene i micobatteri siano più
resistenti degli batteri agli agenti decontaminanti utilizzati non lo sono completamente quindi il
trattamento potrebbe produrre risultati falsi negativi12. Sono stati descritti cinque diversi
metodi per la decontaminazione dei campioni, ma non esistono prove che dimostrino che un
metodo sia il migliore e i laboratori dovranno selezionare quello preferito --- che può variare
con il paziente e con la tipologia del campione. Sono state proposte altre procedure tecniche
che hanno espresso un buon rendimento rispetto a quello più diffuso con NALC-NaOH, che
saranno descritte nella sezione 4.5.1,1, e che potranno anche essere adatte, se appropriate,
dopo validazione locale, al sistema di coltura liquida in uso6,103, 104.
Sodio piruvato
Si deve notare che sebbene il piruvato di sodio aumenti la crescita dei M. bovis, può essere in
grado di inibire alcune specie di Mycobacterium non tubercolari.
Indagine nei campioni di specie Mycobacterium
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Concentrazione / centrifugazione
Per la centrifugazione considerare di aggiungere, al tempo richiesto, quello di avvio per consentire alla centrifuga di raggiungere la velocità appropriata e quello per la successiva frenatura.
Ad esempio, la concentrazione dei campioni di espettorato, mediante centrifugazione, aumenta la sensibilità della microscopia iniziale105.
Si deve notare che quando si usa una centrifuga (per tutti i metodi di decontaminazione applicati ai campioni clinici), è importante accertarsi che il rotore raggiunga e mantenga la RCF necessaria di 3000g per 15 minuti al fine di ottenere un buon recupero dei micobatteri. Le centrifughe non refrigerate non sono adatte in quanto le temperature raggiunte durante la centrifugazione superano in genere i 37°C e ciò influenza la vitalità dei micobatteri106.
Contaminazione crociata
Nei laboratori sono state segnalate colture falsamente positive a causa di contaminazione crociata, e la percentuale di risultati di falsi positivi è risultata del 3,1% 90. Quando possibile, la contaminazione crociata dovrebbe essere evitata con l'uso di pipette monouso, aliquote singole di decontaminanti e di altri additivi. Qualsiasi additivo aggiunto al campione, inclusa l’acqua, dovrebbe essere sterile.
Si raccomanda che i reagenti (quali mucolitici, NaOH e tampone neutralizzante) non vengano dispensati direttamente dalle bottiglie di scorta, ma preparati e pre-dispensati in appositi contenitori sterili asettici, pronti all'uso. Ciò dovrebbe essere predisposto, in modo da evitare problemi di contaminazione crociata dovuta ad uso improprio di flaconi di reagente di scorta. I laboratori possono ridurre le potenziali percentuali di contaminazione, garantendo che il personale agisca in conformità alle linee guida locali stabilite per la preparazione dei reagenti, manipolazione dei campioni, letture di controllo del pH delle soluzioni utilizzate nella decontaminazione e sterilizzazione delle attrezzature di laboratorio. Le percentuali di contaminazione devono essere monitorate in modo continuo.
Sistemi di coltura liquidi automatizzati
I sistemi di coltura liquidi automatizzati disponibili nel Regno Unito sono stati testati per verificare la capacità di rilevare una vasta gamma di micobatteri a lenta e rapida crescita; tuttavia, non ci si deve affidare solo a questi sistemi per l'isolamento di tutte le specie di micobatteri, in particolare quando si eseguono ricerche su pazienti immunocompromessi50. I loro limiti sono legati alla disponibilità di una singola temperatura di incubazione e alla difficoltà di fornire gli additivi di crescita necessari per alcune specie molto esigenti. Possono essere richiesti consigli ai Laboratori di Riferimento o al produttore del sistema in questione. I rari isolati di M. tuberculosis vengono recuperati solo su terreni a base di uova, come ad esempio il Löwenstein Jensen a becco di clarino12.
Temperatura di incubazione
La temperatura delle piastre riscaldate deve essere monitorata in quanto, se troppo calde, comportano perdita di sensibilità nella colorazione, e quindi falsi negativi107,108.
La colorazione dgli strisci
I laboratori che eseguono lo striscio dei campioni per TB dovrebbero garantire che i vetrini preparati siano fissati alla giusta temperatura (65-75 °C) per un congruo periodo (fino a essiccamento, nella maggior parte dei casi per circa 10 minuti, e non superiore a un'ora) come raccomandato nel TP 39 – Staining procedures. Questo perché la fissazione a calore
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prolungata o l'uso di temperature superiori a quella raccomandata possono diminuire la possibilità di rilevare bacilli alcool-acido resistenti (AAFBs), con connesso rischio di falsi strisci negativi107.
Volume del campione
Per un affidabile test NAAT su campioni clinici è richiesto un volume minimo di 5 ml2,19. Tuttavia l’invio di un maggior volume di campioni clinici aumenterà la sensibilità.
Accreditamento
I laboratori devono essere registrati presso UKAS. Essi devono includere le indagini di micobatteriologia nella dichiarazione del loro obiettivo2.
Controllo qualità
La qualità dei terreni solidi a base di uova disponibili in commercio e di quelli liquidi dovrebbe essere garantita dal produttore. Tuttavia, le condizioni di conservazione, in particolare durante la spedizione ai laboratori, potrebbe non essere ottimale e quindi è consigliabile ripetere la validazione dei nuovi lotti di terreno ricevuti in laboratorio prima del loro utilizzo di routine.
I terreni a base di uova sono resistenti e mantengono la loro sensibilità se non sono esposti alla luce diretta del sole o a temperature elevate prolungate. I terreni liquidi sono più esposti alla contaminazione da micobatteri diversi da Mycobacterium tuberculosis o da altri batteri.
Si deve notare che la preparazione in house dei terreni liquidi e dei reagenti è molto sensibile alla contaminazione e pertanto, durante la procedura, devono essere poste in atto tecniche asettiche e la massima attenzione.
Erronea identificazione usando il saggio GenoType Mycobacterium
(CM/AS)
Questo test è stato segnalato per essere sensibile e specifico per l'identificazione della maggior parte delle specie Mycobacterium. Tuttavia, non è stato in grado di differenziare i componenti dei NTM, come alcuni ceppi di M. abscessus identificati come M. chelonae81,82.
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1 Considerazioni sulla Sicurezza101,102,109-123
1.1 Prelievo dei Campioni, trasporto e Conservazione,1,2,74-77
Usare tecnica asettica
Prelevare i campioni in appropriati contenitori impermeabili con marchiatura CE e trasportarli
in sacchetti di plastica sigillati
E’ essenziale la conformità alla regolamentazione postale per trasporto e conservazione
1.2 Procedura sul Campione 101,102,109-123
Microrganismi del Gruppo di Rischio 3,
Tutti i microrganismi del complesso Mycobacterium tuberculosis sono soggetti a denuncia al PHE ai sensi della Health Protection (Notification) Regulations 2010.
Mycobacterium tuberculosis può causare infezioni acquisite in laboratorio LAIs (laboratory-
acquired infections). La via più importante per la trasmissione delle LAIs è tramite aerosol. Come requisito minimo, si raccomanda che il trattamento di tutti i campioni, compresi i
campioni respiratori che potrebbero provocare la formazione di aerosol, deve essere effettuato in una cabina microbiologica di sicurezza in condizioni con Livello di Contenimento
2 con ulteriori precauzioni per ridurre al minimo i rischi di produzione di aerosol secondo la
relativa entità della valutazione del rischio riportate nelle linee guida ACDP e HSE115.
Tuttavia, se vengono processati campioni diagnostici considerati ad alto rischio di contenere
patogeni di Gruppo di Rischio 3 come M. ulcerans, M. microti e M. tuberculosis, vanno utilizzate appropriate condizioni di contenimento, come definito dalla valutazione del rischio
locale. Le tipologie di procedura che possono imporre l’utilizzo del Livello di Contenimento 3 comprendono: la preparazione di strisci di espettorato per microscopia, il trattamento di
campioni (come espettorato) prima della coltura, la manipolazione di emocolture positive
(MGIT) e l'estrazione del DNA da campioni clinici (per le tecniche molecolari quali l'identificazione del DNA, rilevazione di mutazioni del gene legato alla resistenza
farmacologica o, eventualmente, la genotipizzazione) al fine di rispettare la COSHH 2004 Schedule 3 (4e). Se, per esempio, si esegue la procedura con MALDI-TOF, assicurarsi che
siano rispettate le istruzioni del produttore su come utilizzare i diversi tipi di matrici per
l'estrazione MALDI-TOF MS, in quanto alcune sono associate a rischi professionali significativi per gli occhi, pelle e a tossicità respiratorie. Per ulteriori informazioni, fare
riferimento a TP 40: Matrix-assisted laser desorption/ionisation - time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) test procedure.
Utilizzare disinfettanti secondo le istruzioni del produttore per disinfettare le superfici delle
cabine di sicurezza microbiologica, e per pulire l'esterno di attrezzature. I disinfettanti fenolici
non sono sostenuti dalla direttiva sui biocidi 2001 e pertanto nel RU non sono più disponibili 124. Le alternative a disposizione possiedono efficacia variabile di inattivazione verso le specie
Mycobacterium125. La Public Health England ha espresso raccomandazioni per possibili
alternative ai disinfettanti fenolici, tra i quali, gli ipocloriti e il biossido di cloro126. Sono
disponibili anche prove che suggeriscono come l'acido peracetico 0,35% (Nu-cidex A e B) sia
rapidamente micobattericida127. I tempi di contatto e di concentrazione per i vari disinfettanti possono variare e vanno presi in considerazione. Sono opportuni disinfettanti con tempi di
contatto rapidi.
Il reagente NALC-NaOH contiene alcali forti e provoca gravi ustioni. Devono essere indossati guanti e protezione per gli occhi/viso. NaOH è irritante per gli occhi e la cute.
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L'uso di piastre riscaldate in cabina microbiologica di sicurezza in camera di Contenimento di Livello 3 può alterare il flusso d'aria attraverso la cabina. È importante verificare che il flusso d'aria non sia influenzato dal funzionamento della piastra riscaldata per garantire che la protezione dell'operatore non sia compromessa.
In contesti in cui viene usata la strumentazione/confezione progettata per la point-of-care (POCT), dovrebbe essere intrapresa una valutazione del rischio su dove collocarla.
Utilizzare contenitori sigillati per centrifugazione. Dopo la centrifugazione, aprire i contenitori in cabina microbiologica di sicurezza.
Trasportare il materiale di scarto direttamente all'autoclave quando è pronto per lo smaltimento e autoclavare immediatamente.
Ove possibile, utilizzare materiali di consumo in plastica piuttosto che in vetro.
Nota: La fissazione a calore di strisci non uccide le specie Mycobacterium. Manipolare con attenzione i vetrini128 (consultare la sezione 4.4).
Posizionare e trasportare i contenitori del campione su supporti progettati per ridurre al minimo la rottura e la perdita di campione.
Fare riferimento alle linee guida sulla sicurezza nella manipolazione di tutti i microrganismi presentati in questa SMI del RU.
Il personale deve indossare dispositivi di protezione individuale in ogni momento durante la processazione dei campioni clinici nel laboratorio con Livello di Contenimento 3, come pure mantenere condizioni di lavoro sicure.
Le linee guida precedentemente esplicitate dovrebbero essere completate con le valutazioni COSHH e del rischio locale.
2 Prelievo del Campione
2.1 Tipo di campione
Espettorato, liquidi da sedi corporee sterili, (LCR, Liquido pleurico ecc.) urine, cute o biopsie tissutali, lavaggio bronco alveolare, campioni post mortem, lavaggio gastrico midollo osseo, sangue, osso.
2.2 Tempo ottimale e metodo di prelievo129
Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sezione1.1
Raccogliere i campioni prima della terapia antimicrobica se possibile129.
Per la diagnosi iniziale di infezione da micobatteri tutti i campioni devono essere prelevati di recente e possibilmente prima dell’inizio del trattamento anti-tubercolare. Anche '' Altri'' antimicrobici possono avere una notevole attività anti-micobatterica, in particolare i fluorochinoloni come la ciprofloxacina, levofloxacina o moxifloxacina, e macrolidi come la claritromicina o azitromicina.
Usare appropriati contrassegni di rischio in base alla politica locale.
Fare riferimento alle specifiche linee guida HSE / COSHH per la raccolta e la manipolazione sicura dei campioni che possono contenere microrganismi del Gruppo di Rischio 3.
Procedure che generano aerosol, come broncoscopia o espettorato indotto, devono essere eseguite in un’area opportunamente progettata e ventilata1.
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Campioni diversi da sangue
Campioni diversi da sangue o midollo osseo devono essere refrigerati se il trasporto al laboratorio o l’inizio della procedura e >1 ora.
Lavaggi gastrici
Se la procedura è ritardata di > 4 ore, i lavaggi gastrici devono essere neutralizzati aggiungendo circa 100 mg di carbonato di sodio a circa 50 ml del campione130.
Colture di sangue e midollo osseo
Il Sangue e la coltura dell’aspirato di midollo osseo devono essere trasportati e inseriti appena possibile nel sistema di coltura automatizzato.
Nota: Questi campioni non devono essere raccolti in provette con EDTA perché questo inibisce la crescita dei micobatteri. Si consigliano provette con litio eparina.
2.2.1 Corretto tipo di campione e metodo di prelievo
Campioni di espettorato
Per ridurre al minimo la contaminazione i campioni devono essere stati prelevati di recente (da meno di 1 giorno). I migliori campioni sono quelli purulenti. Di prima mattina, per tre giorni consecutivi, devono essere raccolti ≥5 mL per ogni campione con intervallo di 8-24 dall’ultimo1,2,11,13,19.
I campioni prelevati la mattina presto (cioè poco dopo il risveglio del paziente) hanno la massima resa. Quando la tosse è secca, prima della raccolta può essere utile la fisioterapia, il drenaggio posturale o l'inalazione di soluzione salina nebulizzata (induzione della produzione di espettorato)
Nota: Non sono raccomandati i campioni decontaminati e neutralizzati in quanto potrebbero perdere la vitalità durante il trasporto al laboratorio.
Lavaggio broncoalveolare / lavaggi bronchiali
Questi possono essere inviati se espettorato, spontaneo o indotto, non è disponibile o se i campioni sullo striscio sono AFB negativi.
Nota: Dovrebbe essere evitata la contaminazione del broncoscopio con acqua di rubinetto,
che può contenere specie ambientali di Mycobacterium. Il volume minimo del campione è preferibilmente di 5 ml.
Lavaggi gastrici
I lavaggi gastrici sono di solito utilizzati per i bambini quando insorgono problemi per la raccolta dell’espettorato. I bambini piccoli spesso ingurgitano le loro secrezioni respiratorie invece di espellerle. L’espettorato indotto è considerato preferibile al lavaggio gastrico, quando possibile1. Raccogliere un campione al mattino presto (prima di colazione) per 3 giorni consecutivi131. Preferibilmente, un volume minimo di 5 mL. Gli aspirati devono essere prontamente consegnati e trattati per evitare il deterioramento dei microrganismi provocato dall’acido (consultare di seguito la neutralizzazione alla sezione 4.5). I risultati della microscopia diretta sul lavaggio gastrico possono essere fuorvianti perché altri bacilli acido-resistenti sono normalmente presenti nello stomaco.
Liquidi da sedi corporee sterili
I Liquidi da sedi corporee sterili (LCR, liquido pleurico ecc.) non richiedono la
decontaminazione e possono essere seminati direttamente in terreni neutri. Tuttavia, questi
campioni possono essere valutati per la loro contaminazione seminando piastre per il controllo della purezza. Se contaminati, possono essere trattati con acido e se puri possono
essere inoculati direttamente. Prelevare il maggior volume possibile di LCR in modo asettico in un contenitore impermeabile con marchiatura CE. Se dopo la prima puntura lombare è
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disponibile un volume ridotto e i risultati dei conteggi cellulari e della concentrazione delle
proteine fanno sospettare una meningite TB, deve essere considerata l’opportunità di un
secondo prelievo con l’intento di ottenere un maggiore volume di campione per aumentare le
possibilità di colture positive26.
Ricordare che i liquidi pleurico e pericardico non sono campioni molto sensibili per la ricerca di
M. tuberculosis e che attualmente si ritengono più utili le biopsie pleuriche o pericardiche
prelevate durante la raccolta dei liquidi da queste sedi.12. Il risultato negativo di questi campioni fluidi non esclude la diagnosi.
Campioni urinari
I campioni urinari devono essere raccolti di primo mattino per tre giorni consecutivi in un contenitore impermeabile con marchiatura CE (che non contiene acido borico), posto in un
sacchetto di plastica sigillato. Se non sono disponibili contenitori per un campione completo di
urine di primo mattino (UPM), può essere accettato un campione di UMI da mitto intermedio, anche se questa alternativa non è la migliore.
Cute/osso, e tessuti inclusi campioni post mortem95
I campioni di questo tipo devono essere omogeneizzati, con eccezione del tessuto osseo. Se
si riceve un pezzo voluminoso può essere necessario selezionare e tagliare una parte appropriata di tessuto. In modo analogo, alcuni frammenti di tessuto possono richiedere di
essere ‘sminuzzati’ con bisturi e forbici sterili prima di essere omogeneizzati in modo
adeguato. Prelevare asetticamente i campioni e inserirli in un contenitore impermeabile con marchiatura CE privo di conservanti, inserito in sacchetto di plastica sigillato, aggiungendo
acqua distillata sterile per prevenire l’essiccamento. Selezionare, se possibile, una parte caseosa: il maggior numero di microrganismi è presente alla periferia della lesione caseosa.
I campioni di tessuto da biopsia ricevuti in formalina non sono accettabili e non devono essere
trattati133.
Campioni fecali
Mycobacterium tuberculosis e il gruppo dei Mycobacterium avium-intracellulare sono stati
isolati dalle feci, in particolare nei pazienti immunocompromessi, come quelli affetti da HIV-
AIDS. Tuttavia, i batteri NTM possono essere isolati in soggetti sani, solo come
colonizzanti134. Se si isola M. tuberculolosis, questo potrebbe essere dovuto alla ingestione di
secrezioni respiratorie infette piuttosto che a malattia intestinale134. La procedura di isolamento non è affidabile e ha una ridotta percentuale di successo dovuta alla forte
contaminazione di altri batteri, pertanto la coltura di campioni fecali per micobatteri non è
raccomandata in questa SMI. M tuberculosis e i NMT, tra cui i MAI, possono essere isolati da colture di sangue nelle infezioni disseminate.
Pus o pus prelevato con tamponi
Il Pus o pus prelevato con tamponi deve essere raccolto in modo asettico e deve essere
inviato il maggior volume possibile in un contenitore impermeabile con marchiatura CE inserito in un sacchetto di plastica sigillato. Il pus è il campione di scelta. I tamponi sono meno
appropriati perché i micobatteri, se presenti, possono rimanere adesi sul tampone stesso
invece di essere trasferiti con successo nei terreni di coltura135.
Midollo osseo
Prelevare per aspirazione la maggior quantità possibile di midollo osseo e inserirlo
direttamente nel terreno di coltura seguendo le istruzioni del produttore.
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Sangue
Per maggiori informazioni sulle emocolture consultare B 37 – Investigation of Blood Cultures (for Organisms other than Mycobacterium species) ma devono essere eseguiti microscopia, sotto-coltura e altri accertamenti secondo i metodi descritti in questa SMI.
Nota: EDTA, anche in tracce, inibisce la crescita di alcune specie Mycobacterium e pertanto non è accettabile..
Per la coltura i campioni dovrebbero essere inviati su terreno all'uovo a becco di clarino o in apposito terreno liquido in appropriati contenitori da trasporto. Sono richiesti almeno 5mL se coltivati in terreno liquido. Per i dettagli su come preparare la coltura di un campione per l’invio al laboratorio di Riferimento appropriato, selezionare il link nella sezione 4.9 di questa SMI del RU.
2.3 Quantità adeguata e numero appropriato di campioni129
Il numero e la frequenza dei campioni prelevati dipendono dalle condizioni cliniche del paziente.
3 Trasporto e Conservazione del Campione101,102
3.1 Condizioni ottimali di trasporto e conservazione
Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sezione 1.1
I campioni devono essere trasportati e processati il più presto possibile129.
I campioni devono essere trasportati e ricevuti in laboratorio entro un giorno dal prelievo e processati il più presto possibile2. Devono essere indicati i requisiti richiesti da ciascun laboratorio
Se la procedura è ritardata, la refrigerazione è preferibile alla temperatura ambiente129.
3.1.1 Trasporto
La definizione di Categoria A (per colture positive) e Categoria B (per i campioni) è limitata alla classificazione di campioni / colture microbiche che devono essere trasportate a un altro laboratorio (consultare la Tabella successiva).
Descrizione del Campione Istruzioni imballaggio
I campioni di Categoria A sono noti o sospetti di contenere un agente microbico con la seguente definizione "materiale infettante trasportato in una forma che, se si verifica l'esposizione a esso, è in grado di provocare invalidità permanente, malattia pericolosa per la vita o la morte per gli esseri umani o animali ". La maggior parte è del Gruppo di Rischio 3 o 4
Contrassegno UN2814 (Umani)
Istruzioni imballaggio PI620
Documentazione di supporto per ADR
Trasporto come categoria A
ADR corriere autorizzato
Per questioni pratiche, per consentire l’invio ai laboratori di riferimento di ricevere un numero limitato di agenti appartenenti alla categoria A, di questi sono stati esentati da essere trasportati come categoria A. Questi comprendono Escherichia coli produttrici di Vero-citotossina (VTEC), Mycobacterium tuberculosis e Shigella dysenteriae 1
Contrassegno UN3373
Istruzioni per confezionamento PI650
Inviare tramite corriere
Royal mail NOT accetta
I Campioni di Categoria B sono quelli che non sono compresi
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nella definizione della Categoria A Istruzioni per confezionamento PI650
Posta o corriere
NON Accettata da Royal Mail
4 Procedura sul campione101,102
4.1 Selezione della Prova
Se è disponibile un volume sufficiente, i campioni sono normalmente indagati prima con la microscopia per AFB (striscio) e poi con la coltura, con l'esclusione di quelli già pre-inoculati in un flacone di coltura micobatterica. La microscopia diretta delle urine ha un valore discutibile, inoltre, in funzione della situazione clinica, la presenza di micobatteri non tubercolari può essere fuorviante12,31.
Se il volume del campione è insufficiente per entrambe le ricerche, la coltura è generalmente preferibile alla microscopia per la maggiore sensibilità.
Potrebbe essere opportuno processare un campione per AFB, in funzione della sua tipologia e dei dati clinici disponibili, anche se queste prove non sono state espressamente richieste quando campioni sono stati inviati1. Questi materiali particolari includono le biopsie pleuriche o materiale da linfonodi1.
Oltre alle indagini convenzionali AFB può essere richiesto il/i test di amplificazione dell'acido nucleico (NAAT), come PCR, sia per rilevare la presenza di MTBC DNA che/o di una mutazione genetica associata a resistenza ai farmaci (consultare 4.5.4 e la richiesta di
maggiori informazioni quando lo si ritenga opportuno1). Nota: la NAAT su un campione
primario va considerato un accertamento "aggiuntivo"- se il volume del campione è limitato, i test convenzionali dovrebbero normalmente avere la priorità.
Per alcuni fluidi corporei, come il LCR o liquidi pleurici, pericardici o ascitici, in cui viene presa in considerazione la tubercolosi, può anche essere richiesto il test dell’adenosina deaminasi (ADA)1.
4.2 Aspetto
Strisci di espettorato
I campioni di espettorato dovrebbero apparire consistenti e mucoidi o chiari, ma con granulazioni purulente. Il colore varia dal bianco opaco a verde.
I campioni di espettorato ematici appariranno rossastri o marroni.
Nota: la saliva trasparente o la secrezione nasale non sono accettate come campioni per
ricerca di TB
Liquidi corporei da sedi sterili
Notare la presenza di eventuali coaguli, se presenti, utilizzarli nella procedura.
Biopsie dei tessuti
Processare l'intero tessuto se il campione è piccolo.
Per i campioni di grandi dimensioni selezionare per gli strisci e coltura le parti caseose (se presenti), così come il tessuto immediatamente circostante le aree caseose
4 .3 Preparazione del campione Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sessione 1.2
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Consultare di seguito le sezioni importanti per la preparazione degli strisci e dell’esame colturale
4.4 Microscopia
4.4.1 Standard
Eseguire l’esame microscopico e inviare il risultato entro un giorno di lavoro dal ricevimento del campione2.
Eseguire l’esame microscopico dopo omogeneizzazione e prima della decontaminazione dei campioni o direttamente dal campione.
1. Centrifugare i campioni omogeneizzati in contenitori chiusi a 3000 x g* per 15 minuti.
2. Scartare con attenzione il sopranatante in un recipiente contenente un disinfettante idoneo.
3. Preparare uno striscio sottile del sedimento su un solo vetrino e fissare al calore su una piastra riscaldata (65°C–75°C) per almeno 10 minuti e al massimo per 1 ora, collocare in seguito su un idoneo portavetrini o altro supporto107.
4. Colorare con metodo auramina-fenolo.
*E’ importante che la centrifugazione sia eseguita con un’appropriata Forza di Centrifugazione Relativa (FCR ). Questa varia da centrifuga a centrifuga ed è proporzionale alla lunghezza del braccio del rotore e alla velocità di rotazione. Non deve essere confusa con la velocità di Rotazione per Minuto (RPM).
Nota: L’esame dello striscio di appropriati campioni deve essere garantito per almeno sei giorni lavorativi normali alla settimana2.
4.4.2. Preparazione degli strisci
Strisci di espettorato:
Strisciare il sedimento ottenuto per centrifugazione dal campione trattato e centrifugato con un’ansa di plastica su un vetrino, mantenendosi lontani dai margini11,12,108. Non preparare strisci troppo sottili.
Liquidi corporei sterili:
Preparare gli strisci come in precedenza (strisci dell’espettorato) dal sedimento dopo centrifugazione. Per il LCR può essere opportuno strisciare il materiale in strati successivi, se il volume è sufficiente.
Tessuto:
Gli strisci dei tessuti garantiscono una sensibilità più elevata se preparati con tecniche istologiche, cioè colorando sezioni seriali con il metodo di Ziehl-Neelsen modificato. Si possono eseguire strisci diretti, ma questi sono solitamente poco sensibili. Comunque, se il materiale disponibile è scarso, la coltura dei tessuti prelevati di recente è il metodo diagnostico più sensibile perché fornisce il maggior numero di informazioni per la gestione del paziente.
Tamponi
Non esaminare con microscopia diretta i tamponi da prelievo unico perché ciò può essere fonte di contaminazione. L’esame microscopico è indicato se si ricevono un paio di tamponi, oppure un tessuto associato a un tampone con pus. Se è stato inviato un solo tampone sospendere il materiale contenuto in 1 mL di acqua distillata sterile e trattare come l’espettorato
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Sangue / aspirato di midollo osseo
Eseguire l’esame microscopico su ogni flacone che il sistema colturale automatizzato segnala come positivo o è giudicato positivo visivamente. Con ago di sicurezza appropriata o altro dispositivo, rimuovere poche gocce di miscela sangue/brodo trasferendole su un vetrino da microscopio pulito. Diffondere il campione con ansa sterile per ottenere uno strato sottile per la colorazione specifica dei microrganismi acido resistenti.
Urine
Non riunire insieme i campioni di urina preparati per la semina.
4.4.3 Colorazione degli Strisci
La colorazione Auramina-fenolo è più sensibile della Ziehl-Neelsen e pertanto più idonea per la valutazione di strisci da materiali clinici2,11,12,50,105,108,136. La colorazione Ziehl-Neelsen consente l’osservazione di dettagli morfologici ed è utile nell’esame delle colture positive per AFB, e può essere utilizzata per confermare i risultati dei campioni clinici positivi all’auramina–fenolo.
Prima del loro utilizzo nella routine, colorare con i nuovi lotti di auramina-fenolo e Ziehl-Neelsen i vetrini di controllo, positivo e negativo, fissati in precedenza.
Nota: Durante la colorazione dei vetrini, per ridurre il rischio di contaminazione crociata è opportuno garantire che non vengano a contatto fra loro. Devono essere allestiti un vetrino di controllo negativo e positivo correttamente verificati. Inoltre, prima della colorazione, controllare che non siano presenti schizzi d'acqua di rubinetto -- questi possono produrre risultati falsi positivi per presenza di NTM nelle condutture idriche. Quando si utilizzano le tecniche di colorazione, queste devono essere integrate con la COSHH locale e la valutazione del rischio.
Per maggiori informazioni sulla colorazione con auramina-fenolo degli strisci di campioni clinici fissati al calore e della colorazione Ziehl-Neelsen di strisci delle colture positive fissati al calore, fare riferimento a TP 39 – Staining procedures.
4.5 Coltura e ricerca
4 5.1 Pretrattamento
Tutti i metodi prevedono una o più fasi descritte di seguito:
Pre-Trattamento (quale centrifugazione)
Questo non è appropriato per tutti i tipi di campione.
Omogeneizzazione Migliora la sensibilità della coltura ma non è richiesta per tutti i campioni.
Decontaminazione e neutralizzazione:
Rimuove la contaminazione e bilanciare il pH. La temporizzazione delle diverse fasi deve essere prevista in funzione delle percentuali di contaminazione di ciascun laboratorio. I laboratori che utilizzano sistemi di coltura automatizzati devono fare riferimento alle raccomandazioni del produttore per l’uso di metodi di decontaminazione compatibili. Cinque sono i metodi di decontaminazione / digestione ora utilizzati nelle procedure dei campioni.
1. Decontaminazione di campioni con 0,5 N di Idrossido di Sodio (NaOH 4% p/v)
2. Decontaminazione dei campioni usando N-acetil-L-cisteina sodio idrossido ( NALC-NaOH.
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3. Decontaminazione dei campioni con fosfato trisodico e benzalconio (TSPB)
4. Decontaminazione dei campioni con H2SO4 (0.5N).
5.Decontaminazione di campioni utilizzando acido ossalico (5%).
Non sono disponibili dati o prove di valutazione per consigliare un metodo ottimale. La scelta
del metodo più idoneo e il tempo di decontaminazione variano con il livello di contaminanti
presenti nei campioni. I laboratori devono trattare campioni in funzione del livello di
contaminazione presente nel campione.
Sono commercialmente disponibili confezioni per digestione/decontaminazione dei campioni.
Nota: Si deve notare che il successo della omogeneizzazione e decontaminazione dipende
dall’azione appropriata di omogeneizzazione o della soluzione decontaminante, dal tempo di
esposizione dei microrganismi, velocità di centrifugazione, tempo utilizzato per far
sedimentare i bacilli tubercolari, nonché dalla temperatura sviluppata nel campione durante la
centrifugazione.
Concentrazione (per esempio centrifugazione):
Non è adatta per tutti i tipi di campioni.
4.5.1.1 Campioni da sedi non sterili
Questi campioni provengono da sedi non sterili :
• Espettorato.
• Lavaggio gastrico.
• Lavaggio broncoalveolare / lavaggio bronchiale.
• Tamponi laringei (il materiale deve essere eluito dai tamponi con NaOH e il prodotto
trattato come espettorato. Se è richiesta la microscopia devono essere inviati due
tamponi).
Nota:. I campioni da altre sedi sterili quali (LCR, midollo osseo, biopsie dei tessuti, liquidi
pleurici, pericardici e peritoneali, campioni da resezione chirurgica (con esclusione dei
materiali autoptici) pus da ascessi freddi, liquido spinale, sinoviale o altri fluidi corporei interni)
non richiedono decontaminazione prima della coltura.
Pre-trattamento:
Centrifugare i campioni di fluidi, se sufficientemente liquidi, ad esempio lavaggio gastrico,
lavaggi broncoalveolari. Centrifugare a 3000 xg per 15 minuti e scartare il surnatante in
disinfettante, lasciando 1 mL di sedimento da risospendere.
Omogeneizzazione
L’omogeneizzazione può essere effettuata con uno dei seguenti metodi:
1. Durante il processo di decontaminazione passare ripetutamente su vortex finché il
campione è completamente omogeneizzato.
2. Trattamento con ditiotreitolo (DDT): Sciogliere i campioni con un volume in eccesso di
ditiotreitolo, agitare o passare su vortex a intermittenza fino a quando il campione è
omogeneizzato. Centrifugare a 3000 xg per 15 minuti e scartare il surnatante in
disinfettante, lasciando 1 mL per risospendere il sedimento.
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Nota: L'uso di DTT permette la diluizione e facilita il recupero dei microrganismi
presenti nel campione137.
3. Trattamento con N-acetil-L-cisteina (NALC): Includere NALC in fase di
decontaminazione (consultare decontaminazione dei campioni con NALC-NaOH).
Decontaminazione dei campioni usando NaOH (metodo modificato di Petroff)138-140
NaOH è un decontaminante comunemente usato e serve come agente mucolitico, ma con
rigorosa osservanza alla riduzione dei tempi per il metodo di Petroff modificato in quanto è
leggermente più dannoso per i bacilli tubercolari che per quelli contaminanti. Tuttavia, se si
utilizza il metodo originale di Petroff,il tempo di esposizione è protratto a 30 minuti e il
campione viene neutralizzato con HCL utilizzando una goccia di rosso fenolo come indicatore prima della semina sui terreni appropriati.
1 Aggiungere il campione (3-5mL) nella provetta da centrifuga e un volume
uguale di 4% NaOH (0,5 N) con 0,04 g/l di indicatore rosso fenolo già in essa
presente
2 Lasciare agire NaOH per 15 minuti a temperatura ambiente (20-25°C), passare
su vortex ad intervalli regolari (per esempio ogni cinque minuti)
3 Neutralizzare il campione con tampone fosfato sterile 0,067 M (pH 6.8) o 20 ml
di acqua distillata sterile
4 Centrifugare a 3000 xg per 15 minuti
Nota: se si utilizza NaOH 2% come agente di decontaminazione, questa concentrazione è
tossica per i contaminanti e ad alcuni micobatteri.
Decontaminazione dei campioni utilizzando NALC-NaOH138:
Questo metodo è quello "preferito" per la fase di digestione perché è il meno tossico per i
micobatteri e quindi fornisce il maggior numero di positivi. È il metodo più comunemente usato
nei laboratori clinici.
1. Aggiungere al campione un uguale volume di soluzione NALC-NaOH nella provetta
da centrifuga. Serrare il tappo a vite Nota: miscelare volumi uguali di NALC-NaOH* e Na3C6H5O72H2O** (citrato
trisodico 2H2O). Queste soluzione possono essere preparate il giorno prima dell’uso.
Il giorno stesso dell’uso aggiungere 2% di NALC in quanto la sua attività declina se
preparata in precedenza e stoccata.
*Aggiungere 4g di NaOH a 100 mL di acqua distillata per preparare la soluzione di
lavoro di NaOH
**Aggiungere 2.9g di Na3C6H5O72H2O (o 2.6g se si utilizza sodio citrato anidro) a
100 mL di acqua distillata per preparare la soluzione di lavoro di Na3C6H5O72H2O
2. Agitare la provetta su vortex per non più di 20sec. Invertire la provetta in modo che
NALC-NaOH venga a contatto con tutta la sua superficie interna. Evitare
un’eccessiva agitazione
3. Lasciare la provetta a riposo per 15 minuti a temperatura ambiente (20-25° C) per
decontaminare il campione
4. Diluire il composto con tampone fosfato sterile M 0,067 (pH 6,8) contenente
indicatore rosso fenolo e capovolgere più volte per mescolare il contenuto
5. Centrifugare a 3000 xg per 15 minuti
Nota: Se si processa espettorato, dovrebbero essere effettuati tre lavaggi e non uno.
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Decontaminazione dei campioni utilizzando fosfato trisodico e benzalconio
(TSPB)139.141
Questo metodo è considerato una procedura utile perché questi composti chimici sono
abbastanza atossici per i micobatteri e producono una migliore mucolisi.
Il tempo di esposizione di questa procedura non è critico per la vitalità dei bacilli tubercolari. I
suoi limiti sono l’impegno operativo e la carenza dei materiali necessari, in quanto il
benzalconio non è facilmente disponibile.
Aggiungere il campione nella provetta da centrifuga e un volume uguale di
soluzione TSPB
Serrare il tappo a vite e passare su vortex. Lasciare riposare a temperatura
ambiente per 30 minuti
Neutralizzare la miscela con tampone fosfato sterile 0,067 M (pH 6,8) e passare
brevemente su vortex per mescolare il contenuto
Concentrazione
Centrifugare a 3000 xg per 15 min usando contenitori chiusi all'interno della centrifuga.
Scartare il sopranatante in disinfettante lasciando 1 mL per risospendere il sedimento o
risospendere in 1-2 ml di tampone fosfato sterile 0,067 M (pH 6,8). (Quest'ultimo ha l'effetto
aggiuntivo di aumentare l'attività di neutralizzazione).
4.5.1.2 Campioni altamente contaminati da batteri Gram-negativi
I campioni altamente contaminati da batteri Gram negativi includono:
• . Urine.
• Cute o biopsie di tessuto da siti non sterili.
• Campioni post mortem.
• Pus, aspirati e fluidi.
Pre-trattamento
• Centrifugare i campioni fluidi, ad esempio, urina o pus se il volume di liquido è
adeguato e sufficiente, in provette ermeticamente chiuse a 3000 x g per 15 minuti.
Non miscelare i campioni di urine
• Aprire la centrifuga e scartare con attenzione il surnatante in un contenitore con
disinfettante.
• Tagliare il tessuto in piccoli pezzi con un bisturi sterile e omogeneizzare tutti i
frammenti in un mortaio sterile o in una macina per tessuto. Trasferire in un
contenitore sterile universale. Inserire una porzione del campione in un provetta bijou
sterile e conservare a ≤ -20°C per eventuale ripetizione della coltura nel caso sia
contaminata. Seminare direttamente.
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Decontaminazione del campione usando 0.5N) H2SO4139,142
Questo metodo è utilizzato per campioni che producono regolarmente colture contaminate
quando trattate con una delle digestioni alcaline. Un limite importante di questo metodo è che
può inibire la maggior parte dei bacilli tubercolari presenti nel campione.
1. Aggiungere un uguale volume di H2SO4 (0.5N) a tutti fluidi /campioni di tessuti e
lasciare agire per 20-30 min. I tempi delle diverse fasi devono essere rivisti in
funzione della percentuale di contaminazione di laboratorio per diversi tipi di
campioni.
2. Riempire il contenitore sterile con tampone fosfato 0,067 M (pH 6,8) dopo il
trattamento e la centrifugare a 3000 xg per 15 min.
3 Scartare il sopranatante in un contenitore per rifiuti lasciando il sedimento in circa 1
ml di liquido o risospendere in 1-2 ml di tampone fosfato sterile 0,067 M (pH 6,8).
(Quest'ultimo ha anche l'effetto di aumentare l'attività di neutralizzazione).
4 Neutralizzare il sedimento con NaOH 4% contenente un indicatore rosso fenolo (si
aggiunge l'indicatore di fenolo in modo che la neutralizzazione possa essere
verificata visivamente. Tuttavia, l'uso di basse concentrazioni di NaOH (2%) con una
diluizione dovrebbero ovviare alla necessità di questa fase.
5 Inoculare il sedimento direttamente sul terreno di coltura (nei campioni di urina)
Nota: Si deve notare che l'uso di indicatore rosso fenolo non è obbligatoria. Gli utenti omettono l'uso dell’indicatore rosso fenolo quando hanno validato i loro metodi. Tuttavia, alcuni utenti utilizzano questa procedura per garantire che la neutralizzazione è avvenuta, soprattutto durante la formazione del personale..
4.5.1.3 Campioni contaminati con specie Pseudomonas
I campioni includono espettorato ed altri quali quelli respiratori da pazienti con fibrosi cistica o bronchiectasie che possono essere costantemente colonizzati da specie Pseudomonas.
Omogenizzazione
Consultare la sezione la sezione 4.5.1.1 Campioni da sedi non sterili.
Decontaminazione dei campioni mediante acido ossalico5%139
Questo metodo viene utilizzato per i campioni contaminati in modo consistente da specie
Pseudomonas.
1. Aggiungere al campione quantità sufficiente di acido ossalico al 5% in un contenitore di plastica universale riempito quasi completamente e passare su vortex .
2. Lasciare agire l’acido per 30 minuti (o più a lungo se necessario) agitando a intermittenza per facilitare l’omogeneizzazione e la decontaminazione
3. Centrifugare il campione per 15 minuti a 3000 x g
4. Decantare il sopranatante in un contenitore contenete un’appropriata quantità di disinfettante
5. Neutralizzare il campione con NaOH (0,5 N) o risospendere in 1-2ml di tampone fosfato sterile 0,067 M (pH 6,8).
Oppure
Nota: Se recupero di M. tuberculosis da campioni prelevati con tamponi,
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1. Coprire il tampone con acido ossalico al 5% per 15 minuti e poi trasferire in
soluzione salina sterile per alcuni minuti
2. Questo può essere poi rimosso e lasciato sgocciolare.
3. Prima della semina nei terreni neutralizzare il campione (tampone) con 2-3 mL di
citrato di sodio sterile 5% per 5 minuti
4.5.1.4 Campioni da sedi sterili
Il liquido cefalorachidiano (LCR), sangue e altri campioni da sedi normalmente sterili, o
campioni già dimostratisi privi di batteri vitali dopo esame colturale, non necessitano di
decontaminazione (consultare di seguito se il campione fluido è intensamente colorato di
sangue come quelli pleurici). Oltre alla coltura per micobatteri questi campioni dovrebbero
essere saggiati con l’esame colturale per altri patogeni (consultare B 27 - Investigation of
cerebrospinal fluid, B 37 - Investigation of blood cultures for organisms other than
Mycobacterium species o altre SMI appropriate) per eliminare altre cause di infezione. Ciò
indica l'assenza di altri batteri o pone in evidenza la necessità di procedure di
decontaminazione. In questa condizione considerare il ricorso a saggi molecolari prima della
procedura.
Centrifugare il LCR e gli altri campioni fluidi da sedi sterili prima della preparazione dello
striscio e della coltura (3000 x g per 15 minuti, come descritto in precedenza). Per ridurre i
falsi segnali positivi di rilevazione del sistema di fluorescenza può essere appropriato
"Decontaminare" come in 4.5.1.2, i fluidi intensamente colorati di sangue diversi dal LCR
prima dell’incubazione nei sistemi automatici per colture liquide. Utilizzare il restante del
sedimento e del surnatante (se disponibile) per la coltura. Per i campioni di LCR, dopo la
semina di terreni di coltura appropriati, aggiungere al contenitore originale un terreno liquido di
coltura (ad esempio di Kirchner), se disponibile, e incubare con gli altri terreni. In alternativa, il
terreno di coltura di un sistema automatico per colture liquide di bacilli tubercolari può essere
utilizzato per lavare il contenitore.
Omogeneizzare i tessuti e le biopsie e decontaminare se necessario. Utilizzando procedure
asettiche, inoculare le biopsie dei tessuti e osso sminuzzato in piccoli frammenti, direttamente
sulla superficie di un terreno solido e di terreni di arricchimento.
4.5.2 Sistemi automatici di monitoraggio
I sistemi automatici di coltura sono raccomandati per una più rapida e agevole ricerca della
crescita dei micobatteri2. I sistemi automatici segnalano lo sviluppo dei micobatteri rilevando il consumo di ossigeno o produzione di CO2. Questi sistemi riducono notevolmente la media del
tempo richiesta per la crescita dei micobatteri rispetto a quelli solidi a becco di clarino143-145. I
terreni solidi sono utilizzati in associazione ai precedenti2,12,50,146. Rari isolati di M.
tuberculosis si sviluppano solo su terreni contenenti uovo, quali il becco di clarino di
Lowenstein Jensen (LJ)12. Si raccomanda un solo piruvato incorporato nel becco di clarino del
LJ (o altro terreno contenente uovo) per ottimizzare la crescita del M. bovis12 Alcuni
micobatteri non tubercolari possono non produrre segnali di crescita nei terreni liquidi e si
richiede la definizione di una valutazione adeguata per utilizzare solo la coltura in fase liquida.
La coltura su terreno solido è inoltre richiesta per alcune tipologie di campioni quando si
devono utilizzare temperature d’incubazione diverse, come per le lesioni superficiali.
I sistemi automatici di coltura sono pure utilizzati per le prove di sensibilità, con riduzione del
tempo di risposta dei risultati a 4-12 giorni.
Nota: Se il campione ha un volume insufficiente per tutte le indagini richieste, le prove da
eseguire devono essere selezionate su indicazione clinica (consultare B 27 - Investigation of
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Per ridurre il rischio di perdere colture positive, e seguendo le istruzioni del produttore per
l'uso, le colture liquide che sono in ultima analisi negative su un sistema automatico, prima di
essere scartate devono essere ispezionate visivamente per ricercare la crescita di
microrganismi.
4.5.3 Coltura
Tutti i campioni sono trattati come seguente:
1. Preparare i flaconi secondo le istruzioni del produttore.
2. Inoculare la superficie di un becco di clarino di Löwenstein Jensen (LJ) piruvato a pH
neutro (o altro mezzo idoneo a base d'uovo) con 0,2 mL di campione trattato e un
terreno di coltura liquido (con un volume adeguato, come specificato dal produttore).
3. Inoculare i campioni prelevati da sedi superficiali, quali la cute, in due set di terreni,
uno dei quali è incubato a 28-30° C. Usare due temperature di incubazione per i
lavaggi bronchiali con strisci positivi, perché i micobatteri che più comunemente contaminano broncoscopi ed endoscopi preferiscono una bassa temperatura per la crescita. Anche campioni fluidi, osso e articolazioni possono richiedere l’incubazione a 2 temperature per ottimizzare il recupero di tutte le specie NTM50. Si consideri per esempio, se il campione è di una estremità dell'arto e/o uno striscio diretto positivo e la diagnosi di tubercolosi non è attesa.
4. Angolare lievemente il becco di clarino per consentire al campione di essere inoculato sull'intera superficie. Assicurarsi che i tappi siano ben chiusi.
5. Incubare i becchi di clarino a 35-37°C per 8 settimane estendibili a 12, se necessario; controllare tutte le settimane per verificare la presenza di eventuale
sviluppo di acido resistenti58.
6. Utilizzare sistemi di incubazione automatizzati con flaconi liquidi e incubare secondo le istruzioni del produttore. Per piccoli volumi, protrarre il periodo di incubazione. La percentuale d’isolamento dal LCR può essere aumentata aggiungendo un mezzo liquido come quello di Kirchner o Middlebook 7H9 al contenitore originale e incubare a 35-37°C perché è noto che i micobatteri aderiscono alle pareti dei contenitori di plastica. In alternativa, lavare il contenitore originale con il brodo da flacone di coltura automatizzata.
7. .Conservare il sedimento inutilizzato trattato in caso i campioni debbano essere decontaminati. Se non è necessario per altri saggi, l'intero campione del LCR deve essere posto in coltura per ottimizzare la percentuale di isolamento.
8. Confermare la presenza di bacilli acido resistenti (AFB) in coltura positiva con colorazione di Ziehl-Neelsen o auramina-fenolo. La prima può essere preferita per il maggiore dettaglio morfologico ottenuto. Quando eseguita su flaconi con liquido di coltura positivo si raccomanda di effettuare la colorazione Gram per consentire il rilevamento di contaminazione e/o una piastra di agar sangue predisposta per lo stesso scopo.
9. Inviare aliquote delle culture confermate positive (in contenitore impermeabile con marchiatura CE inserito in sacchetto di plastica sigillato) al Laboratorio di Riferimento
competente, in conformità alle regolamentazioni postali e del trasporto110.
10. Controllare la proliferazione batterica nella fase post decontaminazione utilizzando piastre di purificazione.
Nota: Predisporre entro un giorno lavorativo dal ricevimento la coltura automatica in fase liquida associata a quella convenzionale solida per almeno un campione per ogni tipologia di
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campione. Per soddisfare lo standard diagnostico raccomandato dal Department of Health
Guideelines i laboratori devono prestare servizio per sei giorni lavorativi2.
4.5.4 Test di amplificazione degli acidi nucleici
I saggi di amplificazione degli acidi nucleici (NAAT) sono appropriati come metodo primario di
diagnostica in alcune circostanze1. Per una discussione più dettagliata, si veda l'introduzione e le raccomandazioni del NICE.
1. Il test molecolare per la diagnosi di tubercolosi sta sempre più diventando un protocollo standard quando il sospetto clinico è forte.
2. Di base, i test rapidi di amplificazione degli acidi nucleici per la diagnosi di M. tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum) dovrebbero essere richiesti su campione primario idoneo se sussiste il sospetto clinico di malattia tubercolare, e per
paziente con HIV o
informazione rapida su specie di micobatteri che potrebbero modificare la terapia o
sia richiesto per tracciare e rilevare eventuali contatti
3. Nei bambini e giovani di 15 anni o più giovani con TBC polmonare sospetta, si deve offrire un rapido test diagnostico di amplificazione degli acidi nucleici per il complesso M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum). Di solito sarà necessario solo 1 test di amplificazione degli acidi nucleici per tipo di campione (per esempio, espettorato spontaneo, indotto o lavaggio gastrico).
4. Nei giovani di età compresa tra 16-18 anni si usano gli stessi criteri applicati agli adulti per decidere se richiedere test rapidi di amplificazione degli acidi nucleici
5. I medici dovrebbero considerare una diagnosi di TBC extrapolmonare, anche se i test diagnostici rapidi, ad esempio, liquido cerebrospinale, liquido pleurico o liquido ascitico sono negativi
6. Anche se un test diagnostico rapido è negativo, consigliare il trattamento per la meningite da TB se i segni clinici e altri risultati di laboratorio sono coerenti con la diagnosi.
7. In teoria, i test diagnostici rapidi di amplificazione degli acidi diagnostici per rifampicina (e eventualmente,di resistenza all’isoniazide) dovrebbero essere effettuati di routine su tutti i casi positivi allo striscio per AAFB o se M. tuberculosis. viene rilevato direttamente sul espettorato con un test NAAT
8. Di base, per le persone con sospetto clinico di TB, i test diagnostici rapidi di amplificazione degli acidi nucleici sul campione primario per la resistenza alla rifampicina dovrebbero essere intrapresi se la valutazione del rischio per la resistenza ai farmaci identifica uno dei seguenti fattori di rischio:
anamnesi di trattamento precedente per TB, in particolare se era nota scarsa osservanza alla prescrizione
contatto con un caso noto di tubercolosi multi-resistente
nascita o residenza in un paese in cui l'Organizzazione Mondiale della Sanità segnala una percentuale elevata (5% o più) di nuovi casi di tubercolosi multi-resistente
Tutte le NAAT devono essere eseguite secondo le istruzioni del produttore.
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In teoria, campioni clinici idonei dovrebbero essere inviati per le indagini convenzionali di
microscopia e coltura per AFB come sopra specificato.
Nota: Si deve notare che, se non è disponibile un volume di campione sufficiente per PCR e
coltura, dovrebbe essere eseguita solo la coltura. Tutti i campioni, anche se PCR positivi,
devono essere sottoposti a coltura.
4.5.5 Terreni di coltura, condizioni e microrganismi
Aspetti
clinici/
condizioni
Campione Terreni
standard
Incubazione Lettura
colture
Microrganismo
(i) bersaglio)
Temp oC
Atmos Tempo
Tutte le
condizioni
Campioni sterili
:
Sangue
Tutte le ossa
midollo osseo
aspirati
Tampone ferita
Pus o tamponi
pus**
LCR
Ascite
Liquido articolare
Liquido pleurico
Sistemi liquidi
automatici *
e
LJ + piruvato
35 – 37
Aria
8 settimane
estensibili a 12
settimane se
richiesto58
Settimanale
Specie
Mycobacterium
Campioni non-
sterili
Espettorato
Lavaggio bronco-
alveolare/lavaggio
bronchiale
Lavaggio
gastrico
Sistemi liquidi
automatici *
e
LJ +piruvato***
35 – 37
Aria
8 settimane
estensibili a 12
settimane se
richiesto58
Settimanale
Mycobacterium
tuberculosis
Tubercolosi
Genitourina
ria
Urine
Sistemi liquidi
automatici *
e
LJ +piruvato
35 – 37 Aria 8 settimane
estensibili a 12
settimane se
richiesto58
Settimanale
Specie
Mycobacterium
Infezioni
cute
Granuloma
da acquario
- ulcera
cutanea (o
di “Buruli” o
“ulcera
Bairnsdale”
Lesioni cutanee
Biopsia tessuti
LJ + piruvato 28 - 30
Aria
8 settimane
estensibili a 12
settimane se
richiesto58
Settimanale
M. marinum
M. ulcerans
M. chelonae
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Chirurgia cardiaca
Sedi post-chirurgiche es sternotomia
Sistemi liquidi automatici *
e
LJ +piruvato
35 - 37 Aria 8 settimane estensibili a 12 settimane se richiesto
58
Settimanale
Gruppo M.chimaera / M. avium – gruppo intracellulare
Per queste condizioni, aggiungere quanto segue
Aspetti clinici/
Condizioni
Campione Terreni standard
Incubazione Lettura colture
Microrganismo (i) bersaglio)
Temp oC
Atmos Tempo
Meningite tubercolare
LCR e altri campioni diversi da espettorato
Terreno liquido di Kirchner
Oppure
Middlebrook 7H9
35 – 37 Aria 8 settimane estensibili a 12 settimane se richiesto
58
Settimanale Specie Mycobacterium
Aspetti clinici/
Condizioni
Campione Terreni standard
Incubazione Lettura colture
Microrganismo (i) bersaglio)
Temp oC
Atmos Tempo
Osteomielite
Considerare ossa e fluidi articolari ad esempio da estremità e/o da striscio diretto positivo
Sistemi liquidi automatici *
e
LJ + piruvate
28 - 30
Aria 8 settimane estensibili a 12 settimane se richiesto
Note: M.xenopi non crescono bene in terreno con piruvato preferendo il glicerolo.
42 Aria 8 settimane estensibili a 12 settimane se richiesto
58
Settimanale M. xenopi
* Se si utilizzano sistemi di monitoraggio automatizzati, dopo la decontaminazione dei campioni clinici, fare riferimento ai protocolli locali e alle raccomandazioni del produttore. Questi dovrebbero essere controllati in modo continuo per emissione di segnale positivo dal flacone. Per verificare la presenza di contaminazione dovrebbe essere seminata una piastra di agar sangue per tutti i flaconi che vengono segnalati positivi.
** Per i micobatteri i tamponi di pus non rappresentano il tipo di campione di scelta. Questo perché se presenti, possono aderire al tampone piuttosto che essere trasferiti con successo nel terreno di coltura
135.
*** BCG e M.xenopi non crescono bene nel terreno con piruvato preferendo il glicerolo.
Per isolare specie di micobatteri spiccatamente esigenti possono essere richiesti supplementi addizionali.
Nota: In alcune circostanze per il test NAAT è opportuno consultare il paragrafo 4.5.4.
4.6 Identificazione La maggior parte dei laboratori invia i propri isolati per l'identificazione e test di sensibilità ai laboratori di riferimento.
I microrganismi possono essere ulteriormente identificati su indicazione clinica o epidemiologica.
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Nota: Per alcuni isolati NTM, soprattutto i micobatteri a rapida crescita (RGM) (M. fortuitum,
M abscessus, e M. chelonae), possono essere richieste altre tecniche di identificazione in
vitro quali test di sensibilità estesi, sequenziamento del DNA o test di restrizione
endonucleasica mediate polymerase chain reaction (PRA). A causa delle differenze di
sensibilità agli antibiotici che determinano le opzioni di trattamento, l'identificazione delle
specie a livello di NTM sta diventando clinicamente sempre più importante. Diversi fattori
aumentano la probabilità del significato clinico degli isolati NTM, compreso il riscontro da più
campioni o sedi e l’isolamento del microrganismo in grande quantità (strisci positivi di
campioni AFB), o il riscontro di un isolato NTM da una sede normalmente sterile come il
sangue. Nel caso di primo riscontro di micobatteri, tuttavia, a volte è difficile determinare il
significato clinico senza identificazione a livello di specie. Pertanto, è richiesta l'identificazione
a livello di specie della maggior parte dei micobatteri isolati non solo come gruppo, come è
espressamente raccomandato, ad esempio, per il gruppo M.chelonae/abscessus50.
Nel caso in cui uno specifico laboratorio non disponga della tecnologia necessaria per
l'identificazione delle specie di un isolato NTM, questo può essere inviato per ulteriori
accertamenti ad un laboratorio di riferimento per Micobatteri (consultare 4.9).
4.6.1 Livello minimo di identificazione in laboratorio
Livello genere Mycobacterium (si avvale della colorazione della coltura con Ziehl-Neelsen o
auramina-fenolo). Identificare almeno un AFB isolato da ogni nuovo paziente a livello di complesso/specie, ed
eseguire prove di sensibilità adeguate se sono stati identificati MTBC2. Queste sono di solito
eseguite in un la boratorio di riferimento per micobatteri (di seguito elencati).
Ripetere gli accertamenti per gli AFB isolati dallo stesso paziente e le prove di sensibilità per
MTCB se l’isolato proviene da un campione raccolto 3 mesi o più dopo un precedente
l’isolamento di microrganismo MTBC4.
4.7 Prove di Sensibilità agli Antimicrobici
Consultare il National Mycobacterium Reference Laboratory come richiesto.
Per altri riferimenti nazionali e regionali, fare riferimento alla sezione 4.9 per ulteriori
informazioni.
Deve essere identificato come livello di complesso/specie almeno un isolato di AFB di ogni
nuovo paziente ed eseguita una prova adeguata di sensibilità se si è identificato un MTBC2. Ripetere per gli AFB isolati dallo stesso paziente l’identificazione e un nuovo test di sensibilità
per MTBC se isolato da un campione prelevato tre mesi o più dopo una precedente positività per
MTBC2.
4.8 Invio per ricerche su focolaio epidemico
Poiché nel Regno Unito la tubercolosi è una malattia soggetta a denuncia, per la gestione
della salute pubblica dei casi, i contatti e le epidemie, tutti i casi sospetti devono essere
notificati immediatamente ai Public Health England Centres.
Tutti gli isolati clinicamente significativi devono essere comunicati dai laboratori diagnostici per
garantire l'inizio urgente delle procedure appropriate e tutti questi isolati devono essere inviati
al laboratorio nazionale di riferimento per ulteriori accertamenti.
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4.9 Invio ai Laboratori di Riferimento
Per informazioni sulle prove disponibili, tempi di risposta, procedure per il trasporto e altre
richieste del laboratorio di riferimento, click here for user manuals and request forms.
Microrganismi con resistenze insolite o inattese, o qualora sussista un problema clinico o di
laboratorio, o anomalie che richiedano approfondimenti devono essere inviati agli appropriati
laboratori di riferimento.
Contattare l’appropriato laboratorio nazionale di riferimento per informazioni sulle prove
disponibili, tempi di consegna, procedure di trasporto ed eventuali altri richieste per ‘invio del
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5.2.1 Tempo refertazione coltura
Comunicare quando disponibili i risultati delle nuove colture positive e quelli clinicamente urgenti.
Per rispettare i criteri accettati a livello internazionale, i campioni devono essere posti in coltura e i bacilli isolati identificati entro 21 giorni dal ricevimento in laboratorio del campione per almeno il 90% di loro2.
Emettere i referti negativi dei sistemi automatici liquidi secondo le istruzioni del produttore.
Emettere il referto negativo dopo 8 -12 settimane se si è usata una coltura su terreno solido.
Molecolare
Refertazione NAAT
Positivi
MTBC Complesso / i micobatteri non rilevato per (NTM) tubercolare / MDR-TB.
Negativi
Complesso MTBC / micobatteri non tubercolari (NTM) / MDR-TB non rilevati.
Tempo refertazione NAAT
Risultati PCR appena ottenuti.
Referto tipizzazione ceppo
I 24 loci MIRU-VNTR sono refertati dai Laboratori di Riferimento Micobatteri via Mycobnet (Mycobacterial Surveillance Network) Come una stringa di 24 cifre nello stesso ordine, e
cioè:
ETRS: A, B, C, D, E; Seguito da dieci Mirus: 2,10,16,20,23,24,26,27,39,40; Seguiti da
Questi aiutano a ridurre al minimo un falso di raggruppamento e ad abilitare la
standardizzazione internazionale.
Se un locus contiene oltre 9 ripetizioni, le lettere maiuscole sono usate per indicare il numero di copie (A per il 10 e così via).
Se e presente una delezione parziale di una ripetizione in ETR-D, quindi tutte le ripetizioni sono contate includendo la ripetizione parziale, e la presenza della ripetizione parziale è indicata nel conteggio da a’
E ' stato raccomandato che dovrebbe essere disponibile un genotipo MIRU-VNTR per ogni nuovo isolato MTBC, segnalato nell’archivio nazionale entro 21 giorni dalla ricezione al laboratorio di riferimento per ≥95% dei micobatteri isolati2.
Nota: La PHE inizialmente ha sviluppato on-line un dispositivo per fornire una scorciatoia
per l'Identificazione di un gruppo molecolare con "Nome di gruppo" anziché il codice con 24 caratteri, raccomandato in quanto questa proposta riduce i costi, migliora l’efficienza e aumenta l’efficacia. Tuttavia, sono presenti tecnologie in evoluzione che miglioreranno la tipizzazione in futuro147.
5.3 P rove di Sensibilità agli Antimicrobici
Refertare le sensibilità come clinicamente suggerito.
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Per i MTBC, i risultati delle prove di sensibilità dei principali agenti terapeutici (es. isoniazide,
rifampicina, pirazinamide, etambutolo) dovrebbero essere disponibili per ≥ 95% dei campioni
entro 30 giorni dal ricevimento del campione nel laboratorio a cui sono stati inviati2.
Questi risultati devono essere disponibili entro 14 giorni se il MTBC isolato è stato ricevuto dal
laboratorio specializzato per prove di sensibilità di laboratorio2.
6 Notifica al PHE148,149
o Equivalente150-153
Le Norme di Denuncia del 2010 rendono obbligatorio ai laboratori diagnostici di denunciare alla Public Health England (PHE) tutti i casi nei quali s’identificano gli agenti causali elencati nella Scheda 2 della Direttiva. Le denunce devono pervenire per scritto, su carta o per via elettronica, entro sette giorni. I casi urgenti devono essere notificati il più presto possibile verbalmente: si raccomanda entro le 24 ore. Questi stessi devono essere in seguito denunciati in forma scritta entro sette giorni.
Secondo la Notification Regulations il laboratorio ricevente la notifica è l’ufficio locale della PHE. Se il caso è già stato notificato da un professionista medico abilitato, al laboratorio diagnostico è ancora richiesta la denuncia del caso qualora si riscontrino evidenze d’infezione imputabili ad agenti causali soggetti a tale disposizione.
La denuncia secondo la Direttiva dell’Health Protection (Notification) Regulations 2010 non sostituisce l’informazione volontaria alla PHE. La maggior parte dei laboratori del NHS segnala spontaneamente al PHE gran parte delle diagnosi di laboratorio sostenute da vari agenti eziologici e molte sezioni della PHE hanno definito accordi con i laboratori locali per segnalazioni urgenti di alcuni tipi d’infezione. Queste iniziative devono continuare. Nota: La linea guida dell’Health Protection Legislation Guidance (2010) include la segnalazione per Human Immunodeficiency Virus HIV & Sexually Transmitted Infections STIs, Healthcare Associated Infections e HCAIs e Creutzfeldt–Jakob disease CJD da includere nel ‘Notification Duties of Registered Medical Practitioners’, e non al ‘Notification Duties of Diagnostic Laboratories’.
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Appendice: Indagine nei campioni di specie Mycobacterium
Terreni standard
Tutti i campioni tranne
infezioni cutanee, osso/
articolazioni, fluidi da
estremità e strisci positivi
dal lavaggio BAL
Sistemi automatizzati per
liquidi LJ + piruvato
Incubare a 35-37°C in aria
Lettura continua
Seguire istruzioni del
produttore
Mycobacterium
tuberculosis
Altre specie
Mycobacterium
LJ + piruvato
M. marinum
M. ulcerans
M. chelonae
Micobatteri non
tubercolari
Infezioni cutanee ecc
Incubare a 28-30°C in
aria
Lettura a 8-12 settimane
se richiesta
Striscio positivo BAL/
lavaggio
LJ + piruvato
Terreni supplementari
LCR e altri campioni
diversi da espettorato
Terreno liquido di
Kirchner’s o Middlebrook
7H9
Incubare a 35-37°C in aria
Lettura settimanale
a 8-12 settimane se
richiesta
Terreni opzionali
Incubare a 42°C in aria
Lettura settimanale
a 8-12 settimane se
richiesta
M. xenopi
Incubare a 28-30°C in aria
Lettura settimanale
4-6 settimane
Micobatteri a crescita
rapida
Preparare i campioni clinici
LJ + glicerolo
Espettorato
BAL/lavaggio
Lavaggio gastrico
Incubare a 35-37°C in aria
Lettura settimanale
a 8-12 settimane se
richiesta
Specie Mycobacterium
REFERTO: Tutti i microrganismi che sono stati isolati (con identificazione, se appropriata, di potenziali micobatteri non-tubercolari )
Tutti microrganismi non isolati
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Bibliografia
Tabella GRADE modificata utilizzato da UK SMI per valutare la bibliografia
Il GRADE (Grading of Recommendations, Assessment, Development, and Evaluation) è un approccio sistematico alla valutazione della bibliografia. Per le UK SMI si utilizza un metodo GRADE modificato per valutare l’inclusione dei riferimenti bibliografici. Ogni riferimento bibliografico è valutato e assegnato a un grado di consistenza delle raccomandazione (A-D) e alla qualità delle prove soggiaenti(I-VI). Di seguito è presentata una tabella riassuntiva che definisce il grade che deve essere utilizzato in congiunzione con l’elenco delle voci bibliografiche.
Consistenza della raccomandazione
Evidenza della qualità
A Fortemente raccomandata I Dimostrazione da studi controllati, randomizzati, meta-analisi, e revisionati sistematicamente
B Raccomandata ma possono essere accettabili altre alternative
II Dimostrazione da studi non randomizzati
C Debolmete recommandata: ricercare alternative
III Studi non-analitici, es. casi riportati, recensioni, serie di casi
D Mai consigliate IV Opinione degli esperti e ampia accettazione come buona pratica, ma con nessuna prova di studio
V Richiesto dalla normativa, codice di buona pratica o norma nazionale
VI Lettera o altro
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