RIC KKU NEWSLETTER...(XRD) - หล กการท างานเคร อง XRD และข นตอนท ส าค ญในการใช งานเคร อง - การประย

ทมบรรณาธการ

ทปรกษา รองอธการบดฝายวจยและถายทอดเทคโนโลย

บรรณาธการ ผศ.ดร.รนา ภทรมานนท

ทมงาน นายตนกลา อนสวาง

น.ส.ศภจรา ศรจางวาง

น.ส.สภลกษณ ประสาร

พมพท บจก. ศรภณฑ (2497) www.siriphan.com

กจกรรมอบรมเครองมอวจยขนสง

ครงท 2 ประจ�าป 2558

แนะน�าผลงานตพมพจากการใชบรการเครองมอ

แนะน�าเครองมอวจย

• Real Time PCR

• High pressure homogenizer

RIC KKU NEWSLETTER

จดหมายขาวศนยเครองมอวจย มหาวทยาลยขอนแกน

ric.kku.ac.th • ปท 2 ฉบบท 8 ประจำ�เดอน กนย�ยน 2558 •

Cover from: https://lifescience.roche.com

ขาวกจกรรมศนยเครองมอวจย มข

กจกรรมอบรมเครองมอวจยขนสง ครงท 2 ประจ�าป 2558

ศนยเครองมอวจยมหาวทยาลยขอนแกนรวมกบฝายวจยและถายทอดเทคโนโลยไดจดกจกรรมอบรมเครองมอวจยขนสงครงท2ประจ�าป2558ระหวางวนท5สงหาคมถง3กนยายน2558ทผานมาโดยมวตถประสงคเพอใหความรเรองหลกการท�างานและการประยกตใชเครองมอขนสงรวมทงสงเสรมการใชงานเครองมอวทยาศาสตรขนสงเพอใหเกดประโยชนสงสดตองานวจยและการเรยนการสอนแกอาจารยนกวจยนกศกษาและผทสนใจเขารวมการอบรมโดยไมมคาใชจายโดยสมครเขารวมการอบรมไดทเวบไซตric.kku.ac.thในการอบรมครงนไดรบเกยรตจากวทยากรผเชยวชาญดานเครองมอหลายทานทงจากหนวยงานภายในมหาวทยาลยและภาคเอกชนทงนมผลงทะเบยนเขารวมกจกรรมทงสน268คนรายละเอยดการจดการอบรมเครองมอตางๆมดงน

วนท/เวลา เครองมอ หวขอบรรยาย วทยากร

5สงหาคม CircularDichroismspec-troscopy(CD)

-หลกการท�างานของเครองCD-การเตรยมตวอยางการวเคราะหดวยเครองCD

คณสภลกษณประสารRICKKU

19สงหาคม Atomic ForceMicroscope(AFM)

-IntroductiontoAFM- ApplicationofAFMinresearch(Physical&Biochemical)-AFMTechnologyandInnovation-AFMdemonstrationanddiscussion

คณอาทตยภจอม

บรษทโคแอกซกรปคอรปอเรชนจ�ากด

20สงหาคม NMR(400MHz) -หลกการท�างานของเครองNMR-ตวอยางการวเคราะหดวยเครองNMR-วเคราะหตวอยางดวยเครองNMRจากซอฟแวร

ศ.ดร.สมเดชกนกเมธากลคณะวทยาศาสตรมขคณกตศกดภผาสทธRICKKU

24สงหาคม NearInfrared Spectroscopy(NIR)

-หลกการพนฐานและเครองมอของNIR-NIRVisionการใชงานโปรแกรมของเครองNIR

คณปฤษฎางคพชระวรางกรบรษทเมทโธรหมสยามจ�ากด

25สงหาคม Scanningelectronmicroscope(SEM)

-ทฤษฎและหลกการเบองตนของเครองSEM-เทคนคการถายภาพ-เทคนคและวธการเตรยมตวอยาง

คณบญสงสงกองสขRICKKU

INCell Analyzer/2D-PAGE/Fluo-rescence GelScanner

-InCellAnalyzer2000AdvancesandNewApproachesinCellularImaging

-2D-DIGE:AdvanceProteomicsTechnologies

คณสนสาพนพพฒนกลบรษทจอเฮลทแคร

คณศนสนยอยจนทรบรษทแบงเทรดดง1992จ�ากด

TotalOrganicCarbon(TOC)

-หลกการท�างานเครองTOCและขนตอนทส�าคญในการใชงานเครอง-การประยกตใชเครองมอTOCทหองปฏบตการวเคราะหทางเครองมอ

ดร.ธญลกษณราษฏรภกดคณะวศวกรรมศาสตรมข.

26สงหาคม LC-MS/MS -AnalysisofposttranslationalmodificationbyLC-MS/MS-KKUproteomicservice&proteinidentificationbyLC-MS/MS

ดร.จรญใจหนกแนนบรษทBrukerBiospinAG คณตนกลาอนสวางRICKKU

Real-timePCR -Real-timePCRPrinciple&Technology-Real-timePCRApplication&Experimentdesign-QuantitativeAnalysisusingCFX96Touch

คณนฤวรรณเพญพรหมบรษทไลฟไซเอนซเอพจ�ากด

27สงหาคม FlowCytometer IntroductionofFlowcytometerandTrendsinFlowcytometerresearchesinthefuture-AdvancemulticolorsinFlowcytometry-DemoofBDAccuriTMC6Flowcytometer

ศ.ดร.โกวทพฒนาปญญาสตยคณะแพทยศาสตรศรราชพยาบาลม.มหดลคณอญชนะวรรณโลบลบรษทBDBThailand

28สงหาคม Gaschromatography(GC)

-ทฤษฎหลกการและการดแลรกษาเบองตนเครองGC-การใชเครองGC(Settingupinstrument,Settingdataacquisitionanddataanalysis,Sequencinganalysisandcalibrationcurve)

คณไพศรวรรณแสงทองRICKKU

ParticleSizeAnalyser -ทฤษฎเบองตนและหลกการท�างานของเครองParticleSizeAnalyser-การประยกตใชเครองParticleSizeAnalyserกบงานวจยในปจจบน

ดร.เอกพลมหาวหกานนทบรษทDKSHประเทศไทย

31สงหาคม X-raydiffractometer(XRD)

-หลกการท�างานเครองXRDและขนตอนทส�าคญในการใชงานเครอง-การประยกตใชเครองXRD

ผศ.ดร.กตโรจนหวนตาหลาคณะวศวกรรมศาสตรมข

1กนยายน ReverseEngineering ทฤษฎหลกการท�างานเครองReverseengineering รศ.ดร.สรสทธปยะศลปคณะวศวกรรมศาสตรมข

3กนยายน MiniSprayDryer HowtocorrectlyoperatetheMiniSprayDryerB-290 คณวรรณวภาสธาชวะบรษทบช(ไทยแลนด)จ�ากด

บทบรรณาธการ

สวสดคะประชาคมนกวจยทกทานจดหมายขาวศนยเครองมอวจยฯ ในฉบบท8นมเครองมอวจยทนาสนใจ2รายการคอ

RT-PCRสถานทใหบรการทคณะเกษตรศาสตรและHighpressurehomogenizerสถานทใหบรการทคณะเภสชศาสตรนกวทยาศาสตร

ประจ�าเครองมอไดรวบรวมหลกการและวธการใชงานเพอใหทานไดเหนภาพรวมกอนตดตอใชงานจรงนอกจากนชวงเปดภาคการศกษาใหม

นศนยเครองมอวจยฯไดจดการอบรมเครองมอวจยชนสงซงไดรบเกยรตจากวทยากรในหนวยงานสถานศกษาและหนวยงานเอกชนตอง

ขอขอบพระคณมาณทนดวยคะปดทายดวยตวอยางบทความวจยทไดรบการตพมพโดยเนอหาในงานวจยมการใชเครองมอในการดแล

ของศนยเครองมอวจยคอเครองTEMAFMCDและเครองLC-MS/MS

อนงศนยเครองมอวจยมหาวทยาลยขอนแกนจะมการปรบโครงสรางการบรหารเรวๆนเพอใหสอดคลองกบบรบทของการ

เปนมหาวทยาลยในก�ากบของรฐขอใหทกทานโปรดตดตามเพอการบรการดานเครองมอวจยทจะกาวไปสสากล

ผศ.ดร.รนา ภทรมานนทกรรมการและเลขานการศนยเครองมอวจยมหาวทยาลยขอนแกน

ภาพกจกรรม

0 3ric.kku.ac.th : RIC NEWSLETTERจดหมายขาวศนยเครองมอวจย มหาวทยาลยขอนแกน

เครอง Real – Time PCR

รปท 2แสดงหลกการท�างานของ

HydrolysisprobesหรอTaqmanprobe

ผเขยนบทความ : นางสาวศภจรา ศรจางวางต�าแหนง:นกวทยาศาสตร

Email:[email protected]

ปจจบนเทคนคReal–TimePCRไดถกน�า

มาประยกตใชอยางกวางขวางในงานวจยและการ

ตรวจวนจฉยในหองปฏบตการแทนเทคนคPCRหรอ

conventionalPCR(PCRแบบดงเดม)ความแตก

ตางระหวางเทคนคconventionalPCRกบReal

–TimePCRมอะไรบางแลวขอดของเทคนคReal

–TimePCRคออะไรท�าไมจงเปนทนยมน�าเทคนคน

มาใชมากขนในปจจบน

ความแตกตางระหวางเทคนคReal–TimePCR

กบconventionalPCRนนในconventionalPCR

ตองประมาณการวาจะปรบเปลยนอณหภมเทาไรหรอ

ท�าปฏกรยากรอบจงจะไดproductทเพยงพอตอการ

ตรวจวดและตองใชgelelectrophoresisเพอตรวจ

สอบดทงปรมาณและขนาดของproductsเมอสนสด

ปฏกรยา (endpointdetection)ในขณะทในระบบ

Real–TimePCRสามารถตดตามดปฏกรยาไดทกระยะ

ระหวางทปฏกรยาก�าลงด�าเนนอยและสามารถก�าหนด

จดทจะเกบขอมลเพอน�ามาวเคราะหในภายหลงได

สงส�าคญทตองค�านงถงส�าหรบการเรมตนงาน

Real–TimePCRคอขนตอนการสกดสารพนธกรรม

ตองใชเทคนคทเหมาะสมหรอใชชดน�ายาสกดส�าเรจรป

ทมคณภาพการเลอกworkflowในกรณทตวอยาง

ตงตนเปนRNAสามารถเลอกท�าได2ระบบคอการ

ท�าone–stepหรอtwo–stepการท�าone–step

คอการสงเคราะหcDNAและกระบวนการPCRเกด

ขนภายในหลอดเดยวกนสวนการท�าtwo–stepคอ

การแยกสงเคราะหcDNAกอนจากนนจงน�าcDNA

ทไดเขาสกระบวนการReal–TimePCRอกครงหนง

สารเรองแสงทใชในงาน Real – Time PCR ม 5 ประเภท คอ

ซงการสงเคราะห cDNAกอนเขาส กระบวนการ

Real–TimePCRเปนอกหนงขนตอนทส�าคญหาก

เลอกใชระบบน�ายาทดและใชเอนไซมreversetran-

scriptaseทมคณสมบตRNaseHactivityกจะท�าให

ไดyieldของcDNAสงขนการเลอกใชdetection

formatกอนเรมงานตองพจารณาวาจะเลอกใชสาร

เรองแสงรปแบบใด(เปนSYBRGreenIหรอProbe)

เนองจากสารเรองแสงบางรปแบบมขอจ�ากดในการใช

งานบางapplicationตวเครองReal–TimePCR

และน�ายาทใชควรเลอกใชน�ายาทผานการoptimize

และพฒนารวมกนกบตวเครอง เนองจากเปนการ

ท�างานทเปนระบบเดยวกนทงหมดและชวยลดเวลาใน

การoptimizePCRconditionท�าใหท�างานไดงาย

และรวดเรวขน

1. SYBR Green I Dye: เปนสารเรองแสงทสามารถเขาจบกบminer

grooveของDNAสายคไดในชวงการdenatureของปฏกรยาPCRเพอคลาย

สายDNAจากสายคใหเปนสายเดยวนนSYBRGreenIจะยงไมสามารถเขาไปจบ

กบDNAสายเดยวไดแตเมอเขาสกระบวนการannealingและกระบวนการ

extensionSYBRGreenIจะแทรกตวเขาไปจบกบสายคของDNAและเปลงแสง

ในชวงคลนประมาณ530นาโนเมตรเมอรอบของPCRกลบมาถงชวงการdena-

tureอกครงSYBRGreenIกจะหลดออกจากสายDNAท�าใหการเรองแสงลดลง

ในกรณทมDNAหลายชนดปนกนอยในตวอยางเราสามารถแยกสญญาณของสาร

เรองแสงไดจากการเปรยบเทยบคาTmเพราะTmเปนคณสมบตเฉพาะของDNA

สายคแตละสายซงแปรผนตรงกบเปอรเซนตของเบสGและCทอยในสายDNA

(%GCcontent)ดงรปท1

2. Hydrolysis probes หรอ Taqman probe: probeประเภทน

เปนoligonucleotideเสนเดยวทปลาย5’ของprobeตดฉลากReporterdye

และภายในสายprobeหางจากReporterdyeไมเกน5bpจะตดฉลากดวย

Quencherdyeหลงจากทprobeท�าการhybridizationกบDNAtemplate

แลว เมอReporterdyeถกกระตน (excite)ดวยแสงจะถายเทพลงงานไปให

QuencherdyeตวQuencherdyeดดซบพลงงานนนไวแลวคายพลงงานออก

มาในรปของแสงทมชวงความยาวคลนเพมขนเมอกระบวนการPCRเขาสชวงการ

สรางDNAสายใหม(elongation)TaqDNApolymeraseซงมคณสมบตของ

5’–exonucleaseactivityจะท�าการยอยTaqmanprobe(hydrolysis)ท�าให

ReporterdyeหลดเปนอสระและหางจากQuencherท�าใหคายพลงงานในรป

ของแสงไดดงรปท2

รปท1แสดงหลกการท�างานของSYBRGreenI

0 4 RIC NEWSLETTER : ric.kku.ac.thจดหมายขาวศนยเครองมอวจย มหาวทยาลยขอนแกน

3. Hybridization probes: probeประเภทนเปนoligonucleotide สายสน2สายโดยสายแรกตดฉลากทปลาย3’ดวยfluoresceinท�าหนาทเปนQuencherหรอทเรยกวาdonorfluorophoreและสายทสองตดฉลากทปลาย5’ดวยสารRed640หรอRed705หรอทเรยกวาacceptorfluorophoreโดยท ปลาย3’ของoligonucleotideprobeนถกปดดวยPhosphategroupเพอไมใหสามารถท�าหนาทเปนPCRprimerไดทงนprobesทง2เสนจะมล�าดบเบสทตอเนองกนโดยเวนชวงระหวางปลาย3’ของoligonucleotideprobeเสนแรกกบกบปลาย5’ของprobeเสนทสองประมาณ1–5bpเมอprobeทงสองท�าการ hybridizationกบDNAเปาหมาย(PCRproducts)แสงทเปลงออกมาของdonorfluorophoreจะไปกระตน (excite)acceptorfluorophoreท�าใหเกดสญญาณfluorescenceทเรยกวาFluorescentResonanceEnergyTransfer (FRET) ทสามารถวดไดในชวงannealingphaseและชวงแรกของextensionphase ของPCR reactionในแตละรอบของPCRcycleจะมการannealing โดย hybridizationprobesเพมมากขนท�าใหสญญาณfluorescenceเพมขนดงรปท3

รปท3hybridizationprobesในขนตอนdenaturationจะยงไมเกดFRET(AและB)กอนทprobeทงสองจะท�าการhybridizationกบamplificationproductsหากoligonucleotideสายท1ถกกระตนจะเปลงแสงสเขยว(B)เมอปฏกรยาด�าเนนถงขนตอนannealingและชวงแรกของขนตอนextensionจะเกดFRETขนโดยพลงงานทปลอยออกมาจากoligonucleotideสายท1จะไปกระตนLCRed640ทตดอยปลาย5’ของoligonucleotideสายท2ท�าใหเกดการเรองแสงสแดงและสามารถตรวจวดสญญาณการเรองแสงทเกดขนได

รปท5กอนการเกดhybridizationระหวางMolecularBeaconsกบDNAเปาหมายปลาย5’และ3’ของMolecularBeaconsทตดฉลากดวยReporterและQuencherdyeจะอยชดกนจนQuencherdyeสามารถดดพลงงานจากReporterdyeแตเมอเกดการhybridizationขนReporterและQuencherdyeจะอยหางกนท�าใหReporterdyeสามารถ เรองแสงได

รปท4ในขนตอนของการDenaturationนนReporterdyeจะยงไมเปลงแสง(A)เมอเกดการhybridizationกบDNAเปาหมายในขนตอนการannealing(B)Re-porterdyeจะเปลงแสงทสามารถตรวจวดได

5. Molecular Beacons: probeประเภทนเปนoligonucleotide

ทมลกษณะโคงงอเปนloopคลายกบตดผม(hairpinloop)ซงตดกนดวยพนธะ

ไฮโดรเจนประมาณ5–7นวคลโอไทดและมเบสG–Cมากท�าใหปลาย5’และ

3’ทตดฉลากดวยReporterและQuencherdyeเขามาอยใกลกนจนQuencher

dyeสามารถดดซบพลงงานจากReporterdyeไดสวนบรเวณhairpinจะถก

สรางใหมล�าดบเบสเปนคสมกบDNA เปาหมาย เมอMolecularBeacons

เขาจบกบDNAเปาหมายhairpinจะถกสลายไปท�าใหReporterdyeอยหาง

จากQuencherdyeเมอถกกระตนดวยแสงพลงงานสงReporterdyeจงสามารถ

เปลงแสงออกมาไดดงรปท5

4. Simple probe: อาศยการท�างานของprobe1เสนทถกตดฉลากไวดวยReporterdyeและLinkerในขณะทprobeจบกบDNAเปาหมายในขนตอนannealingจะมการเปลยนแปลงconformationของLinkerและReporterdyeโดยการเปลยนแปลงรปรางนมผลท�าใหReporterเปลงแสงในชวงคลน530นาโนเมตรดงรปท4

อตราคาบรการดวยเครอง Real – Time

PCR ยหอ BIORAD รน CFX96

ลกษณะการใชงาน Real – Time PCR

ในดานตาง ๆ ดงน

1.งานตรวจสอบพนธกรรรม(HighResolutionMelting)

2.การตรวจสอบการแสดงออกของยน(5Targets–MultiplexQT/RT)

3.การตรวจสอบการปลอมปนเนอสตวในผลตภณฑทมการดดแปลง

พนธกรรมการปนเปอนของจลนทรยรวมถงการจ�าแนกชนดและปรมาณของ

จลนทรย(MultipledataacquisitionmodesandGradient)

รายการ

อตราคาบรการ(บาท)

บคลากรภายใน มข.

บคคลภายนอก มข.

การใชงานส�าหรบตรวจวดตวอยาง 500บาท/ชวโมง

1,000บาท/ชวโมง

การใชงานส�าหรบวเคราะหผลการตรวจวดตวอยาง

300 บาท/ตวอยาง

400บาท/ตวอยาง

นกวจยสามารถตดตอขอใชบรการหรอสอบถามขอมลเพมเตมไดทคณฐตพร

พทยาวธวนจโทร.089-111-1528Email:[email protected]

0 5ric.kku.ac.th : RIC NEWSLETTERจดหมายขาวศนยเครองมอวจย มหาวทยาลยขอนแกน

ผเขยนบทความ : น.ส.สาวณ นาสมภกดต�าแหนง:นกวทยาศาสตร

Email:[email protected]

เครองลดขนาดอนภาคความดนสง(HighPressureHomogenizer)เปนเครองจกร

และอปกรณส�าหรบการเตรยมตวอยางใหเปนเนอเดยวกนและใหมขนาดเลกระดบนาโนเมตรถง

ไมโครเมตรโดยอาศยปมทความดงแรงสง

High Pressure Homogenizer

รน M-110P Microfluidizer

วตถประสงคการใชเครองHigh

PressureHomogenizer ใชเพอ

เตรยมตวอยางสารประเภทตางๆเชน

1.อมลชน(Emulsion)เชนน�ามน

(oil)น�าผลไมน�านมเปนตน

2.ดสเพอรชน(Dispersion)เชน

ยาทางเภสชกรรมSolidlipidnanopar-

ticles (SLN) และ nanostructured

lipidcarriers(NLC)เปนตน

3.สารแขวนลอย(Suspension)

ของแขงแขวนลอยในน�าหรอน�ามน เชน

น�าผลไมบางชนดซงมกาก (pulp)อย

เปนตน

ภาพตวอยางระบบการท�างานของเครองHighPressureHomogenizer

(ทมา:http://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=5398)

0 6 RIC NEWSLETTER : ric.kku.ac.thจดหมายขาวศนยเครองมอวจย มหาวทยาลยขอนแกน

หลกการท�างาน

เครองHighPressureHomogenizerรนM-110PMicrofluidizer

ท�างานโดยใชปมความดนสงใหสารตวอยางทอยในรปของเหลวผาน

ชองแคบทเรยกวาวาลวฮอโมจไนซ (homogenizationvalve)

ดวยความเรวสงมากแรงดนทใชในการท�างานอยท30,000psiซง

พลงงานแรงดนจะท�าใหเกดแรงกระท�า2แรงคอแรงเฉอน(shear)

และแรงกระแทก(impact)รวมถงการแตกตวของฟองอากาศขนาด

เลกอยางรนแรงจงท�าใหสามารถบด/ยอยตวอยางภายในระบบไดม

ผลใหอนภาคตวอยางมขนาดเลกลงและเกดการกระจายเปนเนอ

เดยวกน

ขอส�าคญส�าหรบการเตรยมตวอยาง

1.ตวอยางทมความไวตอการเปลยนแปลงอณหภมสงจะตอง

ท�าใหตวอยางเยนลงกอนและหลงผานเครอง เพอรกษาระดบ

อณหภมใหคงทการท�าใหตวอยางเยนกอนผานเครองอาจใชวธการ

แชเยนใหตวอยางอณหภมลดลงระดบหนงกอนและการท�าใหเยนลง

หลงผานเครองอาจใชวธการหลอน�าเยนภาชนะทรองรบผลตภณฑ

2.ตวอยางทมความขนหนดสง เชนตวอยางทมสวนประกอบ

ของwaxหรอไขมนจะตองท�าการหลอมเหลวหรอลดความหนด

ของตวอยางโดยการใหความรอนแกตวอยาง(preheat)กอนผาน

เครองและควรเปดเครองใหเครองท�างานโดยการหมนเวยนน�ารอน

สะอาดในชวงความดนทตองการกอนเพอท�าใหโลหะทจะสมผสกบ

ตวอยางรอนเปนการpreheatและปองกนการอดตนตามทอและปม

3.ตวอยางทมของแขงเปนองคประกอบควรท�าการลดขนาด

อนภาคของแขงดงกลาวลงใหมขนาด เลกกวา0.5mmกอนเพอ

ปองกนการอดตนภายในเครอง

ภาพพลงงานแรงดนทท�าใหเกดแรงกระท�า2แรงระหวางการบด/ยอยตวอยาง(ทมา:http://www.sec.gov/Archives/edgar/

data/723889/000110465910002575/a10-2327_1ex99d1.htm)

การน�าตวอยางอนภาคผานเครองHighPressureHomogenizer

การน�าตวอยางสารอมลชน(น�า-น�ามน)ผานเครองHighPressure

Homogenizerท�าใหสารถกบด/ยอยใหมลกษณะเปนเนอเดยวกน

เอกสารอางอง

Trainingpapers“HighPressureHomogenizer;Microfluidics.

TinyParticle,BIGRESULTs”

ดดแปลงจากคมอการประกอบเครองและการใชงานHigh

PressureHomogenizerรนAPV2000.

http://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=5398

รายการคาใชจาย (บาท/ชวโมง)

อตรา 1 อตรา 2 อตรา 3

คาใชบรการ 200 400 800

อตรา 1 ส�าหรบบคลากรภายในมหาวทยาลยขอนแกนอตรา 2 ส�าหรบบคลากรภายนอกมหาวทยาลยขอนแกนอตรา 3 ส�าหรบภาคเอกชน

นกวจยสามารถตดตอขอใชบรการเครอง Particle Size Analyser หรอสอบถามเกยวกบการเตรยมตวอยางไดท คณสาวณ นาสมภกด คณะเภสชศาสตร

โทร. 085-3781416, Email: [email protected]

อตราคาบรการ

0 7ric.kku.ac.th : RIC NEWSLETTERจดหมายขาวศนยเครองมอวจย มหาวทยาลยขอนแกน

ผลงานตพมพทเกดจากการใชบรการเครองมอ

ศนยเครองมอวจย มหาวทยาลยขอนแกน

เครองมอวจย : Atomic Force Microscope และ Circular Dichroism Spectrometer ผเขยน : ผศ.ดร.รนาภทรมานนทภาควชาชวเคมคณะวทยาศาสตรมหาวทยาลยขอนแกนและคณะ วารสาร : BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-Biomembranes หวขอวจย : EffectofacylchainlengthontherapeuticactivityandmodeofactionoftheCX-KYR-NH2 antimicrobiallipopeptide

เครองมอวจย : LC-MS/MS ผเขยน : ศ.ดร.วนชยมาลวงษภาควชาปรสตวทยาคณะแพทยศาสตรมหาวทยาลยขอนแกนและคณะ วารสาร : ExperimentalParasitology หวขอวจย : ProteomicanalysisidentificationofantigenicproteinsinGnathostoma spinigerumlarvae

2356 S. Nasompag et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1848 (2015) 2351–2364

Effect of acyl chain length on therapeutic activity and mode of action ofthe CX-KYR-NH2 antimicrobial lipopeptide

Sawinee Nasompag a,b, Punpimon Dechsiri a,b, Nuttaya Hongsing a,b, Prasart Phonimdaeng c, Sakda Daduang a,b,Sompong Klaynongsruang a,b, Terri A. Camesano d, Rina Patramanon a,b,⁎a Department of Biochemistry, Faculty of Science, Khon Kaen University, Khon Kaen 40002, Thailandb Protein and Proteomics Research Center for Commercial and Industrial Purposes, Khon Kaen University, Khon Kaen 40002, Thailandc Department of Microbiology, Faculty of Science, Khon Kaen University, Khon Kaen 40002, Thailandd Department of Chemical Engineering, Worcester Polytechnic Institute, MA 01609, USA

a b s t r a c ta r t i c l e i n f o

Article history:Received 30 January 2015Received in revised form 13 June 2015Accepted 8 July 2015Available online 11 July 2015

Keywords:LipopeptideAcyl chainMembrane permeabilizationMode of actionAntimicrobialAtomic force microscope

Peptide lipidation has proven to be an inexpensive and effective strategy for designing next-generation peptide-based drug compounds. In this study, the effect of the acyl chain length of ultrashort LiPs (CX-KYR-NH2; X = 10,12, 14 and 16) on their bacterial killing and membrane disruption kinetics was investigated. The geometricmean of the minimum inhibitory concentration (MIC) values for 4 pathogenic bacterial strains was 25 μM, witha selectivity index of 10.24 for C14-KYR-NH2. LiPs at all concentrations exhibited no cytotoxicity towards humanerythrocytes, but towards Vero cells at 80 μM. All the LiPs adopted secondary structure in a membranemimickingenvironment. C14-KYR-NH2 aggregated above 256 μM,while C16-KYR-NH2 did above 80 μM. All LiPs showed outermembrane permeabilizationwithin 3min after treatment, yet the extent and kinetics of innermembrane penetra-tion and depolarizationwere dependent on the acyl chain length. Cell death subsequently occurredwithin 10min,and killing activity appeared to correlate most with depolarization activity but not with outer or inner membranepermeability. AFM imaging of cells treated with C14-KYR-NH2 revealed rupture of the cell surface and cytosolicleakage depending on the length of incubation. This study highlights and follows the progression of events thatoccur during themembrane disintegration process over time, and determines the optimal amphipathicity of ultra-short LiPswith 12–14 carbon atoms for thismembrane disrupting activity. The fast acting bactericidal properties ofultrashort LiPs with optimal chain lengths make them promising candidates for drug lead compounds.

© 2015 Elsevier B.V. All rights reserved.

1. Introduction

The emergence of resistant microbes to classical antibiotics hasprompted the study and development of alternative agents as a newgeneration of antimicrobial compounds. Alternatives to classical antibi-otics are in need and peptide antibiotics such as antimicrobial peptides(AMPs) have shown significant promise as potential candidates for fu-ture therapeutics. The advantages of AMPs over conventional antibioticsinclude, but are not limited to, a broader spectrum of activity, non-receptor mediated modes of action, and minimal induction of drug re-sistance. AMPs were initially isolated more than two decades ago fromvarious organisms, including insects, hemolymphs, frogs andmammali-an neutrophil granules [1–4]. They are essential and evolutionarily con-served elements of the innate defense system of these organisms. AMPsgenerally consist of 12–50 aa that are mixed between hydrophobic and

hydrophilic groups, allowing for solubility in both aqueous and lipidphases. They have a net positive charge of 2–9 and most of themadopt amphipathic structures when bound on the membrane. In thepast decade much focus has been centered on modification of AMPs toimprove their antimicrobial activity, increase their in vivo efficacy andretention, and lower the cost of theirmanufacture [5,6]. Generally,mod-ifying the peptides by changing the amino acid sequence or by alternat-ing their order within the sequence has been shown to increaseantimicrobial activity [3,7,8]. However, other peptide modificationsare interesting as well. Linking peptides with other biological macro-molecules such as sugars or lipids has proven to yield higher antimicro-bial activity compared to the parent non-linked peptides [8,9].

Natural lipopeptides (LiPs) are produced nonribosomally in bacteriaand fungi during cultivation in various carbon sources. The structureconsists of a hydrophobic lipidmoiety covalently attached to hydrophil-ic peptides of 6–7 amino acids. Some of them are highly active againstantibiotic-resistant pathogenic bacteria. For instance, polymyxin B,one of themost studied lipopeptides, has been long used to treat topicaland urinary tract infection [10] and daptomycin has been approved bythe Food and Drug Administration for topical infections [11]. Although

Biochimica et Biophysica Acta 1848 (2015) 2351–2364

⁎ Corresponding author at: Department of Biochemistry, Faculty of Science, Khon KaenUniversity, Khon Kaen 40002, Thailand.

http://dx.doi.org/10.1016/j.bbamem.2015.07.0040005-2736/© 2015 Elsevier B.V. All rights reserved.

Contents lists available at ScienceDirect

Biochimica et Biophysica Acta

j ourna l homepage: www.e lsev ie r .com/ locate /bbamem

Full length article

Proteomic analysis identification of antigenic proteins in Gnathostomaspinigerum larvae

Penchom Janwan a, b, Pewpan M. Intapan b, c, Porntip Laummaunwai b, c,Rutchanee Rodpai b, c, Chaisiri Wongkham d, Tonkla Insawang e,Tongjit Thanchomnang b, f, Oranuch Sanpool b, f, Wanchai Maleewong b, c, *

a Department of Medical Technology, School of Allied Health Sciences and Public Health, Walailak University, Nakhon Si Thammarat 80161, Thailandb Research and Diagnostic Center for Emerging Infectious Diseases, Faculty of Medicine, Khon Kaen University, Khon Kaen 40002, Thailandc Department of Parasitology, Faculty of Medicine, Khon Kaen University, Khon Kaen 40002, Thailandd Department of Biochemistry, Faculty of Medicine, Khon Kaen University, Khon Kaen 40002, Thailande Khon Kaen University Research Instrument Center, Research Affairs, Faculty of Medicine, Khon Kaen University, Khon Kaen 40002, Thailandf Faculty of Medicine, Mahasarakham University, Maha Sarakham 44000, Thailand

h i g h l i g h t s g r a p h i c a l a b s t r a c t

� Of the 93 Gnathostoma spinigerumantigenic spots excised, 87 wereidentified by LC/MSeMS.

� Twenty seven types of proteins wereidentified from the database search.

� The set of identified antigenic mole-cules shows the diversity ofprocesses.

� Most protein is protein involving inmetabolic process and energygeneration.

a r t i c l e i n f o

Article history:Received 3 April 2015Received in revised form31 July 2015Accepted 16 August 2015Available online 25 August 2015

Keywords:Gnathostoma spinigerumProteomic analysisAntigenic protein spots

a b s t r a c t

Gnathostoma spinigerum is the causative agent of human gnathostomiasis. The advanced third stage larva(AL3) of this nematode can migrate into the subcutaneous tissues, including vital organs, often producingsevere pathological effects. This study performed immuno-proteomic analysis of antigenic spots, derivedfrom G. spinigerum advanced third stage larva (GSAL3) and recognized by human gnathostomiasis sera,using two-dimensional (2-DE) gel electrophoresis based-liquid chromatography/tandem mass spec-trometry (LC/MSeMS), and followed by the aid of a database search. The crude GSAL3 extract wasfractionated using IPG strips (pH 3-11NL) and followed by SDS-PAGE in the second dimension. Each gelwas stained with colloidal Coomassie blue or was electro-transferred onto a nitrocellulose membraneand probed with gnathostomiasis human sera by immunoblotting. Individual Coomassie-stained proteinspots corresponding to the antigenic spots recognized by immunoblotting were excised and processedusing LC/MSeMS. Of the 93 antigenic spots excised, 87 were identified by LC/MSeMS. Twenty-sevenprotein types were found, the most abundant being Ascaris suum37. Six spots showed good qualityspectra, but could not be identified. This appears to be the first attempt to characterize antigenic proteinsfrom GSAL3 using a proteomic approach. Immuno-proteomics shows promise to assist the search for

* Corresponding author. Department of Parasitology, Faculty of Medicine, KhonKaen University, Khon Kaen 40002, Thailand.

E-mail address: [email protected] (W. Maleewong).

Contents lists available at ScienceDirect

Experimental Parasitology

journal homepage: www.elsevier .com/locate /yexpr

http://dx.doi.org/10.1016/j.exppara.2015.08.0100014-4894/© 2015 Elsevier Inc. All rights reserved.

Experimental Parasitology 159 (2015) 53e58

2.5. 2-DE-based-liquid chromatography/tandem massspectrometry (LC/MSeMS) and protein identification

Coomassie-stained individual protein spots of interest corre-sponding to the antigenic spots recognized by pooled humangnathostomiasis sera by immunoblotting were excised and sent foranalysis to the proteomic service at the Khon Kaen UniversityResearch Instrument Center, Thailand. Coomassie-stained spotsrecognized by pooled healthy human sera were excluded. Briefly,the gel plugs were destained, airdried, and subjected to trypticdigestion. One ml (10 fmol) of the BSA digest solution was used as astandard control for the experiment. The tryptic peptides wereacidified and analyzed using a nano-liquid chromatography system(EASY-nLC II, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany) coupled toan ion trap mass spectrometer (Amazon Speed ETD, Bruker Dalto-nik GmbH) equipped with an ESI nano-sprayer. Sample volumes of1e2 mL were loaded by the autosampler onto a EASY-Column,10 cm, ID 75 mm, 3 mm, C18-A2 (Thermo Scientific) using a flowrate of 300 nL/min and linear gradient from solution A (0.1% formicacid) to 35% of solution B (0.1% formic acid in acetonitrile) in 35min.The Bruker Daltonik software package, HyStar v.3.2, was used tocontrol the ion trap device. LC-MS/MS spectra were analyzed usingCompass Data Analysis v.4.0. Compound lists were exported asMascot generic files (mgf) for further searching in MASCOT online(http://www.matrixscience.com). Protein identification was per-formed by searching against the protein database from NCBI (allentries) using MASCOTMS/MS Ion Search with the initial searchingparameters; Enzyme: trypsin, allowed up to one missed cleavage;carbamidomethylation (C) as a fixed modification, and oxidation(HW) and oxidation (M) as variable modifications; peptide masstolerance of 0.5 Da and fragmentmass tolerance of 0.5 Da; a peptidecharge state of þ1, þ2, þ3; instrument type: ESI-TRAP; and reporttop: auto. The molecular functions and biological roles of theidentified proteins were assigned according to the gene ontology(GO) database (http://www.geneontology.org) and the Swiss-Prot/UniProt database (http://beta.uniprot.org).

3. Results and discussion

Only 93 antigenic protein spots, which were recognized byhuman gnathostomiasis sera but not by healthy human sera, wereconsidered and further analyzed bymass spectrometry. Most targetproteins were obtained from the acidic region of the IPG strip andtheir molecular masses ranged between 20 and 40 kDa (Fig. 1).Identified target proteins were excised from gels, digested with

trypsin and the resulting peptides analyzed by mass spectrometry(Table S1-Supplementary material). Twenty-seven types ofdifferent proteins were identified using the Mascot program(Table 1). Since there was limited information regarding Gnathos-toma gene sequences, identification was based on matches to ho-mologous proteins from related nematodes (Table 1), e.g.Caenorhabditis sp., Ascaris suum, Brugia malayi, Wuchereria ban-crofti, Onchocerca volvulus, Necator americanus, Haemonchus con-tortus, Loa loa, Trichinella sp., Anisakis simplex, Strongyloidesstercoralis and Ditylenchus destructor. The most abundant identifiedprotein was Ascaris suum37 (As37) (17 spots). Although 6 spotsshow good quality spectra, they could not be identified (Table 1). Inaddition, Table 1 shows the biological processes and molecularfunctions for each immunogenic parasite protein where informa-tion was available from gene ontology (GO) term analysis. Manyproteins had metabolic roles and likely exhibited catalytic activity.Some proteins had other roles: actin (locomotion), heat shockproteins & chaperone proteins (response to stimulus), cytoplasmicintermediate filament protein (binding), peroxiredoxin (antioxi-dant), galactoside-binding lectin (binding), Third Party Data_inferential (TPA_inf): eukaryotic translation elongation factor 1alpha (binding), galectin (binding), and ATPase and cell divisionprotein 48 and vacuolar protein sorting (Vps4) oligomerisationdomain containing protein (binding).

We performed an immunoproteomic analysis to identify allimmunogenic proteins of G. spinigerum in human gnathostomiasis.To date, there have been few proteomic studies on Gnathostomaspecies and human gnathostomiasis. In our previous study, 2-DEgel electrophoresis of GSAL3 crude extract, followed by immuno-blotting using pooled human sera from proven gnathostomiasiscases, detected a number of prominent antigenic peptides, with atleast 70 such spots having approximate molecular masses rangingfrom less than 21.2 to more than 108 kDa with pI between 5 and 10(Laummaunwai et al., 2008). Peptide sequences of two of theseantigenic spots, which had approximate molecular weights of23e24 kDa and a pI of 8.1e9.3, matched with portions of cyclo-philin, hypothetical protein, actin, matrix metalloproteinase(MMP)-like protein and intermediate filament protein B(Laummaunwai et al., 2008). Recently, Campista-Le�on et al. (2012)separated crude somatic antigen of Gnathostoma binucleatum AL3using 2-DE immunoblot analysis. They found four antigenic spots,three withmolecular weights of 32 kDa (pI 6.3, 6.5 and 6.9) and onewith a molecular weight of 40 kDa (pI 5.6), with potential as anti-gens specific for serodiagnosis. Sequence analysis performed ontwo of the four proteins showed that they belonged to the galectin

Fig. 1. Representative images of three independent replicates are shown. Crude extract of Gnathostoma spinigerum advanced third stage larvae (GSAL3) was subjected to two-dimensional gel electrophoresis. The crude GSAL3 extract (200 mg) was fractionated using IPG strip (pH 3-11NL), followed by 12% SDS-PAGE. One gel was stained with colloidalCoomassie blue (A) and the other one was electro-transferred onto a nitrocellulose membrane and probed with human gnathostomiasis sera by immunoblotting (B). IndividualCoomassie-stained protein spots corresponding to the antigenic spots recognized by immunoblotting were excised and subjected to LC/MSeMS. Numbers at the left of each imageindicate protein molecular weight markers. Numbers and arrows on images refer to the spot identity used in the tables.

P. Janwan et al. / Experimental Parasitology 159 (2015) 53e58 55

2.5. 2-DE-based-liquid chromatography/tandem massspectrometry (LC/MSeMS) and protein identification

Coomassie-stained individual protein spots of interest corre-sponding to the antigenic spots recognized by pooled humangnathostomiasis sera by immunoblotting were excised and sent foranalysis to the proteomic service at the Khon Kaen UniversityResearch Instrument Center, Thailand. Coomassie-stained spotsrecognized by pooled healthy human sera were excluded. Briefly,the gel plugs were destained, airdried, and subjected to trypticdigestion. One ml (10 fmol) of the BSA digest solution was used as astandard control for the experiment. The tryptic peptides wereacidified and analyzed using a nano-liquid chromatography system(EASY-nLC II, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany) coupled toan ion trap mass spectrometer (Amazon Speed ETD, Bruker Dalto-nik GmbH) equipped with an ESI nano-sprayer. Sample volumes of1e2 mL were loaded by the autosampler onto a EASY-Column,10 cm, ID 75 mm, 3 mm, C18-A2 (Thermo Scientific) using a flowrate of 300 nL/min and linear gradient from solution A (0.1% formicacid) to 35% of solution B (0.1% formic acid in acetonitrile) in 35min.The Bruker Daltonik software package, HyStar v.3.2, was used tocontrol the ion trap device. LC-MS/MS spectra were analyzed usingCompass Data Analysis v.4.0. Compound lists were exported asMascot generic files (mgf) for further searching in MASCOT online(http://www.matrixscience.com). Protein identification was per-formed by searching against the protein database from NCBI (allentries) using MASCOTMS/MS Ion Search with the initial searchingparameters; Enzyme: trypsin, allowed up to one missed cleavage;carbamidomethylation (C) as a fixed modification, and oxidation(HW) and oxidation (M) as variable modifications; peptide masstolerance of 0.5 Da and fragmentmass tolerance of 0.5 Da; a peptidecharge state of þ1, þ2, þ3; instrument type: ESI-TRAP; and reporttop: auto. The molecular functions and biological roles of theidentified proteins were assigned according to the gene ontology(GO) database (http://www.geneontology.org) and the Swiss-Prot/UniProt database (http://beta.uniprot.org).

3. Results and discussion

Only 93 antigenic protein spots, which were recognized byhuman gnathostomiasis sera but not by healthy human sera, wereconsidered and further analyzed bymass spectrometry. Most targetproteins were obtained from the acidic region of the IPG strip andtheir molecular masses ranged between 20 and 40 kDa (Fig. 1).Identified target proteins were excised from gels, digested with

trypsin and the resulting peptides analyzed by mass spectrometry(Table S1-Supplementary material). Twenty-seven types ofdifferent proteins were identified using the Mascot program(Table 1). Since there was limited information regarding Gnathos-toma gene sequences, identification was based on matches to ho-mologous proteins from related nematodes (Table 1), e.g.Caenorhabditis sp., Ascaris suum, Brugia malayi, Wuchereria ban-crofti, Onchocerca volvulus, Necator americanus, Haemonchus con-tortus, Loa loa, Trichinella sp., Anisakis simplex, Strongyloidesstercoralis and Ditylenchus destructor. The most abundant identifiedprotein was Ascaris suum37 (As37) (17 spots). Although 6 spotsshow good quality spectra, they could not be identified (Table 1). Inaddition, Table 1 shows the biological processes and molecularfunctions for each immunogenic parasite protein where informa-tion was available from gene ontology (GO) term analysis. Manyproteins had metabolic roles and likely exhibited catalytic activity.Some proteins had other roles: actin (locomotion), heat shockproteins & chaperone proteins (response to stimulus), cytoplasmicintermediate filament protein (binding), peroxiredoxin (antioxi-dant), galactoside-binding lectin (binding), Third Party Data_inferential (TPA_inf): eukaryotic translation elongation factor 1alpha (binding), galectin (binding), and ATPase and cell divisionprotein 48 and vacuolar protein sorting (Vps4) oligomerisationdomain containing protein (binding).

We performed an immunoproteomic analysis to identify allimmunogenic proteins of G. spinigerum in human gnathostomiasis.To date, there have been few proteomic studies on Gnathostomaspecies and human gnathostomiasis. In our previous study, 2-DEgel electrophoresis of GSAL3 crude extract, followed by immuno-blotting using pooled human sera from proven gnathostomiasiscases, detected a number of prominent antigenic peptides, with atleast 70 such spots having approximate molecular masses rangingfrom less than 21.2 to more than 108 kDa with pI between 5 and 10(Laummaunwai et al., 2008). Peptide sequences of two of theseantigenic spots, which had approximate molecular weights of23e24 kDa and a pI of 8.1e9.3, matched with portions of cyclo-philin, hypothetical protein, actin, matrix metalloproteinase(MMP)-like protein and intermediate filament protein B(Laummaunwai et al., 2008). Recently, Campista-Le�on et al. (2012)separated crude somatic antigen of Gnathostoma binucleatum AL3using 2-DE immunoblot analysis. They found four antigenic spots,three withmolecular weights of 32 kDa (pI 6.3, 6.5 and 6.9) and onewith a molecular weight of 40 kDa (pI 5.6), with potential as anti-gens specific for serodiagnosis. Sequence analysis performed ontwo of the four proteins showed that they belonged to the galectin

Fig. 1. Representative images of three independent replicates are shown. Crude extract of Gnathostoma spinigerum advanced third stage larvae (GSAL3) was subjected to two-dimensional gel electrophoresis. The crude GSAL3 extract (200 mg) was fractionated using IPG strip (pH 3-11NL), followed by 12% SDS-PAGE. One gel was stained with colloidalCoomassie blue (A) and the other one was electro-transferred onto a nitrocellulose membrane and probed with human gnathostomiasis sera by immunoblotting (B). IndividualCoomassie-stained protein spots corresponding to the antigenic spots recognized by immunoblotting were excised and subjected to LC/MSeMS. Numbers at the left of each imageindicate protein molecular weight markers. Numbers and arrows on images refer to the spot identity used in the tables.

P. Janwan et al. / Experimental Parasitology 159 (2015) 53e58 55

เครองมอวจย : Transmission Electron Microscopeผเขยน : ผศ.ดร.นงลกษณมทองภาควชาฟสกสคณะวทยาศาสตรมหาวทยาลยขอนแกนและคณะวารสาร: Advanced EnergyMaterialsหวขอวจย: XANESInvestigationofDynamicPhaseTransitioninOlivineCathodeforLi-IonBatteries

FULL P

APER

© 2015 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim (1 of 8) 1500663wileyonlinelibrary.com

XANES Investigation of Dynamic Phase Transition in Olivine Cathode for Li-Ion Batteries

Sarawut Pongha , Boonyarit Seekoaon , Wanwisa Limphirat , Pinit Kidkhunthod , Sutham Srilomsak , * Yet-Ming Chiang , * and Nonglak Meethong *

DOI: 10.1002/aenm.201500663

material is the existence of a voltage plateau at around 3.45 V (vs Li/Li + ) which results from a fi rst-order phase transition occurring between LFP and FePO 4 (FP) phases during electrochemical cycling. Behavior associated with this plateau is far from simple, and the fundamentals of reaction mechanisms and phase transition pathways during the charge–discharge processes have been intensively investigated. [ 3–16 ] Many models have been proposed, supported by data from different characterization techniques. These include the core shell or shrinking core, [ 17 ] domino-cascade, [ 18,19 ] mosaic, [ 20,21 ] modifi ed radial core shell, [ 22,23 ] and the single-phase kinetics models. [ 24 ] These models are usu-ally based on the well-established phase dia-gram of the material which composes of a two-phase regime (miscibility gap) bounded by very narrow solid-solution end phase regimes of Li-rich Li 1−α FePO 4 and Li-poor

Li β FePO 4 closing to stoichiometric end members of lithiated oli-vine LFP (triphylite) and delithiated olivine FP (heterosite) phases at room temperature, and a solid solution over the entire com-position range above 520 K. [ 25,26 ] The miscibility gap is found to be particle size, particle geometry, temperature, and compositions (or defect) dependent, and may completely disappear at room temperature forming a complete solid solution. [ 4–6,27–29 ]

Dynamic phase transformation in olivine LiFePO 4 involving formation of one or more intermediate or metastable phases is revealed by an in situ time-resolved X-ray absorption near edge structure (XANES) technique. The XANES spectra measured during relaxation immediately after the application of relatively high overpotentials, where metastable phases are expected, show a continuous shift of the Fe K- edge toward higher energy. Surprisingly, the Fe K -edge relaxes to higher energies after current interrupt regardless of whether the cell is being charged or discharged. This relaxation phenomenon is superimposed upon larger shifts in K- edge due to changes in Fe 2+/ Fe 3+ ratio due to charging and discharging, and implies an intermediate phase of larger Fe O bond length than any of the known crystalline phases. No intermediate crystalline phases are observed by X-ray diffraction (XRD). A metastable amorphous phase formed during dynamic cycling and which structurally relaxes to the equilibrium crys-talline phases over a time scale of about 10 min after cessation of charging/discharging current is consistent with the experimental observations.

1. Introduction

Olivine LiFePO 4 (LFP) is a commercially useful cathode material for Li-ion batteries with good properties such as low toxicity, low cost due to the high natural abundance of iron, as well as high thermal stability and safety due to an affi nity for oxygen through a strong P–O covalent bond. [ 1,2 ] An important characteristic of this

S. Pongha, B. Seekoaon, Prof. S. Srilomsak, Prof. N. Meethong Department of Physics Faculty of Science Khon Kaen University Khon Kaen 40002 , Thailand E-mail: [email protected]; [email protected] Dr. W. Limphirat, Dr. P. Kidkhunthod Synchrotron Light Research Institute Nakhon Ratchasima 30000 , Thailand Prof. S. Srilomsak Nanotec-SUT Center of Excellence on Advanced Functional Nanomaterials Suranaree University of Technology Nakhon Ratchasima 30000 , Thailand Prof. S. Srilomsak School of Ceramic Engineering Suranaree University of Technology Nakhon Ratchasima 30000 , Thailand

Prof. Y.-M. Chiang Department of Materials Science and Engineering Massachusetts Institute of Technology 77 Massachusetts Ave , Cambridge , MA 02139 , USA E-mail: [email protected] Prof. N. Meethong Integrated Nanotechnology Research Center Khon Kaen University Khon Kaen 40002 , Thailand Prof. N. Meethong Nanotec-KKU Center of Excellence on Advanced Nanomaterials for Energy Production and Storage Khon Kaen University Khon Kaen 40002 , Thailand

Adv. Energy Mater. 2015, 1500663

www.MaterialsViews.comwww.advenergymat.de

FULL

PAPER

© 2015 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim1500663 (4 of 8) wileyonlinelibrary.com

The spectral shift to higher energy during relaxation after both charging and discharging suggests the same phase is involved.

To summarize the key experimental observations to this point, we fi nd that during charge or discharge, the overall Fe 2+ /Fe 3+ ratio changes with the SOC/SOD as expected for the change in average Fe valence of the compound. However, during relaxation, the Fe K -edge shows a shift to higher energy in all cases. In the remainder of this paper, we consider the pos-sible origins of this transient behavior.

4. Origins of the Dynamic Phase Transition Behavior

Figure 1 d,e and Figure 3 a–f are the Δ µ XANES data plotted in two different ways. In Figure 1 d,e, we plot the Δ µ XANES during charge–discharge normalized to the reference spec-trum of the fully charged state at 4.50 V. During the charge process, it is clear that the magnitude of the Δ µ difference decreases upon charging. This is indicative of a decrease in the

Adv. Energy Mater. 2015, 1500663

www.MaterialsViews.comwww.advenergymat.de

Figure 2. Normalized and calibrated Fe K- edge XANES spectra obtained during relaxation. Ranges 1R to 3R (left panel) represent the XANES spectra measured during 30 min relaxation during charging at about 30% SOC, 60% SOC, and 90% SOC, respectively. Ranges 5R–7R (right panel) represent the XANES spectra measured during 30 min relaxation during discharging at about 30% SOD, 60% SOD, and 90% SOD, respectively. The dashed lines in each range R represent XANES spectra of LFP (at 0% SOC) and FP (at 100% SOC). Notice that during relaxation the spectra shift from low to high energy regardless of whether the cell charging or discharging prior to the current interrupt.