A. PROBOTICEI. Introduceren ultimii ani, probioticele
comercializate sub form de alimente, suplimente alimentare cu
bacterii vii sau produse farmaceutice au atras tot mai mult
interesul att al cecettorilor ct i al consumatorilor. Interesul
public general de descoperire a unui stil de via sntos, mpreun cu
preocuparea medicilor de a descoperi terapii neinvazive i lipsite
de reacii adverse, au reorientat atenia pe rolul potenial benefic
al microbiotei umane n prevenirea i tratarea diferitelor boli.
Modularea microbiotei intestinale poate fi influenat pozitiv prin
consumarea de probiotice i/sau prebiotice. n cuprinsul acestui
articol ne propunem s prezentm structura bacteriilor lactice cu
potenial probiotic, mecanismele de aciune, interaciunile cu
celulele corpului uman i cu bacteriile patogene, precum i tendinele
actuale n utilizarea probioticelor pentru prevenirea i tratarea
unor afeciuni dermatologice, care au reprezentat motivaia acestei
teze de doctorat.II. Evoluia conceptului de probiotic
Spre sfritul secolului al XIX-lea, numeroi cercettori
descoperiser c o gam larg de iaurturi au un termen de valabilitate
mai extins i un gust mai plcut. Microbiologii au extins cercetrile
de la bacteriile lactice din laptele fermentat la bacterilei
lactice specifice organismului uman.Escherich, n 1885, a fost
primul care a recunoscut importana bacteriilor existente n tractul
intestinal i a subliniat rolul acestora n fiziologia digestiei,
precum i n patologia i terapia bolilor intestinale de cauz
infecioas. n 1900, doi microbiologi, Tissier i Moro, au prezentat
studiul lor privind prezena anumitor bacterii n fecalele
nou-nscuilor hrnii cu lapte. n 1908, au completat studiul, artnd o
predominan a Bacillus bifidus n fecalele sugarilor hrnii la sn,
comparativ cu a celor hrnii cu lapte-formul, unde era predominant
Bacillus acidophillus.Ilia Ilici Mecinikov, laureatul Premiului
Nobel pentru Medicin, n 1908, a fost primul care a formulat ipoteza
tinific privind caracterul probiotic (pentru via) al unor
bacterii[1], chiar dac termenul probiotic care descria substane
produse de microorganisme, capabile de a iniia i susine creterea
altor microorganisme, fusese inventat de Lilly i Stillwell n
1965[2]. Munca sa se bazeaz pe organisme izolate anterior, n 1905,
de Grigoroff, utiliznd culturi starter pentru iaurtul bulgresc, i
denumindu-le Lactobacillus bulgaricus. n timpul procesului,
Grigoroff a identificat un alt microorganism, Streptococcus
termophilus, care ns nu a fost cercetat suficient, fiind considerat
pe atunci patogen. Experimentele lui mecinikov l-au condus pe
acesta s afirme c L. Bulgaricus este capabil de a popula flora
intestinal i de a preveni multiplicarea bacteriilor patogene.
Urmtoarele experimente, ale lui Herter i Kendall n 1908 au euat n a
demonstra aderena acestui Lactobacil n flora intestinal, dar au
subliniat alte aspecte benefice ale prezenei Lactobacilului n flora
intestinal.Ulterior, numeroi oameni de tiin au ncercat s
demonstreze capacitatea de populare a intestinului cu anumite
tulpini de L. acidophyllus, precum i modificrile benefice pe care
le poate produce. Rettger i Horton n 1914 i Rettger i Cheplin n
1920 au prezentat concluzia unor studii care demonstrau modificare
microflorei intestinale, prin obinerea unor culturi predominante de
L. acidophyllus i B. biffidus, prin hrnirea cu lapte sau lactoz a
cobailor, apoi in studiu clinic. Acest studiu a strnit interesul
comercial pentru obinerea de produse fermentate coninnd L.
acidophyllus (Burke, 1938). Alte cercetri i-au aparinut lui Minoru
Shirota din Japonia, care a subliniat potenialul caracter
terapeutic obinut prin modularea microflorei intestinale. n 1930,
el reuete s izoleze o tulpin de Lactobacillus capabil s reziste
pasajului gastro-intestinal. Ulterior, cultura identificat a fost
denumit Lactobacillus casei tulpina Shirota i utilizat cu mare
succes n obinerea produsului Yakult, produsul companiei cu acelai
nume, fondat n 1935. Perioada dintre 1930 i 1950 este srac n studii
i cercetri din cauza condiiilor neprielnice din timpul rzboiului.
Interesul pentru microflora intestinal uman renate spre nceputul
anilor 1960 i conduce spre un nou concept al termenului
probiotic.Fuller redefinete termenul ca fiind suplimente pentru
hrana oragnismelor vii animale, care afecteaz benefic gazda prin
mbuntirea echilibrului florei intestinale.[3] O definiie mai
recent, dar nicidecum ultima, definete probioticele ca
microorganisme vii care, administrate oral, n cantiti adecvate,
confer un efect benefic asupra gazdei [4]. n conformitate cu aceast
definiie, care a fost adoptat i de o Comisie de Experi
[5,6,101,102] microorganismele probiotice nu trebuie neaparat s
colonizeze intestinul uman, ci trebuie s fie viabile i s se gseasc
ntr-o concentraie suficient pentru a-i exercita efectul dorit, de a
spori capacitatea de protecie a florei comensale mpotriva
interaciunilor competiionale, antagonizrii patogenilor i/sau
producerii de factori antimicrobieni bacteriocinele. n alte condiii
clinice care presupun infecii cronice sau imunosupresie,
interacinea dintre microflora probiot i imunitatea gazdei poate fi
cu mult mai relevant n demonstrarea eficacitii probioticelor.
Probioticele pot fi comercializate ca suplimente alimentare,
aditivi alimentari sau produse farmaceutice.Comercializarea unei
tulpini probiotice ca i produs farmaceutic necesit demonstrarea
unei inte terapeutice bine definite, utilizndtrialuri clinice bine
proiectate, care trebuie s fie controlate, randomizate i verificate
dublu-orb [5-7]. Mai mult dect att, sunt necesare studii care s
demonstreze stabilitatea i sigurana administrrii pe mucoasele
diferitelor aparate. [5-8]. Diferite beneficii atribuite
probioticelor sunt raportate n literatura de specialitate, cele mai
multe viznd tulburrile gastro-intestinale[5-14], ns cteva ofer
dovezi clare asupra beneficiilor aduse de probiotice la nivelul
altor organe- int, cum este cazul vaginitelor bacteriene.[15]Scopul
acestui articol de documentare este acela de a explora
complexitatea multidisciplinar a cercetrilor desfurate pe
probiotice, astfel inct s putem dezvolta o nou posibil aplicaie
farmacologic a bacteriilor lactice n prevenirea i tratarea unor
afeciuni dermatologice pentru care tratamentele consacrate s-au
dovedit ineficiente sau a trebuit s se asume riscul efectelor
secundare sau reaciilor adverse inerente.III. DefiniieTermenul
probiotic a fost iniial utilizat ca i antonim al cuvntului
antibiotic. Etimologia cuvntului se afl n limba greac: =pentru i
=via (Hamilton-Miller, Gibson & Bruck, 2003). Originea primei
utilizri a termenului poate fi detectat n 1953, de ctre Kollath,
care l utilizeaz pentru a descrie restabilirea sntii unor pacieni
subnutrii cu diferite suplimente organice i anorganice. Un an mai
trziu, Vergin 1954 susine c dezechilibrul produs n organism de
tratamentul antibiotic poate fi restabilit printr-o diet bogat n
probiotice; o sugestie citat ulterior ca fiind prima referin la
probiotice, aa cum sunt ele definite astzi. Similar cu aceasta, n
1955, Kolb recunoate efectele nedorite postantibiotice i propune
terapia profilactic cu probiotice. Mai trziu, Lilly i Stillwell, n
1965, definesc probioticele ca substane produse de un microorganism
care susin creterea altor microorganisme. Similar cu aceasta,
Sperti n 1971 i Fuji&Cook n 1973 descriu probioticeleca i
compui care fie stimuleaz creterea microbian, fie mbuntesc rspunsul
imun al gazdei, fr a inhiba in vitro creterea culturii. O alt
definiie oferit de Parker n 1974 se aseamn cu descrierile recente
ale probioticelor organisme sau substane, care contribuie la
meninerea echilibrului microbian intestinal. Aceast definiie a fost
contestat de muli autori , deoarece puteau fi incluse multiple
substane n aceast categorie, inclusiv antibiotice. Sfritul anilor
1980 i nceputul anilor 1990 a cunoscut un val de noi i diferite
definiii ale probioticelor. O definiie frecvent citat este cea a
lui Fuller din 1992, care definete probioticele ca suplimente
pentru hrana oragnismelor vii animale, care au efecte benefice
asupra gazdei animale prin mbuntirea echilibrului florei microbiene
intestinale. Aceast definiie prea c se adreseaz i are
aplicabilitate mai mult pe animale dect pe oameni. Ali autori au
mers pe aceast linie, oferind propriile versiuni. Cteva din aceste
definiii sunt listate n Tabelul 1. Dei toi autorii citai au fost de
acord c termenul probiotic se refer la microorganisme vii,
Salminen, Ouwehand, Benno i Lee n 1999 i-au prezentat propria
versiune, incluznd i bacterii neviabile n definiie.Urmnd
recomandarea FAO/WHO asupra evalurii probioticelor ca aditivi
alimentari, n 2002, definiia sugerat descria probioticele ca
microorganisme vii, care administrate n doze adecvate confer
beneficiu asupra sntii gazdei. n consecin, o larg varietate de
specii i genuri pot fi considerate potenial probiotice. (Holzapfel,
Haberer, Snel, Schillinger & Huisint Veld, 1998); din punct de
vedere comercial, cele mai importante tulpini sunt cele de bacterii
lactice. (LAB)Tabel 1.Definiii i descrieri ale termenului probiotic
de-a lungul anilorAnulDescriereSursa
1953Probioticele sunt comune n legume ca vitamine, substane
aromatice, enzime si, eventual, alte substane legate de procese
vitaleKollath
1954Probioticele sunt opusul antibioticelorVergin
1955Efectele nocive ale antibioticelor pot fi prevenite prin
tratamentul cu probioticeKolb
1965O substan secretat de un microorganism care stimuleaz
creterea alteiaLilly and Stillwell
1971Extracte tisulare care stimuleaz creterea
microorganismelorSperti
1973Compuii care construiesc rezistena la infecii, n gazd, dar
nu inhib creterea microorganismelor in vitroFujii and Cook
1974Organisme i substane care contribuie la echilibrul microbian
intestinalParker
1992Supliment pentru hrana organismelor vii microbiene, care
afecteaz benefic animalul gazd prin mbuntirea echilibrului
microbianFuller
1992Cultur mono-sau mixt de microorganisme viabile care,
aplicate la animale sau la om, au un efect benefic asupra gazdei
prin mbuntirea proprietilor microflorei indigeneHavenaar and Huis
intVeld
1996Culturi microbiene sau produse lactate avnd culturi lactice
care influeneaz benefic sntatea i nutriia gazdeiSalminen
1996Microorganisme vii care, la ingerarea n anumite doze,
exercit beneficii pentru sntate, altele dect cele ale hranei de baz
Schaafsma
1999Preparate de celule microbiene sau componente ale celulelor
microbiene, care au un efect benefic asupra sntii i bunstrii
gazdeiSalminen, Ouwehand, Benno and Lee
2001Un preparat sau un produs care conine microorganisme
viabile, definite n numr suficient, care modifica microflora (de
implantare sau colonizare), ntr-un compartiment al gazdei i care
exercita efect benefic asupra sntii gazdeiSchrezenmeir and de
Vrese
2002Microorganisme vii care, atunci cnd sunt administrate n
cantiti adecvate confer un beneficiu asupra sntii
gazdei.FAO/WHO
IV. Taxonomie i caracteristicile importante ale bacteriilor
lacticeGenurile Lactobacillus i Bifidobacterium sunt cele mai
utilizate ca probiotice i de aceea vor reprezenta genurile la care
voi face referire n acest articol. Diferitele specii din genul
Lactobacillus i Bifidobacterium pot include presupuse tulpini
probiotice (Tabel 1.), dar numai cteva din aceste tulpini sunt
considerate importante i utilizate n prepararea suplimentelor
alimentare i produselor farmaceutice.
Genul LactobacillusLactobacilii sunt celule Gram+ sub form de
bastonae sau cocobacili, bacterii lactice nesporulate (LAB), specii
bacteriene capabile s produc acid lactic ca produs final de
fermentaie a carbohidrailor. n conformitate cu Schema Taxonomic a
Procariotelor [Taxonomy and important features of probiotic
microorganisms in food and nutrition], genul Lactobacillus (descris
prima dat de Beijerinck n 1901) aparine: ncrengturai Firmicutes
Clasa BacilliOrdin LactobacillalesFamilia Lactobacillaceaei este
organizat n grupuri filogenetice 8 grupuri dup Dellaglio i Felis.
Genul Lactobacillus este extrem de eterogen coninutul de guanin i
citozin din structura ADN-ului variind de la 32% la 54%,incluznd
132 de specii i 27 de subspecii, a cror clasificare este ntr-o
continu dinamic.Cea mai rapid cale de identificarea a unei specii
de Lactobacili este combinarea unor teste fenotipice (teste de
carbohidrai) i metode moleculare avansate (secvenierea total sau
parial a genei 16S din ARN, electroforez pe gel n cmp pulsat i
hibridizare ADN-ADN).[6,19,31-35]O identificare i o denumire corect
a microorganismelor probiotice este fundamental pentru urmrirea
tulpinilor probiotice i pentru asigurarea securitii unor mrci
nregistrate ale unor produse probiotice.[34]Lactobacilii sunt
aproape ubiquitari, fiind prezeni n mncare, plante, mucoasele
membranelor animale sau umane (respiratorii, gastro-intestinale,
genitale, orale) [31,32].
Genul Bifidobacterium
Bifidobacteriile sunt celule Gram+ polimorfe, sub form de
bastonae, nesporulate i anaerobe, cu un metabolism de tip
fermentativ (producnd acid, dar nu i gaz din carbohidrai). Conform
Clasificrii Taxonomice a Procariotelor, genul Bifidobacterium
aparine:ncrengtura ActinobacteriaClasa ActinobacteriaSubclasa
ActinobacteridaeOrdinul BifidobacterialesFamilia
BifidobacteriaceaeConinutul de guanin-citozin din structura
ADN-ului variaz de la 42% la 67% [31]. Genul Bifidobacterium
include 29 de specii i 6 subspecii [31]. Aceleai metode de
identificare filogenetic i molecular care se aplic la Lactobacili,
sunt utilizate i pentru identificarea Bifidobacteriilor. [33,34].
Bifidobacteriile sunt ntlnite att la animale, ct i la om, n special
se izoleaz din fecale, vagin i carii.[31]Bacteriile lactice sunt
microorganisme Gram pozitive, capabile s produc o cantitate mai
mare sau mai mic de acid lactic, prin degradarea diverselor
substraturi: hexoze: bacteriile care degradeaz 95% din glucoz n
acid lactic sunt denumite homolactice; acidul malic: transformarea
acidului malic in acid lactic, cunoscut sub numele de fermentaie
malolactic.Alte substraturi degradate de bacteriile lactice sunt:
pentozele, acidul tartric, acidul citric, glicerolul.
MORFOLOGIA BACTERIILOR LACTICE Structura general a celulei
bacteriene se apropie de aceea a celulei vegetale. Forma
bacteriilor este un caracter destul de stabil, de aceea constituie
unul dintre criteriile fundamentale ale clasificrii acestor
microorganisme. Bacteriile lactice se prezint la microscop de forme
variate. Astfel se disting: coci, de form rotunjit sau oval i
bacili sau bastonae, de form cilindric, mai mult sau mai puin
groase, uneori sinuoase. Cocii au diametrul de la 0,4 pana la 1,0m,
iar bacilii au grosimea de 0,5 m i 2-5 m sau mai mult n lungime.
Atunci cnd dou celule de coci, rezultate n urma unei diviziuni, se
separ imediat, apar la microscop drept coci izolai; cnd rmn alipite
un anumit timp, apar ca grupri celulare caracteristice: diplococi
(celule alipite cte dou), streptococi (celule n irag), sarcini
(celule n aglomerri cubice), stafilococi ( celule n aglomerri
neregulate). Bacilii, ca i cocii, pot rmne alipii dup diviziune,
formnd diplobacili sau streptobacili, nlnuiri prezentnd aspect de
filamente mai mult sau mai puin lungi, mai mult sau mai puin
sinuoase. Lungimea filamentelor depinde de condiiile de cultur, n
special pH-ul mediului, temperatur, prezena alcoolului, viteza de
multiplicare i agitaia lichidului. STRUCTURA CELULEI LA BACTERIILE
LACTICE Bacteriile sunt celule procariote. Ele se deosebesc esenial
de celulele eucariote (celulele vegetale i animale) att prin talia
net inferioar, ct i prin organizarea lor, caracterizat de absena
membranei ce separ nucleul de citoplasm i prin mecanismul lor de
diviziune. Marea varietate a bacteriilor se datoreaz mai curnd
diferenelor n ceea ce privete metabolismul i fiziologia lor dect
deosebirilor morfologice. Structura tuturor celulelor bacteriene
este foarte asemntoare i cuprinde trei elemente principale: nveliul
celular, citoplasma i nucleul. NVELIUL CELULAR nveliul celular
cuprinde peretele i membrana. Celula este delimitat de membrana
citoplasmatic, dublat spre exterior de perete. Constituia membranei
este relativ constant, n schimb a peretelui este mai variabil i
permite diferenierea unor grupe mari de bacterii. ntre perete i
membran, spaiul periplasmic este un gel mai mult sau mai puin fluid
n care se deplaseaz proteina. Peretele care dubleaz membrana
citoplasmatic poate fi el nsui nconjurat de un nveli exterior de
natur organic vscoas, ea este perfect delimitat, constituind
capsula. Importana sa este adesea legata de condiiile de cultur. La
unele specii sau sue, capsula polizaharidic, adesea groas, particip
la rezistena bacteriei contra unor agresiuni.
PERETELE CELULAR Peretele este scheletul rigid al celulei; el d
celulei forma sa caracteristic sferic sau cilindric. Foarte solid,
el rezist la presiunea osmotic intracelular enorm, care poate varia
ntre 5 i 20 atmosfere. Plasat ntr-un mediu hipotonic, far el,
celula se sparge; de aceea este un element esenial. Comportamentul
celulelor n timpul testului colorat se explic prin structura
peretelui: la Gram (+), peptiloglicanul este gros i este singurul
constituent, la cele Gram(-), el este mai subire i acoperit de
membrana exterioar. Substraturile nutritive, ionii minerali,
vitaminele, apa traverseaz liber peretele, la fel ca i produii
metabolismului bacterian. De asemenea, peretele asigura alte funcii
importante n viaa celulei: este suportul antigenelor specifice i
receptorilor bacteriofagilor. Constituentul principal i
caracteristic al peretelui celulei bacteriene este peptidoglicanul,
care este o macromolecul enorm ce nconjoar celula printr-o reea de
lanuri polizaharidice i peptidice. Lanurile polizaharidice,
lineare, paralele sunt reunite ntre ele prin puni
peptidice.MEMBRANA CITOPLASMATIC Membrana celulei bacteriene are
aceeai structur fundamantal ca i celelalte membrane biologice,
fiind un dublu strat fosfolipidic n care sunt inserate proteine.
Membrana citoplasmatic este unul dintre elementele vitale ale
celulei bacteriene. Alterarea sa ncetinete schimbul cu mediul i
mpiedic meninerea pH-ului intracelular. n special, mecanismele
generatoare de energie care se deruleaz la nivel membranar sunt
inhibate i viabilitatea celulelor este afectat. Lipidele membranare
constituie totalitatea lipidelor bacteriene (95-99%). Ele cuprind
puini acizi grai liberi dar mai ales glicerofosfolipide. Acizii
grai din constituia lipidelor au lanuri carbonate de 10-20 atomi de
carbon. Majoritatea sunt acizi cu 16-18 atomi de carbon, saturai
sau nu. La bacteriile lactice exist i un acid ciclopropanic n C19 -
acidul lactobacilic. Acizii grai posed o caten lung hidrocarbonat i
o funcie acid carboxilic terminal. Lungimea catenei, nesaturarea
ei, conformaia cis- sau trans- a dublelor legturi i, pentru
bacteriile Gram pozitive, ramificarea izo- sau anteizo-
caracterizeaz aceste molecule. Sinteza acizilor grai este realizat
prin condensri succesive ale malonil-CoA pe acidul acetic pentru
catenele cu numr par de atomi de carbon i pe acidul propionic
pentru catenele cu numr impar de atomi de carbon. Acizii nesaturai
sunt sintetizai la bacteriile anaerobe prin aciunea unei
dehidrataze asupra acidului hidroxidecanoic format prin adiia unei
uniti malonil asupra acidului octanoic. Prelungirea progresiv a
acestui acid conduce la acidul cis-vaccenic (C18), el nsui
precursor al acidului lactobacilic (C19). Aceast ultim trecere de
la un acid nesaturat la acidul ciclopropanic corespunztor se
realizeaz prin metilarea dublei legturi. Fosfolipidele cele mai
abundente sunt constituite dintr-o molecul de glicerol la care o
funcie alcool primar i funcia alcool secundar sunt esterificate de
acizii grai. Cealalt funcie alcool primar este esterificat de
acidul fosforic, el nsui esterificat de o nou molecul de glicerol.
Bacteriile lactice conin, de asemenea, difosfatidil glicerol i
esteri aminai ai fosfatidil glicerolului cu alanina i lizina.
Coninutul n fosfolipide al bacteriilor variaz n funcie de stadiul
de cretere i de condiiile de cultur. Glicolipidele, n general
glicozide ale digliceridelor, se formeaz prin legtur ozidic la
nivelul funciei alcool primare a unei gliceride cu un mono sau
dizaharid glucoz, fructoz, ramnoz. Proteinele sunt de dou feluri:
proteine intriseci (70%), care fac parte complet din membran i
proteine periferice (30%). Primele sunt integrate n lipide prin
partea lor hidrofob. Partea lor hidrofil iese la suprafa la
interior sau la exterior. Proteinele periferice sunt legate prin
interaciuni slabe de proteinele integrate sau de lipide. La
interiorul dublului strat, proteinele sunt relativ mobile lateral.
Fluiditatea membranei este legat de constituia sa n acizi grai.
Astfel, de exemplu, bacteriile se pot adapta la o diminuare a
temperaturii crescnd proporia de acizi grai nesaturai. CITOPLASMA
Citoplasma conine enzimele metabolismului bacterian, dar reprezint
i sediul sintezei proteinelor. Ansamblul metabolismului, reacii de
degradare i de sintez se realizeaz n mod programat, n funcie de
schimburile cu mediul exterior pentru a produce energia necesar
creterii. La microscopul electronic cu transmisie, interiorul unei
celule bacteriene apare granulos. Acest aspect este dat de
ribozomi, care au un rol esenial n sinteza proteinelor, ei asigurnd
traducerea codului genetic. Ribozomii sunt formai din dou subuniti
de talie diferit, 50 S i 30 S. Ribozomul asamblat are o constant de
sedimentare de 70 S (Svedberg). Subunitatea 30 S conine o molecul
de ARN ribozomal 16 S (1542 nucleotide) i 21 molecule de proteine
diferite. Masa molecular a acestui ansamblu este de 900 Da.
Subunitatea 50 S conine dou molecule de ARN ribozomal, molecula 23
S i molecula 5 S de 2904 i 120 nucleotide. Ea conine, de aemenea,
35 proteine i are o mas molecular de 1600 kDa.NUCLEUL I MATERIALUL
GENETIC Cromozomul bacterian este reprezentat de o singur molecul
de ADN, de form circular i de talie diferit, n funcie de specie:
2400 kilobaze la Lactobacillus plantarum, 1400 kilobaze la
Leuconostoc oenos, 1200 kilobaze la Pediococcus pentosaceus.
Cromozomul nu este separat de citoplasm printr-o membran. El este
localizat n partea central a celulei dar pare ataat n mai multe de
membrana citoplasmatic, n special la nivelul mezozomului. Pot
exista mai multe nuclee n celul deoarece diviziunea nucleului i a
celulei nu sunt sincrone. Secvena nucleotidic dup care sunt
asamblate cele patru nucleotide caracterizate de cele patru baze A,
T, G i C constituie suportul genetic care este decodat n timpul
traducerii. Cromozomul codific majoritatea informaiilor privind
funciile vitale ale celulei, dar o serie de funcii, mai mult sau
mai puin vitale, sunt determinate de plasmide, mici molecule de ADN
circulare, complet independente de cromozom. Ele sunt n numr i
talie variabile dup speciile i suele de bacterii i determin, n
general, funcii ca alimentaia anumitor zaharuri, hidroliza
proteinelor, rezistena la fagi, la antibiotice, la metale grele
etc. Plasmidele se divizeaz dup acelei principiu de replicare ca i
cromozomul sau n moduri mai specifice dar n orice caz n mod total
independent. Una dintre caracteristicile plasmidelor este
instabilitatea lor astfel nct anumite caractere fenotipice pot fi
pierdute spontan n cursul generaiilor, dar adesea exist mai multe
copii pe celul ale unor plasmide.CARACTERISTICI ALE LACTOBACILILOR
Genul Lactobacillus cuprinde specii oarecum asemntoare, dar
morfologia i gruparea celulelor lor permit diferenierea acestora,
unele specii prezint numeroase caractere metabolice identice,
precum capacitatea de a asimila numeroase substraturi. Diferenierea
speciilor de bacterii lactice se bazeaz pe morfologia lor i pe
caracterul homofermentativ sau heterofermentativ al acestora.
Bacteriile homofermentative produc peste 85% din acidul lactic
pornind de la glucoz. Bacteriile heterofermentative produc, n afar
de acid lactic, CO2, alcool etilic i acid acetic. Lactobacilii pot
prezenta ambele componente i sunt mparii n trei grupe: strict
homofermentativi (grupa I); heterofermentativi facultativ (grupa a
II-a); heterofermentativi obligatoriu (grupa a III-a) Lactobacilii
homofermentativi strict nu fermenteaz pentozele i formeaz, pornind
de la o molecul de glucoz, dou molecule de acid lactic pe calea
Embden-Meyerhoff. La heterofermentativii facultativ, din glucoz
rezult, de asemenea, dou molecule de acid lactic, dar pentozele
sunt metabolizate n acid lactic i acid acetic pe calea
heterofermentativ a pentozofosfailor. Bacteriile heterofermentative
obligatoriu nu posed fructozo-1,6-difosfat-aldolaza, caracteristic
pentru calea Embden-Meyerhoff. Ele metabolizeaz glucoza pe calea
pentozofosfailor n CO2, acid lactic, acid acetic i alcool etilic;
pentozele sunt transformate n acid lactic i acid acetic, ca i n
cazul bacteriilor din grupa a II-a.
Tabelul 2.
BaciliHeterofermentativi facultativ (grupa a II-a)Lactobacillus
casei
Lactobacillus plantarum
Heterofermentativi obligatoriu (grupa a III-a)Lactobacillus
hilgardii
Lactobacillus fructivorans
Lactobacillus brevis
Determinarea genului bacteriilor lactice din genul
LactobacillusMorfologieCelule alungiteBacili
Aranjarea celulelorPerechi sau lnioare
Fermentarea glucozeiHeterofermentativ sau homofermentativ
Izomerul acidului lacticL, D sau D, L
Pentru stabilirea cu rigurozitate a speciei de bacterie
probiotic se impun metode fenotipice i genotipice (bazate pe
structura ADN) [6]. Denumirea bacteriei trebuie s fie conform cu
Lista Denumirilor Aprobate pentru Bacterii [6,104] sau lista de
validare publicat n Jurnalul Internaional de Microbiologie
Sistematic i Evolutiv [6,105] sau n Codul Internaional al
Nomenclaturii Bacteriilor [5,31]. Pnetru stabilirea cu exactitate a
tipului de tulpin, electroforeza pe gel n cmp pulsat este
standardul maxim [6,26]. Tulpina probiotic trebuie depozitat ntr-o
colecie de culturi recunoscute i standardizate genomic.V. Mecanisme
de aciuneModularea sistemului imunitar esutul limfoid intestinal
este cel mai mare n dimensiuni comparativ cu alte zone ale
corpului. Este binecunoscut faptul c bacteriile sunt extrem de
importante pentru dezvoltarea i funcionarea sistemului imunitar la
acest nivel, fiind de fapt mecanismul de aprare mpotriva infeciei
cu ageni patogeni ( Cebra, 1999, Falk et al, 1998 ) . esutul
limfoid intestinal are contact cu componentele alimentare,
antigenii i cu bacteriile benefice sau patogene . Antigenele,
substane care pot declana un rspuns imun, intr n organism prin
mucoasa intestinal, care are un rol esenial n controlarea imunitii
la invazia bacteriilor patogene . Adaptabilitate la diferite
antigene este extrem de important dac avem n vedere c masa
intestinal are o compoziie frecvent schimbat. Cea mai mare
cantitate de antigen este eliberat de la primul contact cu mucoasa
intestinal ( Sanderson i colab., 1993). Dup traversarea barierei
epiteliale prin transcitoz, ele sunt restructurate printr-un proces
de degradare lizozomal. Un test suplimentar este prezena celulelor
M (celule de epiteliu folicular asociate cu esutul limfoid ),
urmate de celulele T ( celule limfocitare aparinnd grupului de
celule albe din snge ), care sunt apoi difereniate ca celule care
mediaz un rspuns imun i promoveaz diferenierea celular i secretoare
de IgA ( imunoglobulina A ) ( Strober i colab., 1998). IgA este un
anticorp care joac un rol crucial n imunitatea mucoaselor. Prin
intermediul receptorilor TLR ( Toll- like receptori ), celule
dendritice ( DC) i celule T, probioticele duc la scderea secreiei
de TH-1 ( limfocite implicate ntr-un rspuns imun mbuntit ), IL-12
(interleukina care este produs n mod natural de celulele dendritice
), TNFa ( citokine inflamatorii ) i IFN- ( citokine care sunt
vitale pentru imunitatea nnscut i dobndit), toate fiind
responsabile pentru izbucnirea proceselor inflamatorii
intestinale.Mecanismele prin care celulele epiteliale fac diferena
dintre microorganisme probiotice i patogene par s fie diferite.
Bacteriile patogene induc un rspuns pro-inflamator n celulele
epiteliale prin activarea factorului de transcripie NF - kB.
Comparativ cu aceste bacterii, speciile nepatogene pot atenua
rspunsul pro - inflamator prin blocarea acestui factor ( Neish et
al., 2000) .S-a constatat c administrarea de L. rhamnosus HN001 i
Bifidobacterium lactis HN019 stimuleaz activitatea limfocitelor
citotoxice. Stimularea activitii limfocitelor citotoxice este
corelat cu secreia de IL - 12, o alt citokin implicat n activitile
probioticelor, asemntor studiului n care s-a administrat L. casei
Shirota ( Takeda i colab., 2006 ) . Aceste studii sugereaz c
probioticele pot juca un rol important n stimularea activitii
limfocitelor citotoxice care au un rol direct n prevenirea
dezvoltrii tumorilor maligne. De asemenea, se pare c rolul
probioticelor n fagocitoz i activitatea limfocitelor citotoxice
este vital n special la vrstnici, care au un sistem imunitar
compromis ( Arunachalam et al., 2000, Gill et al., 2001, Gill et
al., 2001).Calitatea i cantitatea de probiotic din preparat
influeeaz secreia de IL-8 prin intermediul enterocitelor. IL-8 este
asociat cu dezvoltarea inflamaiei intestinale. Date recente arat c
atunci cnd celulele epiteliului intestinal sunt incubate cu L.
rhamnosus GG, este redus cantitateade IL-8 produsde
enterocite(Zhang et Co., 2005). n multe cazuri, s-a observat c
enterocitele produc IL-8 i alte citokine n prezena probioticelor,
precum IL-6 (Ruiz i Co., 2005). Stimularea IL-6 a fost obinut prin
administrarea L. casei CRL431 i a L. helveticus R389 (Vinderola i
Co., 2005).Deci, fiecare probiotic este caracterizat prin prisma
influenei sale asupra sistemului imun. Urmtorul obiectiv ar putea
fi determinarea componentelor exacte din fiecare tulpin probiotic,
care ar fi direct implicate n declanarea rspunsului imun.
Probioticele pot influena sistemul imunitar prin diferii metabolii,
prin componentele peretelui celular sau prin ADN.Inhibarea
bacteriilor patogeneMediul gastrointestinal conine o mare varietate
de elemente, de la flora benefic alimentar i microbian la
bacteriile patogene duntoare. Organismul mamiferelor lupt mpotriva
acestor bacterii patogene prin diferite moduri: blocarea efectelor
bacteriilor patogene prin producerea de substane bactericide i prin
competiie cu ageni patogeni i toxinele acestora necesare aderrii la
epiteliul intestinal, reglementarea raspunsurile imune prin
creterea imunitii nnscute i modularea inflamaia indus de agentul
patogen, prin intermediul cilor semnalizatoare care regleaz
rspunsul receptorilor toll-like; reglementarea homeostaziei
epiteliului intestinal prin stimularea supravieuirii enterocitelor,
mbuntirea funciei de barier i stimularea rspunsurilor protectoare (
Corcionivoschi i Co., 2009). Strategia se bazeaz pe capacitatea
bacteriilor probiotice de a lega patogeni n esutul epitelial
intestinal. Aciunea anti-patogen a probioticelor const n producia
de acid lactic care scade pH-ul, interaciunea cu toxinele produse
de agenii patogeni, producerea de peroxid de hidrogen i sinteza
bacteriocinelor.
Figura 1. Schema diferitelor mecanisme de aciune a probioticelor
prin care se obin diverse efecte terapeuticeProducerea de substane
antimicrobiene (bacteriocine), in situ, n intestin poate fi mbuntit
prin creterea capacitii bacteriilor probiotice de a adera la
mucoasa intestinal. Colostrul bovinelor conine substane care pot
tripla capacitatea speciilor de Lactobacillus casei de a adera la
linie de celule intestinale. Cu toate acestea, producia in situ de
substane microbiene afecteaz microflora intestinal benefic a
organismului gazd (Sanders, 1993). Studiile in vitro pe linie de
celule umane ajut la nelegerea modului n care probioticele reuesc s
adere la epiteliul intestinal. Ulterior, ele mimeaz bariera
intestinal pe care microorganismele patogene trebuie s o treac
pentru a intra n circulaia sistemic i reuesc, cu ajutorul
receptorilor, s lege aceste microorganisme, mpiedicnd adeziunea la
epiteliul intestinal i, deci, manifestarea efectelor
duntoare.Inhibarea aciunii patogenilor se mai realizeaz i prin
producerea unor metabolii, de exemplu acidul lactic sau peroxidul
de hidrogen, care creeaz implicit o scdere a pH-ului, la care
patogenii sunt oprii din dezvoltare (Apella & Co., 1992).
Supernatantul derivat de la culturi de L. rhamnosus Lcr35 au efect
inhibitor asupra a nou tipuri de bacterii patogene: E. coli (ETEC),
E. coli (EPEC), Klebsiella pneumoniae, Shigella flexnerii,
salmonella typhimurium, Enterobacter, Pseudomonas aeruginosa,
Enterococcus faecalis i Clostridium difficile (Forestier & Co.,
2001).Eficacitatea probioticelor a fost demonstrat nu numai n ce
privete tulburrile tractului gastro-intestinal, dar i n prevenirea
i tratarea infeciilor tractului uro-genital, fiind testate pe
pacieni sntoi, de sex feminin, diagnosticai cu infecii
uro-genitale. Rezultatele testelor au sugerat efectele benefice ale
utilizrii probioticelor n prevenirea infeciilor de tract
uro-genital. (Petricevici & Co., 2008). Studiile ulterioare ar
trebui s se axeze pe stabilirea cu o mai mare acuratee a spectrului
de aciune, a tipului de bacterie patogen, asociat cu stabilirea
dozei eficace i a timpului de derulare a tratamentului.Pn n acest
punct am prezentat mai mult sau mai puin exhaustiv mecanismele prin
care probioticele sunt implicate n prevenirea efectelor duntoare
ale patogenilor, precum competiia pentru nutrieni, inhibarea
interaciunii patogenilor cu mucoasa intestinal, ocuparea competitiv
a siturilor de adeziune la substrat, producerea de metabolii cu rol
inhibitor n multiplicarea bacterian i stimularea imunitii mucozale
(Steer & Co., 2000).
Orientri privind evaluarea microorganismelor probioticeTulpinile
probiotice umane ar fi de preferat s aib o origine uman. Mai mult,
dezvoltarea unui probiotic include multe etape i stadii
intermediare, precum descrierea caracteristicilor fiziologice i
metabolice, evaluarea proprietilor biologice (rezistena la
secreiile gastrice, biliare i pancreatice sau la spermicide pentru
probioticele vaginale), producerea de compui antimicrobieni,
adeziunea la celulele epiteliale i colonizarea mucoasei, determinat
n general prin teste in vitro, dar mai ales eficacitatea terapeutic
dovedit prin studii in vitro i in vivo preclinice i clinice
[5-14,26,36-38].Pentru o presupus tulpin probiotic, este important
de stabilit mecanismul de aciune. De fapt, un singur mecanism de
aciune pentru toate probioticele poate genera efecte diferite [39].
Dei nu este esenial, este foarte util, din motive tiinifice, s se
stabileasc mecanismul de aciune, pentru a fi asociat cu orice efect
fiziologic aprut. Multiplele interaciuni microb-microb sau microb-
gazd sunt observate pentru a stabili versatilitatea aciunilor
probioticului i efectele sale asupra patogenilor, asupra
epiteliului intestinal sau asupra sistemului imunitar al gazdei.
[4-6,8,22,39-44]. Multe tulpini probiotice pot produce in vitro una
sau mai multe substane antimicrobiene peroxid de hidrogen, acizi
organici, diacetil, bacteriocine sau molecule bacteriocin-like-
care pot proteja gazda de invazia i multiplicarea patogenilor.
Multiple mecanisme, altele dect activitatea antimicrobian, pot fi
de asemenea implicate: adeziunea microbian competitiv la celulele
peretelui intestinal prin receptori de legtur pentru enteropatogeni
stimularea factorilor intrinseci de activare a sistemului imunitar.
Oricum, niciunul din aceste mecanisme de aciune nu s-a dovedit a fi
componenta cheie n meninerea sntii umane, de aceea cerecetrile n
acest domeniu continu [9,41].Pentru a studia proprietile funcionale
i principiile de operare a coloniilor microbiene intestinale,
precum i a consecinei administrrii probioticelor, este important s
studiem sisteme model simplificate. Un studiu recent pe un cobai
gnotobiotic (ale crui tulpini microbiene sunt cunoscute) a oferit
date despre cum microflora rezident i tulpini ale unor probiotice
frecvent utilizate i pot adapta substratul ca rspuns una alteia i
ilustreaz att relaiile generale ct i pe cele specifice dintre o
gazd, un component al microbiotei indigene i o specie microbian
administrat intenionat [45].Mai mult, tulpinile probiotice pot
genera att rspuns imun nespecific, ct i specific la subieci sntoi
sau bolnavi [22,3640,42,46].Una din cerinele de baz ale unui produs
terapeutic este i sigurana terapeutic. De aceea, tulpinile
utilizate ca probiotice trebuie s fie sigure [6,11], dei teoretic,
ele pot fi responsabile de numeroase efecte adverse, incluznd
infecii sistemice, efecte metabolice, imunodeprimare sau efecte
mutagene [8,13,26,39]. Corelaii documentate ale unor cazuri de
infecii generate de consumul de probiotice septicemie sau
endocardit- sunt extrem de rare i ntlnite numai la pacieni
imunocompromii sau postoperator, unde translocaia bacterian este o
cauz major de infecii ce poate rezulta din multiplicarea bacterian
extrem, i care produce creterea permeabilitii sau chiar distrugerea
barierei mucoasei intestinale i prbuirea sistemului imun [6,47].
Tulpina incriminat de producerea infeciei a fost Lactobacillus
rhamnosus GG, dar este foarte posibil ca identificarea la nivelul
genului sau speciei sa fi fost defectuoas [6,32,39,47]. Niciun
studiu bine documentat despre infecii produse de Bifidobacterii nu
a fost raportat [6]. Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis,
Bacillus subtilis i Saccharomyces boulardii au fost suspectate i
propuse ca poteniale cauze de infecii clinice, n special septicemie
[6,39].Cteva proprieti intrinseci ale Lactobacillilor i
Bifidobacteriilor, asociate sau nu cu activitatea lor metabolic, au
fost incriminate de a fi implicate n tulburri patologice umane.
Aceste proprieti includ deconjugarea i dehidroxilarea excesiv a
srurilor biliare, degradarea stratului de mucus intestinal de ctre
glicozidaze i proteaze, alte activiti enzimatice, agregarea
trombocitelor, colonizarea i producerea de metabolii toxici i
factori viruleni, precum i mutagenitatea [6,23,26,32,39]. Mai mult
dect att, este ectrem de important s cunoatem contraindicaiile
specifice fiecrui grup. Besselink & Co. Au demonstrat recent c
utilizarea profilactic a probioticelor poate fi asociat cu ischemie
intestinal la pacienii cu predispoziie la pancreatit acut sever
[48].Rezistena la antibiotice a LAB, inclusiv a Lactobacililor,
poate aciona ca un rezervor de gene rezistente la antibiotice, care
pot prezenta un posibil risc asupra sntii, prin transferul acestor
gene asupra microbiotei indigene a TGI, i de aici la bacteriile
patogene, oferind patogenilor o nou surs de rezisten antibiotic,
alta dect cea intrinsec. Speciile de Lactobacilli i Bifidobacterii
pot afia rezisten intrinsec non transmisibil (specie-dependent) sau
o susceptibilitatea variabil la cteva antibiotice i chimioterapice
glicopeptide, aminoglicozide, metronidazol, acid fusidic,
cefalosporine, sulfamide, chinolone sau fluorochinolone. Genele
care confer rezisten intrinsec au fost caracterizate pentru
speciile de Lactobacilli, dar sunt necunoscute pentru
Bifidobacterii [32,39,47,49-65,106]Pentru speciile Lactobacillus i
Bifidobacterium, niciun test de sensibilitate standard nu este
general acceptat. Institutul pentru Standarde Clinice i de
Laborator a publicat n 2006 liniile directoare pentru testarea
sensibilitii antimicrobiene a bacteriilor izolate rar sau foarte
pretenioase, incluznd aici speciile de Lactobacillus, Leuconostoc i
Pediococcus, i au oferit puncte de reper interpretative pentru a
putea previziona succesul clinic [66]. Pentru a preveni transferul
nedorit al genelor responsabile de rezistena antibiotic bacteriilor
endogene, probioticele umane sau animale nu ar trebui s prezinte
elemente mobile purttoare de rezisten. Evaluarea siguranei
probioticelor ar putea fi limitat la prezena markerilor
transmisibili ai rezistenei la antibiotice. Din moment ce nu exist
limitri pentru a distinge tulpini probiotice cu rezisten
transmisibil la antibiotice, au fost definite n mod oficial pentru
LAB sau Bifidobacterii, punctele de reper microbiologice sugerate
de Grupul tiinific pentru Aditivii i Produsele sau Substanele
utilizate n Hrana Animalelor (FEEDAP) sunt, n general, utilizate
[52].Un criteriu important pentru evaluarea funciilor probiotice
este fundamentarea funcionalitii acestora, caracterizat prin studii
umane i pe animale, dar i prin analiza in vitro pentru a gsi
markeri valizi ai structurii i funciei n corpul uman (de exemplu,
nivelurile grupelor de microorganisme din fecale sau concentraii
sanguine de markeri imunitari).Grupul de lucru al FAO(Food and
Agriculture Organization) recomand ca metodele standard pentru
evaluarea clinic s se desfoare n 4 stadii: Faza I evaluarea
siguranei Faza II evaluarea eficacitii prin studii randomizate,
dublu orb, controlate placebo i a efectelor adverse Faza III
evaluarea eficienei terapeutice prin comparare cu un standard
terapeutic (doar pentru suplimentele alimentare i produsele
farmaceutice) Faza IV farmacovigilena. Rezultatele din trialurile
pe indivizi trebuie repetate pentru confirmare. n unele cazuri,
modelele animale exist pentru a oferi fundamentarea efectelor in
vitro i determinarea mecanismelor de aciune ale
probioticelor.Testele ulterioare pentru studierea mecanismelor de
aciune ale tulpinilor probiotice i impactul acestora asupra
activitilor metabolice ale microbiotei intestinale, ar putea s se
bazeze pe cobai model gnotobiotic mai elaborat, aa cum a fost
propus de Sonnenburg & Co. [45].n ceea ce privete
caracteristicile tehnologice ale potenialelor tulpini probiotice,
prezint o egal importan stabilitatea genetic n timpul creterii,
meninerea viabilitii pe perioada conservrii, transportul i
depozitarea [6,11,13,26,69,70].Studiile diferiilor autori au artat
c unele produse comerciale nu dein o identificare adecvat i nici o
cuantificare corect a UFC ale speciilor prezente[56,70-72]. Mai
mult, unele produse folosesc denumire incorect, care nu se regsete
n clasificarea Colecia American a Tipurilor de Culturi, de aceea nu
are validitate tiinific. De aceea, produsele care au o utilizare
specific pentru sntatea uman sunt permise numai dup o evaluare
atent a probioticelor-medicamente, care trebuie obligatoriu s treac
prin faza III a studiilor clinice [8].
VI. Proprieti ale bacteriilor lacticeLAB sunt, n general,
microorganisme Gram+, lipsite de citocrom, care prefer condiii
anaerobe, dar sunt i facultativ aerobe, pretenioase, toleran la pH
acid, strict fermentative, producnd acid lactic ca i component de
baz (Stiles&Holzapfel, 1997). Cele mai importante genuri sunt:
Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus,
Pediococcus, Leuconostoc i Bifidobacterium. Bazndu-ne pe coninutul
de guanin-citozin, bacteriile Gram+ se impart n dou ramuri
filogenetice principale: ramura Actinomycetes, unde sunt incluse
bifidobacteriile care au un coninut crescut de G-C n structura ADN,
mai mare de 55-67%, celelalte genuri, cu un coninut mai mic de 55%
fcnd parte din ramura Clostridium. Totui, datorit unor proprieti
fiziologice i biochimice asemntoare cu LAB tipice, bifidobacteriile
sunt considerate ca fcand parte din grupul mare al bacteriilor
lactice. (Stiles&Holzapfel, 1997)Microorganismele ce fac parte
din grupul bacteriilor lactice sunt, n general, mprite n dou
grupuri distincte, lund n considerare metabolismul carbohidrailor.
Astfel, grupul homofermentativ constituit din Lactococcus,
Pediococcus, Enterococcus, Streptococcus i civa lactobacili
utilizeaz calea glicolitic Embden- Meyerhoff-Parnas pentru a
transforma glucoza n acid lactic. n opoziie cu acest grup, grupul
heterofermentativ produce amestecuri echimolare de acid lactic,
CO2, etanol i acid acetic din glucoz, pe calea pentozofosfailor. n
acest grup includem genurile Leuconostoc, Weissella i unii
lactobacili. Exist ntre acetia i specii care sunt att
homofermentative, ct i facultativ heterofermentative.
VII. Criterii de selectare a Lactobacililor cu proprieti
probioticeImportana cunoaterii aprofundate a caracteristicilor
fiziologice, fizico-chimice i biologice ale tulpinilor de
probiotice a fost subliniat n multiple articole, pe ea bazndu-se,
de fapt, succesul terapiei cu Lactobacilli. Pentru aceasta este
necesar ca preparatul s ndeplineasc o serie de cerine: tulpina
trebuie s reprezinte un locatar normal al aparatului,
non-patogenic, capabil s colonizeze zona int i s elibereze
bacteriile benefice n concentraii mari, de 107-109 UFC/mL-1. Dei au
existat de-a lungul timpului numeroase criterii sugerate i
recunoscute (Mattile-Sandholm, Myllarinen, Crittenden,
Fonden&Saarela, 2002; Ouwehand, Kirjavainen,
Shortt&Salminen, 1999; Reid, 1999), s-a realizat o list de
criterii de ctre FAO/WHO, n 2002, expus n Tabelul 2,Tabelul 2.
Criterii de selectare a probioticelor i proprietile vizate
Criteriul Proprietatea
SiguranaOriginea
Patogenitatea i capacitatea de infectare
Factori de virulen-toxicitate,activitate metabolic i proprieti
intrinseci( rezistena antibiotic)
TehnologiaTulpini stabile genetic
Viabilitate crescut n timpul procesrii i stocrii
Proprieti senzoriale bune
Rezistena la fagocitoz
Producere pe scar larg
FuncionalitateaToleran la acid gastric i sruri biliare i
pancreatice
Tolerana la aciunea biliar
Adeziunea la suprafaa mucoaselor
Efecte benefice asupra sntii validate i documentate
Proprieti fiziologice doriteImunomodularea
Activitate antagonic mpotriva patogenilor gastrointestinali
(Helicobacter pylori,Candida albicans)
Metabolizarea colesterolului
Metabolizarea lactozei
Proprieti antimutagene, anticancerigene
Primul pas n selectarea probioticului este ncadrarea sa
taxonomic, care ne ofer indicii asupra originii, habitatului normal
i caracteristicilor sale fiziologice. Clasificarea bacteriilor
lactice se realizeaz n funcie de structura fenotipic i genotipic.
De-a lungul timpului s-au descoperit metode rapide i de o acuratee
crescut care fac posibil clasificarea corecta a tulpinii. Tulpini
nrudite se pot separa utiliznd metode bazate pe investigarea ADN
profilul plasmidic, analiza enzimatic, tipul ribonucleic,
electroforeza n cmp pulsat (Holzapfel, Haberer, Geisen,
Bjorkroth&Schillinger, 2001; Vuaghan, Heilig, Ben-Amor& de
Vos, 2005). Pn de curnd, era imperativ specificarea originii
tulpinii probiotice, ns noile reglementri ale FAO/WHO consider c
este mai important specificitatea probioticului dect originea sa,
avnd n vedere c, la natere, intestinul uman este, teoretic, steril.
Este solicitat, de asemenea, testarea siguranei i a profilului
facultativ patogenic al tulpinilor incluse n uz comercial, dei au
existat extrem de puine cazuri documentate de infecii generate de
unele specii de Lactobacili (Salminen & Co., 2006). Un alt
aspect important este rezistena la antibiotice a probioticelor,
datorat unor gene codificate de plasmide, deoarece, n cazul
acestora, rezistena poate fi transmis ntre microorganisme, ceea ce
ar duce n timp la crearea rezistenei crescute la antibiotice i a
patogenilor. Un studiu a sugerat c prezena antibioticului poate
facilita creterea rezistenei antibiotice a mutanilor (Marteau,
2001). De aceea, tulpinile probiotice trebuie testate asupra
rezistenei antibiotice i, mai mult, asupra capacitii de a tranfera
aceast proprietate, pentru a preveni instalarea unei rezistene
antibiotice la bacteriile endogene sau chiar patogene.
VIII. Tulpini probiotice cu larg utilizare comercial
Plecnd probabil de la teoria lui Mecinikov, conform creia ranii
bulgari dovedeau a avea o rat mai mare de supravieuire datorit
consumului de bacterii lactice, industria lactat a nceput s
dezvolte o serie ntreag de noi produse funcionale coninnd bacterii
lactice benefice. Se estimeaz la ora actual c exist peste 70
produse cu coninut probiotic, comercializate n ntreaga lume (Shah,
2004). n mod tradiional, probioticele au fost ncorporate n iaurturi
punctul de plecare ulterior s-a extins utilizarea lor n maionez
(Khalil&Mansour, 1998), pine (Arihara&Co., 1998), brnzeturi
i paste de brnz (Henriksson&Shah, 2006). Probioticele se pot
ntlni i n lapte, kefir, sucuri de fructe, ngheat, diverse produse
de panificaie. Consumul de produse cu coninut probiotic a crescut
cu 12% din 2005 pn azi, n Europa de Vest, America i Japonia, ultima
fiind cea mai prolific, avnd 53 de produse cu diferite tulpini de
Lactobacili pe pia. Produsele conin n general lactobacili i
bifidobacterii, unele neprezentnd importan ca i efecte benefice, ci
doar cu rol de aditivi, pentru a crete perioada de valabilitate a
produsului.Lactobacilii sunt ubiquitari n natur, se gsesc n orice
mediu bogat n carbohidrai. Sunt microorganisme Gram+, nesporulate,
non-catalazice-cu unele excepii- cu form de bastonae sau coci. Sunt
organisme fermentative, microaerofilice i chemoorganotropice. Pe
baza compoziiei G-C a structurii ADN, ele au, n general, un coninut
108 UFC/mL n colon. Meninerea viabilitii lactobacililor depinde de
gazd, de vehicul, precum i de rezistena intrinsec a tulpinii
selectate. Cteva dintre probiotice sunt distruse de sucul gastric,
n timp ce doar cteva ating niveluri crescute n scaun. O mbuntire a
modelelor in vitro, a alegerii tehnicilor de eantionare n intestin
i a gsirii unor modaliti de ncredere pentru identificarea
probioticelor n ecosisteme complexe, ar oferi perspective mari
pentru nelegerea mai profund a parametrilor farmacocinetici reali i
corelarea corect a relaiei doz-rspuns farmacologic (94).
Condiionarea i etichetarea produselor cu coninut
probioticMaterialele utilizate pentru condiionarea produselor cu
coninut probiotic trebuie, n primul rnd, s fie impermeabile,
rezistente la umiditate, de aceea unul dintre cele mai preferate
materiale este sticla, deoarece este non-toxic, sigur pentru mediu
i reciclabil. Plasticul nu se recomand, deoarece nu este complet
impermeabil, uneori producnd i diverse mirosuri neplcute. La aceste
condiionri trebuie adugai desicani, precum silicagelul, n sachete
sau miniflacoane (15).Etichetarea produselor cu coninut probiotic
se face conform standardelor NNFA (National Nutritional Food
Association). O etichet convenional a unui produs probiotic trebuie
s conin informaii despre: identificarea microorganismelor dup gen i
specie, declaraie a numarului minim de celule viabile sau
UFC/unitate de msur, dat de expirare sau termen de valabilitate i
recomandri privind depozitarea. Produsele probiotice sunt nsoite de
un prospect, care conine mai multe informaii pentru consumator,
precum i pentru medic, informaii privind indicaiile terapeutice,
posibilele efecte secundare i avertizarea de ase adresa medicului
sau farmacistului n cazul apariiei oricrei reacii adverse (95).
XII. Caracterizarea proprietilor probioticuluiDiversele
beneficii nutriionale i terapeutice ale probioticelor pot fi pe
deplin exploatate numai dup acceptarea lor n lumea tiinific i
definirea reglementrilor. De aceea sunt necesare nelegerea
mecanismului lor de aciune i validarea complet. Diferitele modele
in vitro au fost concepute pentru a verifica, cuantifica i
certifica proprietile probioticelor, precum i mecanismele care stau
la baza activitii lor (6). Dei este dificil s investighezi
proprietile bacteriilor in vitro, aceste modele prezint beneficii
din mai multe puncte de vedere (96).Probiotice orale
Caracteristicile culturiiTrebuie controlate urmtoarele aspecte
privind puritatea culturii, procesele de fermentaie i produii
metabolici, deoarece toate acestea pot afecta stabilitatea sau
chiar altera caracteristicile funcionale (97). Rezistena la
aciditatea gastricAceast proprietate este asigurat in vitro prin
incubarea culturilor alturi de o soluie tampon, la pH =2-3,4 i
numrarea bacteriilor viabile la anumite intervale de timp. Acest
aspect nu s-a realizat i in vivo, deci nu exist o validare a ratei
de supravieuire realizabil n stomac (98). Rezistena la acizi
biliariPlcile sunt analizate ntr-o manier similar testrii de
rezisten la aciditatea gastric, fiind incubate cu bil porcin sau
bovin de concentraie 0,3-7,5%, la 37oC, n condiii anaerobe, iar
multiplicarea baterian este nregistrat dup 24, apoi 48 de ore (97).
Tolerana la tranzitTolerana produsului la tranzit digestiv se
realizeaz determinnd cantitatea de lactobacili viabili, la diferite
intervale de timp, dup expunerea la mediu simulat gastric (pH=2)
sau suc pancreatic (pH=8) i NaCl (0,5% m/V) a suspensiei de celule
bacteriene (99). Capacitatea de multiplicareAcest parametru a fost
testat in vivo pe oricei tineri, urmnd o metod validat. Astfel, s-a
determinat greutatea iniial, cantitatea de mncare administrat,
cantitatea de ap administrat i diferena de greutate nregistrat la
un anumit interval de timp. Rezistena in vivoTradiional, aceast
determinare se realiza prin analiza scaunului unor pacieni sntoi
crora li s-au administrat probiotice trei luni de zile i
determinarea cantitii totale de lactobacili, nainte, n timpul i dup
sistarea administrrii produsului (87). Deoarece testele au condus
la o subestimare a capacitii de colonizare, acest parametru este
msurat astzi n mucoasa colonului prin colonoscopie i biopsie (101).
Diverse proprieti ale probioticelor oraleSimulatorul Ecosistemului
Intestinal Uman este un model bine caracterizat pentru probioticele
orale, avnd 6 compartimente cu o compoziie microbian diferit,
corespunznd stomacului, duodenului, jejunului, ileonului, colonului
ascendent i descendent, expus la o temperatur normal a organismului
uman de 37oC. Fiecare compartiment are un timp de remanen diferit i
un volum de lucru diferit, astfel nct efectele pot fi studiate
separat. Acest model simuleaz cu exactitate condiiile in vivo i
influena microbiotei intestinale asupra activitii
metabolice.Probiotice vaginale Capacitatea producerii de
biosurfactaniAceast proprietate poate fi caracterizat fie prin
metoda picturii, folosind Analiza Axisimetric a Formei Picturii,
fie prin msurarea capacitii de inhibare a aderrii patogenilor la
suprafaa polimerilor. Ultimele analize utilizate implic aderarea
suspensiei de celule la pereii plcilor de polistiren, urmat de
incubare, dup care bacteria aderent este evideniat prin colorare
(107,108). Capacitatea producerii de peroxid de hidrogen
H2O2Lactobacillus este cultivat ntr-un mediu coninnd
tetrametilbenzidin i peroxidaz din hrean n condiii de anaerobioz.
Timpul necesar apariiei coloraiei albastre este o msur a capacitii
de producere a peroxidului de hidrogen.
Parametri de multiplicare intravaginalModelul Gompertz este unul
dintre modelele statistice utilizate pentru a obine date despre
creterea bacterian. Unul din avantajele acestui model este acela de
a permite calcularea ratei maxime de cretere utiliznd doar un punct
de pe curb (numit punctul de maxim ndoire), ceea ce nu era posibil
cu metodele tradiionale (109). Testul de co-agregareSuspensia cu
lactobacili i uro-patogeni este incubat, apoi proba analizat n
microscopie cu lumin inversat, cu sau fr coloraie Gram, pentru
determinarea gradului de agregare, unde 0 reprezint lipsa agregrii,
iar 4 reprezint maxim de agregare (75).Proprieti comune att
probioticelor orale ct i celor vaginale AdeziuneaAceasta
proprietate presupune detrminarea unor proprieti diverse, precum
legarea de suprafee solide ca polistirenul, capacitate de agregare,
hemaglutinare i adeziune la straturi unicelulare de culturi
celulare (110,111). Sub acest aspect, exist numeroase rezultate
obinute pe modele in vitro, precum non-mucus/linie celular
secretoare de mucus (112); intestinul gros/modelul colon, esut
colonic uman obinut prin rezecie (113) sau mucus din intestinul
subire canin (114). Activitate antimicrobianAceast analiz poate fi
modificat i aplicat la preparate cu mediu de cultur solid sau
lichid, unde uro-patogenii i lactobacilii sunt adugai n mediu, iar
creterea este comparat cu martorul (115-117.) Viabilitate i
proprieti n timpul procesrii i depozitriiTehnica numrrii n plac
este cea mai frecvent utilizat metod n acest scop, ns au aprut i
noi tehnici, precum flow cytometry i fluorimetria (36).XIII.
Aspecte privind sigurana probioticelorMajoritatea utilizrilor
iniiale ale lactobacililor au vizat domeniul nutriie muli ani.
Faptul c utilizarea lor ndelungat i originea lor uman, a fcut s nu
existe suspiciuni asupra siguranei utilizrii acestora (6). Totui,
s-a ajuns n acest moment la necesitatea de a demonstra sigurana
utilizrii lor, deoarece au existat cteva cazuri documentate de
infecii ale unor rni, endocardite bacteriene i chiar infecii n snge
produse prin asocierea Lactobacillus, Pediococcus, Enterococcus i
Bifidobacteria. De asemenea, datorit recentelor descoperiri n
domeniul geneticii, tehnicile de recombinare i nu n ultimul rnd
probioticele vectori, demonstrarea siguranei este imperios necesar,
mai ales n cazul pacienilor imunocompromii (118). Acest aspect al
siguranei devine cu att mai important de demonstrat atunci cnd vrem
s administrm un produs cu bacterii vii la o gravid sau la sugari.
Nu s-au raportat nc efecte adverse la L. rhamnosus GG (95).De
aceea, probioticele trebuie cercetate i evaluate cu mare atenie, n
funcie de urmtorii factori: ncadrare taxonomic Patogenitate i
infeciozitate Activitate metabolic Activitatea de agregare
plachetar i degradarea mucosal Transferul genelor i rezistena
plasmidelor codificateXIV. Evaluarea i controlul calitii produselor
probioticeXV. ReglementriXVI. Probioticele viitoruluiXVII.
ConcluziiXVIII. Referine 1. Metchnikoff, E., The prolongation of
life optimistic studies- Lactic acid as inhibiting intestinal
putrefaction, 1907, Ed. Heinemman, London, UK 161- 183.2. Lilly,
D.M.; Stillwell, R.M., Probiotics: growth promoting factors
produced by microorganisms, 1965, Revista Science 147, pg.
747-748.3. Fller, R., Probiotics in man and animal, 1989, Journal
of Applied Bacterilogy 66, pg. 365-378.5. Joint FAO/WHO Expert
Consultation. Health and Nutritional properties of probiotics in
food including powder milk with live lactic acid bacteria. Joint
FAO/WHO Expert Consultation, Cordoba, Argentina, 1-4 October 2001.
*Clear and detailed introduction to the multidisciplinary aspects
of probiotics.6. Guidelines for the evaluation of probiotics in
food: Joint FAO/WHO Working Group meeting, London, UK, ON, Canada,
30 April-1 May, 2002.7 Guarner F, Malagelada JR. Gut flora in
health and disease.Lancet361, 512-519 (2003).8 Saarela M, Mogensen
G, Fondn R, MttJ, Mattila-Sandholm T. Probiotic bacteria: safety,
functional and technological properties.J. Biotechnology84, 197-215
(2000).9 Reid G, Jass J, Sebulsky MT, McCornick JK. Potential uses
of probiotics in clinical practice.Clin. Microbiol. Rev.16(4),
658-672 (2003).10 Mercenier A, Pavan S, Pot B. Probiotics as
biotherapeutic agents: present knowledge and future prospects.Curr.
Pharm. Des.9(2), 175-191 (2003). *Stresses the multidisciplinary
complexity of the research field and addresses the existing
crossreaction between a number of key issues.11 O'Hara AM, Shanahan
F. Mechanisms of action of probiotics in intestinal
diseases.ScientificWorldJournal7, 31-46 (2007).12 Del Piano M,
Morelli L, Strozzi GPet al.Probiotics: from research to
consumer.Dig. Liver. Dis.38(Suppl.2), S248-S255 (2006). *Examines
the sequential steps of research, from the identification of a
possible probiotic strain to its production and marketing.13 Parvez
S, Malik KA, Ah Kang S, Kim HY. Probiotics and their fermented food
products are beneficial for health.J. Appl. Microbiol.100,
1171-1185 (2006). *Objective and up-to-date review of the health
benefits of probiotics.14 Holzapfel WH, Schillinger U. Introduction
to pre- and probiotics.Food Res. Int.35, 109-116 (2002).15 Falagas
ME, Betsi GI, Athanasiou S. Probiotics for the treatment of women
with bacterial vaginosis.Clin. Microbiol. Infect.13, 657-664
(2007).101 Food and Agriculture Organization of the United Nations
www.fao.org102 World Health Organization www.who.int