Ricardo Helman A expressão da mutação JAK2V617F em células endoteliais de pacientes com Síndrome Budd-Chiari e sua correlação com as doenças mieloproliferativas crônicas Ph negativo Tese apresentada ao Curso de Pós- Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Medicina SÃO PAULO 2016
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Ricardo Helman
A expressão da mutação JAK2V617F em células endoteliais de
pacientes com Síndrome Budd-Chiari e sua correlação com as
doenças mieloproliferativas crônicas Ph negativo
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Medicina
SÃO PAULO
2016
Ricardo Helman
A expressão da mutação JAK2V617F em células endoteliais de
pacientes com Síndrome Budd-Chiari e sua correlação com as
doenças mieloproliferativas crônicas Ph negativo
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Medicina Área de Concentração: Ciências da Saúde Orientador: Prof. Dr. Carlos Sergio Chiattone
SÃO PAULO
2016
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Helman, Ricardo A expressão da mutação JAK2V617F em células endoteliais de pacientes com Síndrome Budd-Chiari e sua correlação com as doneças meiloprofilerativas crônicas Ph negativo./ Ricardo Helman. São Paulo, 2016.
Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.
Área de Concentração: Ciências da Saúde Orientador: Carlos Sérgio Chiattone 1. Síndrome de Budd-Chiari; 2. Mutação; 3. Janus quinase 2; 4.
Células endoteliais BC-FCMSCSP/18-16
Dedicatória
DEDICATÓRIA
A meus pacientes, Delma e Claudio, que lutaram até o último minuto contra
uma doença cruel sempre com um sorriso no rosto.
À minha esposa, Luciana, sempre ao meu lado com muito carinho e amor.
Aos meus pais, Anita e Rafael, que sempre me apoiaram incondicionalmente.
Sou eternamente grato por tudo que fizeram por mim.
A minha irmã, Priscila, pela amizade e companheirismo, toda essa
caminhada.
Agradecimentos
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de Misericórdia de São
Paulo – FCMSCSP – aonde iniciei minha jornada na medicina e aprendi a amar
cada tijolinho.
Ao Departamento de Hematologia, aonde me apaixonei por essa
especialidade vibrante, em que a cada ano o conhecimento parece multiplicar-se
numa velocidade difícil de imaginar. Local em que fiz amizades sinceras, Talita,
Sergio, João Paulo e Martucci, Edvan, vocês foram especiais nessa caminhada.
Às meus professores e mestres, que com muita dedicação e carinho, me
introduziram no mundo da Hematologia. Rodolfo, Vania, Cristina Bortolheiro, Sergio
Brasil, Carmem, Andreza, Fabio Kerbauy, obrigado por me apoiarem nessa jornada.
Aos meus amigos e colegas de trabalho, Fabio Pires, Tarcila, Iracema,
Guilherme, Breno, Morgani, Joyce, Claudia, Paulo, obrigado por fazermos parte
dessa equipe maravilhosa, aonde um sorriso e uma gargalhada sempre encerram
um dia difícil de trabalho.
Aos colegas médicos, biomédicos, enfermeiros, Isabel, Sandra, Michelli,
Renato Puga e Welbert, por ajudarem a criar o nosso Projeto LMA Brasil, que tornou
possível o sonho de concluir essa tese.
Agradecimento especial aos meus mestres, Carlos Chiattone e Nelson
Hamerschlak, que me inspiram diariamente, sempre lembrando que a medicina é
mais do que uma profissão, é um ofício.
Abreviaturas
ABREVIATURAS
CE Células Endoteliais
DMPC Doença Mieloproliferativa Crônica
DNA Deoxyribonucleic acid
LMA Leucemia mielóide aguda
LMC Leucemia mielóide crônica
LMCA Leucemia mielóide crônica atípica
LMMC Leucemia mielomonocítica crônica
LNC Leucemia neutrofílica crônica
MF Mielofibrose primária
MS Mastocitose Sistêmica
N Normal
PBMCs Linfo-Monocelulares de Sangue Periférico
PCR Polymerase Chain Reaction
PV Policitemia Vera
SBC Síndrome de Budd-Chiari
SHE Síndrome hipereosinofílica
T Tumor
TE Trombocitemia essencial
VAF Variant Allele Frequence
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
Sumário
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO…………………………………………………………...……........ 1 1.1. Doenças Mieloproliferativas Crônicas (DMPC) .......................................... 2 1.2. Mutação JAK2V617F.................................................................................. 4 1.3 Células Endoteliais (CE) ............................................................................. 7 1.4. Síndrome de Budd-Chiari (SBC) ................................................................ 8 1.5. Sequenciamento genético ......................................................................... 10 2. OBJETIVOS…………………………………………………………………........... 13 3. CASUÍSTICA E MÉTODOS …………………………………………...……........ 15 3.1. Critérios de Inclusão………………………………………………….............. 16 3.2. Critérios de Exclusão…………………………………………...……………… 17 3.3. Métodos - Coleta de Amostras…………………………………...…………… 17 3.3.1. Coleta de Amostras de Sangue e/ou Medula Óssea............................ 17 3.3.2 Coleta de DNA germinativo.................................................................... 17 3.3.3. Biópsia e Aspirado de Medula Óssea................................................... 18 3.4. Processamento das amostras..................................................................... 18 3.4.1. Separação de células mononucleares (PBMCs) ................................. 18 3.4.2. Protocolo de Hill EndoCult – cultura de células Endoteliais................. 19 3.4.3 Extração de DNA a partir de biópsia de pele e células endoteliais
19 3.4.4. Avaliação de quantidade e qualidade de DNA, RNA e Proteína.......... 20 3.4.5. Critérios de quantidade e qualidade para utilização da amostra.......... 20 3.4.6 Células endoteliais: seleção e quantificação......................................... 21 3.4.7. Pesquisa de mutação JAK2V617F nas CE.......................................... 21 3.4.8. Sequenciamento e Análise Bioinformática........................................... 21 4. RESULTADOS ……………………………………………………………………... 23 4.1. Cultura de Células Endoteliais ………………….......................................... 25 4.2. Sorting de células endoteliais..................................................................... 25 4.3. Sequenciamento de exoma........................................................................ 27 5. DISCUSSÃO ………………………………………………………………….......... 28 6. CONCLUSÕES ………………………………………………………………......... 35 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………….......... 37
Em todos os sete pacientes incluídos foi possível realizar a cultura de células
endoteliais com material extraído de aspirado de Medula Óssea, cultura foi realizada
conforme descrita nos Materiais e métodos. A Figura 3 representa a cultura de
células.
Figura 3: Cultura de células endoteliais após cinco dias incubação.
4.2. Sorting de células endoteliais
Após a extração das células endoteliais do meio de cultura foi realizado
sorting das mesmas conforme protocolo descrito acima. A Figura 4 representa os
histogramas da citometria de fluxo. A pureza de células endoteliais obtida após o
sorting com citometria de fluxo foi superior a 96%.
26
Resultados
Figura 4: Painel de citometria de fluxo de ECs CD45negVEGFR2+CD31+CD34+CD133.
Após a extração das CE foi pesquisada a presença da mutação JAK2V617F
nestas células, dos sete pacientes avaliados, em um deles a reação de PCR alelo-
específico não funcionou.
Em um paciente com diagnóstico de SBC a presença de JAK2 não
apresentava a mutação, apenas a tirosino quinase selvagem.
Nos outros cinco pacientes avaliados todos apresentaram a mutação
JAK2V617F em suas células endoteliais, sendo dois pacientes com diagnóstico de
Mielofibrose.
27
Resultados
Tabela 3: Frequência alélica mutação JAK2V617F.
ID_LAB ID_SEQ Tipo JAK2V617F DP VAF
1 MPC011 WP034 T
+ 150 0,13
WP035 N 70 .
2 MPC012 WP036 T
+ 159 0,05
WP037 N 86 .
3 MPC016 WP427 T
+ 190 0,88
WP051 N 91 .
4 MPC027 WP138 T
+ 123 0,20
WP139 N 81 0,01
5 MPC128 WP166 T
+ 142 0,06
WP167 N 90 .
Legenda: Identificação da amostra no laboratório (ID_LAB); identificação da amostra enviada para sequenciamento (ID_SEQ); tipos de amostra T = tumor e N = normal; Mutação JAK2V617F (chr9:5073770 G/T); número total de sequencias na posição da mutação JAK2V617F (DP) e a frequência do alelo variante Variant Allele Frequence (VAF).
4.3. Sequenciamento de exoma
Nos três pacientes com SBC sem DMPC a única mutação foi a mutação
JAK2V617F, embora numa frequência alélica baixa: 5%, 6% e 13%,
respectivamente. Nos dois pacientes com diagnóstico de MF, a frequência alélica da
mutação foi próxima de 90%.
28
5. DISCUSSÃO
29
Discussão
As doenças trombóticas apresentam uma enorme morbidade, podendo evoluir
muitas vezes com grande mortalidade. Dentre as principais localizações de
tromboses venosas graves, as tromboses mesentéricas incluindo tromboses de
veias Porta e Hepática, também conhecidas como Síndrome de Budd-Chiari, são as
que cursam com maior mortalidade.
O quadro grave de insuficiência hepática, cursando com ascite, icterícia,
sangramentos por varizes de Esôfago, decorrentes de hipertensão portal muitas
vezes é o primeiro sinal de alerta para uma doença trombótica ainda não
identificada.
A investigação completa de alterações genéticas ou adquiridas, conhecidas
genericamente como “trombofilias” deveria, portanto, ser considerada obrigatória em
todos pacientes que cursam com tromboses esplâncnicas. No grupo de pacientes
em acompanhamento no Hospital Albert Einstein apenas cinco pacientes não
apresentam nenhum tipo de trombofilia, sendo a presença e anticorpos
antifosfolípides e a mutação JAK2V617F as alterações mais diagnosticadas.
As primeiras publicações relacionando a mutação JAKV617F com tromboses
mesentéricas graves, inclusive com casuísticas com mais de 100 pacientes datam
do ano de 200856, inclusive com publicações importantes que analisaram a carga
alélica da mutação JAK2 em pacientes com trombose57.
Estas publicações deram origem a uma série de outros estudos retrospectivos
que comprovaram a relação entre a mutação JAKV617F com as doenças
trombóticas em geral, o que culminou com a publicação de uma meta-análise58
demostrando uma maior incidência desta mutação em pacientes com tromboses
portal e SBC de até 26% em relação à trombose em outros órgãos.
Em nossa opinião a investigação da presença da mutação JAK2V617F é
obrigatória em pacientes com tromboses mesentéricas, e embora não seja consenso
a sua investigação em pacientes com trombose em outras localidades, ela deve ser
realizada em paciente sem outros fatores de risco, como idade avançada, neoplasia,
tabagismo, obesidade e uso de anticoncepcionais orais.
30
Discussão
A correlação de DMPC com tromboses mesentéricas já está bem
estabelecida há muito tempo50,59 embora a sua fisiopatologia ainda não esteja
definida. Alguns autores advogam que o risco de trombose esteja relacionado com a
leucocitose presente nestes pacientes60, outros acreditam estar relacionada ao
aumento da viscosidade sanguínea, principalmente nos pacientes com Policitemia
Vera, mesmo os pacientes já em tratamento cito-redutor, com normalização dos
níveis de hematórcrito, hemoglobina e plaquetas, mantenham elevado risco de
novas tromboses, inclusive nos casos de pacientes em uso de medicações anti-
coagulantes.
A correlação entre as células endoteliais com a células tronco-
hematopoiéticas está bem estabelecida, seja através de teorias que correlacionam a
mesma origem embrionária, seja através da manutenção do pool de células tronco-
hematopoiéticas através da produção e liberação de fatores de crescimento pelas
células endoteliais43. Esta intrínseca relação entre estas duas linhagens nos
estimulou o procurar a expressão da mutação JAK2V617F nas CE.
A caracterização da tirosina quinase em CE foi descrita pela primeira vez na
dissecção de biópsia de fígado em pacientes com SBC61, e em seguida foi
demonstrado que a mutação JAK2 está presente em CE de modelos animais com
DMPC62.
Embora nos últimos anos tenham sido publicados diversos trabalhos
demonstrando a presença de mutação JAK2V617F nas CE, nenhum autor
conseguiu isolar estas células em pacientes vivos, com um grau de pureza acima de
90%. Normalmente as CE estão presentes em número muito restrito no sangue
periférico dos indivíduos, o que nos obriga a isolar estas células de algum órgão ou
tecido. Os primeiros estudos com aspirado de medula óssea foram realizados com
células isoladas de aspirado esternal de crianças cardiopatas no momento da
cirurgia cardíaca, com bons resultados após incubação em meio de cultura
desenvolvida por Hill e colaboradores63.
Em nosso estudo tentamos num primeiro momento utilizar exatamente a
mesma técnica de isolamento e expansão utilizados pelos autores chineses, porém
não conseguimos um número adequado de células após o “sorting” que fosse
31
Discussão
suficiente para a extração de DNA. Como nossa intenção foi extrair uma quantidade
de células endoteliais com um grau de pureza elevado, acima de 95%, tivemos que
fazer algumas alterações no protocolo original de cultivo EndoCult. Em primeiro
lugar coletamos uma quantidade maior de aspirado de medula óssea, cerca de 20
ml contra 5 ml que foi descrito pelo grupo chinês, em segundo lugar, prolongamos o
período de incubação em meio de cultura para sete dias ao invés de cinco.
No trabalho realizado pelo prof. Wu63 não foi realizada a quantificação
de pureza de CE após cultivo e expansão em meio de cultura, portanto não há
certeza se houve ou não contaminação com células polimorfo-nucleares.
Acreditamos que nosso estudo seja pioneiro na técnica de isolamento, cultivo
e expansão de células endoteliais, tendo como fonte aspirado de medula óssea,
uma vez que conseguimos uma pureza na amostra superior a 96% em todos os
pacientes estudados, confirmada através de painel de quatro cores de citometria de
fluxo.
As CE estão presentes numa quantidade muito pequena na medula óssea.
Planejamos num primeiro momento realizar o sequenciamento de exoma pareado
em tecido de pele, para termos o DNA chamado germinativo, pareado ao DNA
extraído das células tumorais, no caso os granulócitos e as células endoteliais
extraídas da medula óssea. Nosso objetivo a princípio era tentar identificar a
mutação JAK2V617F, assim como tentar identificar outras mutações relacionadas
DMPC nos dois tipos de linhagens celulares. Infelizmente a quantidade de DNA que
conseguimos extrair das nossas CE extremamente reduzida, o que inviabilizou a
realização de sequenciamento do exoma deste material. Não encontramos na
literatura nenhum estudo publicado de sequenciamento de células endoteliais,
acreditamos que a dificuldade de trabalhar com este tipo de linhagem celular ainda
seja uma barreira a ser superada. O meio de cultura desenvolvido por Hill e
colaboradores certamente nos ajudou muito a entender estas células, porém novas
técnicas de cultivo devem ser desenvolvidas nos próximos anos.
Nos sete pacientes estudados foi possível a extração de DNA das CE numa
quantidade suficiente para a realização de PCR alelo-especifico para a identificação
32
Discussão
da mutação JAK2V617F. Infelizmente em um dos pacientes a reação de PCR foi
inconclusiva, já em outro paciente a proteína expressa foi a selvagem.
Nos outros cinco pacientes estudados todos apresentaram a mutação
JAK2V617F em suas CE, o que corrobora nossa hipótese de que os pacientes com
SBC e mutação JAK2V617F em granulócitos também possuam a mutação em
células endoteliais. Os dois pacientes que eram portadores de Mielofibrose
apresentaram a mutação em CE.
Quando analisamos o sequenciamento do exoma pareado de pele e
granulócitos percebemos que os cinco pacientes apresentaram a mutação
JAK2V617F. Os dois pacientes com Mielofibrose apresentaram a mutação com uma
carga alélica muito elevada, próximo de 90%, enquanto nos três pacientes com SBC
sem DMPC a carga alélica foi baixa, menor do que 13%.
Em nosso estudo optamos por utilizar amostras de tecido de pele, para
caracterizar a amostra de DNA germinativo ou considerado Normal, ou seja, não
neoplásico. A utilização de pele, com suas camadas mais profundas, como a derme,
pode apresentar contaminação de sangue, ou seja, não podemos garantir que não
haja células de outras linhagens nessa amostra, principalmente granulócitos e as
próprias CE. Outras opções de tecidos não tumorais que poderiam ser estudados
seriam amostras de cabelo e saliva, porém a quantidade e principalmente a
qualidade do DNA extraído desses tecidos inviabilizariam o sequenciamento de
exoma.
Nossos resultados, embora numa amostra muito pequena, nos levam a
extrapolar que a mutação da tirosina-quinase está presente tanto nos granulócitos
quanto nas células endoteliais. A frequência alélica baixa pode sugerir uma lesão
“pré-neoplásica”, ou seja, o paciente já apresenta a mutação em suas células tronco
hematopoiética e nas CE, e embora a mutação ainda não tenha levado a um quadro
de DMPC, ocorreu a ativação da tirosina quinase no endotélio, já sendo capaz de
produzir eventos trombóticos.
Alguns autores sugerem que os pacientes portadores de SBC sejam
investigados para detecção de DMPC51,64, e que sejam seguidos ao longo dos anos,
33
Discussão
pois acreditam que esse indivíduos possam em algum momento evoluir para DMPC.
A biópsia de medula óssea muitas vezes não pode ser realizada, pois tratam-se de
pacientes clinicamente graves e em uso de medicações anticoagulantes. A pesquisa
da mutação JAK2V617F em sangue periférico, assim como a quantificação de sua
carga alélica pode tornar-se uma ferramenta muito útil no diagnóstico e seguimento
a longo prazo. Uma possibilidade de seguimento seria a aferição da carga alélica em
períodos de tempo determinados, e assim que a carga alélica apresentar acréscimos
significativos preparar o paciente adequadamente para a punção biópsia da medula
óssea.
A fisiopatologia da trombose mesentérica em pacientes com DMPC ainda não
foi totalmente elucidada, alguns autores demonstraram a relação de trombose com
aumento de células endoteliais circulantes, fatores de coagulação aumentados,
proteínas de ativação endotelial como V-CAM1, fator de crescimento endotelial
vascular (VEGF) e o fator de crescimento placentário65,66. Em nosso estudo não
realizamos nenhum estudo funcional de ativação endotelial, essa pode ser uma nova
linha de pesquisa para tentar elucidar o papel da ativação de tirosina quinases em
células endoteliais em pacientes com trombose em geral e principalmente com
DMPC.
O prognóstico dos pacientes com SBC é muito variável, depende
basicamente da estratificação de risco ao diagnóstico e a etiologia da trombose. Na
nossa experiência os pacientes apresentam uma alta morbidade, porém com uma
mortalidade relativamente baixa. Os pacientes normalmente apresentam um índice
de MELD baixo, o que dificulta a indicação de transplante de fígado, em nossa
casuística apenas dois pacientes com SBC foram transplantados nos últimos dez
anos.
O tratamento da SBC vai depender da etiologia da trombose, sendo o controle
dos sintomas clínicos como a ascite, através do uso de diuréticos, e a
descompressão da hipertensão portal através de shunts venosos, são o tratamento
de escolha. Sabidamente os pacientes com DMPC bem controlada continuam a
apresentar risco aumentado de trombose. A descoberta da associação da mutação
JAK2V617F como possível agente etiológico dos quadros trombóticos pode abrir um
novo leque de opções terapêuticas para os pacientes. Os inibidores de JAK2, como
34
Discussão
o Ruxolitinib, entre outros, talvez possam ser usados em outras patologias que não
DMPC. Estudos clínicos fase 1 devem ser iniciados em pacientes com SBC com
presença de mutação de tirosina quinase com a esperança de que o bloqueio da
proteína possa prevenir a ativação endotelial e evitar novos episódios de trombose.
As técnicas de sequenciamento tanto de exoma quanto de genoma estão
cada vez mais factíveis na prática clínica, e devem ser cada vez mais utilizadas
como ferramenta diagnóstico em doenças raras, pois auxiliam na identificação de
mutações pré-malignas que podem ser tratadas antes de causar uma doença grave.
No nosso caso a identificação da mutação JAK2V617F com uma carga alélica baixa
pode ajudar na identificação precoce de uma doença potencialmente grave.
35
6. CONCLUSÕES
36
Conclusões
A presença da mutação JAK2V617F foi confirmada nas células endoteliais
isoladas de medula óssea em pacientes portadores de Síndrome de Budd-Chiari que
expressavam a mutação em sangue periférico.
O estudo mutacional dos granulócitos nos pacientes de Budd-Chiari confirmou
a presença da mutação JAK2V617F, sendo esta a única mutação encontrada.
A mutação JAK2V617F em pacientes com SBC apresenta frequência alélica
mais baixa quando comparado com os pacientes portadores de doença
mieloproliferativa cônica que evoluem com SBC.
37
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
38
Referências Bibliográficas
1. Tefferi A, Gilliland G. Classification of chronic myeloid disorders: from Dameshek towards a semi-molecular system. Best Pract Res Clin Haematol. 2006;19(3):365-85. 2. Levine RL, Gilliland DG. Myeloproliferative disorders. Blood. 2008;112(6):2190-8. 3. Tefferi A. Classification, diagnosis and management of myeloproliferative disorders in the JAK2V617F era. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2006:240-5 4. Campbell PJ, Green AR. The myeloproliferative disorders. New Engl J Med. 2006;355(23):2452-66. 5. Michiels JJ, De Raeve H, Berneman Z, Van Bockstaele D, Hebeda K, Lam K, Schroyens W. The 2001 World Health Organization and updated European clinical and pathological criteria for the diagnosis, classification, and staging of the Philadelphia chromosome-negative chronic myeloproliferative disorders. Semin Thromb Hemost. 2006;32(4 Pt 2):307-40. 6. Barbui T, Thiele J, Vannucchi AM, Tefferi A. Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis. Blood Cancer J. 2015;5(8):e337. 7. Nowell PC, Hungerford DA. Chromosome studies on normal and leukemic human leukocytes. J Natl Cancer Inst. 1960;25:85-109. 8. Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, East C, Fourouclas N, Swanton S, et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet. 2005;365(9464):1054-61. 9. Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, Teo SS, Tiedt R, Passweg JR, Tichelli A, Cazzola M, Skoda RC. A gain-of-function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders. N Engl J Med. 2005;352(17):1779-90. 10. Barbui T, Finazzi G, Falanga A. Myeloproliferative neoplasms and thrombosis. Blood. 2013;122(13):2176-84. 11. Souza MC, Rodrigues CA, Silva MR, Ribeiro J, Tognon R, Castro FA, Simões BP, Souto EX, Chauffaille ML. Application of five prognostic survival scores to primary myelofibrosis in 62 Brazilian patients. Med Oncol. 2013;30(2):555. 12. Scott LM, Tong W, Levine RL, Scott MA, Beer PA, Stratton MR, et al. JAK2 exon 12 mutations in polycythemia vera and idiopathic erythrocytosis. New Engl J Med. 2007;356(5):459-68. 13. Tefferi A. Novel mutations and their functional and clinical relevance in myeloproliferative neoplasms: JAK2, MPL, TET2, ASXL1, CBL, IDH and IKZF1. Leukemia. 2010;24(6):1128-38.
14. James C, Ugo V, Le Couedic JP, Staerk J, Delhommeau F, Lacout C, et al. A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes polycythaemia vera. Nature. 2005;434(7037):1144-8. 15. Campbell PJ, Scott LM, Baxter EJ, Bench AJ, Green AR, Erber WN. Methods for the detection of the JAK2 V617F mutation in human myeloproliferative disorders. Methods Mol Med. 2006;125:253-64. 16. Steensma DP, Dewald GW, Lasho TL, Powell HL, McClure RF, Levine RL, Gilliland DG, Tefferi A. The JAK2 V617F activating tyrosine kinase mutation is an infrequent event in both "atypical" myeloproliferative disorders and myelodysplastic syndromes. Blood. 2005;106(4):1207-9. 17. Sandberg EM, Wallace TA, Godeny MD, VonDerLinden D, Sayeski PP. Jak2 tyrosine kinase: a true jak of all trades? Cell Biochem Biophys. 2004;41(2):207-32. 18. Mesa RA, Powell H, Lasho T, Dewald G, McClure R, Tefferi A. JAK2(V617F) and leukemic transformation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. Leuk Res. 2006;30(11):1457-60. 19. da Silva RR, Domingues Hatzlhofer BL, Machado CG, Lima AS, de Albuquerque DM, dos Santos MN, Fertrin KY, Costa FF, Araújo Ada S, Bezerra MA. JAK2 V617F mutation prevalence in myeloproliferative neoplasms in Pernambuco, Brazil. Genet Test Mol Biomarkers. 2012;16(7):802-5. 20. Macedo LC, Santos BC, Pagliarini-e-Silva S, Pagnano KB, Rodrigues C, Quintero FC, Ferreira ME, Baraldi EC, Ambrosio-Albuquerque EP, Sell AM, Visentainer JE. JAK2 46/1 haplotype is associated with JAK2 V617F--positive myeloproliferative neoplasms in Brazilian patients. Int J Lab Hematol. 2015;37(5):654-60. 21. Ziakas PD. Effect of JAK2 V617F on thrombotic risk in patients with essential thrombocythemia: measuring the uncertain. Haematologica. 2008;93:1412-4. 22. Dahabreh IJ, Zoi K, Giannouli S, Zoi C, Loukopoulos D, Voulgarelis M. Is JAK2 V617F mutation more than a diagnostic index? A meta-analysis of clinical outcomes in essential thrombocythemia. Leuk Res. 2009;33:67-73. 23. Vannucchi AM, Antonioli E, Guglielmelli P, Longo G, Pancrazzi A, Ponziani V, Bogani C, Ferrini PR, Rambaldi A, Guerini V, Bosi A, Barbui T; MPD Research Consortium. Prospective identification of high-risk polycythemia vera patients based on JAK2(V617F) allele burden. Leukemia. 2007;21(9):1952-9. 24. Carobbio A, Finazzi G, Antonioli E, Guglielmelli P, Vannucchi AM, Dellacasa CM, Salmoiraghi S, Delaini F, Rambaldi A, Barbui T. JAK2V617F allele burden and thrombosis: a direct comparison in essential thrombocythemia and polycythemia vera. Exp Hematol. 2009;37(9):1016-21.
25. Finazzi G, Rambaldi A, Guerini V, Carobbo A, Barbui T. Risk of thrombosis in patients with essential thrombocythemia and polycythemia vera according to JAK2 V617F mutation status. Haematologica. 2007;92:135-6. 26. Fiorini A, Chiusolo P, Rossi E, Za T, De Ritis DG, Ciminello A, Leone G, De Stefano V. Absence of the JAK2 exon 12 mutations in patients with splanchnic venous thrombosis and without overt myeloproliferative neoplasms. American journal of hematology 2009;84:126-7. Am J Hematol. 2009;84(2):126-7. 27. Kiladjian JJ, Cervantes F, Leebeek FW, Marzac C, Cassinat B, Chevret S, et al. The impact of JAK2 and MPL mutations on diagnosis and prognosis of splanchnic vein thrombosis: a report on 241 cases. Blood. 2008;111(10):4922-9. 28. De Grandis M, Cambot M, Wautier MP, Cassinat B, Chomienne C, Colin Y, Wautier JL, Le Van Kim C, El Nemer W. JAK2V617F activates Lu/BCAM-mediated red cell adhesion in polycythemia vera through an EpoR-independent Rap1/Akt pathway. Blood. 2013;121(4):658-65. 29. De Stefano V, Za T, Rossi E, Fiorini A, Ciminello A, Luzzi C, Chiusolo P, Sica S, Leone G. Influence of the JAK2 V617F mutation and inherited thrombophilia on the thrombotic risk among patients with essential thrombocythemia. Haematologica. 2009;94(5):733-7. 30. Borowczyk M, Wojtaszewska M, Lewandowski K, Gil L, Lewandowska M, Lehmann-Kopydłowska A, et al. The JAK2 V617F mutational status and allele burden may be related with the risk of venous thromboembolic events in patients with Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasms. Thromb Res. 2015;135(2):272-80. 31. Bailey AS, Fleming WH. Converging roads: evidence for an adult hemangioblast. Exp Hematol. 2003;31(11):987-93. 32. Khakoo AY, Finkel T. Endothelial progenitor cells. Annual Review Med. 2005;56:79-101. 33. Jacques N, Vimond N, Conforti R, Griscelli F, Lecluse Y, Laplanche A, Malka D, Vielh P, Farace F. Quantification of circulating mature endothelial cells using a whole blood four-color flow cytometric assay. J Immunol Methods. 2008;337(2):132-43. 34. Ozdogu H, Sozer O, Boga C, Kozanoglu L, Maytalman E, Guzey M. Flow cytometric evaluation of circulating endothelial cells: a new protocol for identifying endothelial cells at several stages of differentiation. Am J Hematol. 2007;82(8):706-11. 35. Moroni G, Del Papa N, Moronetti LM, Vitali C, Maglione W, Comina DP, Urgnani F, Sandri S, Ponticelli C, Cortelezzi A. Increased levels of circulating endothelial cells in chronic periaortitis as a marker of active disease. Kidney Int. 2005;68(2):562-8.
36. Del Papa N, Cortiana M, Maglione W, Comina DP, Silvestris I, Moronetti Mazzeo L, Fracchiolla N, Fantini F, Cortelezzi A. Raised levels of circulating endothelial cells in systemic sclerosis. Reumatismo. 2005;57(1):29-35. 37. Godoy CR, Levy D, Giampaoli V, Chamone DA, Bydlowski SP, Pereira J. Circulating endothelial cells are increased in chronic myeloid leukemia blast crisis. Brazilian journal of medical and biological research. Braz J Med Biol Res. 2015;48(6):509–14. 38. Gora-Tybor J, Jamroziak K, Szmigielska-Kaplon A, Krawczynska A, Lech-Maranda E, Wierzbowska A, Jesionek-Kupnicka D, Blonski JZ, Robak T. Evaluation of circulating endothelial cells as noninvasive marker of angiogenesis in patients with chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma. 2009;50(1):62-7. 39. Wierzbowska A, Robak T, Krawczynska A, Wrzesień-Kuś A, Pluta A, Cebula B, Smolewski P. Circulating endothelial cells in patients with acute myeloid leukemia. Eur J Haematol. 2005 Dec;75(6):492-7. 40. Yoder MC, Mead LE, Prater D, Krier TR, Mroueh KN, Li F, Krasich R, Temm CJ, Prchal JT, Ingram DA. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 2007;109(5):1801-9. 41. Oppliger Leibundgut E, Horn MP, Brunold C, Pfanner-Meyer B, Marti D, Hirsiger H, Tobler A, Zwicky C. Hematopoietic and endothelial progenitor cell trafficking in patients with myeloproliferative diseases. Haematologica. 2006;91(11):1465-72. 42. Bellucci S, Michiels JJ. The role of JAK2 V617F mutation, spontaneous erythropoiesis and megakaryocytopoiesis, hypersensitive platelets, activated leukocytes, and endothelial cells in the etiology of thrombotic manifestations in polycythemia vera and essential thrombocythemia. Semin Thromb Hemost. 2006;32(4 Pt 2):381-98. 43. Ding L, Saunders TL, Enikolopov G, Morrison SJ. Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells. Nature. 2012;481:457-62. 44. Teofili L, Martini M, Iachininoto MG, Capodimonti S, Nuzzolo ER, Torti L, Cenci T, Larocca LM, Leone G. Endothelial progenitor cells are clonal and exhibit the JAK2(V617F) mutation in a subset of thrombotic patients with Ph-negative myeloproliferative neoplasms. Blood. 2011;117(9):2700-7. 45. Janssen HL, Garcia-Pagan JC, Elias E, Mentha G, Hadengue A, Valla DC; European Group for the Study of Vascular Disorders of the Liver. Budd-Chiari syndrome: a review by an expert panel. J Hepatol. 2003;38(3):364-71. 46. Janssen HL, Wijnhoud A, Haagsma EB, van Uum SHM, van Nieuwkerk CMJ, Adang R, et al. Extrahepatic portal vein thrombosis: aetiology and determinants of survival. Gut. 2001;49(5):720-4.
47. Martens P, Nevens F. Budd-Chiari syndrome. United Eur Gastroent J. 2015;3:489-500. 48. Hoekstra J, Janssen HL. Vascular liver disorders (I): diagnosis, treatment and prognosis of Budd-Chiari syndrome. Neth J Med. 2008;66:334-9. 49. Rajesh S, Mukund A, Arora A. Imaging diagnosis of splanchnic venous thrombosis. Gastroenterol Res Pract. 2015;2015:101029. 50. Sekhar M, McVinnie K, Burroughs AK. Splanchnic vein thrombosis in myeloproliferative neoplasms. Brit J Haematol. 2013;162:730-47. 51. Vladareanu AM, Popov V, Bumbea H, Onisai M, Ilea A, Dobrea C, Miulescu M. Splanchnic vein thrombosis, the onset manifestation in JAK positive Chronic Myeloproliferative Disorders Neoplasms. J Med Life. 2011;4(1):97-101. 52. Zhang P, Zhang Y, Zhang J, Wang H, Ma H, Wang W, Gao X, Xu H, Lu Z. Association between JAK2 rs4495487 Polymorphism and Risk of Budd-Chiari Syndrome in China. Gastroenterol Res Pract. 2015;2015:807865. 53. Biesecker LG, Green RC. Diagnostic clinical genome and exome sequencing. New Engl J Med. 2014;371:1170. 54. Papaemmanuil E, Gerstung M, Malcovati L, Tauro S, Gundem G, Van Loo P, et al. Clinical and biological implications of driver mutations in myelodysplastic syndromes. Blood. 2013;122(22):3616-27; quiz 99. 55. Conway O'Brien E, Prideaux S, Chevassut T. The epigenetic landscape of acute myeloid leukemia. Advances in Hematology. 2014;2014:103175. 56. Colaizzo D, Amitrano L, Tiscia GL, Iannaccone L, Gallone A, Grandone E, Guardascione MA, Margaglione M. Occurrence of the JAK2 V617F mutation in the Budd-Chiari syndrome. Blood Coagul Fibrinolysis. 2008;19(5):459-62. 57. Xavier SG, Gadelha T, Pimenta G, Eugenio AM, Ribeiro DD, Gomes FM, Bonamino M, Zalcberg IR, Spector N. JAK2V617F mutation in patients with splanchnic vein thrombosis. Dig Dis Sci. 2010;55(6):1770-7. 58. Qi X, Yang Z, Bai M, Shi X, Han G, Fan D. Meta-analysis: the significance of screening for JAK2V617F mutation in Budd-Chiari syndrome and portal venous system thrombosis. Aliment Pharmacol Ther. 2011;33(10):1087-103. 59. Smalberg JH, Arends LR, Valla DC, Kiladjian JJ, Janssen HL, Leebeek FW. Myeloproliferative neoplasms in Budd-Chiari syndrome and portal vein thrombosis: a meta-analysis. Blood. 2012;120:4921-8. 60. Landolfi R, Di Gennaro L, Barbui T, De Stefano V, Finazzi G, Marfisi R, et al. Leukocytosis as a major thrombotic risk factor in patients with polycythemia vera. Blood. 2007;109:2446-52.
61. Teofili L, Larocca LM. Blood and endothelial cells: together through thick and thin. Blood. 2013;121:248-9. 62. Etheridge SL, Roh ME, Cosgrove ME, Sangkhae V, Fox NE, Chen J, López JA, Kaushansky K, Hitchcock IS. JAK2V617F-positive endothelial cells contribute to clotting abnormalities in myeloproliferative neoplasms. Proc Natl Acad Sci USA. 2014;111:2295-300. 63. Wu YT, Li JX, Liu S, Xin Y, Wang ZJ, Gao J, Ji BY, Fan XM, Zhou QW. A novel and feasible way to cultivate and purify endothelial progenitor cells from bone marrow of children with congenital heart diseases. Chin Med J (Engl). 2012;125:1903-7. 64. Karakose S, Oruc N, Zengin M, Akarca US, Ersoz G. Diagnostic value of the JAK2 V617F mutation for latent chronic myeloproliferative disorders in patients with Budd-Chiari syndrome and/or portal vein thrombosis. Turk J Gastroenterol. 2015;26:42-8. 65. Trelinski J, Wierzbowska A, Krawczynska A, Sakowicz A, Pietrucha T, Smolewski P, Robak T, Chojnowski K. Circulating endothelial cells in essential thrombocythemia and polycythemia vera: correlation with JAK2-V617F mutational status, angiogenic factors and coagulation activation markers. Int J Hematol. 2010;91:792-8. 66. Trelinski J, Wierzbowska A, Krawczynska A, Sakowicz A, Pietrucha T, Smolewski P, Robak T, Chojnowski K. Plasma levels of angiogenic factors and circulating endothelial cells in essential thrombocythemia: correlation with cytoreductive therapy and JAK2-V617F mutational status. Leuk Lymphoma. 2010;51:1727-33.
Helman R. A expressão da mutação JAK2V617F em células endoteliais de pacientes com Síndrome Budd-Chiari e sua correlação com as doenças mieloproliferativas crônicas Ph negativo. Tese (Doutorado); 2016.
As Doenças Mieloproliferativas Crônicas (DMPC): Policitemia Vera (PV),
Trombocitemia Essencial (TE) e Mielofibrose (MF) estão associadas com tromboses
venosas graves, principalmente com a Síndrome de Budd-Chiari (SBC) e outras
tromboses esplâncnicas. A fisiopatologia destas tromboses acredita-se estar
associada às alterações de viscosidade sanguínea gerada pela hipercelularidade
presente nestas patologias. A mutação JAK2V617F está presente em mais da
metade dos pacientes com MF e TE e em cerca de 90% dos portadores de PV,
ajudando muito no diagnóstico precoce e correto das DMPC. Nos últimos anos a
mutação JAK2V617F foi descrita em pacientes com tromboses esplâncnicas sem
alterações hematológicas, indicando que esta alteração pode preceder o surgimento
de doenças mieloproliferativas. Nos últimos dois anos foi comprovada a presença da
mutação JAK2V617F na célula endotelial de pacientes com SBC e outras tromboses
venosas.Com o advento do sequenciamento de DNA de nova geração (NGS),
tornou-se possível a detecção de todas as mutações presentes nas células tumorais
de um paciente, o que contribuiu sobremaneira para: 1- A identificação de novas
mutações; e; 2- A análise global das diferentes mutações presentes em um mesmo
tumor e que provavelmente atuam de forma cooperativa, permitindo a identificação
das vias moleculares alteradas nestes casos. A importância das células endoteliais,
tanto na fisiopatologia das doenças mieloproliferativas, quanto nas doenças
trombóticas ainda é uma questão aberto na literatura, principalmente pelas
dificuldades técnicas para extração e quantificação de pureza das células. A
utilização de técnicas refinadas para cultivo de células com o EndoCult e a utilização
de técnicas de citometria de fluxo com sorting de células selecionadas através de
fluocromos permitiu a identificação de células endoteliais com 98% de pureza e
permitiu a extração de DNA dessas células e identificação da mutação JAK2V617F
presentes nestas células em pacientes com doenças trombóticas. A presença da
mutação JAK2V617F nas células endoteliais em paciente com SBC, com
diagnóstico ou não de Doenças Mieloproliferativas sugere um papel importante
desta mutação na fisiopatologia das tromboses esplâncnicas.