Riassumendo Ci sono diverse modalità con cui un gene può produrre trascritti alternativi Ci sono diverse modalità con cui un gene può produrre trascritti.

RiassumendoRiassumendo

Ci sono diverse modalità con cui un gene può Ci sono diverse modalità con cui un gene può produrre trascritti alternativiprodurre trascritti alternativi

Inizi alternativi della trascrizioneInizi alternativi della trascrizione Terminazioni alternative della trascrizioneTerminazioni alternative della trascrizione Splicing alternativi:Splicing alternativi:

Introni trattenutiIntroni trattenuti Siti di splicing alternativiSiti di splicing alternativi Esoni cassetta (exon skipping)Esoni cassetta (exon skipping) Esoni mutualmente esclusiviEsoni mutualmente esclusivi

Gli esoni che invece sono sempre presenti in Gli esoni che invece sono sempre presenti in tutti i trascritti sono detti “tutti i trascritti sono detti “esoni costitutiviesoni costitutivi””

1) Gli introni “trattenuti”1) Gli introni “trattenuti”DNA

(doppiofilamento)

Trascritti che mappanosul filamento positivo

1) Gli introni “trattenuti”1) Gli introni “trattenuti”DNA

(doppiofilamento)

Trascritti che mappanosul filamento NEGATIVO

2) Segnali “in competizione”2) Segnali “in competizione”

Trascritti maturi:

3) Esoni “a cassetta”3) Esoni “a cassetta”

Trascritti maturi:

4) Esoni mutualmente esclusivi4) Esoni mutualmente esclusivi

Trascritti maturi:

... l’eccezione, oppure la regola?... l’eccezione, oppure la regola?

Philip Sharp (premio Nobel 1993): circa il 5% Philip Sharp (premio Nobel 1993): circa il 5% dei geni umani è soggetto a splicing alternativi..dei geni umani è soggetto a splicing alternativi..

Roberts & Smith (Curr. Op. in Chemical Biology, Roberts & Smith (Curr. Op. in Chemical Biology, 2002): circa il 45%2002): circa il 45%

Progetti trascrittoma... stima: circa, anzi più del Progetti trascrittoma... stima: circa, anzi più del 75%!75%!

Nostra stima… praticamente tutti, purché Nostra stima… praticamente tutti, purché abbiano più di un esone!abbiano più di un esone!

Stima “ufficiale” - come la nostra!Stima “ufficiale” - come la nostra!

Definire gli splicing alternativiDefinire gli splicing alternativi

Avendo a disposizione sia la sequenza Avendo a disposizione sia la sequenza genomica che quella dei trascritti, genomica che quella dei trascritti, mappando i differenti trascritti sulla mappando i differenti trascritti sulla sequenza genomicasequenza genomica si osservano a si osservano a “colpo d’occhio” le differenze“colpo d’occhio” le differenze

Mentre eventi sul primo (ultimo) esone Mentre eventi sul primo (ultimo) esone probabilmente lasciano la proteina probabilmente lasciano la proteina inalterata, inalterata, eventi negli esoni interni eventi negli esoni interni cambieranno anche la sequenza cambieranno anche la sequenza codificante del trascritto maturocodificante del trascritto maturo

Inizi della trascrizione alternativiInizi della trascrizione alternativi

Cosa può succedere alla regione Cosa può succedere alla regione codificante quando un gene mostra codificante quando un gene mostra inizi della trascrizione alternativi?inizi della trascrizione alternativi?

ATG

In questo caso,nulla alla CDS:

semplicementesi allunga/

accorciala 5’UTR

Ma...Ma...

... oltre che a “bordare” la CDS, le ... oltre che a “bordare” la CDS, le UTRUTR al al 5’ e al 3’ 5’ e al 3’ servono a qualcosaservono a qualcosa??

...sì!...sì!

Produrre un trascritto Produrre un trascritto non implicanon implica, , necessariamente, che il trascritto venga necessariamente, che il trascritto venga automaticamente tradottoautomaticamente tradotto

La 5’UTR di solito interagisce con il ribosoma, La 5’UTR di solito interagisce con il ribosoma, ma anche con specifiche proteine che si legano ma anche con specifiche proteine che si legano al DNA, e che regolano l’efficienza della al DNA, e che regolano l’efficienza della traduzionetraduzione

La 3’UTR, di solito, viene “attaccata” per La 3’UTR, di solito, viene “attaccata” per degradare l’mRNA, e quindi regola l’efficienza degradare l’mRNA, e quindi regola l’efficienza della degradazione (che può avvenire prima della degradazione (che può avvenire prima che la traduzione sia completa)che la traduzione sia completa)

MORALE: MORALE: 5’ e 3’ UTR5’ e 3’ UTR possono influenzare possono influenzare se/quando/come un trascritto viene tradottose/quando/come un trascritto viene tradotto

Splicing e proteineSplicing e proteine

Un gene (visto classicamente) non Un gene (visto classicamente) non produce UN trascritto, ma MOLTI produce UN trascritto, ma MOLTI trascritti, che differiscono tra loro trascritti, che differiscono tra loro per:per: Inizio/fine della trascrizioneInizio/fine della trascrizione Splicing alternativi (esoni “cassetta”, Splicing alternativi (esoni “cassetta”,

esoni alternativi, segnali di splicing esoni alternativi, segnali di splicing alternativi, introni ritenuti)alternativi, introni ritenuti)

Un gene, quante proteine Un gene, quante proteine “produce”?“produce”?

Le proteine “concettuali”Le proteine “concettuali”

Abbiamo a nostra disposizione genomi, Abbiamo a nostra disposizione genomi, e centinaia di migliaia di trascritti/ESTe centinaia di migliaia di trascritti/EST

In realtà, le sequenze proteiche “note” In realtà, le sequenze proteiche “note” (sequenziate) sono (sequenziate) sono pochepoche

... la maggior parte derivano da ... la maggior parte derivano da traduzioni “plausibili”traduzioni “plausibili” dell’RNA, oppure dell’RNA, oppure della sequenza genomicadella sequenza genomica

Come si prediconoCome si predicono, “concettualmente”, , “concettualmente”, le sequenze di proteine?le sequenze di proteine?

Tradurre i nucleotidiTradurre i nucleotidi

Se la traduzione avviene a Se la traduzione avviene a “triplette”, allora ci sono tre modi “triplette”, allora ci sono tre modi possibili di tradurre in amminoacidi possibili di tradurre in amminoacidi una sequenza nucleotidica (sempre una sequenza nucleotidica (sempre da 5’ a 3’!!)da 5’ a 3’!!)

5’- GATCAGTATGAGGTTAACATAACG - 3’

Tradurre i nucleotidiTradurre i nucleotidi

La traduzione avviene La traduzione avviene SEMPRESEMPRE leggendo la sequenza leggendo la sequenza dal 5’ al 3dal 5’ al 3’’

I tre diversi modi di tradurre una I tre diversi modi di tradurre una sequenza sono detti “sequenza sono detti “frameframe” di ” di letturalettura

E su un doppio filamento di DNA, E su un doppio filamento di DNA, quanti modi possibili di tradurre la quanti modi possibili di tradurre la sequenza ci sono?sequenza ci sono?

5’- GATCAGTATGAGGTTAACATAACG - 3’

3’- CTAGTCATACTCCAATTGTATTGC - 5’

Tre per filamento, quindiSEI in tutto

(indicate con +1,+2,+3 e-1,-2,-3)

Le frame di lettura “aperte”Le frame di lettura “aperte”

Ovviamente, a noi interessa trovare un Ovviamente, a noi interessa trovare un codone di start (ATG) e tradurre a partire codone di start (ATG) e tradurre a partire da quello da quello

La frame che inizia con ATG e termina La frame che inizia con ATG e termina con un codone di stop è detta “con un codone di stop è detta “frame di frame di lettura apertalettura aperta” (oppure “” (oppure “open reading frameopen reading frame”, oppure ORF)”, oppure ORF)

Quindi, si cerca innanzitutto un codone Quindi, si cerca innanzitutto un codone ATGATG

Le ORFLe ORF

5’- GATCAGTATGAGGTTAACATAACG -3’

... e si traduce fino a quando non si trova un codone di STOP nello stesso frame…

frame +2

Le ORFLe ORF

5’- GATCAGTATGAGGTTAACATAACG -3’

||||||||||||||||||||||||

3’- CTAGTCATACTCCAATTGTATTGC -5’

... e si traduce fino a quando non si trova un codone di STOP nello stesso frame…

frame +2

frame -2

Annotare un gene I parteAnnotare un gene I parte

Supponiamo di avere a disposizione solo mRNA Supponiamo di avere a disposizione solo mRNA e genoma (situazione tipica)e genoma (situazione tipica)

Primo passo: dato un mRNA, predire una Primo passo: dato un mRNA, predire una regione codificante “plausibile”regione codificante “plausibile”

Si procede sempre da 5’ a 3’, quindi solo 3 Si procede sempre da 5’ a 3’, quindi solo 3 frame di lettura possibiliframe di lettura possibili

Si cerca una frame (ORF) che inizi con ATG, Si cerca una frame (ORF) che inizi con ATG, finisca con un codone di stop, e che abbia una finisca con un codone di stop, e che abbia una lunghezza plausibile (di solito, più di 100 aa)lunghezza plausibile (di solito, più di 100 aa)

Annotare un gene, I parteAnnotare un gene, I parte

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/

6 possibiliframe

di letturaE’ un mRNA,

qual è lasoluzione?

Annotare un gene II parteAnnotare un gene II parte

Solitamente, va abbastanza bene: si Solitamente, va abbastanza bene: si trova un’unica regione codificante trova un’unica regione codificante “sensata”“sensata”

Poi, si mappa il trascritto sul genoma, e Poi, si mappa il trascritto sul genoma, e se ne determina la struttura se ne determina la struttura esoni/introni, nonché dove vanno a esoni/introni, nonché dove vanno a cadere codone di start e di stopcadere codone di start e di stop

Ma, tornando ai trascritti “multipli” e Ma, tornando ai trascritti “multipli” e agli “splicing”, cosa succede alla regione agli “splicing”, cosa succede alla regione codificante?codificante?

Splicing e ORFSplicing e ORF

Da “anomalia” la produzione di trascritti alternativi si è Da “anomalia” la produzione di trascritti alternativi si è scoperto essere la “normalità” nei geni degli eucarioti scoperto essere la “normalità” nei geni degli eucarioti superiorisuperiori

Trascritti alternativi, tramite:Trascritti alternativi, tramite: Inizi alternativi della trascrizioneInizi alternativi della trascrizione Terminazioni alternative della trascrizioneTerminazioni alternative della trascrizione Splicing alternativi che coinvolgono gli esoni interniSplicing alternativi che coinvolgono gli esoni interni

Quale effetto ha la produzione di trascritti alternativi sul Quale effetto ha la produzione di trascritti alternativi sul proteoma di un organismo?proteoma di un organismo?

A ogni trascritto alternativo, corrisponde una “proteina A ogni trascritto alternativo, corrisponde una “proteina alternativa” (della tecnicamente “alternativa” (della tecnicamente “isoformaisoforma”)?”)?

IsoformeIsoforme

A grandi linee gli effetti possono essere A grandi linee gli effetti possono essere riassunti come segue:riassunti come segue:

Inizi trascrizione alternativi:Inizi trascrizione alternativi: Allungano o accorciano la 5’UTRAllungano o accorciano la 5’UTR Aggiungono, rimuovono o modificano l’N terminale Aggiungono, rimuovono o modificano l’N terminale

della proteina codificatadella proteina codificata Terminazioni trascrizione alternative:Terminazioni trascrizione alternative:

Allungano o accorciano la 3’UTRAllungano o accorciano la 3’UTR Aggiungono, rimuovono o modificano il C terminale Aggiungono, rimuovono o modificano il C terminale

della proteina codificatadella proteina codificata Splicing alternativi esoni interni:Splicing alternativi esoni interni:

Modificano la regione codificanteModificano la regione codificante

ATG alternativiATG alternativi

In questo caso, ai 3 inizi di In questo caso, ai 3 inizi di trascrizione alternativi trascrizione alternativi corrispondono 3 ATG alternativicorrispondono 3 ATG alternativi

.....

5’ 3’Ovviamente,

le tre proteinecodificatesarannodiverseCOME,

dipendedal framedi lettura

ATG ATG ATG

ATG alternativiATG alternativi

Consideriamo il Consideriamo il secondo esonesecondo esone: se : se nel nel primo e secondo trascrittoprimo e secondo trascritto mantiene lo stesso frame, allora la mantiene lo stesso frame, allora la traduzione varia solo nella parte traduzione varia solo nella parte inizialeiniziale

.....

5’ 3’

ATG alternativiATG alternativi

IDEM, per il terzo trascritto: IDEM, per il terzo trascritto: se se l’ATG nel secondo esone è nello l’ATG nel secondo esone è nello stesso frame degli altri duestesso frame degli altri due, la , la traduzione da lì in poi sarà ugualetraduzione da lì in poi sarà uguale

.....

5’ 3’

OvveroOvvero

Parte uguale in tutti i trascritti

Dipende dal frame di lettura, ecome si arriva nella parte uguale per tutti. Potenzialmente, può essere tradotta in 3 modi diversi. Per avere la stessa cosa, in pratica, la parte codificante variabile all’inizio deve essere lunga...

OvveroOvveroParte uguale in tutti i trascritti

UN MULTIPLO DI 3!!!!!!In questo modo, le 3 proteineavranno un inizio diverso... ma una fine uguale!

Gli “spostamenti” di frameGli “spostamenti” di frame(frameshift)(frameshift)

5’- ATGCAGTCTGAGGTTAACATAACG - 3’

immaginiamo di avere una sequenza tradotta in questo modo....

5’- ATGCTCCAAATGCAGTCTGAGGTTAACATAACG -

se aggiungo un multiplo di 3 di nucleotidi la traduzione non cambia...

5’- ATGCTCCAATGCAGTCTGAGGTTAACATAACG -

..ma se non è un multiplo di 3... sposto “shift” tutto il frame di lettura cheavevo prima!!!!

Gli “spostamenti” di frameGli “spostamenti” di frame(frameshift)(frameshift)

5’- ATGCAGTCTGAGGTTAACATAACG - 3’

... e se cancello un po’ di nucleotidi?

5’- ATGCAG...GAGGTTAACATAACG - 3’

se ne cancello 3 (o multiplo) in frame, cancello esattamente un amminoacido

5’- ATGCA...TGAGGTTAACATAACG - 3’

... se ne cancello 3 (o multiplo) NON in frame, cancello un amminoacido e cambio quello adiacente

I “frameshift”I “frameshift”

5’- ATGCAGTCTGAGGTTAACATAACG - 3’

5’- ATGCAG..TGAGGTTAACATAACG - 3’

... se ne cancello NON 3 (o multiplo) dal punto di cancellazione in avantila traduzione è COMPLETAMENTE DIFFERENTE

Gli esoni “cassetta”Gli esoni “cassetta”

Le considerazioni appena viste si applicano a Le considerazioni appena viste si applicano a inserzioni/cancellazioni dovute ai “cassette exon”inserzioni/cancellazioni dovute ai “cassette exon”

se la lunghezza dell’esone giallo è un multiplo di 3, allora il suo inserimento causeràsoltanto un inserimento di amminoacidi nella proteina codificata

altrimenti, la traduzione dell’esone verde sarà DIVERSA a seconda della presenza o

meno di quello giallo

Siti di splicing alternativiSiti di splicing alternativi

Idem, quando si usano segnali di splicing Idem, quando si usano segnali di splicing alternativialternativi

in questo caso, se la lunghezza del frammento aggiuntivo (in blu) è un multiplo di 3, allora il suo inserimento causeràsoltanto un inserimento di amminoacidi

nella proteina codificata

altrimenti, la traduzione dell’esone giallo e verde sarà DIVERSA a seconda della presenza del frammento aggiuntivo in blu

(analogamente quando si accorciano esoni)

Gli esoni alternativiGli esoni alternativi

Generalmente (ma con moltissime Generalmente (ma con moltissime eccezioni) gli esoni altertativi (cassetta eccezioni) gli esoni altertativi (cassetta et similia) et similia) hanno proprio lunghezza hanno proprio lunghezza multipla di tre e frame +1multipla di tre e frame +1, quindi , quindi aggiungono/tolgono pezzi alla proteina aggiungono/tolgono pezzi alla proteina codificatacodificata

La “La “modularitàmodularità” nella costruzione della ” nella costruzione della regione codificante, d’altra parte, si regione codificante, d’altra parte, si sposa bene con la modularità che si sposa bene con la modularità che si osserva nella proteineosserva nella proteine

I domini delle proteineI domini delle proteine

Una sequenza proteica può essere suddivisa in Una sequenza proteica può essere suddivisa in ““dominidomini””

Ogni dominio forma la propria struttura Ogni dominio forma la propria struttura ““indipendenteindipendente”, ed è responsabile di una delle ”, ed è responsabile di una delle funzioni della proteina: si può legare ad altre funzioni della proteina: si può legare ad altre proteine, a ligandi, al DNA/RNA, ecc.proteine, a ligandi, al DNA/RNA, ecc.

In pratica, proteine diverse possono contenere In pratica, proteine diverse possono contenere lo/gli stessi dominilo/gli stessi domini

Il gene più famoso del mondoIl gene più famoso del mondo

Dominio di legame alDNA

Dominio di “tetramerizzazione”Di solito, 4 catene

di p53 sonoassemblate insieme

Il gene più famoso del mondoIl gene più famoso del mondo

Visualizzare gli splicing alternativiVisualizzare gli splicing alternativi

Visualizzare gli splicing alternativiVisualizzare gli splicing alternativi

Sempre il gene più famoso del Sempre il gene più famoso del mondomondo

Domanda!!!!Domanda!!!!

Disegna la struttura di un mRNA, Disegna la struttura di un mRNA, indicandone gli elementi che indicandone gli elementi che conosci. Immaginando che l’mRNA conosci. Immaginando che l’mRNA sia prodotto da un gene con 4 sia prodotto da un gene con 4 esoni, sul filamento negativo, con esoni, sul filamento negativo, con codone di start nel secondo esone codone di start nel secondo esone e stop nell’ultimo, “mappa” il e stop nell’ultimo, “mappa” il trascritto e tutti gli elementi trascritto e tutti gli elementi mappabili sulla sequenza genomicamappabili sulla sequenza genomica

Morale...Morale...

Il dogma iniziale:Il dogma iniziale: UN GENEUN GENE UN TRASCRITTO UN TRASCRITTO UNA PROTEINAUNA PROTEINA

... è ora diventato..... è ora diventato.. UN GENEUN GENE TANTI TRASCRITTITANTI TRASCRITTI (POTENZIALMENTE) TANTE PROTEINE(POTENZIALMENTE) TANTE PROTEINE

Potenzialmente, perché... non è assolutamente Potenzialmente, perché... non è assolutamente detto che tutti i trascritti prodotti da un gene detto che tutti i trascritti prodotti da un gene siano necessariamente codificantisiano necessariamente codificanti

Morale... (2)Morale... (2)

In “origine” gli RNA erano o In “origine” gli RNA erano o Codificanti (mRNA)Codificanti (mRNA) Coinvolti nella traduzione dei mRNA Coinvolti nella traduzione dei mRNA

(tRNA, rRNA)(tRNA, rRNA) In realtà, esistono centinaia di RNA In realtà, esistono centinaia di RNA

non codificanti prodotti da un non codificanti prodotti da un genoma (miRNA, snoRNA, genoma (miRNA, snoRNA, smallRNA) e così via, con svariate smallRNA) e così via, con svariate funzionifunzioni

Per cosa si vince un Nobel, negli Per cosa si vince un Nobel, negli anni 2000?anni 2000?

Fire & Mello, 1998

Morale... (3)Morale... (3)

Da un trascritto per gene, a molti Da un trascritto per gene, a molti trascritti per geni... ok?trascritti per geni... ok?

Ma, in realtà, ci si è resi conto che la Ma, in realtà, ci si è resi conto che la trascrizione non sembra essere limitata trascrizione non sembra essere limitata a quelli canonicamente annotati come a quelli canonicamente annotati come genigeni

““Foreste” di trascritti provenienti da Foreste” di trascritti provenienti da regioni genomiche non limitate solo ai regioni genomiche non limitate solo ai geni (es : RNA antisenso)geni (es : RNA antisenso)

Morale... (4)Morale... (4)

... il tutto ha portato a fare un ... il tutto ha portato a fare un ulteriore passo indietro... ora, molti ulteriore passo indietro... ora, molti si chiedono...si chiedono...

Dopotutto, che cos’è un gene??